CN111763751A - 结核病唾液检测生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的用途。本发明首次发现结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的作用，能够快速检测结核菌感染，样本易获得，检测效率高，速度快，无污染，成本低，具有很高的敏感性和特异性。

Description

结核病唾液检测生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种结核病唾液检测生物标志物及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis,简称结核杆菌tubercle bacilli)引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。肺结核如果不及时治疗，不仅会影响人体健康，而且影响生活、工作，甚至危及生命；同时，结核病传染性极强，很容易使周围人造成感染。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现，免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中5％-10％携带者可发展为活动性肺结核。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此结核病又成为了威胁人类健康的全球性的卫生问题。
目前肺结核可以通过痰涂片检查进行诊断。痰结核菌图片检查较为简便，成本低，一般24小时内得到结果，但特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，无法辨别结核分枝杆菌和其它类分枝杆菌；敏感性低，通常需要5000-10000条菌/ml才能够得到阳性结果。采用痰结核菌常规培养进行诊断，可信度高，但培养时间长，需要4-6周才能得出结果，应用国外进口的聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒，采取一步法技术，是目前的另一种辅助诊断方法，优点是敏感性可达80％～90％，但特异性不足，价格也比较昂贵。国内也有采取类似技术开发出PCR核酸分枝杆菌核酸检测试剂盒，同样也出现假阳性的问题。
以上三种方法均需提取患者气管或支气管深部的痰液样本而痰液有时不容易提取。如果提取不到的话，很容易造成漏诊或误诊。这是它们共同的不足之处。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于结核病唾液检测生物标志物及其应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的用途。
本发明第二方面提供特异性识别结核菌rpoB基因的物质用于制备结核病唾液检测产品的用途。
本发明第三方面提供一种结核病唾液检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别结核菌rpoB基因的物质。
如上所述，本发明的唾液外泌体在结核病检测中的应用，具有以下有益效果：
本发明首次发现结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的作用，能够快速检测结核菌感染，检测效率高，样本易获得，速度快，无污染，成本低，具有很高的敏感性和特异性。
附图说明
图1：采用本发明所述的唾液外泌体中的结核菌rpoB基因进行RT-PCR扩增电泳图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
各种原料和试剂均购自商业供应商，未经进一步纯化，除非另有说明。易受潮的原料和试剂均存放于全密封瓶中，并直接使用，均未经过特殊处理。
本发明提供结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的用途。
所述结核病唾液检测产品包括特异性识别结核菌rpoB基因的物质。
结核菌rpoB基因的Genbank号为MG676199 1。
本发明提供特异性识别结核菌rpoB基因的物质用于制备结核病唾液检测产品的用途。
所述结核病唾液检测产品以唾液作为检测样本来源。
进一步的，所述结核病唾液检测产品可以检测唾液外泌体中是否含有结核菌rpoB基因。
所述结核病唾液检测产品检测所需唾液样本用量为1-1.5毫升。
所述结核病检测产品用于结核菌感染的判断、治疗方案的选择、治疗疗效的判断和/或预后评估。
结核病的预后评估是指对结核病病人的病程和/或结局进行预后判断。
所述用药疗效的判断是指，在患者治疗一段时间后，利用本发明的的产品进行检测，判断患者是否痊愈。
所述结核病可选自肺结核。
进一步的，所述结核病检测产品是指是指用于检测唾液样本中外泌体中的结核菌rpoB表达量的产品，根据检测结果以对病人是否患有结核病、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。
需要说明的是，所述结核病检测产品并不限定为必须为液体形式。
所述特异性识别结核rpoB基因的物质可选自特异性扩增结核菌rpoB基因的引物。
在一种实施方式中，所述特异性扩增rpoB基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的结核菌上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
具体的，上游引物：tcaaggagttcttcggcaccagc(SEQ ID NO：1),
下游引物：gtagtgcgacgggtgcacgt(SEQ ID NO：2)。
本发明提供的结核病唾液检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别结核菌rpoB基因的物质。
所述特异性识别结核菌rpoB基因的物质可选自特异性扩增结核菌rpoB基因的引物。
所述特异性扩增结核菌rpoB基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
在一种实施方式中，所述结核病唾液检测试剂盒中还包括核酸纯化液，所核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000031
Figure BDA0002326756120000041
具体的，所述核酸纯化液中，十二烷基硫酸钠的含量为5g/100ml-50g/100ml。例如，十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为50g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-10g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-15g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-20g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-25g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-30g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-35g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-40g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-45g/100ml。
十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml-50g/100ml。
在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000051
在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000052
Figure BDA0002326756120000061
在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000062
在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000063
在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure BDA0002326756120000064
Figure BDA0002326756120000071
在一种实施方式中，所述核酸纯化液中，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
在一种实施方式中，所述核酸纯化液中，十二烷基硫酸钠的终浓度为40g/100ml，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
唾液中的核酸可通过以下方法纯化提取：将唾液样本的离心后上清液加入核酸纯化液混合处理，沉淀，得纯化后的核酸。
纯化核酸时，所需唾液样本用量为1-1.5毫升。
唾液样本的离心条件为：2000-3000g/min，离心10-15min。
优选的，所述沉淀核酸的方法为：加入异丙醇，混合，离心，弃上清液，得核酸沉淀。进一步的，离心条件为：11000g/min，离心10-15min。
优选的，所述洗涤核酸的方法为采用乙醇水溶液进行洗涤。具体的，将核酸沉淀与乙醇水溶液混合，离心，弃去上清液，得到纯化的核酸。进一步的，离心条件为：10000-20000g/min，离心10-15min。
优选的，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为75-80％。
优选的，所述纯化方法还包括以下步骤：将得到的纯化的核酸溶解保存。
进一步的，用于溶解所述纯化的核酸的试剂中不含核酸酶。
优选地，用于溶解所述纯化的核酸的试剂为水。
实施例1唾液中微量核酸的纯化
1.样本来源：
收集上海市肺科医院2019年2月至2019年8月收治住院的痰抗酸杆菌涂片阳性的初治肺结核患者。留取唾液标本前，尚未进行抗结核治疗。
留取方法：采集前病人以清水漱口3-4次，除去口腔黏液和食物残渣。漱口后静止5分钟，将唾液2毫升由舌下或两颊分泌出，吐于1带盖的唾液收集管内，采集的样本应立即置于摄氏4度冰箱里。
总共收集112例。其中男性56例，女性56例，男女比例1:1。平均年龄49.7±16.1岁。
2.采用以下步骤进行唾液中微量核酸的纯化：
1)空腹3小时，清水漱口3-4遍，去除口腔食物残渣和黏液；
2)取1-1.5毫升唾液至高温高压处理过的有盖实验管。
3)将样本转置于1.5毫升的高温高压处理过的离心管，2000g/分，离心10-15分钟；
4)取上清液50微升，置于高温高压处理过的1.5毫升离心管；
5)加入200微升核酸纯化液，充分混合10分钟；
6)加入200微升异丙醇，充分混合5分钟；
7)11000g/分离心15分钟，弃去上清液；
8)加入500微升75-80％乙醇清洗核酸沉淀；
9)11000g/分离心5分钟，弃去上清液；
10)室温空气干燥核酸沉淀；
11)溶解核酸沉淀于10微升不含核酸酶的蒸馏水，得到核酸样本，保存备用。
步骤5)中，按如下配方配制核酸纯化液，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：
Figure BDA0002326756120000081
实施例2纯化结果分析
用rpoB基因的特异性扩增引物对实施例1中得到的核酸样本PCR的扩增(PCR)，用rpoB基因的特异性扩增引物的序列为：
上游引物：(SEQ ID NO：1)：tcaaggagttcttcggcaccagc
下游引物：(SEQ ID NO：2)：gtagtgcgacgggtgcacgt
表1扩增反应体系
dNTP 1.2μL
10X EX buffer 2.0μL
引物mix(5μM) 2.0μL
模板DNA 1.0μL
DNase-Free H<sub>2</sub>O 5.1μL
(2)PCR结果进行进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果证明：
经本发明所述方法可知，所述112份样本中，有98例为阳性。2例微弱条带，12例为阴性。
阳性对照：入院后，所述患者进行痰抗酸杆菌涂片筛查，结果为均为阳性。
对比对照：所述患者进行痰分枝杆菌培养，结果为阴性3例，非结核分枝杆菌9例，其余100例均为结核分枝杆菌。
与阳性对照方法相比，本发明所述方法的敏感性为87.5％。对比对照与阳性对照相比，敏感性为89.5％。可见，本发明的敏感性较高。同时，本发明测试速度快，取样后1-2天即可得出检测结果，是一种可选的结核病检测手段。也可辅助进行结核病检测。
本发明还在对健康人进行抽样检测，测试人数为100人，采用本发明的检测方法，所述样本均为阴性。可见，本发明的特异性高。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海力拜生物科技有限公司
<120> 结核病唾液检测生物标志物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaaggagtt cttcggcacc agc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtagtgcgac gggtgcacgt 20

