JP4599346B2 - ヒト型結核菌の特異的検出のための方法およびキット - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト型結核菌といわゆる結核菌群の他のメンバー、すなわち、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ウシ型結核菌））、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ（弱毒化ウシ型結核菌）、マイコバクテリウム・アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ（アフリカ型結核菌））およびマイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ（ネズミ型結核菌））との識別が特に達成される、生物試料中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌））の特異的検出のための方法および手段に関する。
現在、全世界で約２０億人が結核の病原体であるヒト型結核菌に感染したことがあり、毎年８００万人が結核で倒れている。結核に罹患している人々のうち、毎年３００万人が死亡する。このため、結核は現在、非常に高頻度で死亡に繋がる細菌感染症である。結核の深刻さのため、特に人口に蔓延することを可能な限り速やかに防ぐために、結核は大部分の先進工業国で診断直後の届出義務がある。最近の数年間に、結核の発生の増加が発展途上国でおよび先進国での両方で観察されており、結核による死亡例が、特に免疫抑制ＨＩＶ患者の例で、常に記録されている。しかし、世界人口の大部分への一般的危険のためばかりでなく、その一方での病院の内外における多剤耐性菌株（ＭＤＲＴＢ）の流行型発生のためにも、ヒト型結核菌の検出のための迅速なおよび明確な診断が必要とされている。
ヒトでは、結核は全世界でヒト結核病原体マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌））によって事実上単独で引き起こされる。これから下記を区別する必要がある：ウシ結核の病原体であるマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ウシ型結核菌））、ウシ型結核菌の弱毒化株であって結核に対する免疫に用いられるマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）（弱毒化ウシ型結核菌）、マイコバクテリウム・アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ（アフリカ型結核菌））およびマイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ（ネズミ型結核菌））。それらの近縁関係の結果として、上述の種のすべてはいわゆる結核菌群にまとめられている。これから、いわゆる非結核性抗酸菌を区別する必要がある。現在、これらの約１００の異なる種があり、そのうち少なくとも３０種は、唾液、糞便、尿などといったヒト材料中に存在し、および一部の場合にはまた感染および／または疾患へ繋がる能力がある。抗酸菌診断の分野における現在の試みの目的は、したがって、可能な最短時間以内に感染初期段階で抗酸菌感染を識別することを可能にする抗酸菌検査の供給だけでなく、また、結核菌群のメンバーを特異的に同定すること、および同時にヒト型結核菌と結核菌群の他のメンバーとを識別することでもある。
結核菌群のメンバーの同定、およびヒト型結核菌と結核菌群の他のメンバーとの識別は、抗酸菌の硝酸還元酵素活性およびナイアシン蓄積を検査することによって通常は達成できる（たとえばメチョック（Ｍｅｔｃｈｏｃｋ）Ｂ．Ｇ．らの『臨床微生物学の手引き』（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．）ＡＳＭプレス社（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）、１９９９：３９９−４３７）。この点で、ヒト型結核菌は、結核菌群の他のメンバーと比較して、硝酸還元酵素活性の上昇によって特徴づけられる。硝酸還元酵素検査を実施するためには、しかし、臨床材料から単離された抗酸菌株、したがって特に結核性病原体株の、検査室での培養が何よりも必要であり、これは通常は高感染性病原体の培養のために特別の設備を有する検査室でのみ可能であり、および、病原体の増殖の遅さのため、数週間かかる。日常の臨床診断においてそのような検査が利用できることは、したがって検査室の技術および財政に関して、高額支出を伴う。
現在までの既存のすべての検出方法は、不十分でおよびしたがって改善を要すると考えられている。その単純な応用の結果として、およびそれによって唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、骨髄、血液といった臨床材料中にまたは生検中に結核菌群のメンバーを特異的に検出できることおよび同時にヒト型結核菌を結核菌群の他のメンバーから識別できることで際立っている、日常の臨床使用に適した方法は、今までのところ最新技術から知られていない。
たとえば気温調節系を備えおよびしたがって従来のＰＣＲと比較して顕著に低い移行時間を示すリアルタイムＰＣＲ（「高速サイクルＰＣＲ」）の使用は、たとえば、抗酸菌の単離された遺伝物質の増幅による抗酸菌の検出までの時間の相当な短縮に繋がることが知られている（チェーピン（Ｃｈａｐｉｎ）およびローダーデール（Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）３５：２１５７−２１５９）。加えて、蛍光定量測定は、特に高速サイクルＰＣＲの枠組内で、色素標識化ハイブリダイゼーションプローブを用いる場合、増幅された遺伝子断片の検出のための迅速および高感度な方法となる。これまではしかし、それによって結核菌群のメンバーが特異的に検出され、および、同時にヒト型結核菌が結核菌群の他のメンバーから識別される、（リアルタイム）ＰＣＲ検査を提供することは不可能であった。
こうした背景のもと、結核菌群のメンバーの特に迅速なおよび同時に特異的な検出を可能にする方法であって、およびそれによって同時にヒト型結核菌を結核菌群の他のメンバーから識別することが可能になる、特に改良された方法および手段を提供することが本発明の目的である。
本発明によると、その目的は、請求項１から１１に記載の方法、請求項１２〜１７に記載のプライマーおよびプライマー対、請求項１９から２８に記載のハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションプローブ対によって、請求項１８および２９に記載の使用によって、および特に請求項３０から３５に記載のキットによっておよび／または５１の請求項３６の対象によって達成される。
本発明は特に、核酸増幅方法が、配列ＩＤ番号：１に示される、その配列がｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの領域に由来する断片を含み、そのＤＮＡ断片がｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含む配列に由来するＤＮＡ断片を増幅するのに適したプライマーを用いて実施される方法であり、およびその場合に、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に、ヒト型結核菌に特異的な多型が検出される、生物試料中のヒト型結核菌の特異的検出のための方法に関する。
ＮａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンは、本発明によると、調節配列を含み、特にそのプロモーターを含む、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素をコードする核酸配列を意味すると理解すべきである。ヒト型結核菌に特異的な多型とは、結核菌群の他のメンバー、すなわち弱毒化ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌およびネズミ型結核菌の核酸配列と比較して特異的である、個々のヌクレオチド交換（Ｔ−＞Ｃ）、すなわちＳＮＰ（一塩基多型）である。
本発明の一実施形態によると、微生物ＤＮＡは、最初の段階で、好ましくは臨床材料を含む試料から抽出され、および、続く段階で、抗酸菌の硝酸還元酵素オペロン、すなわち硝酸還元酵素をコードするｎａｒＧＨＪＩオペロンの少なくとも１つのＤＮＡ断片が、抽出されたＤＮＡから増幅され、その増幅されたＤＮＡ断片（または増幅されたＤＮＡ断片のうちの１つ（いくつかの抗酸菌株の代表が生物試料中に存在するならば））は、ヒト結核菌に特異的な少なくとも１つのＤＮＡ多型を示す標的領域（標的配列）を含む。
