KR101817504B1 - 벚나무빗자루병균 검출용 등온증폭 반응 프라이머 세트 및 이를 이용하는 벚나무 빗자루병 진단 방법 - Google Patents

벚나무빗자루병균 검출용 등온증폭 반응 프라이머 세트 및 이를 이용하는 벚나무 빗자루병 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출용 등온증폭 반응 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트, 이를 포함하는 벚나무빗자루병균 검출용 키트 및 벚나무 빗자루병 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적이기 때문에, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 벚나무빗자루병균 검출 및 벚나무 빗자루병 진단 방법에 효과적이다.

Description

벚나무빗자루병균 검출용 등온증폭 반응 프라이머 세트 및 이를 이용하는 벚나무 빗자루병 진단 방법{Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for Taphrina wiesneri and method for diagnosing Witches' broom}
본 발명은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출용 등온증폭 반응 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트 및 이를 이용하는 벚나무 빗자루병(Witches’ broom) 진단 방법에 관한 것이다.
벚나무는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽교목으로 주로 조경수로 이용되고 있다. 국내에는 약 20여종이 분포하고 있으며, 주로 식재되는 종은 왕벚나무(Prunus yedoensis Matsumura)로, 가로수 및 정원수로 전국에서 식재되고 있다.
왕벚나무는 많은 병원균에 대해 감수성이 높은 식물로 알려져 있으며, 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)에 의한 빗자루병 등 13 종류의 병이 보고되어 있다(한국식물병리학회. 2009. 한국식물병명목록. pp. 487-489.). 이 중 벚나무빗자루병균에 의한 빗자루병의 피해가 가장 심각한 것으로 여겨지고 있다.
빗자루병에 대하여 국내 피해현황이 전국적으로 조사된 바 없지만, 제주도부터 강원도까지 전국적으로 발생하고 있으며, 특히 제주도의 경우 45 년생 이상의 노거수들은 거의 모두가 심각한 정도의 빗자루병에 감염된 것으로 조사되었다(Kim, C. J., I. S. So, and M. R. Huh. J. Agri. Life Sci 43 (2009): 1-6.). 벚나무 빗자루병균에 감염되면 가지가 비대해지고, 그 부분에서 작은 가지들이 밀생하며, 감염된 가지에서는 꽃이 거의 피지 않는다.
이러한 병징은 병원균이 기주에 호르몬 이상을 초래하여 나타나는 것으로 알려져 있으나, 정확한 침입 경로, 침입 시기 및 유전적 특성 등에 관하여는 아직까지 보고된 바 없어 효과적인 방제방법 또한 개발되지 않았다. 종래 유일한 방제 방법은 감염부위의 제거로(Yamamoto, A., Y. Matsuda, and S. Ito. Tree For Health 11 (2007): 115-120.), 최근 벚나무빗자루병원균은 벚나무 감염 가지 안쪽과 눈 안쪽에서 월동하는 것이 보고되어, 이 부분을 이용하여 빗자루병에 감염된 벚나무를 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 하는 연구가 계속되고 있다.
구체적으로, 일본에서는 벚나무빗자루병균의 종-특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과 벚나무빗자루병균의 감염 및 월동 부위를 검출할 수 있음이 보고되었으며(Komatsu, Masabumi, et al. Journal of General Plant Pathology 76.6 (2010): 363-369.), 상기 종-특이적인 프라이머를 이용하여 국내 벚나무에서 PCR 반응으로 감염 벚나무를 진단하는 방법이 보고되었다(손수연, 이선근, and 서상태. 한국임학회지 104.2 (2015): 332-335.).
그러나 이러한 PCR 기반의 종래 검출 방법은 DNA의 변형이 온도에 민감하기 때문에 프라이머의 개발이 매우 중요하며, 증폭 단계에서 온도를 변화시키기 위해 시간이 소요된다는 단점을 가진다. 또한, 증폭된 반응 산물을 전기영동으로 확인하고 최종적으로 염기서열 분석을 해야하는 일련의 과정을 통해 추가로 분석 시간이 요구되며, 중합효소연쇄반응기와 같은 전문적인 장비가 요구되어 고비용이라는 단점 또한 강조되고 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 일정한 온도에서 온도변화 없이 특정 유전자의 증폭이 가능하기 때문에 반응 시간을 단축할 수 있다는 장점을 가진다. 등온증폭법에서는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)를 사용하며, 표적 DNA의 특정 염기서열을 바탕으로 특이적으로 디자인된 4개 또는 6개의 프라이머를 이용하여 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발하여 증폭 반응을 수행한다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 하므로, 병원성균의 진단 및 검출 방법에서 사용할 수 있다.
