KR101329316B1 - 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고리매개등온증폭법 (Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)을 이용하여 소량의 멍게편모충 감염도 빠르게 확인할 수 있는 검사법을 제공한다. LAMP 반응을 이용한 고감도 검사법을 개발하기 위해 멍게 편모충의 동원핵 18S 리보솜 단백질 유전자를 표적으로 하여 특수한 고리형태의 반응산물이 증폭될 수 있도록 6개의 프라이머로 이루어진 고리매개등온증폭법 프라이머 세트를 제작하여 최적의 반응 조건을 확립한 후 멍게편모충 및 물렁증 멍게를 대상으로 민감도와 특이도를 분석하였다. 이로부터 해수 또는 물렁증 초기 멍게로부터 고리매개 등온증폭 반응을 이용하여 신속하고 빠르게 멍게 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충을 검출함으로써 양식 멍게 물렁증 예보시스템에 적용하여 피해 확산을 조기에 차단할 수 있다.
Description
본 발명은 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
멍게는 우리나라, 일본의 북해도 지방 및 일부 아시아 국가의 기호식품으로서, 최근 멍게류에서 콜라겐, 바나듐, 식이섬유 및 콘드로이친 같은 생리활성 물질 외에 천연 항암 및 항생 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 밝혀짐에 따라 그 수요가 증가하고 있다.
그러나 1970년대 후반부터 양식산 멍게가 일명 물렁병 또는 쪼그랑증 등의 질병으로 인해 대량 폐사가 발생하고 있으며, 이로 인해 폐사율이 연간 양식량의 최고 80%에 달하고, 연간 피해 금액이 약 200 ~400억 원이 이르는 것으로 추정되고 있다(멍게수하식수협, 2007).
멍게 물렁증(피낭연화증)은 병원체에 감염된 멍게 껍질(피낭)이 물렁해지면서(연화) 얇아지며 비이상적으로 점액성 물질이 증가하며, 피낭이 괴사 또는 천공되어 내부조직이 유출되는 외형적 특징을 가지고 있으며, 식용으로 사용되는 멍게 안쪽 육질은 감염되지 않는다. 현재 멍게 물렁증은 멍게 양식 주산지를 중심으로 발생하고 있으며, 우리나라는 통영, 일본은 미야기현 앞바다에서 주로 발생하는 것으로 알려져 있다.
멍게 물렁증은 수온이 12-13℃ 정도로 낮은 12월 이후에 발생하여 15℃ 전후의 6-7월경에 가장 심하고 해수온이 20℃를 넘기는 8월 이후에는 발생하지 않는 것으로 알려져 있다. 멍게 물렁증은 만 1년이 되지 않은 멍게보다 2-3년 정도 자란멍게에서 주로 발생하며 누적폐사율은 20-100%로 일단 물렁증이 발생하면 회복되지 않는 것으로 알려져 있다. 멍게 물렁증은 멍게편모충 (Azumiobodo hoyamushi)에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 양식 멍게의 대량 폐사는 국내 멍게 양식업계에 막대한 직접적 경제적 손실을 가져올 뿐만 아니라 국내 생산 멍게의 해외수출에도 큰 장애가 되고 있다.
멍게 질병의 원인을 밝혀내기 위한 환경적 요인 조사(수온, 염분, 용존 산소, pH, 클로로필 α 함량 등), 생리적 요인 조사(산지별 멍게의 성장 상태), 세균학적 조사(소화선 내 총 세균수), 및 분자유전학적 접근 등의 연구가 진행되고 있지만, 현재까지 대량 폐사의 원인이 명확히 밝혀지지 않아, 이에 대한 예방 및 대책이 미비한 실정이다.
한편, 고리매개 등온증폭법 (Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)은 기존의 중합효소 연쇄반응 (PCR) 이 변성 (denaturation), 접합(annealing), 신장 (extension) 세 가지 온도변화를 주어야 하는 반면 고리매개 등온증폭법은 한 가지 온도에서 DNA 증폭 반응이 일어나기 때문에 중합효소 연쇄반응처럼 별도의 특수한 기기 (PCR machine)가 필요하지 않다.