さらなる段階では、少なくとも１つの増幅されたＤＮＡ断片の特異的ハイブリダイゼーションが、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、すなわちオリゴヌクレオチドを用いて検出され、そのハイブリダイゼーションプローブは好ましくは配列ＩＤ番号：５で表されるヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号：５に対する相補配列、配列ＩＤ番号：６で表されるヌクレオチド配列、および配列ＩＤ番号：６に対する相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、結核菌群の他のメンバー、すなわち上記のウシ型結核菌、ＢＣＧ、アフリカ型結核菌およびネズミ型結核菌に対するヒト型結核菌の特異的検出は、ｎａｒＧＨＪＩオペロンの増幅されたＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションプローブの特異的ハイブリダイゼーションの融解温度の分析によって、すなわち融解曲線分析によって行われる。具体的な一実施形態によると、１または複数のプローブが、１または複数の上述のヌクレオチド配列を示す。具体的な一実施形態によると、上述のハイブリダイゼーションプローブは配列ＩＤ番号：４に記載のアンカープローブまたはそれと相補的なヌクレオチド配列と組み合わされている。
本発明によると、ｎａｒＧＨＪＩオペロンの少なくとも１つのヒト型結核菌特異的ＤＮＡ多型は、好ましくはｎａｒＧＨＪＩオペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に、すなわち以後ｎａｒＧＨＪＩプロモーターと称するプロモーター領域に位置する。この多型（結核菌群の他のメンバーの場合のＣと比較してＴ）をｎａｒＧＨＪＩプロモーター中に示す、突然変異によって生じたヒト型結核菌の種類は、これが−２１５位に位置せずｎａｒＧＨＪＩオペロンの翻訳開始コドンＧＴＧに関して異なる位置であっても含まれる。
驚いたことに、ｎａｒＧＨＪＩオペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において２１５番目のヌクレオチドの代わりに、すなわちｎａｒＧＨＪＩプロモーターの−２１５位にて、結核菌群の他のメンバー（特にアフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌（図１を参照のこと）の場合にはシトシン塩基が存在する一方、ヒト型結核菌の場合にはチミン塩基が見出されることが本発明の枠組内で見出されている。この一塩基多型はヒト型結核菌に特異的であり、および、とりわけ、全世界の１００を超えるヒト型結核菌株についての比較調査によって確認された通り、安定である。さらに、予想外なことに、この一塩基多型が、結核菌群の他のメンバーと比較したヒト型結核菌の硝酸還元酵素検査における異なる反応の原因であることが見出されている（例４を参照のこと）。
本発明によると、少なくとも１つのプライマー、特に少なくとも１つのプライマー対が、好ましくはｎａｒＧＨＪＩオペロンのＤＮＡ断片の増幅に用いられ、そのプライマーは、配列ＩＤ番号：２で示されるヌクレオチド配列および／または配列ＩＤ番号：３で示されるヌクレオチド配列を含み、すなわちそれらから構成され、特に、しかし、それらから成り、すなわち示す。好ましくは、本発明によると、増幅されたＤＮＡ断片の特異的ハイブリダイゼーションに好ましくは用いられる、その標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つの対は、配列ＩＤ番号：４でおよび配列ＩＤ番号：５で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列対、配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：５の相補配列の対、配列ＩＤ番号：４でおよび配列ＩＤ番号：６で示されるヌクレオチド配列、ならびに配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：６の相補配列の対の群から選択されるヌクレオチド配列を含み、特にそれらから成る。
ヒト型結核菌の種類の病原体株、すなわち特にヒト型結核菌Ｈ３７ｖ（ＡＴＣＣ２５６１８）およびヒト型結核菌エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）（ＡＴＣＣ３５８０１）の株および他の臨床株による結核性感染の明確な検出は、本発明によると、好ましくは配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列または相補配列の対を有する標識化ハイブリダイゼーションプローブ対の、ヒト型結核菌に特異的なｎａｒＧＨＪＩプロモーター領域との、特異的ハイブリダイゼーションの融解温度の分析によって行われる。この点では、ヒト型結核菌は、特に６１℃未満、好ましくは５９℃未満の、特に好ましくは約５７℃未満の融解温度によって際立っている。比較して、ヒト型結核菌と識別すべき、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌の抗酸菌種の病原体株は、標識化ハイブリダイゼーションプローブ対配列ＩＤ番号：４／配列ＩＤ番号：５が用いられる場合、特に、５９℃を超える、好ましくは６１℃を超える、特に好ましくは６３℃を超える融解温度を有する。
たとえば緩衝液組成、標識化プローブとしてまたはプローブのヌクレオチド配列の改変によるプローブの設計についての、実際に一般的なハイブリダイゼーション条件に応じて、絶対融解温度の（通常はわずかな）変化が起こる可能性がある；明らかに、そのような融解温度の変化が生じうる場合のすべての方法は、ここに示す本発明に記載の方法の好ましい実施形態に相当する。
別の一変形では、ヒト型結核菌の種類の病原体株、すなわち特にヒト型結核菌Ｈ３７ｖ（ＡＴＣＣ２５６１８）およびヒト型結核菌エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）（ＡＴＣＣ３５８０１）の株および他の臨床株による結核性感染の明確な検出は、本発明によると、好ましくは、配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列を有する標識化ハイブリダイゼーションプローブ対または相補配列の対とヒト型結核菌に特異的なｎａｒＧＨＪＩプロモーター領域との特異的ハイブリダイゼーションの融解温度の分析によって行われる（表１を参照）。ヒト型結核菌の種類の病原体株は、この点で特に５８℃を超える、好ましくは６０℃を超える、特に好ましくは約６２℃の融解温度によって特徴づけられる。比較して、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌の病原体株は、配列ＩＤ番号：４／配列ＩＤ番号：６の標識化ハイブリダイゼーションプローブ対が用いられる場合、特に６２℃未満、好ましくは６０℃未満、特に好ましくは約５８℃の融解温度を有する。
本発明に記載の核酸増幅は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって起こりうる。加えて、さらなる任意の望ましい核酸増幅方法は、明らかに、適当であると考えることができる。
さらに、驚くべきことに、配列ＩＤ番号：２で表されるヌクレオチド配列を含むおよび／または配列ＩＤ番号：３で表されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプライマー、特に１つのプライマー対を、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域の少なくとも１つのＤＮＡ断片の増幅に用いる際、増幅は結核菌群の病原体株の場合でのみ行われ、すなわち増幅産物を生じることが見出されている。非結核性病原体または非抗酸菌病原体の場合には、しかし、増幅は行われず、これは対応する増幅産物が得られないことを意味する。本発明に記載のプライマーを用いることによって、病原体株ヒト型結核菌と結核菌群の他の病原体株（上記参照）との間の、ならびに非結核性抗酸菌および非抗酸菌、たとえば放線菌、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ）およびプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の病原体または真菌病原体に対しての明確な区別が、特に有利に可能である。
上述の方法の好ましい一実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅が実施される。特に好ましい一実施形態では、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲ（高速サイクルＰＣＲ）である。
