KR101940674B1 - 신경계 감염병 원인체를 검출하기 위한 조성물 - Google Patents

신경계 감염병 원인체를 검출하기 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

일 양상에 따른 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 의하면, 1회의 검사만으로 동물의 신경계 감염병 원인체들, 특히 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 감염을 구분하여 검출할 수 있으므로, 개 등의 동물에게 뇌수막염 등 신경계 감염병 질병을 일으키는 원인체의 감염을 효율적으로 진단할 수 있다.

Description

신경계 감염병 원인체를 검출하기 위한 조성물{Composition for detecting neurologic pathogens}
동물의 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
개홍역 바이러스(canine distemper virus), 블라스토미세스 더마티티디스(blastomyces dermatitidis), 크립토코커스 네오포르만스(cryptococcus neoformans), 보렐리아 부르그도르페리(borrelia burgdorferi), 네오스포라 칸니눔(neospora caninum), 바르토넬라 종(bartonella spp.), 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis), 톡소플라스마 곤디(toxoplasma gondii), 및 각종 박테리아 등은 개 등의 동물의 신경계에 감염되면 뇌수막염을 유발한다.
뇌수막염은 컴퓨터 단층촬영(CT) 또는 자기공명영상검사(MRI), 또는 임상적 증상으로 진단할 수 있다. 그러나 이러한 방법으로는 어떠한 원인체로 인해 뇌수막염이 발병하였는지는 알 수 없다. 따라서 발병 개체로부터 뇌척수액을 채취하여 어떠한 병원체에 감염되었는지를 확인하여야 하나, 발병 원인체의 종류가 다양하여 개별적으로 원인체를 확인하는 방법에는 한계가 있었다.
일 양상은 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 양상은 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머; 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머; 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5 프라이머; 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제6 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프로브; 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프로브; 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 또는 보렐리아 부르그도르페리의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 프라이머, 제2 프라이머, 및 제1 프로브는 개 홍역 바이러스의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제3 프라이머, 제4 프라이머, 및 제2 프로브는 박테리아의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제5 프라이머, 제6 프라이머 및 제3 프로브는 보렐리아 부르그도르페리의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 따라서 상기 프라이머들은 각각 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리 유전자 서열의 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 각각 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브들은 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머 및 제1 프로브 내지 제3 프로브, 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 PCR에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
상기 제1 프라이머, 제3 프라이머 및 제5 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제2 프라이머, 제4 프라이머 및 제6 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 역방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제5 프라이머 및 제6 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제7 프라이머; 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제8 프라이머; 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제9 프라이머; 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제10 프라이머; 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제11 프라이머; 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제12 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프로브; 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5 프로브; 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제6 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 크립토코커스 종, 에를리히아 카니스, 및 바르토넬라 종의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제7 프라이머, 제8 프라이머, 및 제4 프로브는 크립토코커스 종의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제9 프라이머, 제10 프라이머, 및 제5 프로브는 에를리히아 카니스의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제11 프라이머, 제12 프라이머 및 제6 프로브는 바르토넬라 종의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 따라서 상기 프라이머들은 각각 크립토코커스 종, 에를리히아 카니스, 및 바르토넬라 종 유전자 서열의 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 각각 크립토코커스 종, 에를리히아 카니스, 및 바르토넬라 종의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브들은 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 제7 프라이머 내지 제12 프라이머 및 제4 프로브 내지 제6 프로브, 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 PCR에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
상기 제7 프라이머, 제9 프라이머 및 제11 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제8 프라이머, 제10 프라이머 및 제12 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 역방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제7 프라이머 및 제8 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제9 프라이머 및 제10 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제11 프라이머 및 제12 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제13 프라이머; 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제14 프라이머; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제15 프라이머; 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제16 프라이머; 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제17 프라이머; 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제18 프라이머; 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제19 프라이머; 및 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제20 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제7 프로브; 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제8 프로브; 및 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제9 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제13 프라이머, 제14 프라이머, 및 제7 프로브는 네오스포라 카니눔의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제15 프라이머, 제16 프라이머, 제17 프라이머, 제18 프라이머 및 제8 프로브는 블라스토미세스 데르마티티디스의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제19 프라이머, 제20 프라이머 및 제9 프로브는 톡소플라스마 곤디의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 따라서 상기 프라이머들은 각각 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 유전자 서열의 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 각각 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브들은 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 제13 프라이머 내지 제20 프라이머 및 제7 프로브 내지 제9 프로브, 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 PCR에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