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 등온증폭법은 60~65℃에서 1시간 내에 목표 핵산을 109 copies로 증폭시킬 수 있으므로 64 ~ 65도 정도의 항온유지 장치만 있으면 측정 가능하고 검사시간이 30-60분 정도로 짧고 육안으로 관찰이 가능하고 고가의 장비의 구입 및 장비 운용에 필요한 전문지식의 습득이 불필요하여 간편하고 쉽게 DNA를 증폭할 수 있다. 이 방법은 강력한 strand displacement activity의 DNA polymerase에 의한 autocycling strand displacement DNA 합성에 기초하고 있는데, 등온 조건하에서 반응이 일어나기 때문에 실험 자체가 아주 간단하고, 온도 변화에서 시간의 손실이 없기 때문에 증폭효율이 매우 높다.
또한, template DNA의 특정 6 부위 중 4곳 혹은 6곳 모두에 특이적인 4 종 혹은 6종의 프라이머가 있어야 하므로, 검출의 정확도와 신뢰도가 매우 높다. 결과 판독은 부산물 magnesium pyrophosphate가 백색의 침전물이나 젤 전기영동, 혹은 interchelating 형광 dye에 의해 가능하며, 미생물 검출에서는 PCR에 비해 훨씬 빠른 시간 내에 신뢰도 높은 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명은 양식생물 환경내성 및 폐사 메카니즘 규명 연구를 통하여 수행하는 멍게 물렁증의 고감도 진단법의 개발을 목적으로 본 발명은 고리매개 등온증폭법 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하여 고감도로 신속하게 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출할 수 있는 프라이머를 제공하고자 한다.
본 발명은 현재 감염진단에 많이 활용되는 중합효소연쇄반응법(PCR) 보다 감도와 특이성이 뛰어난 것으로 알려진 고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)을 이용하여 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출할 수 있는 프라이머와 이를 이용하여 소량의 멍게편모충 감염에도 빠르게 반응, 확인할 수 있는 검사방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 등온증폭반응을 통해 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하기 위한 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 제공하며, 등온증폭반응용 프라이머 및 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 포함하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 프라이머 키트를 제공한다.
상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 멍게를 채취하여 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 이용하여 멍게편모충의 동원핵 18S 리보솜 DNA (ribosomal DNA, rDNA) 유전자의 등온증폭반응을 수행하여 유전자의 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi) 검출방법을 제공한다.
또한 본 발명은 멍게를 채취하여 시료를 준비하는 단계; 시료에서 멍게 편모충의 동원핵 18S 리보솜 단백질을 분리하는 단계; 상기 분리된 멍게 편모충의 동원핵 18S 리보솜 단백질을 주형으로 하여, 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 유전자의 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하는 방법을 제공함으로서 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 탁도계, 형광시약 또는 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다
본 발명의 프라이머는 멍게 물렁증의 원인체인 멍게편모충의 동원핵 18S 리보솜 DNA (ribosomal DNA, rDNA) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있고, 해수 또는 물렁증 초기 멍게로부터 고리매개 등온증폭 반응을 이용하여 신속하고 빠르게 멍게 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충을 검출함으로써 양식 멍게 물렁증 예보시스템에 적용하여 피해 확산을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 고리매개 등온증폭 반응에 필요한 6종의 프라이머를 구성하는 각 염기서열의 명칭 및 방향을 나타낸다.
도 2는 고리매개증폭반응을 이용한 멍게편모충의 감염 여부를 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 각기 다른 농도의 멍게편모충 DNA에 대한 고리매개등온증폭반응의 실시간 흡광도 측정 곡선을 나타낸다.
도 4은 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 실시한 후 균주 개수별 반응산물을 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 5는 정상 멍게와 물렁증 DNA에 대한 고리매개등온증폭 반응의 실시간 흡광도 곡선을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트가 세균성 멍게 질병을 유발할 수 있는 다른 병원성 세균에 대해 교차반응을 일이키지 않고 멍게 편모충에 특이적인 결과를 나타낸다.
도 2는 고리매개증폭반응을 이용한 멍게편모충의 감염 여부를 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 각기 다른 농도의 멍게편모충 DNA에 대한 고리매개등온증폭반응의 실시간 흡광도 측정 곡선을 나타낸다.