ヒト型結核菌に特異的な多型の検出は、本発明によると、１つのまたはいくつかのプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物の増加をリアルタイムで、増幅サイクルを追って観察することができる。特に好ましくは、増幅はリアルタイムＰＣＲの一実施形態であるロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標））システムで実施される。この目的のため、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝溶液およびプライマーの他に、所期のＰＣＲ増幅産物と特異的に結合するハイブリダイゼーションプローブもまた、特に、ＰＣＲ開始混合物に加えられる。これに関連して、特に異なる色素で標識化された２つの配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが用いられる。本発明に記載の標識化されたハイブリダイゼーションプローブ対の配列は、一方のプローブの３'末端が他方のプローブの５'末端の近くに位置しその結果として２つの色素が互いに隣接するように、増幅されたＤＮＡ断片の標的配列にハイブリダイズするよう選択される；好ましくは、２つのプローブ間の距離はヌクレオチド１個から５個の間である。特に、ハイブリダイゼーションプローブの２つの色素間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；たとえばハイト（Ｈｅｉｄ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６ （１９９６）９８６−９９４を参照）および結果として蛍光スペクトルにシフトが起こり、この波長領域の蛍光の程度は、検出されたＤＮＡの量の関数である。検出は、たとえば国際公開第００／５８５０５号パンフレットに記載の方法に従って行うことができる。
本発明によると、ＦＲＥＴ系はまた、増幅されたＤＮＡ断片の量の定量的測定を提供する。本発明に記載の選択されたハイブリダイゼーションプローブは、定量的に、すなわち化学量論的に、増幅された断片と結合することができる。この点で、定量的ハイブリダイゼーションは特に、増幅されたＤＮＡ断片上の検出された配列と用いられたオリゴヌクレオチドプローブのホモロジーの程度に依存する。
好ましい一実施形態では、増幅された断片中の特定のＤＮＡ配列の蛍光定量検出は、従来のＰＣＲによるその断片の増幅後に実施される。特に好ましい一実施形態では、蛍光定量検出は高速サイクルＰＣＲにおいて、たとえば、生じるＤＮＡの増加を蛍光シグナルの増加として監視することができる、増幅反応中に実施される。
本発明に記載の方法の好ましい一実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の特異的検出は、増幅反応の完了時に行われ、ここで、融解曲線分析の枠内で、ハイブリダイゼーションプローブ対の、好ましくはＦＲＥＴ対の、検出すべき領域へのハイブリダイゼーション後に、温度を変え、好ましくは連続的に上昇させ、および測定されている温度の関数として蛍光が同時に放出される。この方法で、ハイブリダイゼーションプローブ、特に使用したＦＲＥＴ対が、増幅されたＤＮＡ断片の検出すべき領域にハイブリダイズしなくなる融解温度が測定される。融解曲線分析の本質的な側面は、使用したハイブリダイゼーションプローブ対と増幅されたＤＮＡ断片上の標的領域との間のミスマッチの発生の場合に、測定融点の低下が起こるという事実から成る。ハイブリダイゼーションプローブ、特にＦＲＥＴ対を用いて、ヌクレオチド配列中の１またはいくつかの点突然変異でごくわずか互いに配列が異なるＤＮＡ断片のその領域が、本発明にしたがってこの方法で同定される。
本発明に関連して、「区域」、「領域」、「断片」、「標的領域」または「隣接領域」の語は、直鎖型デオキシまたはリボ核酸分子、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ上の少なくとも１つの連続した部分を意味すると解し、ＤＮＡまたはＲＮＡは、この分子のヌクレオチドの数で測定して、その分子の特定の数のヌクレオチドの、すなわち特定の位置の、読み下流および／または上流の５'から３'方向に、好ましくはその分子の２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３または２個のヌクレオチドから成る。
本発明に記載の増幅されたＤＮＡ断片は、好ましくはｈａｓ、プライマーが結合する配列に加えて、長さ少なくとも１および最大５００ヌクレオチド、好ましくは最大３００および特に好ましくは最大１５５ヌクレオチドを有する。上述の領域以内の個別の長さの値は明示的に含まれ、すなわち２、３、４、５…、４９７、４９８および４９９である。増幅されたＤＮＡ断片は、明らかに、おそらく好ましい実施において、より長いまたはより短い断片でありうる。
本発明の一実施形態によると、本方法に用いられるプライマー対は、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３またはその相補配列を有する配列のうち少なくとも１つを有する。
本発明の一実施形態では、ヒト型結核菌に特異的な多型の検出は、標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つの対を用いて行われ、一方のプローブが３'末端で、および他方のプローブが５'末端で標識化されており、およびプローブは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が可能になるように増幅物に特異的に結合する（上記参照）。
好ましい一実施形態では、プローブ対は配列ＩＤ番号：４および５またはその相補配列を有する配列および／または配列ＩＤ番号：４および６またはその相補配列を有する配列を示す。
本発明の対象は、さらに、臨床材料中の結核菌群の病原体の同時検出のための方法であり、ｎａｒＧＨＪＩプロモーター領域の増幅産物の存在が、特に、増幅されたＤＮＡ断片に特異的な少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブによって、好ましくは上述の方法によって検出され、および結核菌群の病原体株がそのようにして非結核性病原体に対しておよび／または非抗酸菌に対して検出される。別の一変形では、増幅産物の存在が、それ自体既知である方法で、特に電気泳動法によって、検出される。これに関連して、本発明の方法は、さらに、好ましくは病原体特異的（型特異的または種特異的）検出が、特に多重ＰＣＲに関連して、並行バッチ中のまたは同一反応バッチ中の特異的な配列断片に対応する核酸増幅によって実施される、包括的検出方法の一部となりうる。
本発明に記載の方法の本質的な長所は、抗酸菌感染の診断のための検出方法において、ともにヒト型結核菌の既存の感染が明らかに、正確におよび特に同時に、好ましくは単一の定型診断バッチにおいて他の微生物感染に対して、ヒト型結核菌による感染が非結核性感染に対して、およびヒト型結核菌による感染が結核菌群の他のメンバーに対して、認識されるという事実から成る。本発明に記載の方法の別の本質的な長所は、ヒト型結核菌の型の抗酸菌株を、加えて、特に同時におよび明確な方法で検出することができ、およびこの型を個別に同定できるという点である。本発明に記載の検出方法は、したがって、特に、結核の明確なおよび正確な早期検出および、結核菌群の単離された病原体株のヒト型結核菌に対する型依存性の明確なおよび正確な早期検出を可能にする。これは、特に有利に、感染した生物の速やかなおよび管理された治療を可能にする。
本質的に、本発明に記載の方法は、日常の診断に、および本質的に通常の検査室で用いられる。本方法を、高感染性病原体株を培養するための複雑な設計の、特別な設備を有する安全実験室で実施する必要は無い。このため、本発明に記載の方法は、幅広い使用者に利用可能にすることができる。
本発明に関連して、臨床材料は本質的に臨床試料、すなわち唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、髄液、骨髄、血液といった患者材料、しかしまた生検、特にたとえば頚部のリンパ節からといった吸引生検を意味すると解する。しかし、臨床材料はまた、たとえば液体培養からの、特に患者材料由来の、酸耐性桿細胞の選択培養のための液体培養からの、特に培養単離物も意味すると解する。
好ましくは、微生物ＤＮＡは、臨床材料から、それ自体既知である方法で、特にキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアンプ（ＱＩＡｍｐ）（登録商標）ＤＮＡミニキットといったＤＮＡ調製キットによって抽出される。
好ましくは、本発明に記載の試料は、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿糞便、髄液、骨髄、血液および生検から成る選択された臨床試料の群から選択される。
本発明はまた、上述の方法の実行に必要なプライマー、プライマー対、プローブおよびプローブ対に関する。
ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む配列ＩＤ番号：１に示される配列に由来するＤＮＡ断片の増幅に適したプライマー対が本発明によると好ましく、そのＤＮＡ断片はｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含む。