상기 제13 프라이머, 제15 프라이머, 제16 프라이머 및 제19 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제14 프라이머, 제17 프라이머, 제18 프라이머 및 제20 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 역방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제13 프라이머 및 제14 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제15 프라이머 및 제17 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제16 프라이머 및 제18 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제19 프라이머 및 제20 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 상기 제7 프라이머 내지 제12 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 및 상기 제13 프라이머 내지 제20 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 제공한다. 상기 제1 프라이머 세트 내지 제3 프라이머 세트는 서로 섞이지 않도록 구분되어 있는 것일 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브의 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 탈아미노화, 캡화, 천연 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 따라서 상기 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 티민, 구아닌, 및 우라실 이외에도, 이노신(inosine) 등의 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
또한 상기 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 기질을 검출 가능한 물질로 전환할 수 있는 효소, 리포터 및 ?처 FRET 쌍 염료, 또는 이들에 부착된 물질, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 리포터는 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 물질일 수 있으며, 예를 들면 HEX, FAM, JOE, 또는 Cy5를 포함한다. 상기 ?처는 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 물질일 수 있으며, 예를 들면 TAMRA, BHQ1, 또는 BHQ2 등을 포함한다.
상기 프라이머 또는 프로브는 10 내지 35, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 12 내지 25, 12 내지 24, 12 내지 23, 12 내지 22, 12 내지 21, 12 내지 20, 12 내지 19, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 14 내지 25, 14 내지 24, 14 내지 23, 14 내지 22, 14 내지 21, 14 내지 20, 14 내지 19, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 14 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 17, 17 내지 25, 17 내지 23, 또는 17 내지 20 nt의 길이를 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 존재를 동시에 검출하기 위한 조성물을 제공한다. 또한 다른 양상은 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 상기 제7 프라이머 내지 제12 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 및 상기 제13 프라이머 내지 제20 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 포함하는, 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 존재를 동시에 검출하고, 동물의 신경계 감염병 원인체를 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)과 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 직장 스왑 (swab) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 의료기기와 같은 무생물의 표면으로부터 채취된 것일 수 있다. 상기 시료는 이미 개체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 방법은 생체 외 또는 인 비트로 방법일 수 있다.
상기 조성물은 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소들을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 상기 프라이머 세트 외에도, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 검출 가능한 표지 물질 및 표지 물질의 검출에 필요한 시약을 포함하거나, 뉴클레오티드를 염색하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 각각의 농도는 0.1 내지 0.8 μM, 0.2 내지 0.7 μM, 0.3 내지 0.6 μM, 0.3 내지 0.5 μM, 0.35 내지 0.45 μM, 0.38 내지 0.42 μM, 또는 약 4 μM일 수 있다.
상기 프로브 각각의 농도는 0.1 내지 0.3 μM, 0.15 내지 0.25 μM, 0.18 내지 0.22 μM, 또는 약 0.2 μM일 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트 또는 조성물을 포함하는, 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 감염을 동시에 진단하기 위한 키트를 제공한다. 또한 다른 양상은 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 상기 제7 프라이머 내지 제12 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 및 상기 제13 프라이머 내지 제20 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 포함하는, 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 존재를 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는, 예를 들면 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 또는 톡소플라스마 곤디의 표적 서열을 검출할 수 있는 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기한 프라이머 세트 또는 조성물을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상술한 프라이머 세트 또는 그와 상보적인 서열, 또는 그에 대응되는 핵산 서열이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 또는 상술한 프로브, 결합 물질 또는 표지 물질이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 고정상을 2개 이상 포함할 수 있다. 상기 고정상에 부착된 물질에 따라, 상기 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정상에 상기 표지 물질이 부착되어 있는 경우, 상기 결합 물질이 부착된 상기 증폭된 표적 서열은 상기 고정상에 부착될 수 있고, 또한 상기 고정상에 상기 프로브가 부착된 경우, 상기 프로브에 상보적인 서열을 갖는 상기 증폭된 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다.
