JP2006521797A - ヒト型結核菌の特異的検出のための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
a)臨床材料から
微生物DNAは、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、液、骨髄、血液または吸引生検から成る臨床試料から、既知の方法で、たとえばキアンプ(QlAmp)(登録商標)DNAミニキット(キアゲン社(Qiagen)、ドイツ、ヒルデン(Hillden))を用いて精製、すなわち抽出する。
患者試料に由来する診断すべき微生物の培養は、自動細胞培養系バクテック(BACTEC)(登録商標)MGIT(登録商標)(ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー・ダイアグノスティック・システムズ(Becton,Dickinson and Company Diagnostic Systems)、米国)において液体培養中で、酸耐性細胞桿体の、特に抗酸菌の培養を促進する条件下で培養される。陽性培養から、微生物DNAがたとえば機械的破壊によって得られる。微生物DNAは既知の方法で、たとえばキアンプ(QlAmp)(登録商標)DNAミニキット(キアゲン社(Qiagen)、ドイツ、ヒルデン(Hillden))を用いて培養単離物から抽出され、および、必要に応じて、等分される。
最適化ライトサイクラー(LightCycler(登録商標))PCRでの使用のためには、「ライトサイクラー・ファストスタート・DNAマスター(LightCycler FastStart DNA Master)ハイブリダイゼーションプローブ」(カタログ番号239272,ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社(Roche Molecular Biochemicals))の使用可状態の入手可能な混合物を含むバッチが選択される。
・ファストサート(FastSart)(登録商標)Taqポリメラーゼ
・反応緩衝液
・デスオキシヌクレオシド三リン酸混合物(dNTP)
・3mmol/l MgCl2(終濃度)
・プライマー、プライマー当たり:19pmol、1.1(mol/l終濃度に相当
・オリゴヌクレオチドFRETプローブ対
プローブ当たり:2pmol、100nmol/l終濃度に相当
1.95℃にて3秒間変性
2.68℃から62℃の温度にて2秒間プライマーハイブリダイゼーション(「タッチダウン・アニーリング」)
3.72℃にて40秒間重合
増幅された断片を検出するために、反応混合物中で用いられるFRET標識化ハイブリダイゼーションプローブ対(実施例2を参照)が用いられ、一方のハイブリダイゼーションプローブパートナー(配列ID番号:4)は供与体成分として3'末端ヌクレオチドにフルオレセインを伴い、個々の場合で異なるハイブリダイゼーションプローブパートナー(配列ID番号:5または6)は受容体成分として5'末端ヌクレオチドにライトサイクラーレッド640(LightCycler Red)(登録商標)を伴う。最後の増幅サイクルの直後に、ハイブリダイゼーションプローブを用いた検出中に行われる融解曲線分析は、増幅された断片の95℃にて30秒間の変性で始まり、続いて上述のFRET対を用いたハイブリダイゼーションを38℃にて30秒間行う。ハイブリダイゼーションの融解曲線を決定するために、温度はその後連続的に38℃から80℃へ、毎秒0.2℃の速度で上昇させ、結合したFRET対によって放出される蛍光を連続的に記録する。蛍光は少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブパートナーが溶解すると直ちに規則的に消滅する。蛍光シグナルを評価するために、バージョン3.5.3のライトサイクラー「運転プロファイル」プログラムが用いられ、ライトサイクラーシステムの光度検出器のF2およびF3チャンネルの増幅が自動的に調節される。
比較試験において、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌および弱毒化ウシ型結核菌を含む異なる試料が本発明に記載の方法に、および従来の硝酸還元酵素検査に供された(図4)。
ヒト型結核菌:
1.H37Rv 野生型;
2.H37Rv narG (T−215C)
3.エルトマン(Erdmann)野生型;
4.エルトマン(Erdmann)narG(T−15C)
ウシ型結核菌:
5.野生型
弱毒化ウシ型結核菌
6.野生型
Claims (51)
- 生物試料中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis(ヒト型結核菌))の特異的検出のための方法であって、
核酸増幅法が配列ID番号:1で示される配列に由来するDNA断片を増幅するのに適したプライマーを用いて実施され、その配列がnarGHJI硝酸還元酵素オペロンの領域に由来する断片を含み、そのDNA断片がnarGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位を含む
およびその場合に、narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位に、ヒト型結核菌に特異的な多型が検出される方法。 - 核酸増幅がPCR、NASBA、SDAまたはLCRによって行われる点で特徴づけられる請求項1に記載の方法。
- PCRがリアルタイムPCRである点で特徴づけられる請求項2に記載の方法。
- ヒト型結核菌に特異的な多型の検出が1つまたはいくつかのプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって実施される点で特徴づけられる請求項1から3に記載の方法。
- 増幅されたDNA断片が少なくとも1および最大500ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項1から4に記載の方法。
- 増幅されたDNA断片が少なくとも1および最大300ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項1から4に記載の方法。