本発明によると、プライマー対は、好ましくは、長さ１５５ｂｐの抽出されたＤＮＡに由来する、ヒト型結核菌型の病原体株に特異的なｎａｒＧＨＪＩ遺伝子の多型を有するＤＮＡ断片の増幅に用いられ、その場合、順方向プライマーは配列ＩＤ番号：２に記載のヌクレオチド配列を、および逆方向プライマーは配列ＩＤ番号：３に記載のヌクレオチド配列を、含むおよび／または示す。本発明の別の対象は、したがってまた、配列ＩＤ番号：２および／または配列ＩＤ番号：２で表されるヌクレオチド配列を有するまたはこれらのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、特にそれから成る、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素遺伝子のヒト型結核菌特異的プロモーター領域のＤＮＡ断片の増幅のための、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、好ましくは少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー対から成る。
好ましい一実施形態では、プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーは、配列ＩＤ番号：２またはその相補配列に示される配列を示すかまたはそれを構成する。
別の好ましい一実施形態では、プライマー対のうち少なくとも１つのプライマーは、配列ＩＤ番号：３またはその相補配列に示される配列を示すかまたはそれを構成する。
特に好ましい一実施形態では、プライマー対のプライマーは配列ＩＤ番号：２に示される配列および配列ＩＤ番号：３に示される配列またはその相補配列を示す。
本発明に記載のプライマーは、配列ＩＤ番号：２に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：３に示される配列またはその相補配列を示しうる。
本発明の一実施形態は、すなわち生物試料中に含まれるヒト型結核菌ＤＮＡの増幅および得られた増幅物の特異的検出による、ヒト型結核菌の特異的検出のための上述のプライマーまたはプライマー対の１つの使用に関する（上記参照）。
本発明は好ましくはまた、配列ＩＤ番号：２および３で示されるヌクレオチド配列を含む本発明に記載の上述のプライマーと比較して、それぞれの場合でその縮重、変異または改変した配列または断片であって、それらが由来する配列ＩＤ番号：２および３で示される、問題のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それぞれの場合に存在するホモロジーの程度は、好ましくは元のヌクレオチド配列と比較して配列の全長にわたって少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％である、ＤＮＡ断片の増幅のための本発明にしたがって用いられるプライマーおよび／またはプライマー対に関する。この点で、得られた断片はそれぞれの場合で、ヌクレオチド配列の長さの好ましくは最大９８％、特に好ましくは最大約９５％、最大約９０％、最大約７５％、最大約５０％または最大約２５％の配列長を有する。特に好ましくは、得られた断片は元のヌクレオチド配列と比較して、最大１０、最大５、４、３または２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド短い。
本発明に関連して、「修飾配列」または「修飾ヌクレオチド配列」の語は、異常なまたは合成ヌクレオチドを含む少なくとも１つのヌクレオチドの交換、逆位、欠失または付加によって、元の配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが、好ましくは２個のヌクレオチドが異なる核酸配列と理解される。これに関連して、「修飾」の語は、修飾ヌクレオチド配列に関係する特徴を意味すると理解される。
本発明に関連して、「そのヌクレオチド配列を含むプライマー」または「そのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ」または同様の言い回しは、問題のプライマーおよびプローブが、そのヌクレオチド配列を示す、すなわちその具体的に言及されたヌクレオチド配列だけから成ることを意味すると解される。その言い回しはまた、問題のプライマーおよびプローブが、必要に応じて、具体的表現で言及されたヌクレオシド配列以外の、少なくとも１つの別の追加の配列から成ることを意味すると解される。この追加の配列は、具体的表現で言及されたヌクレオチド配列に隣接し、および、具体的表現で言及されたヌクレオチド配列の長さの好ましくは最大約１００％、特に好ましくは最大約７５％、最大約５０％、最大約２５％、最大約１０％、最大約５％または最大約２％に達する配列長を有する。特に好ましくは、追加の配列は１０から５ヌクレオチド、４、３、２ヌクレオチドの長さを有し、または追加の配列は単一のヌクレオチドから成る。
本発明に記載のハイブリダイゼーションプローブは、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適したプローブである。
本発明に記載のハイブリダイゼーションプローブ対は、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適したプローブ対である。
本発明の別の対象はまた、配列ＩＤ番号：５で表されるヌクレオチド配列を有するかまたはその相補配列を有する核酸分子を含み、特にそれから成る、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブから成る。本発明の別の対象はまた、配列ＩＤ番号：４でおよび配列ＩＤ番号：５で表されるヌクレオチド配列を有するかまたはその相補配列を有する核酸分子を含み、特にそれから成る、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブから成る。
本発明の別の対象はまた、配列ＩＤ番号：６で表されるヌクレオチド配列を有するかまたはその相補配列を有する核酸分子を含み、特にそれから成る、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズする、別のまたは代替的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブから成る。本発明の別の対象はまた、配列ＩＤ番号：４でおよび配列ＩＤ番号：６で表されるヌクレオチド配列を有するかまたはその相補配列を有する核酸分子を含み、特にそれから成る、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブから成る。
特に好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブ対の少なくとも１つのプローブは、配列ＩＤ番号：４に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：５に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：６に示される配列またはその相補配列を示す。
特に好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブ対のプローブは、配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：５に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：６に示される配列またはその相補配列を示す。
本発明に記載のハイブリダイゼーションプローブは、配列ＩＤ番号：４に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：５に示される配列またはその相補配列または配列ＩＤ番号：６に示される配列またはその相補配列を示しうる。
本発明に記載の好ましい方法では、ＤＮＡ断片の検出は、ＦＲＥＴ対として実施される、すなわち標識化された、上述のハイブリダイゼーションプローブを用いて実施され、ハイブリダイゼーションプローブパートナーは、好ましくは３'末端ヌクレオチドに色素、好ましくは蛍光色素、特に好ましくはフルオレセインを伴う、供与体成分＝「アンカープローブ」として実施される。本発明によると、配列ＩＤ番号：４に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列を含むハイブリダイゼーションプローブは、好ましくはアンカープローブとして提供される。
ハイブリダイゼーションプローブ対のハイブリダイゼーションプローブパートナーは、個々の場合で異なり、好ましくは５'末端ヌクレオチドに別の色素を、好ましくはローダミン誘導体を伴う、受容体成分＝センサープローブとして実施される。本発明によると、配列ＩＤ番号：５、６に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列をそれぞれの場合含むハイブリダイゼーションプローブは、好ましくはセンサープローブとして提供される。上述の実施形態の好ましい変形では、ローダミン誘導体はライトサイクラーレッド６４０（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｒｅｄ ６４０）（登録商標）であり、上述の実施形態の別の好ましい変形では、ローダミン誘導体はライトサイクラーレッド７０５（登録商標）であり、上述の実施形態の別の好ましい変形では、ローダミン誘導体はＣｙ５である。特に好ましくは、本発明に記載のヒト型結核菌の型特異的検出に用いられる標識化センサープローブは、色素ライトサイクラーレッド６４０またはライトサイクラーレッド７０５を有する。