상기 키트는 표적 핵산의 PCR에 의한 증폭과 그 증폭 산물을 라인 블롯팅에 의하여 검출하기 위한 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "라인 블롯팅 (line blotting)"이란 올리고뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브가 평행선 (밴드 모양)으로 공유적으로 부착되어 있는 막에서 표적 핵산과 프로브의 혼성화를 수행하고, 그 혼성화 산물을 검출하는 것을 포함한다. 상기 검출은 프로브에 부착된 검출 가능한 표지 물질에 의하는 것일 수 있다. 표적 핵산의 구분은 각 프로브의 밴드(band)의 위치에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 세트를 준비하는 단계; 상기 제1 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 시료에 접촉시켜 시료 중 포함된 표적 핵산과 상기 프라이머의 혼성화 산물을 얻는 단계; 상기 혼성화 산물의 프라이머들을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 단계; 및 상기 증폭 산물의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 감염을 동시에 확인하는 방법을 제공한다. 또한 다른 양상은 제1 프라이머 세트 내지 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 준비하는 단계; 상기 제1 프라이머 세트 내지 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 개체로부터 분리된 시료에 접촉시켜 시료 중 포함된 표적 핵산과 상기 프라이머의 혼성화 산물을 얻는 단계; 상기 혼성화 산물의 프라이머들을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 단계; 및 상기 증폭 산물의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 감염을 동시에 확인하는 방법을 제공한다.
상기 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR)일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "PCR"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환 (thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 PCR 키트를 이용할 수도 있다. PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다. 또한 다중 PCR에서 어느 한 표적 서열의 증폭에 이용되는 프라이머는 그 표적 서열의 증폭에만 이용되는 것이 아니라, 의도적으로 다중 PCR 중의 어느 다른 표적 서열의 증폭에 중복적으로 이용되는 것일 수 있다.
상기 확인하는 단계는 상기 증폭 산물에 특이적인 프로브를 접촉시키고, 상기 증폭 산물과 결합하는 상기 프로브들로부터 검출되는 신호를 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 신호를 얻는 단계는 상기 프로브의 양 말단에 리포터와 ?처가 각각 표지되어 있고 프로브의 3차 구조상 리포터의 발색이 ?처로 인해 억제되어 있다가, 프로브가 증폭 산물에 결합하여 리포터와 ?처의 거리가 멀어지거나, 또는 폴리머레이즈 등의 효소에 의해 프로브 핵산 서열이 분해되어, ?처로부터 유리된 리포터 물질이 형광을 나타내고, 이를 검출하는 것일 수 있다.
상기 확인하는 단계는 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 개 홍역 바이러스가 존재하는 것을 나타내고, 상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 박테리아가 존재하는 것을 나타내고, 상기 제5 프라이머 및 제6 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 보렐리아 부르그도르페리가 존재하는 것을 나타내고, 상기 제7 프라이머 및 제8 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 크립토코커스 종이 존재하는 것을 나타내고, 상기 제9 프라이머 및 제10 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 에를리히아 카니스가 존재하는 것을 나타내고, 상기 제11 프라이머 및 제12 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 바르토넬라 종이 존재하는 것을 나타내고, 상기 제13 프라이머 및 제14 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 네오스포라 카니눔이 존재하는 것을 나타내고, 상기 제15 프라이머 및 제17 프라이머쌍, 또는 제16 프라이머 및 제 18 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 블라스토미세스 데르마티티디스가 존재하는 것을 나타내고, 상기 제19 프라이머 및 제20 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 톡소플라스마 곤디가 존재하는 것을 나타내는 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 신경계 감염병 원인체들을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 의하면, 1회의 검사만으로 동물의 신경계 감염병 원인체들, 특히 개 홍역 바이러스, 박테리아, 보렐리아 부르그도르페리, 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 바르토넬라 종, 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디의 감염을 구분하여 검출할 수 있으므로, 개 등의 동물에게 뇌수막염 등 신경계 감염병 질병을 일으키는 원인체의 감염을 효율적으로 진단할 수 있다.
도 1은 CDV, 박테리아 및 B.부르그도르페리 검출을 위한 프라이머 및 프로브가 포함된 패널의 검출 반응 효율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스, 및 바르토넬라 종 검출을 위한 프라이머 및 프로브가 포함된 패널의 검출 반응 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 네오스포라 카니눔, 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디 검출을 위한 프라이머 및 프로브가 포함된 패널의 검출 반응 효율을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 및 프로브 설계
(1) CDV , 박테리아 및 B. 부르그도르페리 검출을 위한 프라이머 및 프로브
개 홍역 바이러스(Canine distemper virus: CDV), 박테리아 감염, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)를 동시에 진단하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 설계하였다.