도 4은 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 실시한 후 균주 개수별 반응산물을 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 5는 정상 멍게와 물렁증 DNA에 대한 고리매개등온증폭 반응의 실시간 흡광도 곡선을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트가 세균성 멍게 질병을 유발할 수 있는 다른 병원성 세균에 대해 교차반응을 일이키지 않고 멍게 편모충에 특이적인 결과를 나타낸다.
본 발명은 현재 감염진단에 많이 활용되는 중합효소연쇄반응법 (PCR) 보다 감도와 특이성이 뛰어난 것으로 알려진 고리매개등온증폭법 (Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)을 이용하여 소량의 멍게편모충 감염도 빠르게 확인할 수 있는 검사법에 관한 것이다.
LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4 종의 프라이머가 필요하고 반응 속도를 향상시키기 위해 2 종의 프라이머를 추가하여 전체 6 종의 각기 다른 염기서열의 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머가 반응에 필요하다.
기본 4 종 프라이머는 외부 (outer) 프라이머 2 종과 내부 (internal) 프라이머 2 개로 구성된다. 외부(outer) 프라이머는 전방 외부(forward outer, F3) 프라이머와 후방 외부(backward outer, B3) 프라이머 2 종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step)동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다.
내부(inner) 프라이머는 전방 내부(forward inner, FIP) 프라이머와 후방 내부 (forward inner, BIP)프라이머 2종으로 구성되고 고리매개등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 순방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다.
추가 2종 프라이머는 전방 고리(forward loop, LF) 프라이머와 후방 고리 (backward loop, LB) 프라이머 2 종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 포함하는 멍게편모충을 검출하기 위한 고리매개 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다. 상기 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트는 멍게편모충을 진단하는데 이용되는 염기서열이다.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 각각 18개, 20개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되며, 서열번호 3의 서열 내의 21개, 18개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되며, 서열번호 4의 서열 내의 21개, 19개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성된다.
서열번호 5의 서열 내의 25개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되며, 서열번호 6의 서열 내의 19개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성된다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
LAMP 반응을 이용한 멍게 편모충의 고감도 검사법을 개발하기 위해 멍게 편모충의 동원핵 18S 리보솜 단백질 유전자를 표적으로 하여 특수한 고리형태의 반응산물이 증폭될 수 있도록 6개의 프라이머로 이루어진 고리매개등온증폭법 프라이머 세트를 제작하여 (도 1) 최적의 반응 조건을 확립한 후 멍게편모충 및 물렁증 멍게를 대상으로 민감도와 특이도를 분석하였다.
이하 실시예를 중심으로 6 종의 프라이머에 의해 이루어지는 고리매개 등온 증폭 반응실험에 대해 설명한다.
실시예 1. 감염 의심 멍게로부터 genomic DNA의 분리
멍게 물렁병의 원인체 (AsSTF, AsSTS(soft tunic syndrome in ascidian, Halocynthia roretzi)-associated flagellate)를 분리하기 위하여 정상 멍게 및 멍게 물렁병 감염 개체 또는 감염 의심개체를 준비한 후, 상기 멍게의 외피 (tunic)을 제거하였다.
이를 멸균한 후 0.22um에 여과된 해수에 3-4회 세척하였다. 상기 과정을 통해 하나의 개체로부터 분리하고 세척한 멍게의 외피 (tunic)를 0.2 x 0.2 cm의 크기를 자르고, 6 웰 배양 플레이트에 넣은 후, 멸균 후 0.22um에 여과된 해수를 1000 μl /well로 넣었다.
15-30분 후, 웰 내의 suspension 용액을 피펫으로 모으고, 이를 1500g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 버린 다음 침사를 200 μl PBS로 재부유한 다음 genomic DNA를 분리하여 멍게편모충 검출을 위한 고리매개등온증폭반응에 이용한다.
실시예 2. 멍게편모충 검출을 위한 고리매개 등온증폭반응 (LAMP)용 프라이머의 설계
고리매개 등온증폭법을 이용하여 병원체의 특정 유전자를 증폭하는 경우, 반응 초기 DNA 증폭산물이 고리형태를 이루도록 하여 DNA 증폭이 계속되면 최종적으로 전기영동을 했을 때 사다리형태의 특징적인 형태를 나타내어야 하며 이를 위해 기존 중합효소 연쇄반응과 달리 4종 혹은 6종의 특수 설계된 프라이머를 필요로 한다.
