KR20090111933A - 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 등온증폭반응 (Isothermal Amplification Reaction)을 이용하여 결핵균을 신속하고 정확하게 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물, 상기 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 rpoB 유전자 부위를 LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) 법을 이용하여 등온에서 증폭하여 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

결핵, LAMP, 등온증폭, 프라이머 세트, 키트

Description

특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법{Primer composition and kit for isothermal amplification reaction for detecting Mycobacterium sp. comprising specific primer set, and method for detecting Mycobacterium sp. using the primer set}

본 발명은 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 상기 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

매년 전 세계적으로 결핵으로 인해 사망하는 사람들의 수가 증가하고 있으며 또한 약물내성의 증가로 인해서 결핵의 유병률이 점점 증가하고 있다. 전세계 인구의 1/3 정도인 20억명 정도가 결핵 감염으로 추정되고 결핵과 HIV 중복 감염자의 수가 대략 1천 5백만명 정도이며 연간 800만명의 결핵환자가 발생하고 200만명 정도가 사망하는 것으로 보고되어졌다. 특히, 우리나라 경우는 전 인구의 약 1/3 정도가 결핵 감염으로 추정되고 매년 약 12만명의 신규 결핵균 감염자가 발생하며 OECD 가입 국가 중에 결핵 사망률이 1위를 차지하고 있는 실정이다. 더욱 심각한 것은 60대 이상 노인층에서 결핵환자가 많이 있으며 20대의 청년들의 감염률이 2위로 나타나고 있다는 것이다.

결핵은 Mycobacterium tuberculosis 감염으로 생기는 전염성 질환으로서 감염으로 결절을 만드는 만성 전염성 질환이다. 주로 비말핵의 형태로 호흡기를 통해서 흡입되어 전파된다. 결핵 감염 위험성이 높은 경우는 주로 면역 기능이 약화된 경우인데 영양 결핍, 알콜 중독, 에이즈, 당뇨병, 만성 신부전 등이 있다. 대부분은 처음 감염시 별다른 증상 없이 자연 치유되고 일부가 휴지기 상태로 오랜 기간 지내다가 개체의 저항력이 감소하여 결핵균 증식에 유리한 상태가 되면 다시 성장하여 발병하게 된다.

인체에서 발생하는 결핵 중 가장 흔한 형태가 폐결핵인데, 이는 예방과 관리 및 화학 요법의 발달로 오늘날 결핵으로 인한 사망은 많이 감소되었으나, 사회경제적으로 낙후된 나라에서는 아직도 결핵에 의한 높은 사망률을 보이고 있다.

결핵의 진단방법으로는 투베르쿨린 반응, 흉부 X-선 촬영, ROREKA 도말 검사, 면역학적 검사에 의하여 진단한다. 현재 결핵을 진단하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법에서는 여러 종류의 유전자 부위를 사용하고 있는데 일반적으로 IS6110과 rpoB gene, hsp65 gene 등이 이용되고 있다 (Dissou Affolabi et al., J. Clin . Microbiology . 45: 2123-2125, 2007; Hiroshi Maeda et al., Immu . Med . Microbiology. 43: 233-239, 2005; Hong et al., J. Clin . Microbiology . 42: 1956-1961, 2004). 이렇듯 결핵을 진단하는 방법으로 여러 가지가 있지만 방법과 절차가 까다로워 신속하고 정확한 진단에 어려움이 많다. 게다가 빠르고 신속한 진 단을 요구하는 결핵균에 대한 진단은 실제로 많은 시간이 소요되어 어려움이 많은 실정이다.

다양한 분자 생물학적 기법이 결핵균을 검출하기 위해 이용되고 있는데, 첫째 PCR-SSCP 방법으로 표적 유전자를 PCR 방법으로 증폭하고 증폭된 유전자의 야생형과 돌연변이형의 유전자 구조적 변화를 분석하는 것으로 검출 감도가 낮다는 단점이 있다. 둘째 혼성화 방법을 이용한 Line hybridization assay 법으로 프로브나 표적 유전자가 많이 필요하다는 단점이 있다. 셋째 PCR-Sequencing 방법으로 표적 유전자를 PCR 방법으로 증폭하고 정제하여 sequencing을 하는 방법으로 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있다.

