KR101498768B1

KR101498768B1 - 배추무름병균 검출용 ｐｃｒ 프라이머 및 이를 이용한 초고속 배추무름병균 검출 방법

Info

Publication number: KR101498768B1
Application number: KR1020120131899A
Authority: KR
Inventors: 김정구; 박동석; 김창국; 설영주; 윤병수
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 경기대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2015-03-05
Also published as: KR20140064499A

Abstract

본 발명은 배추무름병균 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 배추무름병균 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PCR 프라이머를 이용하고, 유전자 증폭조건을 따르면 신속하게 배추무름병균을 검출할 수 있다.

Description

배추무름병균 검출용 ＰＣＲ 프라이머 및 이를 이용한 초고속 배추무름병균 검출 방법{PCR PRIMERS AND ULTRA RAPID REAL TIME PCR METHOD FOR DETECTING PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM SUBSP. CAROTOVORUM}

본 발명은 배추무름병균 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 배추무름병균 검출 방법에 관한 것이다.

배추는 국내 재배면적 2위 채소 작물로서, 그 재배 면적은 연평균 약 4만 ha이다. 배추무름병에 감염된 배추의 잎이나 잎자루는 처음에 수침상 병반이 생기며 차츰 무르게 되고 심한 악취를 발생시킨다. 이 병으로 인해 연간 100억 원 내외의 큰 피해가 발생하고 있다.

결구가 되기 전에 배추에 이 병이 발병되면 포기 전체가 부패하여 결구가 되지 않는다. 결구된 배추는 표면이 담갈색으로 되지만 속잎은 변색되지 않고 물러 썩는다. 배추무름병을 일으키는 병원균은 감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria)의 일종인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum(또는, Erwinia carotovora subsp. carotovora)이며 그람음성의 짧은 간균으로 한천배지에서 회백색 원형 또는 아메바성 콜로니를 형성한다. 기회적 혐기성이며 혐기 조건에서도 증식이 가능하다. 이 균은 펙틴 분해 효소를 분비하여 식물 조직을 분해하여 부패시킨다. 건조에 약하여 식물체상에서 월동하는 일은 거의 없으며 감수성 식물 조직이 섞여 있는 토양에서는 오랫동안 생존할 수 있다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 아주 적은 양의 DNA 만으로도 특정 부위의 DNA 염기서열을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. PCR을 이용한 미생물의 검출은 목적 미생물의 특이 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 이를 증폭·확인하는 것이다.

PCR(polymerase chain reaction) 검출 방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 수행한다. 이후 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하며, 그 PCR 증폭 산물을 아가로스 겔(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 및 은 염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출한다.

현재, 이러한 PCR에 의한 세균(병원균) 진단법은 인체나 동물의 세균성 질병을 진단하는데 이용되고 있는데, 식중독 관련 병원성 세균인 대장균, 콜레라균 등의 검출용 PCR 진단용 키트들이 개발되어 있다. 또한, 외국의 경우는 식물 병원균에 대해서도 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 비롯한 다양한 병원균에 대한 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다.

그러나 현재까지 배추무름병균을 신속하게 진단할 수 있는 고속 PCR용 프라이머는 개발되지 않았다. 이에 본 발명자들은 이에 대해 연구를 계속하여 배추무름병균을 신속하게 진단할 수 있는 PCR 프라이머를 개발하여 본 발명에 이르렀다.

대한민국 공개특허 제2011-00138021호

본 발명의 목적은 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 검출용 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 상기 프라이머세트를 포함하는 배추무름병균 검출용 PCR 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 배추무름병균을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈)을 위한 시약의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명은 배추무름병균에서만 증폭하고 기타 생물종에 대해서는 증폭하지 않는 배추무름병균에 대한 특이성이 높은 프라이머 세트를 제공한다(서열번호 1 및 2). 이 프라이머 세트를 이용하면 배추무름병균에 있어서만 특정 크기(301 bp)의 반응물을 생성한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 프라이머 세트와 이의 PCR 반응 혼합물을 포함하는 배추무름병 검출용 PCR 키트를 제공한다.

상기 검출 키트를 이용하면 손쉽게 PCR을 수행하고 그 산물의 크기를 P. carotovorum 에서 증폭된 것과 비교하여 배추무름병균의 존재 여부를 알 수 있다. 상기 키트에는 P. carotovorum로 부터 증폭된 유전자산물이 양성 대조군으로 포함될 수 있다.