LAMP 반응을 이용한 고감도 검사법을 개발하기 위해 멍게 편모충의 동원핵 18S 리보솜 단백질 유전자를 표적으로 하여 특수한 고리형태의 반응산물이 증폭될 수 있도록 6개의 프라이머로 이루어진 고리매개등온증폭법 프라이머 세트를 제작하여 최적의 반응 조건을 확립한 후 멍게편모충 및 물렁증 멍게를 대상으로 민감도와 특이도를 분석하였다.
도 1은 본 발명의 고리매개 등온증폭 반응에 필요한 6종의 프라이머를 구성하는 각 염기서열의 명칭 및 방향을 나타낸다. 멍게 편모충 동원핵 18S 리보솜 RNA 유전자의 염기서열 (GenBank accession no. AB636162)전체를 분석하여 6 종의 고리매개 등온증폭 반응용 프라이머를 설계하였다. 프라이머로 설계하기 가장 적합한 부위는 유전자 개시 염기서열에서 1537 번째 뉴클레오티드에서 1742까지가 가장 적합한 것으로 판단하여 프라이머를 제작하였다.
1) 외부 프라이머 2종의 설계
- 전방 외부 프라이머 (F3) : 멍게 편모충 동원핵 18S 리보솜 RNA 유전자의 1537-1554 번째의 순방향 염기서열에 해당되는 18개의 뉴클레오티드로 제작하였다(서열번호 1).
- 후방 외부 프라이머 (B3) : 멍게 편모충 동원핵 18S 리보솜 RNA 유전자의1723-1742 번째의 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는 20개의 뉴클레오티드로 제작하였다(서열번호 2).
2) 내부 프라이머 2종의 설계
- 전방 내부 프라이머(FIP) : 두 개의 서로 다른 부위 (F1c 와 F2)의 염기서열을 토대로 설계된 프라이머로 39 개의 뉴클레오티드로 구성되며 프라이머 앞부분 21 개의 뉴클레오티드는 F1c (1602-1622)부분 염기서열에 대해 역방향으로 상보적인 염기에 해당하며 전방 내부 프라이머 뒷부분은 F2 부분 (1555-1572)에 대한 순방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드를 결합해서 프라이머를 제작하였다 (서열번호 3).
- 후방 외부 프라이머(B3) : 두 개의 서로 다른 부위 (B1c 와 B2)의 염기서열을 토대로 만들어진 프라이머로 40 개의 뉴클레오티드로 구성되며 프라이머 앞부분 21 개의 뉴클레오티드는 그림 1의 B1c (1646-1666)부분 염기서열의 순방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드와 프라이머 뒷부분은 그림 1의 B2 부분 (1723-1740)에 대해 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는19개의 뉴클레오티드를 결합해서 프라이머를 제작하였다 (서열번호 4).
3) 추가 2종 고리 프라이머
- 전방 고리 프라이머 (LF) : 내부 및 외부 프라이머가 부착되지 않는 부위 (1753-1597)의 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는 25 개의 뉴클레오티드로 제작하였다 (서열번호 5).
- 후방 고리 프라이머 (LB) : 전방 고리 프라이머와 마찬가지로 내부 및 외부 프라이머가 부착되지 않는 부위 (1667-1685)의 순방향 염기서열에 해당하는 19개의 뉴클레오티드로 구성되어진 프라이머로 제작하였다 (서열번호 6).
표 1은 멍게물렁증을 유발하는 멍게 편모충 검출을 위한 고리매개등온증폭반응용 프라이머 6종 1 세트와 각 프라이머의 염기서열을 나타낸다.
| 개발단계의 프라이머 명칭 |
Sequence (5'- 3') | LAMP용 멍게 편모충 프라이머의 정식 명칭 |
| F3 | GAATGGTGGTGCATGGCC (서열번호 1) | AH-F3 |
| B3 | GCCCAAAATCTCACCTCGTT (서열번호 2) | AH-B3 |
| FIP (F1c-F2) | CTACTGGGCGGCTTGGATCTC-GCTTTTGGTCGGTGGAGT (서열번호 3) |
AH-FIP |
| BIP (B1c-B2) | AGCAATCCTCTTGCTCGGCTT-AGGAATCCCGCAGAGAAGG (서열번호 4) |
AH-BIP |
| LF | GTTGACGGAATCAACCAAACAAATC (서열번호 5) | AH-LF |
| LB | CGGCTGACTGAGGCAACCT (서열번호 6) | AH-LB |
상기에서 제작한 각각의 외부, 내부 순환 프라이머 (F3, B3, FIP, BIP, LB, LB)들에 대해 멍게편모충의 학명 (Azumiobodo hoyamushi)에서 속명 ( A zumiobodo) 및 종명( h oyamushi)의 첫문자를 조합하여 각각 AH-F3, AH-B3, AH-FIP, AH-BIP, AH-LF, AH-LB로 명명하였다.