대한민국 특허등록 제254414호에는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체를 유효성분으로 포함하는 결핵균 항원검출용 진단 키트가 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제285254호에는 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex)의 136bp의 DNA 분절의 PCR 증폭 여부를 확인할 수 있는 결핵균군과 비결핵 항산성균을 감별-탐지하기 위한 진단시약이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제361345호에는 결핵균의 38kD 항원을 1-2 중량부, 16kD 항원을 1-2 중량부, 6kD 항원을 0.5-1 중량부, 23kD, 19kD, 85A 및 85C 항원 각각을 0.125-0.5 중량부로 포함하는 결핵진단용 항원 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제454585호에는 마이코박테리아의 균주 감별 및 결핵균의 항생제 내성을 검출할 수 있는 마이크로어레이 및 이를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제455032호에는 마이코박테리아 관 련 3종의 유전자(MTP40, IS6110, HSP65) 각각을 표적으로 하는 3종의 특이 프라이머쌍을 동시에 사용하는 다중-이중 중합효소연쇄 반응(MULTIPLEX-NESTED PCR)에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 상기에서 언급한 종래의 분자생물학적 방법들의 단점들을 보완하기 위해서 본 발명에서는 등온증폭반응이라는 방법을 사용하여 표적 유전자 부위를 등온증폭반응용 프라이머를 사용하여 등온에서 증폭하여 결핵균을 신속하고 정확하게 빠르고 검출하는 방법을 개발하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 등온증폭반응을 통해 결핵균을 검출하기 위한 rpoB 유전자의 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 등온증폭반응을 사용하여 온도의 변화 없이 일정한 온도에서 유전자를 증폭하여 결핵균을 신속하고 정확하게 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 기존의 PCR 반응을 수행하여 결핵균을 검출하는 방법보다 신속하고 감도가 좋은 등온증폭반응법을 이용하여 1시간 안에 일정한 온도에서 결핵균을 검출할 수 있는 방법이다.

등온증폭반응을 이용하게 되면 기존의 유전자 증폭반응을 위한 장비가 필요 하지 않으며 일정한 온도를 맞출 수 있는 실험실의 어떠한 장비를 사용해도 유전자를 증폭할 수 있는 장점이 있으며 또한 현장 적용성이 뛰어나 생물학 테러나 이동형 유전자 검출 장비 개발에 크게 도움이 될 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다. 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 결핵을 진단하는데 이용되는 rpoB 유전자 내의 서열이며, 서열번호 1 및 2의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 프라이머로서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 프라이머이다. 또한, 서열번호 3 및 4의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머로서, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer; FIP)이며, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다.

본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 각각 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 3의 서열 내의 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리 고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 4의 서열 내의 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상, 43개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 결핵균을 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 rpoB 유전자의 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 분자유전학적 기법인 등온증폭반응을 이용하여 결핵관련 유전자 부위인 rpoB 유전자를 증폭하여 기존의 PCR처럼 온도의 증감 없이 일정한 온도에서 증폭반응을 진행하여 결핵균을 신속하고 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 시료는 혈액, 객담, 침 조직, 소변, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 늑막액(pleural fluids), 늑막 생검(pleural biopsies), 또는 기관지 세척액일 수 있으나, 결핵균이 검출될 수 있는 시료이면 제한되지 않는다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 rpoB 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다. 상기 등온증폭반응은 62~64℃, 바람직하게는 63℃에서 1시간 정도 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 증폭 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 결핵 균주에서 gDNA 추출

(1) 3% 오가와 배지에 배양한 결핵 균주인 인형균 (Mycobacterium tuberculosis)에 1M의 NaOH를 1 mL 넣고 배지 전체에 닿도록 위아래로 혼합하였다.

(2) 끓는 물에 15 분 동안 중탕하여 처리한 용액을 2 mL 원심분리 튜브 (tube)로 옮겼다.

(3) 1.5 mL 원심분리 튜브에 proteinase K (20 mg/mL) 20 ㎕, 전처리 용액 200 ㎕와 조직분해 완충용액(tissue lysis buffer)(GeNetBio, Korea) 200 ㎕를 넣고 5 초 동안 섞은 후 항온 수조에서 60℃로 1시간 동안 반응시켰다.