설계 기준으로서, 프라이머와 프로브의 멜팅 온도가 10℃ 이상 차이나고, 프라이머와 프로브의 GC 함량이 40-60% 정도이며, 프라이머와 프로브들이 서로 다이머를 형성할 가능성이 없거나, 형성하더라도 ΔG 값이 -9 kcal/mol보다 높도록 하였다. 이와 같이 설계한 프라이머 및 프로브는 하기 표 1과 같다.
ID 서열 (5'-> 3')
CDV F (서열번호 1) AGCTAGTTTCATCTTAACTATCAAATT
CDV R (서열번호 2) TTAACTCTCCAGAAAACTCATGC
CDV probe (서열번호 3) ACCCAAGAGCCGGATACATAGTTTCAATGC
Uni bact F (서열번호 4) TCCTACGGGAGGCAGCAGT
Uni bact R (서열번호 5) GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT
Uni bact probe (서열번호 6) CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC
Borrelia F(Bb23Sr)(서열번호 7) CGAGTCTTAAAAGGGCGATTTAGT
Borrelia R(Bb23Sr)(서열번호 8) GCTTCAGCCTGGCCATAAATAG
Borrelia probe(Bb23Sr)(서열번호 9) AGATGTGGTAGACCCGAAGCCGAGTG
CDV 프로브는 리포터(reporter) FAM, ?처(qeuncher) BHQ2로 라벨링하고, 박테리아 통합 프로브(Uni bact probe)는 HEX-BHQ1, 및 보렐리아 프로브는 Cy5-BHQ1로 라벨링하였다. 이와 같이 3개 프로브를 서로 다른 리포터로 표지함으로써, 반응의 민감도를 유지하면서 하나의 PCR 튜브에서 동시에 3가지 결과를 관찰할 수 있었다. 또한 무형광 ?처 BHQ1, BHQ2를 이용하여 프로브의 제작 비용을 줄일 수 있었다.
박테리아 검출을 위한 프라이머 및 프로브는 세균의 공통 유전자(universal gene)인 16s rRNA 유전자를 표적으로 하는 것으로, 세균의 종과 관련 없이 세균 자체가 존재하는지 여부를 검출할 수 있으며, 다른 프라이머 및 프로브에 영향을 미치지 않는 것으로 선별하였다.
CDV는 RNA 바이러스로, 역전사(reverse transcription) 과정 후 PCR을 진행해야 하는 반면, 다른 두가지(uni bact, borrelia)는 DNA를 갖는 세균으로, 역전사 과정이 필요 없는 것이므로, CDV는 본래 역전사가 필요 없는 다른 항목과 복합검사로 수행할 수 없었다. 본 실시예에서는 CDV, 박테리아, 및 보렐리아의 복합 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 동시에 넣은 후, 역전사 과정을 거치고 세 가지를 한번에 검사하도록 하였다. 이 때 박테리아와 보렐리아의 반응 효율이 불필요한 역전사 과정 동안 고온 가열로 인해 떨어질 수 있는데, 본 실시예에서는 프라이머, 프로브의 농도비율을 일괄적으로 조정하여 반응 효율과 검출한계가 유지되도록 하였다. 또한 CDV를 검출하기 위한 기존의 프라이머 쌍은 본래 48도의 반응온도(annealing temperature)로 설계되었으나, 반응온도가 60℃인 박테리아 및 보렐리아 프라이머 쌍과의 복합 단회 검사를 위해 반응온도를 60도로 설정하였다. 모든 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.4 μM 및 0.2 μM로 변경하였다(기존: CDV 0.6 μM 및 0.4 μM, 박테리아 0.1 μM 및 0.1 μM, 및 보렐리아 0.9 μM 및 0.125 μM).
(2) 크립토코쿠스 종, 에를리히아 카니스 , 및 바르토넬라 종 검출을 위한 프라이머 및 프로브
크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis), 및 바르토넬라 종(Bartonella spp.)을 동시에 진단하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 설계하였다.