이상 6 종의 프라이머를 이용하여 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)에 대한 고리매개 등온 증폭 반응을 실시하였다. 고리매개 등온증폭반응은 이하의 문헌에 의한 방법으로 실시하였다.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9.
실시예
3.
멍게물렁증을
유발하는 멍게 편모충 검출 실시 결과
본 발명의 멍게 물렁증을 유발하는 멍게편모충의 동원핵 18S 리보솜 DNA를 표적으로 6개 프라이머가 한 세트를 이루어 사다리형태로 DNA가 증폭되도록 특수하게 설계되어 있다.
PCR DNA 중합효소반응을 이용하여 병원체를 검출하는 경우 반응 산물을 한천젤 전기영동법을 실시하여 확인해야 하지만 본 프라이머 세트를 이용한 고리매개중합효소반응을 이용하면 육안으로도 검출이 가능하여 매우 간편하게 멍게 물렁증 감염 여부를 확인할 수 있다.
도 2는 고리매개증폭반응을 이용한 멍게편모충의 감염 여부 확인 결과를 나타낸다. 도 2의 (가)는 탁도계를 이용하여 실시간 흡광도의 변화를 확인하여 양성, 음성을 확인한 결과를 나타낸 것이고, (나)는 형광시약을 첨가하여 고리매개등온증폭반응을 실시한 것으로, 육안으로 녹색으로 관찰되는 것이 양성, 연한 갈색으로 나타나는 것이 음성을 나타낸다. (다)는 고리매개등온증폭반응 산물을 전기영동한 경우를 나타내며, 특징적인 사다리형 DNA형 전기영동 형태가 관찰되면 양성으로 판별된다는 것을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명의 프라이머는 멍게 물렁증의 원인체 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있고, 해수 또는 물렁증 초기 멍게로부터 고리매개 등온증폭 반응을 이용하여 신속하고 빠르게 멍게 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충을 검출할 수 있다.
도 3은 멍게 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충의 각기 다른 농도 (1ng 내지 100 fg)의 멍게편모충 DNA에 대한 고리매개등온증폭반응의 실시간 흡광도 측정 곡선을 나타낸다. 본 발명에서의 멍게 편모충의 농도는 1ng, 100pg, 10pg, 1pg 및 100fg에 대하여 실험하였고 도 3의 실시간 흡광도 측정 곡선에 의하면 흡광도 및 육안판별에 의해 100fg까지 고리매개등온증폭 반응이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로부터 100fg의 멍게 편모충의 DNA까지 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다(도 3).
도 4는 해수 중에 각각 다른 숫자 (1000마리 내지 0.01마리)의 멍게편모충이 들어 있을 때, 본 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 실시한 후, 전기영동을 하였을 때, 어느 정도의 범위까지 검출할 수 있는지를 실험한 결과이다. 실험 결과에 의하면, 0.01 마리가 해수에 들어 있는 경우에도 본 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응에 따라 검출되는 것을 확인되었다(도 4). 본 발명의 진단결과는 동일한 유전자를 표적으로 한 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출한 경우보다 약 10배 이상의 높은 감도를 나타내었다. 이러한 결과들을 바탕으로 최종적으로는 본 프라이머 세트를 이용한 고리매개등온증폭반응으로 멍게 물렁증을 진단할 수 있다는 것이 확인되었다.
도 5는 정상 멍게와 물렁증 DNA에 대한 고리매개등온증폭 반응의 실시간 흡광도 곡선을 나타낸다. 정상 멍게 및 물렁증 초기, 중기 및 말기의 멍게로부터 DNA를 추출한 후 DNA가 100 ng, 10 ng, 1 ng 이 되도록 희석한 후, 본 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 실시하였다.