LAMP 반응을 이용한 병원성균의 진단 및 검출 방법에 있어서, 대한민국 등록특허 제 1557844 호에서는 이리도바이러스를 검출하기 위한 LAMP용 프라이머 세트, 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용하는 이리도바이러스 검출방법에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제 1375242 호에서는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 검출 방법에 대하여 개시하고 있으나, 벚나무빗자루병균을 검출하기 위한 LAMP 방법에 대하여는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 벚나무빗자루병균을 검출하기 위한 효과적인 진단 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트를 제작하였으며, 제작된 LAMP 프라이머는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적일 뿐 아니라, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 목편 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 본 발명의 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균 검출 및 벚나무 빗자루병 진단 방법에 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트를 제작하고, 제작된 LAMP 프라이머는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적일 뿐 아니라, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 목편 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출용 등온증폭 반응 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 벚나무빗자루병균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 벚나무 빗자루병 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는, 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출용 등온증폭 반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 벚나무빗자루병균 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은
i) 벚나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고 상기 벚나무빗자루병균 검출용 키트를 이용하여 등온증폭 반응(LAMP)을 수행하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 반응 산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 벚나무 빗자루병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 등온증폭 반응은 60 내지 65℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 분석은 전기영동을 통한 DNA 밴드 형성여부 또는 SYBR Green I을 이용한 형광발색 여부를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 벚나무 빗자루병은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)의 감염으로 유발된 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 벚나무빗자루병균 검출용 등온증폭 반응 프라이머 세트 및 이를 이용하는 벚나무 빗자루병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적이기 때문에, 다른 타프리나(Taphrina) 속의 병원균과 벚나무빗자루병균을 효과적으로 구분할 수 있고, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 나무의 잎눈, 꽃눈 및 어린싹 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 벚나무빗자루병균 검출 및 벚나무 빗자루병 진단 방법에 효과적이다.
도 1은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출을 위한 등온증폭 반응 분석(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트의 특이성을 분석한 도이다.
도 2는 벚나무빗자루병균 검출을 위한 LAMP 프라이머 세트의 검출 한계점 분석을 나타낸다:
도 2a는 LAMP 증폭 산물을 전기영동으로 분석한 DNA 밴드를 나타낸 결과이고;
도 2b는 LAMP 증폭 산물을 UV 조사하지 않은 상태에서 육안으로 관찰한 결과이며; 및
도 2c는 LAMP 증폭 산물에 UV를 조사하여 육안으로 관찰한 결과이다.
도 3은 벚나무 빗자루병 감염 의심목으로부터 LAMP 프라이머를 이용한 벚나무빗자루병균 검출을 나타낸다:
도 3a는 LAMP 증폭 산물을 UV 조사하지 않은 상태에서 육안으로 관찰한 결과이고; 및
도 3b는 LAMP 증폭 산물에 UV를 조사하여 육안으로 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 국내에서 감염된 벚나무 빗자루병 의심목을 대상으로 벚나무빗자루병균을 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법에 대하여 보고된 바가 없다.
본 발명의 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적이기 때문에, 다른 타프리나(Taphrina) 속의 병원균과 벚나무빗자루병균을 효과적으로 구분할 수 있고, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 목편 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 벚나무빗자루병균 검출 및 벚나무 빗자루병 진단 방법에 효과적이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는, 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 검출용 등온증폭 반응 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LAMP 프라이머 세트를 포함하는, 벚나무빗자루병균 검출용 키트를 제공한다.