설계 기준으로서, 프라이머와 프로브의 멜팅 온도가 10℃ 이상 차이나고, 프라이머와 프로브의 GC 함량이 40-60% 정도이며, 프라이머와 프로브들이 서로 다이머를 형성할 가능성이 없거나, 형성하더라도 ΔG 값이 -9 kcal/mol보다 높도록 하였다. 이와 같이 설계한 프라이머 및 프로브는 하기 표 2와 같다.
ID 서열 (5'-> 3')
Cryptococcus F (CneoFwd)(서열번호 10) GCCGCGACCTGCAAAG
Cryptococcus R (CneoRev)(서열번호 11) GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT
Cryptococcus probe (CneoProbe)(서열번호 12) ACGTCGGCTCGCC
E. canis F (dsb312)(서열번호 13) TTGCAAAATGATGTCTGAAGATATGAAACA
E. canis R (dsb671)(서열번호 14) GCTGCAGGACCGATAAATGTATCCCCTA
E. canis probe (dsb-p)(서열번호 15) AGCTAGTGCTGCTTGGGCAACTTTGAGTGAA
Bartonella F (ssrA-f)(서열번호 16) GCTATGGTAATAAATGGACAATGAAATAA
Bartonella R (ssrA-r)(서열번호 17) GCTTCTGTTGCCAGGTG
Bartonella probe (ssrA-p)(서열번호 18) ACCCCGCTTAAACCTGCGACG
크립토코쿠스 프로브는 FAM-MGB, E. 카니스 프로브는 HEX-BHQ1, 및 보렐리아 프로브는 Cy5-BHQ1로 라벨링하였다.
세 가지 병원체의 동시 검사를 위해 프라이머 및 프로브가 다양하게 포함되는데, 세 항목을 개별검사하는 경우와 동일한 반응효율과 검출한계를 유지하도록 프라이머와 프로브의 농도비율을 각각 0.4 μM 및 0.2 μM로 일괄 조정하였다 (기존: 크립토코쿠스 0.9 μM 및 0.25 μM, E. 카니스 0.2 μM 및 25 μM, 및 바르토넬라 0.5 μM 및 0.5 μM).
(3) 네오스포라 카니눔 , 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디 검출을 위한 프라이머 및 프로브
네오스포라 카니눔(Neospora caninum ), 블라스토미세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis) 및 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)를 동시에 진단하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 설계하였다.
설계 기준으로서, 프라이머와 프로브의 멜팅 온도가 10℃ 이상 차이나고, 프라이머와 프로브의 GC 함량이 40-60% 정도이며, 프라이머와 프로브들이 서로 다이머를 형성할 가능성이 없거나, 형성하더라도 ΔG 값이 -9 kcal/mol보다 높도록 하였다. 이와 같이 설계한 프라이머 및 프로브는 하기 표 3과 같다.
ID 서열 (5'-> 3')
Neospora F (NC5-550)(서열번호 19) GGGTGAACCGAGGGAGTTG
Neospora R (NC5-596)(서열번호 20) ACGTGAGGAATGACTAACCACAA
Neospora probe (NC5-p)(서열번호 21) AGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGG
Blastomyces F (V1741)(서열번호 22) TGTGCTGCTGCACCTTGATT
Blastomyces F (V1983)(서열번호 23) CTGTACCTTGTACCTTGATT
Blastomyces R (V1742)(서열번호 24) CAACTTGGATAATGCGTGAATACAATA
Blastomyces R (V1984)(서열번호 25) CAACTTGGATAATGCGTGAATAACATA
Blastomyces probe (V1743)(서열번호 26) ATTCAAGACAACAGAGCCCAGGCGAAAT
Toxoplasma F (toxo-f)(서열번호 27) TCCCCTCTGCTGGCGAAAAGT
Toxoplasma R (toxo-r)(서열번호 28) AGCGTTCGTGGTCAACTATCGATTG
Toxoplasma probe (toxo-p)(서열번호 29) TCTGTGCAACTTTGGTGTATTCGCAG
네오스포라 프로브는 FAM-BHQ1, 블라스토미세스 프로브는 HEX-BHQ1, 및 톡소플라스마 프로브는 Cy5-BHQ1로 라벨링하였다.