本発明の別の一実施形態は、ヒト型結核菌の特異的検出のための、上述のハイブリダイゼーションプローブのうちの１つまたは上述のハイブリダイゼーションプローブ対のうちの１つの使用に関する。
明らかに、本発明はまた、本発明に記載の方法を実施するための、たとえばキット（装置）といった手段を含む。
一実施形態では、キットは、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む、配列ＩＤ番号：１に示される配列に由来するＤＮＡ断片の増幅に適した少なくとも１つのプライマー対を含み、そのＤＮＡ断片はｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位、および／またはｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適した少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブまたは１つのハイブリダイゼーションプローブ対を含む。
特に好ましい一実施形態では、キットは、少なくとも１つのプライマー対を含み、その場合、プライマーは配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３に示される配列またはその相補配列を示す。
別の特に好ましい一実施形態では、キットは、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ対を含み、ここでそのプローブは配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：５またはその相補配列または配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：６またはその相補配列を示す。
特に好ましい一実施形態では、キットは、プライマーが配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３に示される配列またはその相補配列を示す場合のプライマー対、および、プローブが配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：５またはその相補配列またはｔｈｅ配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：６またはその相補配列を示すハイブリダイゼーションプローブ対の両方を含む。
別の一実施形態では、キットは加えて、増幅物の核酸増幅および／または検出反応を実施するのに必要な、他の装置、試薬および／または補助物質を含む。
本発明の別の対象はまた、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域中の、特に翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位にある、少なくとも１つのヒト型結核菌特異的ＤＮＡ多型の、ヒト型結核菌による感染の特異的検出のための使用から成る。特に好ましい一変形では、このゲノム断片は、配列ＩＤ番号：１で表される核酸配列または相補配列を含み、特にそれから成る点で特徴づけられる。好ましくは、本発明に記載の使用は、たとえば高速サイクルＰＣＲでのまたはそれ自体が既知であるＤＮＡ配列決定、特にキャピラリー配列決定装置、すなわち対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＯＬＡ（「オリゴヌクレオチド・ライゲーション測定法」）または変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）の従来のハイブリダイゼーションの方法での、以降のまたは同時のハイブリダイゼーションを伴う、少なくとも１つのＰＣＲバッチにおいて行われる。増幅のための代替法は、ＰＣＲ以外に、たとえばＮＡＳＢＡ、ＳＤＡまたはＬＣＲの既知の方法から成る。
本発明は、配列番号１から６を含む添付の配列プロトコルによって、図１から５によっておよび実施例１から４によってさらに詳細に説明される。
配列ＩＤ番号：１−ｎａｒＧＨＪＩプロモーターの−２１５位にあるヒト型結核菌に特異的な多型を含むｎａｒＧＨＪＩオペロンの部分中の領域。
配列ＩＤ番号：２−ヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型を含む抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩプロモーターの１５５ｂｐ断片の増幅のための順方向プライマー。
配列ＩＤ番号：３−配列ＩＤ番号：２に対する逆方向プライマー。
配列ＩＤ番号：４−ハイブリダイゼーションプローブ（アンチセンス）、特に、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩプロモーターの型特異的領域の検出のためのプローブ対の、アンカープローブおよび供与体成分。
配列ＩＤ番号：５−ハイブリダイゼーションプローブ（アンチセンス）、特に、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩプロモーターの型特異的領域の検出のためのプローブ対の、センサープローブおよび受容体成分。
配列ＩＤ番号：６−ハイブリダイゼーションプローブ（アンチセンス）、特に、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩプロモーターの型特異的領域の検出のためのプローブ対の、センサープローブおよび受容体成分。
実施例１：ＤＮＡ単離
ａ）臨床材料から
微生物ＤＮＡは、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、髄液、骨髄、血液または吸引生検から成る臨床試料から、既知の方法で、たとえばキアンプ（ＱｌＡｍｐ）（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｌｄｅｎ））を用いて精製、すなわち抽出する。
ａ）臨床材料から
微生物ＤＮＡは、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、髄液、骨髄、血液または吸引生検から成る臨床試料から、既知の方法で、たとえばキアンプ（ＱｌＡｍｐ）（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｌｄｅｎ））を用いて精製、すなわち抽出する。
ｂ）培養単離物から
患者試料に由来する診断すべき微生物の培養は、自動細胞培養系バクテック（ＢＡＣＴＥＣ）（登録商標）ＭＧＩＴ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー・ダイアグノスティック・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）において液体培養中で、酸耐性細胞桿体の、特に抗酸菌の培養を促進する条件下で培養される。陽性培養から、微生物ＤＮＡがたとえば機械的破壊によって得られる。微生物ＤＮＡは既知の方法で、たとえばキアンプ（ＱｌＡｍｐ）（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｌｄｅｎ））を用いて培養単離物から抽出され、および、必要に応じて、等分される。
患者試料に由来する診断すべき微生物の培養は、自動細胞培養系バクテック（ＢＡＣＴＥＣ）（登録商標）ＭＧＩＴ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー・ダイアグノスティック・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）において液体培養中で、酸耐性細胞桿体の、特に抗酸菌の培養を促進する条件下で培養される。陽性培養から、微生物ＤＮＡがたとえば機械的破壊によって得られる。微生物ＤＮＡは既知の方法で、たとえばキアンプ（ＱｌＡｍｐ）（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｌｄｅｎ））を用いて培養単離物から抽出され、および、必要に応じて、等分される。
実施例２：ＰＣＲ増幅
最適化ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標））ＰＣＲでの使用のためには、「ライトサイクラー・ファストスタート・ＤＮＡマスター（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ）ハイブリダイゼーションプローブ」（カタログ番号２３９２７２，ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））の使用可状態の入手可能な混合物を含むバッチが選択される。