상기 “키트”는 필요에 따라서 시료를 제외한 반응액이 포함되도록 제작될 수 있다. 구체적으로 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 상기 DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 국내에서 분리된 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri) 및 다른 타프리나(Taphrina) 속의 병원균을 배양하고, 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트를 제작하였다(표 1 및 표 2). 그런 다음, 벚나무빗자루병균 또는 다른 타프리나 속 병원균의 DNA 시료를 주형으로 하고 제작한 벚나무빗자루병균 특이적인 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행한 결과, 벚나무빗자루병균에서만 특이적으로 형광발색이 나타나는 것을 확인하였다(도 1)
또한, 본 발명자들은 LAMP 반응을 이용한 프라이머 세트가 벚나무빗자루병균 유전자에 민감한지 검출 한계점을 확인한 결과, 10 pg/㎕의 농도에 대하여도 벚나무빗자루병균의 DNA 검출이 가능함을 확인하였다(도 2). 또한, 본 발명자들은 벚나무 빗자루병 감염 의심목의 잎눈, 꽃눈 및 어린싹(shoot)으로부터 DNA 시료를 추출하여 LAMP 반응을 수행한 결과, 벚나무빗자루병균에 대하여 특이적인 검출이 가능하므로 본 발명의 LAMP 용 프라이머가 현장 시료에서도 효과적으로 벚나무 빗자루병 감염을 진단할 수 있음을 확인하였다(도 3).
따라서, 본 발명의 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적이기 때문에, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 목편 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 벚나무빗자루병균 검출에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 벚나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 벚나무빗자루병균 검출용 키트를 이용하여 등온증폭 반응(LAMP)을 수행하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 반응 산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 벚나무 빗자루병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 단계 ii)의 “등온증폭 반응”은 60 내지 65℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 iii)의 분석은 전기영동을 통한 DNA 밴드 형성여부 또는 SYBR Green I을 이용한 형광발색 여부를 확인하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명은 LAMP 증폭하여 생성된 생성물에 감염여부의 육안 확인을 위한 발광물질을 첨가하는 단계를 더 실시할 수 있다. 즉, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 반응액을 만들고, 여기에 시료를 첨가하여 DNA 합성을 진행한 후 발광물질을 첨가하는 것이 가능하다. 상기 발광물질은 당업계에서 일반적으로 사용되는 것을 적용할 수 있으나, 바람직하게는 SYBR Green을 사용하는 것이 가능하다.
상기 SYBR Green은 DNA 이중가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 특히, SYBR Green은 DNA 이중 가닥에 삽입되어 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현할 수 있다. 따라서, 벚나무빗자루병균에 감염된 시료를 주형으로 하고 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 생성물에 SYBR Green을 첨가한 후 자외선을 조사하게 되면 녹색 형광을 나타내게 된다. 즉, 본 발명은 전기영동 등 별도의 추가적 실험을 하지 않고도 LAMP 증폭실험 후 SYBR Green 염색에서 녹색 형광을 나타내면 벚나무빗자루병균에 감염된 것을 의미하고, 녹색형광을 나타내지 않으면 벚나무빗자루병균 비감염 또는 타 타프리속 균주의 감염을 의미하므로, 벚나무 빗자루병을 고감도이면서 신속하게 육안으로 확인할 수있다.
본 발명의 벚나무빗자루병균에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균에 민감하고 특이적이기 때문에, 벚나무빗자루병균과 타 타프리나 속 병원균주를 효과적으로 구분할 수 있고, 벚나무 빗자루병 감염이 의심되는 목편 시료에서 벚나무빗자루병균 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 벚나무 빗자루병 진단 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
벚나무빗자루병균 ( Taphrina wiesneri ) 검출을 위한 등온증폭 반응 분석(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 제작
<1-1> 병원균 배양 및 DNA 추출
본 발명의 대상 병원균인 벚나무빗자루병균 및 다른 타프리나 속 병원균을 배양하고, DNA를 분리하였다.
구체적으로, 하기 [표 1]에서 기재된 바와 같이 국내에서 분리된 벚나무빗자루병균(Seo, Sang-Tae, et al. Research in Plant Disease 15.1 (2009): 13-16.)을 이용하였으며, 타프리나 속 균주는 국립산림과학원 산림병해충연구과(한국)에서 보존중인 균주를 이용하였다. 이용 대상의 균주들은 PDA(Potato Dextrose Agar, BD DifcoTM, USA) 배지에서 7 내지 15일 간 배양하였다.