상기 PCR 반응 혼합물에는 이 기술분야에서 널리 공지된 것은 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면, PCR 반응 혼합물은 주형 DNA, dNTP, 10X 완충용액, 및 Taq DNA 폴리머라아제 등이 포함될 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 배추에서 검체를 분리하여 총 DNA를 추출하고; 그리고 상기 추출된 DNA를 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymer chain reaction)을 수행하는 단계를 포함하는 배추무름병균 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하는 PCR의 종류에는 제한이 없으나, 실시간 PCR(real-time PCR)이 바람직하다. 실시간 PCR을 이용한 직접적인 진단방법은 바이러스나 박테리아 감염을 민감하고 정확하게 정량할 수 있다.

상기 PCR은 어닐링(annealing) 온도가 54-60℃일 수 있다. 54℃ 미만에서는 특이성이 없는 산물의 증폭이 나타날 수 있으며, 60℃ 초과 온도에서는 주형 DNA와의 어닐링이 원활하지 않아 PCR 산물의 증폭이 잘 일어나지 않을 수도 있다.

상기 PCR 산물은 301 bp일 수 있다. 즉, 증폭된 PCR 산물이 301 bp일 때 배추무름병원균으로 진단할 수 있다. 따라서 현장의 열악한 상황에서 채취되어 여러 잡균 및 기주생물인 배추의 유전자가 혼입된 시료를 PCR에 투입하더라도 배추무름병원균만 특이적으로 증폭이 가능하다.

상기 검출 시간은 7-10분일 수 있다. 여기서 "검출 시간"이란 Ct 값에 도달하는 시간을 말한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 초고속 실시간 PCR(Ultra-rapid real-time PCR: URRT-PCR)이 가능하다. 본 발명에서 사용하는"초고속 실시간 PCR"이란, PCR에 소요되는 총시간을 30분 이내로 단축하고 검출 시간은 10분대 이하로 단축할 수 있는 PCR로, 일반 실시간 PCR과 구분하여 사용한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행시 총 소요시간은 30분 이하이고, 검출 시간 역시 10분 이하로 매우 짧은 시간이 소요되었다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 배추무름병균을 매우 신속하게 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따르면, PCR 검출 한계가 3 x 10¹ 유전자 카피일 수 있다. 즉, 매우 적은 양의 배추무름병균 유전자도 검출이 가능하다.

본 발명에 따른 PCR 프라이머 세트를 이용하면 매우 빠른 시간에 높은 민감도를 가지고 배추무름병균을 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 최적 어닐링 온도 검색을 위한 증폭 분석 그래프이다: 54℃ 일 때의 Ct 값은 11.71 (파랑색), 56℃ 일때의 Ct 값은 11.70 (하늘색), 58℃일 때의 Ct 값은 11.51 (초록색), 그리고 60℃일 때의 Ct 값은 11.85 (보라색)임.
도 2는 본 발명의 일 실시예의 프라이머의 어닐링 온도(54℃, 56℃, 58℃, 60℃)에 따른 Ct값을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 프라이머의 검출 한계를 나타내는 증폭 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예의 프라이머의 검출 특이성을 나타내는 증폭 분석 결과이다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1: 플라스미드 DNA

pBX 벡터와 P.carotovorum으로 분류된 KACC10227 균주의 Lytic murein transglycolase 유전자(NCBI accession number AB045036)를 재조합한 클론인 PCC-pBX437을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다(Yamada, K., M. 등, 2006. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:2236-2247; 노지나 등, 한국미생물학회지 45(4):306-311, 2009; 및 김정구 등, 한국미생물학회지, 47(2):103-109, 2011).

1-2: 프라이머 제작

PCC(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)의 lytic murein transglycolase 유전자(NCBI accession number AB045036)를 타겟으로 하여 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였으며, BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 를 통해 다른 염기서열과 비교 분석하여 선발하였다. 설계된 프라이머는 PCC-URRT-F와 PCC-URRT-R로 명명하여(표 1), 제작을 바이오닉스(Bionics, Korea)사에 의뢰하였으며 PCR 산물의 크기는 301bp 이었다.