네오스포라의 반응온도를 58℃에서 60℃로 변경하고, 동시에 반응효율과 검출한계가 유지되도록 모든 프라이머 및 프로브의 농도를 각각 0.4 μM 및 0.2 μM로 조정하였다 (기존: 네오스포라 50 μM 및 50 μM, E. 카니스 1 μM 및 0.25 μM, 및 바르토넬라 5 μM 및 2 μM).
실시예 2. 패널 디자인
아래 표 4와 같이 패널을 디자인 하였다.
패널 1(RNA) 염료 패널2(DNA) 염료 패널3(DNA) 염료
CDV FAM 바르토넬라 종 Cy5 네오스포라 카니눔 FAM
박테리아 통합 HEX E.카니스 HEX 블라스토미세스 데르마티티디스 HEX
보렐리아 Cy5 크립토코쿠스 네오포르만스/가티 FAM 톡소플라스마 곤디 Cy5
IC NED IC NED IC NED
기준(reference) ROX 기준 ROX 기준 ROX
IC(내부 대조군)은 아래 표 5와 같이 개 GAPDH 유전자 특이적인 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 이용하였다. 염료 조합은 FAM-HEX-Cy5-NED-ROX, PCR 기기는 ABI 7500 (5채널, Life technologies)을 이용하였다.
ID 서열(5'-> 3')
GAPDH F (GAP-F)(서열번호 30) TCAACGGATTTGGCCGTATTGG
GAPDH R (GAP-R)(서열번호 31) TGAAGGGGTCATTGATGGCG
GAPDH probe (GAP-p)(서열번호 32) CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGCAAAGTGGA
GAPDH 프로브는 NED-BHQ1로 라벨링하였다.
실험예 1. 분석적 민감도 검사
표적 서열들에 대한 단일 검사(singleplex) 및 다중 검사(multiplex)로 상기 실시예에서 확립된 프라이머 및 프로브 세트에 대해 검출 한계(LOD) 평가, 재현성 평가를 실시하여 비교 대조하고, 반응의 선형성(linearity), 및 반응 효율(reaction efficiency) 평가를 수행하였다. 구체적으로는 아래와 같다.
표적 서열을 포함하도록 제작한 pAUC 벡터를 8회 10배 희석하였다. 프라이머 농도는 0.4 μM로 고정하였다. 프로브 농도는 각각의 9종 서열을 포함한 벡터를 이용하여 0.2 μM 또는 0.4 μM에서 각각 반응시킨 후 효율을 비교하였다. 이후, 프로브 농도 0.2 μM로 실험을 진행하였다.
5채널의 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System을 이용하여 제조사의 지시에 따라 PCR을 수행하였고, 모든 실험은 3회 반복평가하였다. 양성 대조군으로는 알려진 복제 수의 각 표적에 대한 재조합 벡터를 이용하였다.
RNA 표적에는 AgPath Multiplex one-step RT-PCR kit (with ROX)(Ambion), DNA 표적에는 Qiagen Multiplex PCR kit (with ROX)(Qiagen)를 사용하였으며, 패널 1은 RNA 및 DNA 표적이 모두 있으므로 두 개의 시약 모두로 테스트하여 효율 차이가 있는지 확인하였다. PCR 마스터 믹스 및 반응 조건은 아래 표들과 같다.