본 발명에서 사용한 벚나무빗자루병균 및 타프리나 속 균주의 목록
병원균주　 숙주　
병원균 명칭 균주명 숙주 수종 출처
T. betulina KCTC 27057 Betulanana x pubescens Unknown
T. purpurascens KCTC 27064 Rhus copallina 스웨덴
T. dearnessii KCTC 27061 Acer rubrum Unknown
T. carpini KCTC 27059 Carpinus betulus 슬로바키아
T. coerulescens KCTC 27058 Quercus alba Unknown
T. confusa KCTC 27060 Prunus virginiana Unknown
T. polystichi KCTC 27062 Dryopteris carthusiana Unknown
T. wiesneri TA1 Prunus sp . 충남 공주
T. wiesneri TA2 Prunus sp . 충남 공주
T. wiesneri TA3 Prunus sp . 충남 공주
T. wiesneri TA4 Prunus sp . 충남 공주
T. wiesneri TA6 Prunus sp . 경기 용인
T. wiesneri TA10 Prunus sp . 제주
T. wiesneri TA11 Prunus sp . 제주
T. wiesneri TA12 Prunus sp . 제주
T. wiesneri TA17 Prunus sp . 충북 청주
<1-2> LAMP 프라이머 세트의 제작
본 발명의 LAMP 반응을 위한 프라이머 세트는 벚나무빗자루병균의 5.8S rRNA 서열(GenBank accession number: AB505443.1)을 기반으로 하여 Primer Explore(http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 사용하여 제작하였다. 제작한 프라이머의 염기서열은 하기 [표 2]와 같다.
LAMP 반응을 위한 프라이머 염기서열
프라이머 명 서열번호 염기서열 길이(Mer) Tm(℃)
B3 서열번호 1 5`-AAATGAAGAAGCCAAGAGC-3` 19 53.0
FIP 서열번호 2 5`-GAGGACAGCGATCCCAGAAGTTTTCACAAGACCGTCTGGTCTCT-3` 44 81.0
BIP 서열번호 3 5`-GCCCGGTTTACACAACGTTCTTTTTTAGGTGCAGCACCATGA-3` 42 78.9
LAMP 반응을 이용한 프라이머 세트의 특이성 확인
본 발명에서 제작한 LAMP 용 프라이머 세트가 벚나무빗자루병균 및 타프리나 속 균주를 구분하는 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응의 벚나무빗자루병균 특이성을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 생육한 벚나무빗자루병균 균주 또는 타프리나 속 균주를 각각 수득한 다음, ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM 키트(ZYMO RESEARCH)를 사용하여 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 균주의 DNA를 분리하여 20 ng/㎕ 농도로 준비하였다. 그런 다음, 320U/㎖ Bst DNA 중합효소(제품번호: M0275S; New England BioLabs 사), 2 mM MgSO4를 포함하는 1× TermoPol 완충용액, 6 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP 및 6 mM 베타인(Betaine)을 혼합하여 LAMP 반응액을 만들고, 이에 상기 준비한 벚나무빗자루병균 또는 BM의 DNA 1 ㎕, 상기 [표 2]에 기재된 1.6μM FIP/BIP 프라이머 및 0.2 μM F3/B3 프라이머를 가한 후, Nuclease-free water로 최종 부피 25 ㎕가 되도록 하였다. LAMP 반응은 62 ℃에서 1 시간 동안 수행하였다. 반응 종료 후 SYBR Green I 염색약(Invitrogen 사, 5000×)를 0.5 ㎕ 첨가하여 발색반응하였다. 또한, 증폭된 산물은 1.5% 아가로즈 젤에 로딩한 후 Mupid 21(COSMO bio Co.) 기기를 사용하여 60 분 동안 전개한 다음 DNA 밴드를 관찰하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 모든 벚나무빗자루병균의 DNA 시료에서 발색반응이 나타나 육안으로 확인하였을 때 시료의 색깔이 형광색으로 변색하는 반면, 벚나무빗자루병균을 제외한 다른 타프리나 속 균주의 DNA 시료에서는 발색반응하지 않은 것을 확인하였고 전기영동하였을 때도 DNA 밴드를 나타내지 않는 것을 확인하여, LAMP용 프라이머가 벚나무빗자루병균에 대하여만 특이적으로 산물을 증폭할 수 있음을 확인하였다(도 1).