最適化ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標））ＰＣＲでの使用のためには、「ライトサイクラー・ファストスタート・ＤＮＡマスター（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ）ハイブリダイゼーションプローブ」（カタログ番号２３９２７２，ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））の使用可状態の入手可能な混合物を含むバッチが選択される。
下記の反応混合物がライトサイクラー反応のために作製される：
・ファストサート（ＦａｓｔＳａｒｔ）（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ
・反応緩衝液
・デスオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＮＴＰ）
・３ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2（終濃度）
・プライマー、プライマー当たり：１９ｐｍｏｌ、１．１(ｍｏｌ／ｌ終濃度に相当
・オリゴヌクレオチドＦＲＥＴプローブ対
プローブ当たり：２ｐｍｏｌ、１００ｎｍｏｌ／ｌ終濃度に相当
・ファストサート（ＦａｓｔＳａｒｔ）（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ
・反応緩衝液
・デスオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＮＴＰ）
・３ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2（終濃度）
・プライマー、プライマー当たり：１９ｐｍｏｌ、１．１(ｍｏｌ／ｌ終濃度に相当
・オリゴヌクレオチドＦＲＥＴプローブ対
プローブ当たり：２ｐｍｏｌ、１００ｎｍｏｌ／ｌ終濃度に相当
この反応混合物はパルス遠心によってライトサイクラーシステムのガラスキャピラリーへ移され、および増幅は、「ホットスタート」原則に従って、９５℃にて１０分間の最初の変性後、下記の段階とともに実施される。
1.９５℃にて３秒間変性
2.６８℃から６２℃の温度にて２秒間プライマーハイブリダイゼーション（「タッチダウン・アニーリング」）
3.７２℃にて４０秒間重合
1.９５℃にて３秒間変性
2.６８℃から６２℃の温度にて２秒間プライマーハイブリダイゼーション（「タッチダウン・アニーリング」）
3.７２℃にて４０秒間重合
段階１から３は合計５０回実施され、最初の５サイクルについてハイブリダイゼーションは段階２に６８℃にて行われ、および次の６サイクル中には温度は６２℃までサイクル毎に１℃の段階で低下され、および残りのサイクルについては６２℃にて行われた。温度変化の速度はすべての段階において毎秒２０℃であった。
ヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型を含むｎａｒＧＨＪＩプロモーターの領域の増幅のために、配列ＩＤ番号：２のヌクレオチド配列を有するプライマーが順方向プライマーとして、および配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド配列を有するプライマーが逆方向プライマーとして用いられる。ｎａｒＧＨＪＩプロモーターの１５５ｂｐ断片が増幅される。さらに、これらのプライマーの使用は、結核菌群の病原体株の場合のみに増幅産物に繋がるが、非結核性病原体または非抗酸菌病原体の場合には繋がらないことが見出されている。このため、配列ＩＤ番号：２および／または配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド配列を有するプライマーの使用はまた、非結核性型と、および非抗酸菌の病原体と、結核菌群の型の病原体との間の明確な区別を可能にする。
実施例３：検出および融解曲線分析
増幅された断片を検出するために、反応混合物中で用いられるＦＲＥＴ標識化ハイブリダイゼーションプローブ対（実施例２を参照）が用いられ、一方のハイブリダイゼーションプローブパートナー（配列ＩＤ番号：４）は供与体成分として３'末端ヌクレオチドにフルオレセインを伴い、個々の場合で異なるハイブリダイゼーションプローブパートナー（配列ＩＤ番号：５または６）は受容体成分として５'末端ヌクレオチドにライトサイクラーレッド６４０（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ）（登録商標）を伴う。最後の増幅サイクルの直後に、ハイブリダイゼーションプローブを用いた検出中に行われる融解曲線分析は、増幅された断片の９５℃にて３０秒間の変性で始まり、続いて上述のＦＲＥＴ対を用いたハイブリダイゼーションを３８℃にて３０秒間行う。ハイブリダイゼーションの融解曲線を決定するために、温度はその後連続的に３８℃から８０℃へ、毎秒０．２℃の速度で上昇させ、結合したＦＲＥＴ対によって放出される蛍光を連続的に記録する。蛍光は少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブパートナーが溶解すると直ちに規則的に消滅する。蛍光シグナルを評価するために、バージョン３．５．３のライトサイクラー「運転プロファイル」プログラムが用いられ、ライトサイクラーシステムの光度検出器のＦ２およびＦ３チャンネルの増幅が自動的に調節される。
増幅された断片を検出するために、反応混合物中で用いられるＦＲＥＴ標識化ハイブリダイゼーションプローブ対（実施例２を参照）が用いられ、一方のハイブリダイゼーションプローブパートナー（配列ＩＤ番号：４）は供与体成分として３'末端ヌクレオチドにフルオレセインを伴い、個々の場合で異なるハイブリダイゼーションプローブパートナー（配列ＩＤ番号：５または６）は受容体成分として５'末端ヌクレオチドにライトサイクラーレッド６４０（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ）（登録商標）を伴う。最後の増幅サイクルの直後に、ハイブリダイゼーションプローブを用いた検出中に行われる融解曲線分析は、増幅された断片の９５℃にて３０秒間の変性で始まり、続いて上述のＦＲＥＴ対を用いたハイブリダイゼーションを３８℃にて３０秒間行う。ハイブリダイゼーションの融解曲線を決定するために、温度はその後連続的に３８℃から８０℃へ、毎秒０．２℃の速度で上昇させ、結合したＦＲＥＴ対によって放出される蛍光を連続的に記録する。蛍光は少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブパートナーが溶解すると直ちに規則的に消滅する。蛍光シグナルを評価するために、バージョン３．５．３のライトサイクラー「運転プロファイル」プログラムが用いられ、ライトサイクラーシステムの光度検出器のＦ２およびＦ３チャンネルの増幅が自動的に調節される。
ヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型を含むｎａｒＧＨＪＩプロモーターの領域の特異的ハイブリダイゼーションのためには、配列ＩＤ番号：４／配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列を有するＦＲＥＴ標識化ハイブリダイゼーションプローブ対が用いられる。代替として、配列ＩＤ番号：４／配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列を有するＦＲＥＴ標識化ハイブリダイゼーションプローブ対が、ヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型を含むｎａｒＧＨＪＩプロモーターの領域の特異的ハイブリダイゼーションに用いられる。
図２および３および表１は融解曲線分析の結果を示す。
実施例４：従来の硝酸還元酵素検査との本発明に記載の方法の比較
比較試験において、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌を含む異なる試料が本発明に記載の方法に、および従来の硝酸還元酵素検査に供された（図４）。
比較試験において、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌を含む異なる試料が本発明に記載の方法に、および従来の硝酸還元酵素検査に供された（図４）。
下記の試料が用いられ、試料番号は図４中の番号に対応する：
ヒト型結核菌：
1.Ｈ３７Ｒｖ 野生型；
2.Ｈ３７Ｒｖ ｎａｒＧ （Ｔ−２１５Ｃ）
3.エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）野生型；
4.エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）ｎａｒＧ（Ｔ−１５Ｃ）
ウシ型結核菌：
5.野生型
弱毒化ウシ型結核菌
6.野生型
ヒト型結核菌：
1.Ｈ３７Ｒｖ 野生型；
2.Ｈ３７Ｒｖ ｎａｒＧ （Ｔ−２１５Ｃ）
3.エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）野生型；
4.エルトマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）ｎａｒＧ（Ｔ−１５Ｃ）