CDV , 박테리아 및 B. 부르그도르페리 검출을 위한 마스터 믹스
시약 반응당 μL
Ambion® 2X Multiplex RT-PCR Buffer 12.5
Ambion® 20X Multiplex Enzyme Mix 2.5
CDV mix (FAM) 1
Universal bacteria mix (HEX) 1
B. burgdorferi mix (Cy5) 1
Internal control mix (NED) 1
Internal control template 1
Total 20
CDV , 박테리아 및 B. 부르그도르페리 검출을 위한 PCR 조건
Cycles Temperature Time (MM:SS)
1 cycle 45 10:00
1 cycle 95 10:00
40 cycles 95
60		 0:15
1:00
바르토넬라 종, 에를리히아 카니스 , 및 크립토코쿠스 종 검출을 위한 마스터 믹스
시약 반응당 μL
QuantiTect 2X master mix 12.5
Cryptococcus mix (FAM) 1
E. canis mix (HEX) 1
Bartonella mix (Cy5) 1
Internal control mix (NED) 1
Internal control template 1
Water 0.5
Total 18
바르토넬라 종, 에를리히아 카니스 , 및 크립토코쿠스 종 검출을 위한 PCR 조건
Cycles Temperature Time (MM:SS)
1 cycle 95 15:00
40 cycles 95
60		 0:15
1:30
네오스포라 카니눔 , 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디 검출을 위한 마스터 믹스
시약 반응당 μL
QuantiTect 2X master mix 12.5
N. caninum mix (FAM) 1
B. dermatitidis mix (HEX) 1
T. gondii mix (Cy5) 1
Internal control mix (NED) 1
Internal control template 1
Water 0.5
Total 18
네오스포라 카니눔 , 블라스토미세스 데르마티티디스 및 톡소플라스마 곤디 검출을 위한 PCR 조건
Cycles Temperature Time (MM:SS)
1 cycle 95℃ 15:00
40 cycles 95℃
60℃		 0:15
1:30
(1) 검출 한계( LOD ) 확인
LOD 확인 결과는 아래 표 12과 같다. 바르토넬라, 블라스토미세스 및 톡소플라스마의 경우 다중 분석의 경우 LOD가 10배 증가한 것을 확인하였다.
LOD ( molecules / μl )
표적 단일( singleplex ) 다중( multiplex )
CDV 3.80E+00 (34) 3.80E+00 (34)
보렐리아 3.80E+00 (34) 3.80E+00 (34)
바르토넬라 3.70E+00 (34) 3.70E+01 (33)
E.카니스 3.70E+02 (33) 3.70E+02 (34)
크립토코쿠스 3.70E+00 (34) 3.70E+00 (32)
블라스토미세스 6.60E+00 (34) 6.60E+01 (34)
네오스포라 3.80E+01 (34) 3.80E+01 (34)
톡소플라스마 3.70E+00 (33) 3.70E+01 (33)
박테리아 통합 6.60E+00 (34) 6.60E+00 (34)
패널 1의 보렐리아, 박테리아 통합의 경우 RNA 분석 키트로 평가한 것이나, DNA 분석 키트로 별도 LOD 평가한 결과 키트와 상관없이 LOD는 동일한 것으로 확인되었다.
(2) 재현성 확인
재현성 확인 결과는 아래 표 13과 같다.
다중 분석의 결정 계수(coefficient of determination, R2)
표적 R 2 value
CDV 0.9857806392
박테리아 통합 0.9993510651
B. 부르그도르페리 0.9912233212
바르토넬라 종 0.9840134387
E. 카니스 0.9956410773
크립토코쿠스 종 0.9949608742
B. 데르마티티디스 0.984157434
N. 카니눔 0.9939068486
T. 곤디 0.988836138
허용 수준(acceptable level)은 > 0.98이다.
(3) 반응 효율 확인
결과는 도 1 내지 도 3, 및 아래 표 14와 같다.
표적 Slope Exponent Efficiency Amplification
CDV -3.27 0.306 102.2% 2.022
박테리아 통합 -3.55 0.282 91.3% 1.913
B. 부르그도르페리 -3.57 0.28 90.6% 1.906
바르토넬라 종 -3.49 0.287 93.4% 1.934
E. 카니스 -3.57 0.28 90.6% 1.906
크립토코쿠스 종 -3.42 0.292 96.1% 1.961
B. 데르마티티디스 -3.46 0.289 94.5% 1.945
N. 카니눔 -3.38 0.296 97.6% 1.976
T. 곤디 -3.57 0.271 90.6% 1.906
기울기의 허용 수준은 -3.10 내지 -3.60, 효율의 허용 수준은 90 내지 110%이다. 전체적으로 양호한 수준으로 나타났다.