LAMP 반응을 이용한 프라이머 세트의 민감도 확인
병원균의 검출 방법에 있어서 적은 농도의 병원균 DNA에도 유의적인 검출이 가능한 것이 요구되므로, 다양한 농도의 DNA에 대하여 LAMP 반응을 수행하여 프라이머 세트의 민감도를 분석하였다.
구체적으로, 벚나무빗자루병균을 배양한 후 DNA를 추출하고 정량하여, 10 ng/㎕, 1 ng/㎕, 100 pg/㎕, 10 pg/㎕, 1 pg/㎕, 100 fg/㎕, 10 fg/㎕ 또는 1 fg/㎕의 농도로 희석하였다. 그런 다음, 각각의 농도로 희석한 DNA를 주형으로 하여 상기 <실시예 2>의 방법으로 LAMP 반응을 수행하고, 형광발색 및 전기영동 후 밴드 형성 정도를 확인하여 LAMP 반응에 대한 검출 한계점을 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 벚나무빗자루병균에 대하여, 육안 및 전기영동 상에서 확인하였을 때의 검출 한계점은 100 pg/㎕ 농도였으나(도 2b), UV를 조사하였을 때 10 pg/㎕의 농도에 대하여도 병원균 DNA의 검출이 가능함을 확인하였다(도 2a 및 도 2c). 이에, UV 조사 없는 육안 및 전기영동을 통한 검출보다 UV를 조사하는 경우에 보다 정확한 검출이 가능할 것으로 판단하였다.
벚나무 빗자루병 감염 의심 시료로부터 LAMP 반응을 통한 벚나무빗자루병균 검출 확인
본 발명의 LAMP 용 프라이머쌍이 벚나무빗자루병균를 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 확인하였으므로, 실제 벚나무 빗자루병에 감염된 것으로 의심되는 나무의 시료로부터 벚나무빗자루병균 감염 여부를 LAMP 반응으로 확인하였다.
구체적으로, 벚나무 빗자루병 감염 의심목 또는 비감염목의 잎눈, 꽃눈 및 어린싹(shoot) 시료로부터 PowerSoil DNA extraction Kit(MO bio.Co.)를 이용하여 DNA를 추출하고 벚나무짓자루병균 존재 여부를 LAMP로 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 빗자루병 감염목으로부터 분리된 시료 중 잎눈 시료에서는 유의적으로 LAMP 증폭된 DNA가 형광발색을 나타내는 것을 확인하였으며, 감염목 유래의 어린싹 시료에서도 육안으로는 형광발색이 유의적으로 나타나지 않는 반면, UV를 조사하였을 때 형광발색을 나타내는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).
<110> KOREA FOREST RESEARCH INSTITUTE <120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for Taphrina wiesneri and method for diagnosing Witches' broom <130> 1060754 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 Primer <400> 1 aaatgaagaa gccaagagc 19 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP Primer <400> 2 gaggacagcg atcccagaag ttttcacaag accgtctggt ctct 44 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP Primer <400> 3 gcccggttta cacaacgttc ttttttaggt gcagcaccat ga 42

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하며,
    벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)의 5.8S rRNA 영역을 표적으로 하고,
    10 pg/㎕의 검출 한계점을 가지는,
    벚나무빗자루병균 검출용 등온증폭 반응 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트.
  2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 벚나무빗자루병균 검출용 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 키트는 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 벚나무빗자루병균 검출용 키트.
  4. i) 벚나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고 제 2항의 키트를 이용하여 등온증폭 반응(LAMP)을 60 내지 65℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)의 반응 산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 벚나무 빗자루병 진단 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 단계 iii)의 분석은 전기영동을 통한 DNA 밴드 형성여부 또는 SYBR Green I을 이용한 형광발색 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는, 벚나무 빗자루병 진단 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 벚나무 빗자루병은 벚나무빗자루병균(Taphrina wiesneri)의 감염으로 유발된 것을 특징으로 하는, 벚나무 빗자루병 진단 방법.
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Komatsu et al. J Gen Plant Pathol (2010) 76:363-369.*
Natsu Uemura et al. Journal of Medical Microbiology (2008), 57, 50-57
李怡潔. 대만대학 식물병리 및 미생물학 연구소 학위논문 초록 (2014)*

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