ウシ型結核菌：
5.野生型
弱毒化ウシ型結核菌
6.野生型
試料番号１および３は本発明に記載の方法を用いて検査で陽性となり（実施例３および４を参照）、すなわちヒト型結核菌が特異的に検出され、抗酸菌株番号５および６間の明確な識別が可能であった。試料２および４は、−２１５位でＴをコードする配列が遺伝子技術によってＣをコードするように改変された場合で、融解曲線でより低い値を示し、およびウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌を含む試料５および６の場合と同等の値を示した。
生化学検査である硝酸還元酵素検査は結果を支持し、非改変ヒト型結核菌試料番号１および３は検査で陽性となった一方、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌を含む試料、および−２１５位での遺伝子技術によるＴ−＞Ｃ交換によって改変されたヒト型結核菌株を含む試料の場合に発色反応は観察されず、それは本発明に記載の検出方法についての−２１５位における多型の意義を支持する。
Claims (48)
- 生物試料中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌））の特異的検出のための方法であって、
核酸増幅法が配列ＩＤ番号：１で示される配列に由来するＤＮＡ断片を増幅するのに適したプライマーを用いて実施され、その配列がｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの領域に由来する断片を含み、そのＤＮＡ断片がｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含む
およびその場合に、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に、ヒト型結核菌に特異的な多型が検出される方法。 - 核酸増幅がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡまたはＬＣＲによって行われる点で特徴づけられる請求項１に記載の方法。
- ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである点で特徴づけられる請求項２に記載の方法。
- ヒト型結核菌に特異的な多型の検出が１つまたはいくつかのプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって実施される点で特徴づけられる請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 増幅されたＤＮＡ断片が最大５００ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
- 増幅されたＤＮＡ断片が最大３００ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
- 増幅されたＤＮＡ断片が最大１５５ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
- プライマー対が配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３を有する配列のうち少なくとも１つを有する点で特徴づけられる請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- ヒト型結核菌に特異的な多型の検出が、標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つの対を用いて行われ、一方のプローブは３'末端で、および他方のプローブは５'末端で標識化され、およびプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が可能になるような方法で特異的に増幅物と結合する点で特徴づけられる請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- プローブ対が配列ＩＤ番号：４および５またはそれらの相補配列を有する配列、および／または配列ＩＤ番号：４および６またはそれらの相補配列を有する配列を持つ点で特徴づけられる請求項９に記載の方法。
- 試料が唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、髄液、骨髄、血液および生検から成る臨床試料の群から選択される点で特徴づけられる請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む配列ＩＤ番号：１に示される配列に由来するＤＮＡ断片の増幅に適し、そのＤＮＡ断片はｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含む点で特徴づけられるプライマー対。
- 少なくとも１つのプライマーが配列ＩＤ番号：２に示される配列を示す点で特徴づけられる請求項１２に記載のプライマー対。
- 少なくとも１つのプライマーが配列ＩＤ番号：３に示される配列を示す点で特徴づけられる請求項１２に記載のプライマー対。
- プライマーが配列ＩＤ番号：２に示される配列および配列ＩＤ番号：３に示される配列を示す点で特徴づけられる請求項１２に記載のプライマー対。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含むＤＮＡ断片の増幅に使用するためのプライマーであって、配列ＩＤ番号：２に示される配列を示す点で特徴づけられるプライマー。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含むＤＮＡ断片の増幅に使用するためのプライマーであって、配列ＩＤ番号：３に示される配列を示す点で特徴づけられるプライマー。
- 請求項１６もしくは１７に記載のプライマー、または請求項１２から１５のいずれか１項に記載のプライマー対の、ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出のための使用。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適している点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に用いるためのハイブリダイゼーションプローブ対であって、narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位を含むヒト型結核菌特異的プロモーター領域にハイブリダイズするプローブと配列ＩＤ番号：４に示される配列またはその相補配列からなるプローブとからなり、前記検出は、前記両プローブの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動を利用することにより達成されることを特徴とするハイブリダイゼーションプローブ対。
- 前記narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位を含むヒト型結核菌特異的プロモーター領域にハイブリダイズするプローブが配列ＩＤ番号：５に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項２０に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- 前記narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位を含むヒト型結核菌特異的プロモーター領域にハイブリダイズするプローブが配列ＩＤ番号：６に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項２０に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型の検出に用いるためのハイブリダイゼーションプローブであって、前記検出は、当該プローブと前記−２１５位を含むヒト型結核菌特異的プロモーター領域にハイブリダイズするプローブとの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動を利用することにより達成される、配列ＩＤ番号：４に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- 配列ＩＤ番号：５に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- 配列ＩＤ番号６に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- ヒト型結核菌の特異的検出のための請求項２３から２５のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションプローブまたは請求項２０から２２のいずれか１項に記載のハイブリダイゼーションプローブ対の使用。
- 請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットにおいて、
ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む配列ＩＤ番号：１に示される配列に由来するＤＮＡ断片の増幅に適するプライマー対であって、そのＤＮＡ断片はｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位を含む、少なくとも１つのプライマー対を含み、および
ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５'から３'方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出のための、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブまたはハイブリダイゼーションプローブ対を含む、キット。 - プライマー対が請求項１５に記載のプライマー対である点で特徴づけられる請求項２７に記載のキット。
- ハイブリダイゼーションプローブ対が請求項２１に記載のプローブ対および／または請求項２２に記載のプローブ対である点で特徴づけられる請求項２７に記載のキット。
- プライマー対が請求項１５に記載のプライマー対である点で特徴づけられる請求項２９に記載のキット。
- 核酸増幅および／または検出反応を実施するのに必要なまたは有用な、他の試薬および／または補助物質を含む点で特徴づけられる請求項２７から３０のいずれか１項に記載のキット。
- ａ）微生物ＤＮＡの臨床材料からの抽出、
ｂ）抽出されたＤＮＡに由来する、narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌に特異的なＤＮＡ多型を含む、抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域の少なくとも１つのＤＮＡ断片の増幅、
ｃ）配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：５に対する相補配列、配列ＩＤ番号：６、および配列ＩＤ番号：６に対する相補配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブとの、増幅されたＤＮＡ断片の特異的ハイブリダイゼーションの検出、
ｄ）融解曲線分析によって行われる、ウシ型結核菌、弱毒化ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌およびネズミ型結核菌に対するヒト型結核菌の特異的検出
の段階を含む、臨床材料中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌））の特異的検出のための方法。 - 増幅が段階ｂ）において配列ＩＤ番号：２のヌクレオチド配列を含むプライマー及び配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド配列を含むプライマーによって行われる、請求項３２に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションが段階ｃ）において、
配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブと配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列またはその相補配列を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブとの対、および
配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブと配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列またはその相補配列を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブとの対
を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つの対を用いて行われる、請求項３２又は３３に記載の方法。 - ＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増加がリアルタイムＰＣＲとして実施される、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の方法。
- ＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増加がライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（登録商標）システムを用いて実施される、請求項３５に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションの段階がＤＮＡ断片の増幅中または増幅後に行われる、請求項３２から３６のいずれか１項に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションおよびその検出がリアルタイムＰＣＲで行われる、請求項３２から３６のいずれか１項に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションおよびその検出がライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（登録商標）システムで行われる、請求項３８に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションの検出が蛍光検出によって実施され、および標識化ハイブリダイゼーションプローブ対が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対として形成される、請求項３４から３９のいずれか１項に記載の方法。
- 臨床材料が、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、髄液、骨髄、血液および生検から成る臨床試料の群から選択される、請求項３２から４０のいずれか１項に記載の方法。
- ｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素遺伝子のヒト型結核菌特異的プロモーター領域のＤＮＡ断片の増幅のための、配列ＩＤ番号：２のヌクレオチド配列を含むプライマーと配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド配列を含むプライマーとを含むオリゴヌクレオチドプライマー対。
- 配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドと配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドとの対を含むオリゴヌクレオチド対。
- 配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドと配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドとの対を含むオリゴヌクレオチド対。
- ａ）配列ＩＤ番号：２のヌクレオチド配列を含むプライマーと配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド配列を含むプライマーとを含む少なくとも１つのプライマー対および
ｂ）配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むハイブリダイゼーションプローブと配列ＩＤ番号：５のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むハイブリダイゼーションプローブとの対、及び
配列ＩＤ番号：４のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むハイブリダイゼーションプローブと配列ＩＤ番号：６のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むハイブリダイゼーションプローブとの対を含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ対
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌））の特異的検出のためのキット。 - ヒト型結核菌による感染の特異的検出のための、配列ＩＤ番号：６で示される核酸配列またはその相補配列を含む抗酸菌のｎａｒＧＨＪＩ硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域中の、narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンＧＴＧの読み上流の５’から３’方向において−２１５位に位置するヒト型結核菌特異的ＤＮＡ多型の使用。
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