다중 분석으로 짝지어진 병원체(pathogen) 3종과 내부 대조군 1개의 반응 평가 결과, 특정 염료의 신호 증가에 따른 유사파장 신호의 간섭은 없는 것으로 확인되었다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for detecting neurodegenerative disease <130> pn117424 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDV primer <400> 1 agctagtttc atcttaacta tcaaatt 27 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDV primer <400> 2 ttaactctcc agaaaactca tgc 23 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDV probe <400> 3 acccaagagc cggatacata gtttcaatgc 30 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uni bacteria primer <400> 4 tcctacggga ggcagcagt 19 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uni bacteria primer <400> 5 ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uni bacteria probe <400> 6 cgtattaccg cggctgctgg cac 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> borrelia primer <400> 7 cgagtcttaa aagggcgatt tagt 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> borrelia primer <400> 8 gcttcagcct ggccataaat ag 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> borrelia probe <400> 9 agatgtggta gacccgaagc cgagtg 26 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cryptococcus primer <400> 10 gccgcgacct gcaaag 16 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cryptococcus primer <400> 11 ggtaatcacc ttcccactaa cacat 25 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cryptococcus probe <400> 12 acgtcggctc gcc 13 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.canis primer <400> 13 ttgcaaaatg atgtctgaag atatgaaaca 30 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.canis primer <400> 14 gctgcaggac cgataaatgt atccccta 28 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E.canis probe <400> 15 agctagtgct gcttgggcaa ctttgagtga a 31 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bartonella primer <400> 16 gctatggtaa taaatggaca atgaaataa 29 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bartonella primer <400> 17 gcttctgttg ccaggtg 17 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bartonella probe <400> 18 accccgctta aacctgcgac g 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neospora primer <400> 19 gggtgaaccg agggagttg 19 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neospora primer <400> 20 acgtgaggaa tgactaacca caa 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neospora probe <400> 21 agcggtgaga ggtgggatac gtgg 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blastomyces primer <400> 22 tgtgctgctg caccttgatt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blastomyces primer <400> 23 ctgtaccttg taccttgatt 20 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blastomyces primer <400> 24 caacttggat aatgcgtgaa tacaata 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blastomyces primer <400> 25 caacttggat aatgcgtgaa taacata 27 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blastomyces probe <400> 26 attcaagaca acagagccca ggcgaaat 28 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> toxoplasma primer <400> 27 tcccctctgc tggcgaaaag t 21 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> toxoplasma primer <400> 28 agcgttcgtg gtcaactatc gattg 25 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> toxoplasma probe <400> 29 tctgtgcaac tttggtgtat tcgcag 26

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머;
    서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머;
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머;
    서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5 프라이머; 및
    서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제6 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프로브;
    서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프로브; 및
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프로브를 더 포함하는 프라이머 세트.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 제1 프로브 내지 제3 프로브는 서로 다른 염료로 표지된 것인 프라이머 세트.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 제1 프로브 내지 제3 프로브는 FAM, HEX, 및 Cy5 중 선택된 서로 다른 염료로 표지된 것인 프라이머 세트.
  5. 청구항 1에 있어서, 개 홍역 바이러스(canine distemper virus), 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리(borrelia burgdorferi)의 감염을 동시에 진단하기 위한 것인 프라이머 세트.
  6. 청구항 2의 프라이머 세트를 포함하는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 감염을 동시에 진단하기 위한 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제1 프라이머 내지 제6 프라이머의 농도는 각각 0.3 내지 0.5 μM이고, 상기 제1 프로브 내지 제3 프로브의 농도는 각각 0.1 내지 0.3 μM인 조성물.
  8. 청구항 7의 조성물을 포함하는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 감염을 동시에 진단하기 위한 키트.
  9. 청구항 1의 프라이머 세트를 준비하는 단계;
    상기 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 시료에 접촉시켜 시료 중 포함된 표적 핵산과 상기 프라이머의 혼성화 산물을 얻는 단계;
    상기 혼성화 산물의 프라이머들을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 단계로서, 상기 연장시키는 단계는 역전사 과정을 수행하는 것을 포함하는 것인 단계; 및
    상기 증폭 산물의 존재를 확인하는 단계로서, 상기 확인하는 단계는 상기 증폭 산물에 청구항 2의 제1 프로브 내지 제3 프로브를 접촉시키고, 상기 증폭 산물과 결합하는 상기 프로브들로부터 검출되는 신호를 얻는 단계를 포함하는 개 홍역 바이러스, 박테리아, 및 보렐리아 부르그도르페리의 감염을 동시에 확인하는 방법.
  10. 삭제
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 개 홍역 바이러스가 존재하는 것을 나타내고,
    상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 박테리아가 존재하는 것을 나타내고,
    상기 제5 프라이머 및 제6 프라이머쌍의 증폭 산물이 존재하는 경우 시료 중에 보렐리아 부르그도르페리가 존재하는 것을 나타내는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  13. 삭제
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