(4) 튜브에 동량의 PCI-9 (페놀:클로로포름:이소아밀알콜 25:24:1)를 넣고 5 분간 13,000 rpm에서 원심분리한 후 상층액을 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮겼다.

(5) 상층액에 2 M 소듐 아세테이트 30 ㎕와 차가운 100% 에탄올 900 ㎕를 넣은 후 가볍게 섞어준 후 DNA의 수율을 최대화하기 위해 -20℃에서 30분 동안 두었다.

(6) 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버린 후 70% 에탄올을 500 ㎕ 넣고 가볍게 섞어 준 후 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리시킨 후 상층액을 제거했다.

(7) 에탄올을 완전히 제거하기 위해 오븐에서 1시간 반 동안 건조시킨 후 50 ㎕의 용리 완충용액 (elution buffer)을 넣어 줬다.

(8) 분리한 DNA는 곧바로 실험에 사용하거나 4℃에 보관하고, 장기간 보존하기 위해서는 -20℃에 저장해 두었다.

실시예 2: 중합효소연쇄반응( PCR )

실시예 1에서 수득한 gDNA에서 rpoB 유전자에 대하여 표 1 기재의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 구체적으로, 하기 표 2의 구성을 통해 PCR 기기(Perkin-Elmer사, GeneAmp PCR System 2700)를 이용하여 230bp의 PCR 산물을 얻었다.

정방향 프라이머(프라이머 1)	5'-ACT CGA CAT CCT CGA TGG AC-3'(서열번호 1)
역방향 프라이머(프라이머 2)	5'-CCA ACA AGA AGG CGT ACT CG-3'(서열번호 2)

구성	DNA	10×완충액	dNTP (2.5mM)	프라이머 1 (10pM)	프라이머 2 (10pM)	Taq (5 unit)	증류수	합계
첨가량(㎕)	2	2.5	2	0.8	0.8	0.1	16.8	25

실시예 3: 등온증폭반응 ( Isothermal Amplification )

실시예 1에서 수득한 gDNA에서 rpoB 유전자에 대하여 표 3 기재의 프라이머를 사용하여 등온증폭반응을 수행하였다. 구체적으로 하기 표 4의 구성을 통해 63℃에서 1시간 동안 증폭반응을 수행하였다. 또한 2.1×10²∼2.1×10⁶ copy/mL의 범위까지 검출할 수 있었다.

정방향 프라이머	ACTCGACATCCTCGATGGAC(서열번호 1)
역방향 프라이머	CCAACAAGAAGGCGTACTCG(서열번호 2)
FIP(Forward inner primer)	GGTTGGATGCCTGCCTCGGCATACGGATAGGGGATCTCAGT(서열번호 3)
BIP(Backward inner primer)	AGCGGTCGGAAGCTCCTATGACAGGGTTTGATCAGCTCGGTCT(서열번호 4)

구성	DNA	10× 완충액	dNTP (2.5mM)	정방향 (10pM)	역방향 (10pM)	FIP (10pM)	BIP (10pM)	Bst (5unit)	증류수	합계
첨가량 (㎕)	2	2	2	0.6	0,6	1.4	1.4	1.5	8.5	20

실시예 4: 전기영동

1.5% 아가로스겔 및 0.5X TBE 완충액을 준비하여, 10V/cm의 전기영동조건으로 상기 PCR 결과 산물을 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 그 결과를 도 1과 도 2에 도시하였다.

도 1은 PCR 반응을 수행한 후 전기영동으로 PCR 반응 산물을 확인한 결과로서, M은 100bp ladder이고 U는 희석되지 않은 DNA, 1번 레인은 10^-1 희석, 2번 레인은 10^-2 희석, 3번 레인은 10^-3 희석, 4번 레인은 10^-4 희석, 5번 레인은 10^-5 희석, 6번 레인은 10^-6 희석, 그리고 7번 레인은 음성 대조군이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 230bp의 PCR 산물을 얻었으며, gDNA 희석을 많이 할수록 PCR 산물의 밴드 강도가 약해지는 것을 알 수 있었다.