- 増幅されたDNA断片が少なくとも1および最大155ヌクレオチドの長さを有する点で特徴づけられる請求項1から4に記載の方法。
- プライマー対が配列ID番号:2および配列ID番号:3を有する配列またはその相補配列のうち少なくとも1つを有する点で特徴づけられる請求項1から7に記載の方法。
- ヒト型結核菌に特異的な多型の検出が、標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも1つの対を用いて行われ、一方のプローブは3'末端で、および他方のプローブは5'末端で標識化され、およびプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が可能になるような方法で特異的に増幅物と結合する点で特徴づけられる請求項1から8に記載の方法。
- プローブ対が配列ID番号:4および5またはその相補配列を有する配列および/または配列ID番号:4および6またはその相補配列を有する配列を持つ点で特徴づけられる請求項9に記載の方法。
- 試料が唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、液、骨髄、血液および生検から成る臨床試料の群から選択される点で特徴づけられる請求項1から10に記載の方法。
- narGHJI硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む配列ID番号:1に示される配列に由来するDNA断片の増幅に適し、そのDNA断片はnarGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位を含む点で特徴づけられるプライマー対。
- 少なくとも1つのプライマーが配列ID番号:2に示される配列または相補配列を示す点で特徴づけられる請求項12に記載のプライマー対。
- 少なくとも1つのプライマーが配列ID番号:3に示される配列または相補配列を示す点で特徴づけられる請求項12に記載のプライマー対。
- プライマーが配列ID番号:2に示される配列および配列ID番号:3に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項12に記載のプライマー対。
- 配列ID番号:2に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるプライマー。
- 配列ID番号:3に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるプライマー。
- 請求項16および17に記載のプライマーまたは請求項13から16に記載のプライマー対の、ヒト型結核菌の特異的検出のための使用。
- narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適している点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適している点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ対。
- 少なくとも1つのプローブが配列ID番号:4に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項20に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- 少なくとも1つのプローブが配列ID番号:5に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項20に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- 少なくとも1つのプローブが配列ID番号:6に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項20に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- プローブが配列ID番号:4および配列ID番号:5に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項20に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- プローブが配列ID番号:4および配列ID番号:6に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられる請求項20に記載のハイブリダイゼーションプローブ対。
- 配列ID番号:4に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- 配列ID番号:5に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- 配列ID番号6に示される配列またはその相補配列を示す点で特徴づけられるハイブリダイゼーションプローブ。
- ヒト型結核菌の特異的検出のための請求項26から28に記載のハイブリダイゼーションプローブまたは請求項21から25に記載のハイブリダイゼーションプローブ対の使用。
- 請求項1から11に記載の方法を実施するためのキット。
- narGHJI硝酸還元酵素オペロンの部分に由来する断片を含む配列ID番号:1に示される配列に由来するDNA断片の増幅に適し、そのDNA断片はnarGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位を含む、少なくとも1つのプライマー対を含み、および/または
narGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向において−215位に位置するヒト型結核菌に特異的な多型の特異的検出に適している、少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブまたはハイブリダイゼーションプローブ対を含む
請求項30に記載のキット。 - プライマー対が請求項15に記載のプライマー対である点で特徴づけられる請求項31に記載のキット。