명칭	방향	서열(5'→ 3')	서열번호
PCC-URRT-F	정방향 프라이머	ACC TCC TCA TCA CGC TGT TT	1
PCC-URRT-R	역방향 프라이머	CAG GCA GGA TTA AAC GGT TG	2

실시예 2: 최적 어닐링 온도 측정

2-1: 프라이머의 최적 어닐링 온도 측정

PCC-URRT-F/R 프라이머의 최적 어닐링 온도를 측정하기 위하여 PCC-pBX437 클론 1 ng을 주형으로 하여 그래디언트 PCR을 수행하였다. 정방향/역방향 프라이머 각각 10 pmole, 2.5 mM dNTP, 2U Taq 폴리머라아제, 10ㅧPCR 버퍼 (25 mM MgCl₂ 포함)를 첨가하여 조성하였다(표 2). PCR 수행 조건은, 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation) 수행 후 94℃ 30초, 45-65℃ 30초, 72℃ 30초를 1 사이클로 하여 45 사이클을 수행하였으며 72℃에서 7분간 후기 신장(post extension)을 수행하였다(표 3).

PCR 수행 후 그 산물은 1.5% 아가로스 겔에 100V로 30분간 전기영동하여 EtBr에 염색하여 확인하였다. 그 결과 최적 어닐링 온도는 약 57℃로 판단하였다.

조성	부피
주형 DNA (1ng/㎕)	1㎕
정방향/역방향 프라이머(10pmole)	1㎕/1㎕
dNTP (각 2.5mM)	1㎕
Taq 폴리머라아제 (2U/㎕)	1㎕
10ㅧPCR 버퍼 (25mM MgCl₂포함)	2㎕
D.W.	13㎕
총	20㎕

단계	온도	시간	사이클
전변성	94℃	5분	1
변성	94℃	30초	45
어닐링	45-65℃	30초
신장	72℃	30초
후기 신장	72℃	7분	1

다음으로, 검출 시간을 최소화하기 위하여 앞선 실험을 통해 얻어진 최적 어닐링 온도를 바탕으로 초고속 실시간 PCR(URRT-PCR)의 최적 어닐링 온도를 측정하였다. URRT-PCR의 조건과 조성은 하기 표 4 및 5와 같다. 구체적으로, URRT PCR의 합성 반응은 6㎕를 총량으로 하여 1 ng의 PCC-pBX437 클론과 각각 10 pmole의 서열번호 1 및 2의 프라이머, 2 × TMC-1000 마스터 믹스(genet bio, Korea)를 사용하였으며, 반응 조건은 94℃에서 100초간 전변성후, 변성 95℃ 5초, 어닐링 54-60℃ 5초, 신장 72℃ 10초를 35 사이클 반복하여 수행하였으며, 85℃부터 95℃까지 녹는점을 분석하였다. 어닐링 온도만 달리하여 54℃부터 60℃까지 2℃ 간격으로 각각 수행하였고, Ct(threshold cycle)에 도달하는 시간과 증폭량을 고려하여 최적 온도를 확립하였다.

조성	부피
주형 DNA (1ng/㎕)	1㎕
정방향/역방향 프라이머 (10pmole)	1㎕/1㎕
2 × TMC-1000 마스터 믹스	3㎕
총	6㎕

단계	온도	시간	사이클
전변성	95℃	100초	1
변성	95℃	5초	35
어닐링	54-60 ℃	5초
신장	72℃	10초
녹는점 분석	85-95℃	0.2℃/초

어닐링 온도(54℃, 56℃, 58℃, 60℃)에 따른 Ct값을 분석한 결과(도 1), Ct값은 차례대로 11.71, 11.70, 11.51, 11.85℃로 측정되었다. 또한 어닐링 온도에 따른 Ct의 변화를 그래프로 나타내었다(도 2). 도 1 및 2의 결과, 어닐링 온도가 58℃일 때, 가장 낮은 Ct값(11.51)을 보였다.

하기 표 6은 어닐링 온도에 따른 녹는점 분석 결과를 나타낸 것이다.

어닐링 온도	경과 시간	Ct값	Tm 값
54℃	24:50	11.71	88.75
56℃	23:55	11.70	89.03
58℃	23:12	11.51	90.01
60℃	22:41	11.85	91.23

상기 도 1, 2 및 표 5의 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR의 최적 어닐링 온도는 54 내지 60℃임을 알 수 있다.