Claims (12)

1.结核菌rpoB基因作为生物标志物在制备结核病唾液检测产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述结核病唾液检测产品包括特异性识别结核菌rpoB基因的物质。
3.特异性识别结核菌rpoB基因的物质用于制备结核病唾液检测产品的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述结核病唾液检测产品以唾液作为检测样本来源；
2)所述结核病唾液检测产品检测所需唾液样本用量为1-1.5毫升；
3)所述结核病唾液检测产品用于结核病的判断、治疗方案的选择、治疗疗效的判断和/或预后评估；
4)所述结核病选自肺结核。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述特异性识别结核菌rpoB基因的物质选自特异性扩增结核菌rpoB基因的引物。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述特异性扩增结核菌rpoB基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
7.一种结核病唾液检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别结核菌rpoB基因的物质。
8.如权利要求7所述的结核病唾液检测试剂盒，其特征在于，所述特异性识别结核菌rpoB基因的物质选自特异性扩增结核菌rpoB基因的引物。
9.如权利要求8所述的结核病唾液检测试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增结核菌rpoB基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
10.如权利要求7所述的结核病唾液检测试剂盒，其特征在于，所述结核病唾液检测试剂盒中还包括核酸纯化液，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure FDA0002326756110000011
11.如权利要求10所述的结核病唾液检测试剂盒，其特征在于，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：
Figure FDA0002326756110000021
12.如权利要求10所述的结核病唾液检测试剂盒，其特征在于，所述核酸纯化液中，十二烷基硫酸钠的终浓度为40g/100ml，和/或，所述核酸纯化液中，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。
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