도 5에 의하면 정상 멍게와 1 ng의 초기 및 말기 물렁증 멍게 DNA에서는 흡광도 변화가 관찰되지 않았으나, 10 ng 이상의 초기 및 말기 멍게 DNA를 사용한 경우 고리매개등온증폭반응이 일어나, 흡광도 변화가 관찰됨을 알 수 있다.
따라서 10 ng의 멍게 DNA를 이용할 경우 초기, 말기 모두 본 프라이머 세트를 이용한 고리매개등온증폭법으로 멍게편모충 감염 여부를 확인할 수 있다는 것을 알 수 있었는바(도 5), 본 프라이머 세트를 이용한 고리매개등온증폭법은 해수와 물렁증이 의심되는 멍게에서 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충이 극소량으로 들어 있는 경우에도 쉽고 빠르게 검출할 수 있다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트가 세균성 멍게 질병을 유발할 수 있는 다른 병원성 세균에 대해 교차반응을 일이키지 않고 멍게 편모충에 특이적인 결과를 나타낸다. 도 6에 의하면 본 발명의 프라이머 세트는 세균성 멍게 질병을 유발할 수 있는 다른 병원성 세균으로 알려진 Pseudoalteromonas elyakovii와 Hasllibacter halocynthiae과 교차반응을 일이키지 않고 교차반응을 일이키지 않고 멍게 편모충에 특이적인 결과를 보여주고 있다.
이상으로부터 본 발명에서 제공되는 프라이머는 멍게 물렁증의 원인체인 멍게편모충의 동원핵 18S 리보솜 DNA (ribosomal DNA, rDNA) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있고, 해수 또는 물렁증 초기 멍게로부터 고리매개 등온증폭 반응을 이용하여 신속하고 빠르게 멍게 물렁증의 원인체로 알려진 멍게편모충을 검출함으로써 양식 멍게 물렁증 예보시스템에 적용하여 피해 확산을 조기에 차단할 수 있다.
해수 및 멍게에 있는 극소량의 멍게편모충의 검출이 가능하기 때문에 양식 멍게의 조기 감염 여부 및 멍게 예보시스템으로써 활용할 수 있고 아울러 고리매개등온증폭반응을 활용한 멍게 물렁증 원인체 검출에 있어 선도적인 위치를 확보함에 따라 진단키트제작 및 기술이전 등의 효과를 볼 수 있고 고리매개등온증폭법을 통해 확보된 기술을 이용하여 국내외 양식생물에서 빈발하는 다양한 감염 질병의 병원체를 검출하는데 이용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (5)
- 서열번호 1 내지 6으로 구성되는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물
- 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 포함하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi)을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 키트
- 멍게를 채취하여 시료를 준비하는 단계;
서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 이용하여 멍게편모충의 동원핵 18S 리보솜 DNA (ribosomal DNA, rDNA) 유전자의 등온증폭반응을 수행하여 유전자의 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi) 검출방법.
- 제 4항에 있어서, 증폭 산물을 검출하는 단계는 탁도계, 형광시약 또는 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는 멍게편모충(Azumiobodo hoyamushi) 검출방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020130105485A KR101329316B1 (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020130105485A KR101329316B1 (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR101329316B1 true KR101329316B1 (ko) | 2013-11-15 |
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ID=49857716
Family Applications (1)
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| KR1020130105485A KR101329316B1 (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 멍게 물렁증 원인체로서 멍게편모충 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출방법 |
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| KR (1) | KR101329316B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11519017B2 (en) | 2017-12-26 | 2022-12-06 | Bioacts Corporation | Kit for diagnosing infection with Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by detecting magnesium ions |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100950495B1 (ko) * | 2008-04-23 | 2010-03-31 | 단국대학교 산학협력단 | 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법 |
-
2013
- 2013-09-03 KR KR1020130105485A patent/KR101329316B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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| KR100950495B1 (ko) * | 2008-04-23 | 2010-03-31 | 단국대학교 산학협력단 | 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of Fish Diseases, Vol. 33, pp. 153-160 (2010) * |
| 한국어병학회지, 제24권, 제3호, 제197-204면 (2011) * |
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| US11519017B2 (en) | 2017-12-26 | 2022-12-06 | Bioacts Corporation | Kit for diagnosing infection with Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by detecting magnesium ions |
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