실시예 3: 검출 한계 측정

본 발명의 프라이머 세트의 민감도를 검사하기 위하여 PCC-pBX437 클론을 1 ng (3×10⁶ 카피) 부터 1/10씩 단계 희석하여 주형으로 사용하였다. 실시예 2의 표 4 및 5의 조건을 바탕으로 PCR을 수행하였으나 녹는점 분석만 75-95℃ 범위에서 수행하여 그 결과를 도 3 및 하기 표 7에 나타내었다.

초기 주형	경과 시간	Ct값	Tm 값
1 ng	30:31	12.55	87.86
100 pg	30:36	15.92	87.51
10 pg	30:25	19.96	87.63
1 pg	30:47	27.02	87.75
100 fg	30: 42	29.18	77.29

도 3 및 표 7을 통해 본 발명의 프라이머 세트의 검출 한계는 100 fg,즉 3 x 10¹ 유전자 카피임을 알 수 있다.

실시예 4 : 특이성 측정

본 발명의 프라이머의 특이성을 측정하기 위하여, 하기 표 8에 명시된 Pectobacterium carotovorum 3 균주, Shigella dysenteriae 1 균주, Salmonella enterica subsp. enterica 1 균주, Escherichia coli 1균주의 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하여 URRT-PCR을 수행하였다.

균주 명칭	기탁번호
Pectobacterium carotovorum	KACC10227
Pectobacterium carotovorum	KACC10228
Pectobacterium carotovorum	KACC10229
Shigella dysenteriae	ATCC13313
Salmonella enterica subsp. enterica	ATCC13076
Escherichia coli	ATCC10536

도 4 및 하기 표 9에 나타난 것과 같이, P. carotovorum인 KACC10227, KACC10228, KACC10229에서만 특이성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

주형	경과 시간	Ct값	Tm 값
KACC10227	23:26	18.43	87.81
KACC10228	23:38	23.66	89.32
KACC10229	23:29	23.29	88.95
ATCC10536	23:19	-	86.89
ATCC13076	23:27	-	86.62
ATCC13313	23:26	-	90.34

실시예 5: 시간 단축 확인

본 발명의 프라이머를 이용한 실시간 PCR 수행시 시간이 단축됨을 확인하기 위하여, 각 단계별로 시간을 조절하여 최소 검출 시간을 확인하였다. 여기서 검출 시간이란, Ct 값에 도달하는 시간을 말한다. 샘플 1은 95℃에서 100초간 전변성 후, 변성 95℃ 5초, 어닐링 58℃ 5초, 신장 72℃ 10초를 35 사이클 반복하여 수행하였으며, 85℃부터 95℃까지 녹는점을 분석하였고, 그리고 샘플 2는 95℃에서 100초간 전변성 후, 변성 95℃ 3초, 어닐링 58℃ 3초, 신장 72℃ 5초를 35 사이클 반복하여 수행하였으며, 85℃부터 95℃까지 녹는점을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

시간	경과 시간	검출 시간	Ct값	Tm 값
5-5-10초(샘플 1)	23:12	7:38	11.51	90.01
3-3-5초(샘플 2)	18:01	8:16	17.76	89.44

표 10을 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 검출 시간이 매우 단축됨을 알 수 있다. 구체적으로 종래의 PCR 방법을 이용하면 평균 2 시간 이상이 걸리던 검출 시간이 매우 획기적으로 단축되는 것이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면, 배추무름병의 신속한 검출이 가능하므로 현장에서 다수의 샘플을 검정하는 경우에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> PCR PRIMERS AND ULTRA RAPID REAL TIME PCR METHOD FOR DETECTING PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM SUBSP. CAROTOVORUM <130> P120805 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of PCC-URRT-F <400> 1 acctcctcat cacgctgttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of PCC-URRT-R <400> 2 caggcaggat taaacggttg 20

Claims

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배추에서 검체를 분리하여 총 DNA를 추출하고; 그리고
상기 추출된 DNA를 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 검출용 프라이머 세트를 이용하여 초고속 실시간(Ultra rapid real-time) PCR을 수행하는;
단계를 포함하는 배추무름병균 검출 방법으로서, 상기 검출 방법에 의한 검출 시간은 7-10분이고, 상기 검출 방법의 검출 한계는 3 x 10¹ 유전자 카피인 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출 방법.
제4항에 있어서,
상기 PCR은 어닐링(annealing) 온도가 54-60℃인 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출 방법.
제4항에 있어서,
상기 PCR 산물은 301 bp인 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출 방법.
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