- ハイブリダイゼーションプローブ対が請求項24に記載のプローブ対および/または請求項25に記載のプローブ対である点で特徴づけられる請求項31に記載のキット。
- プライマー対が請求項15に記載のプライマー対である点で特徴づけられる点で特徴づけられる請求項33に記載のキット。
- 核酸増幅および/または検出反応を実施するのに必要なまたは有用な、他の試薬および/または補助物質を含む点で特徴づけられる請求項30から34に記載のキット。
- a)微生物DNAの臨床材料からの抽出、
b)抽出されたDNAに由来するヒト型結核菌に特異的な少なくとも1つのDNA多型を含む、抗酸菌のnarGHJI硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域の少なくとも1つのDNA断片の増幅、
c)配列ID番号:5、配列ID番号:5に対する相補配列、配列ID番号:6、および配列ID番号:6に対する相補配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブとの、増幅されたDNA断片の特異的ハイブリダイゼーションの検出、
融解曲線分析によって行われる、ウシ型結核菌、弱毒化ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌およびネズミ型結核菌に対するヒト型結核菌の特異的検出
の段階を含む、臨床材料中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis(ヒト型結核菌))の特異的検出のための方法。 - DNA多型がnarGHJI硝酸還元酵素オペロンの翻訳開始コドンGTGの読み上流の5'から3'方向においてプロモーター領域の−215位に位置する、請求項36に記載の方法。
- 増幅が段階b)において配列ID番号:2/配列ID番号:3のヌクレオチド配列を含むプライマー対によって行われる、請求項37に記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションが段階c)において、配列ID番号:4/配列ID番号:5のヌクレオチド配列またはその相補配列の対および/または配列ID番号:4/配列ID番号:6のヌクレオチド配列またはその相補配列の対を含む標識化ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも1つの対を用いて行われる、請求項36から38のうちの1つに記載の方法。
- DNA断片のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増加が好ましくはリアルタイムPCRとして、好ましくはライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)システムを用いて実施される、前記請求項のうちの1つに記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションの段階がDNA断片の増幅中または増幅後に行われる、前記請求項のうちの1つに記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションおよびその検出がリアルタイムPCRで、好ましくはライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)システムで行われる、前記請求項のうちの1つに記載の方法。
- 特異的ハイブリダイゼーションの検出が蛍光検出によって実施され、および標識化ハイブリダイゼーションプローブ対が蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)対として形成される、前記請求項のうちの1つに記載の方法。
- 臨床材料が、唾液、気管支洗浄液、胃液、尿、糞便、液、骨髄、血液および生検から成る臨床試料の群から選択される、前記請求項のうちの1つに記載の方法。
- narGHJI硝酸還元酵素遺伝子のヒト型結核菌特異的プロモーター領域のDNA断片の増幅のための、配列ID番号:2/配列ID番号:3のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー対。
- 配列ID番号:5のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むnarGHJI硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 配列ID番号:6のヌクレオチド配列またはその相補配列を含むnarGHJI硝酸還元酵素オペロンのヒト型結核菌特異的プロモーター領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 配列ID番号:4/配列ID番号:5のヌクレオチド配列またはその相補配列の対を含むオリゴヌクレオチド対。
- 配列ID番号:4/配列ID番号:6のヌクレオチド配列またはその相補配列の対を含むオリゴヌクレオチド対。
- a)配列ID番号:2/配列ID番号:3のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのプライマー対および
b)配列ID番号:4/配列ID番号:5のヌクレオチド配列またはその相補配列の対少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブ対および/または配列ID番号:4/配列ID番号:6のヌクレオチド配列またはその相補配列の対を含む少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブ対
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis(ヒト型結核菌))の特異的検出のためのキット。 - ヒト型結核菌による感染の特異的検出のための、配列ID番号:6で示される核酸配列またはその相補配列を含む抗酸菌のnarGHJI硝酸還元酵素オペロンのプロモーター領域中のヒト型結核菌特異的DNA多型の使用。
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