도 2는 등온증폭반응을 수행한 후 전기영동으로 반응 산물을 확인할 결과로서, M은 100bp ladder이고 U는 희석되지 않은 DNA, 1번 레인은 10^-1 희석, 2번 레인은 10^-2 희석, 3번 레인은 10^-3 희석, 4번 레인은 10^-4 희석, 5번 레인은 10^-5 희석, 6번 레인은 10^-6 희석, 그리고 7번 레인은 음성 대조군이다.

도 1과 도 2를 통해 검출 가능한 농도 범위는 중합효소연쇄반응의 경우는 2.1×10³∼2.1×10⁶ copy/mL의 범위 내에서 검출되었고, 등온증폭법의 경우는 2.1×10²∼2.1×10⁶ copy/mL의 범위까지 검출되어 등온증폭법이 중합효소연쇄반응보다 더 높은 검출 한계를 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: DNA 염기서열 분석법에 의한 유전자 판별

등온 증폭법에 사용된 프라이머 중 정방향 및 역방향 프라이머만을 이용해 얻은 DNA 증폭산물을 염기서열분석법(ABI 3730xl DNA analyser, Applied Biosystem, USA)으로 분석하여 도 3의 결과를 얻었고, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 비교 후 결핵군임을 확인하였다.

실시예 6: 재현성 실험

인형 (Mycobacterium tuberculosis) 결핵균 DNA (2.1×10⁶ copy/mL)을 일반 PCR 방법과 등온증폭법을 이용하여 한번에 6개의 동일 시료를 30번 반복 시행하여 각 실험간 재현성을 테스트하였고 결과는 도 4와 같다.

도 4의 결과로 등온증폭법에 사용된 정방향, 역방향 프라이머의 감도가 정확하며 예상된 부위에서 정확히 증폭된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 민감성 검사

인형 (Mycobacterium tuberculosis) 균 DNA 원액(2.1×10⁶ copy/mL)을 단계희석을 하여 2.1×10⁶∼2.1×10⁰ copy/mL의 농도에서 검출 테스트를 수행하였고, 도 1과 도 2의 결과를 얻었다.

도 1과 도 2의 결과를 비교분석한 결과, 등온증폭반응이 기존의 유용하게 사용한 PCR 반응보다 100배 정도 감도가 더 좋은 것으로 관찰되었다.

실시예 8: 실시간 등온증폭반응 ( Real - time Isothermal Amplification )

상기 표 3과 표 4의 조건으로 등온증폭반응 시약을 혼합하고 10X SYBR Green I이라는 형광시약을 더 첨가하여 실시간 등온증폭반응을 수행하였다. 반응조건은 63℃에서 1시간 정도 반응을 수행하였다.

도 5는 실시간 등온증폭반응을 수행한 결과로서, 1번은 2.1×10⁶ copy/ml, 2번은 2.1×10⁵ copy/mL, 3번은 2.1×10⁴ copy/mL, 4번은 2.1×10 ³ copy/mL, 5번은 2.1×10² copy/mL, 6번은 음성 대조군이다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 인형균의 농도가 높을수록 더 낮은 사이클 수에서 증폭 산물이 관찰됨을 알 수 있었다.

도 1은 PCR 반응을 수행한 후 PCR 산물을 전기영동하여 확인한 결과이다.

도 2는 둥온증폭반응을 수행한 후 결과물을 전기영동하여 확인한 결과이다.

도 3은 등온증폭반응에 사용한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한 후 염기분석을 통해 증폭부위가 결핵균임을 확인한 결과이다.

도 4는 등온증폭반응의 재현성 결과이다.

도 5는 실시간 등온증폭반응 결과이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Primer composition and kit for isothermal amplification reaction for detecting Mycobacterium sp. comprising specific primer set, and method for detecting Mycobacterium sp. using the primer set <130> PN08086 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 actcgacatc ctcgatggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ccaacaagaa ggcgtactcg 20 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward inner primer <400> 3 ggttggatgc ctgcctcggc atacggatag gggatctcag t 41 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward inner primer <400> 4 agcggtcgga agctcctatg acagggtttg atcagctcgg tct 43

Claims (6)

1. 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물.
2. 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 결핵균을 검출하기 위한 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. 시료에서 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;

   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 rpoB 유전자의 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 결핵균을 검출하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 객담, 침 조직, 소변, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 늑막액(pleural fluids), 늑막 생검(pleural biopsies), 또는 기관지 세척액인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 63℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

Images