KR101909786B1

KR101909786B1 - 로젤리니아 네카트릭스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR101909786B1
Application number: KR1020160135605A
Authority: KR
Inventors: 류호진; 배원실; 김형민; 원경호; 김윤경
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2016-10-19
Publication date: 2018-10-18
Also published as: KR20180042961A

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트 및 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 수목의 백문우병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 백문우병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

Description

로젤리니아 네카트릭스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법{Primer set for detecting Rosellinia necatrix and method for detecting using the same}

본 발명은 로젤리니아 네카트릭스에서 분리한 RL-RN-M-01, RL-RN-M-02 또는 RL-RN-M-03 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트 및 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출 방법에 관한 것이다.

백문우병을 일으키는 곰팡이인 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)는 자낭균의 일종으로 30목 63속 약 170여 종의 식물체에서 병원성을 확인할 수 있다. 주로 과수인 배나무, 사과나무, 포도나무, 감나무 등에서 심하게 발생하고 있으며, 특히 배나무의 경우 다른 과수보다 병에 약하다.

육안으로 병징이 발현되기까지 적어도 2~3년이 소요되고, 지상부에서 병징이 발현될 때는 나무 뿌리의 1/2 이상이 감염되어 있는 경우가 대부분이다. 또한 아직 검증된 방제 방법이 없고, 한번 병이 퍼진 과원에서는 신목을 심어도 다시 병의 피해를 받을 가능성이 크기 때문에 조기 진단으로 피해를 최소화시키는 기술 연구가 필요한 상황이다.

백문우병은 토양조건이 과습한 상태(70%이상)에서 발병이 잘 된다. 발병 초기에는 수년간 외관적으로 완전히 건전해 보인다. 병이 진전되면 낙엽이 빠르고, 착과량이 많으며 과실의 비대가 떨어지게 되며 잎이 황화된다. 나중에는 가지의 선단부가 갑자기 고사하거나 잎이 검게 변하며, 개화기가 빨라진다. 결국 수년 내에 나무 전체가 고사하게 된다. 병원균은 토양에서 보통 4년간 생존 가능하며, 토양 내 병원균 포자에 의한 전염보다 피해를 입은 뿌리에 붙은 병원균 균사로 전염이 이루어지게 된다.

백문우병의 감염 경로나 증상은 잘 규명되어 있는 반면, 이들의 감염 여부를 확인하는 방법은 미비한 실정이다. 배나무 주변에 고구마, 배, 감자 등을 10cm 이상 깊이로 묻은 후 30일 후에 백문우병의 감염여부를 확인하여 예방하는 방법이 있다. 하지만 과수를 이용한 확인은 부패로 인해 백문우병의 진단이 불확실한 상황이다.

한국등록특허 제1207424호 한국등록특허 제1133104호

이에 본 발명자들은 백문우병을 저비용으로 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 연구하던 중 백문우병의 원인균인 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)에 종 특이성을 가진 RL-RN-M-01, RL-RN-M-02 또는 RL-RN-M-03 프라이머 세트를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물체 검체는 배나무, 사과나무, 포도나무, 감나무, 귤나무, 모과나무, 유자나무, 석류나무, 호두나무 또는 은행나무에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 수목에서 백문우병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 백문우병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트가 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여 토양에 존재하는 곰팡이병 10종을 이용하여 비교한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머들은 각각 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균의 100bp 크기의 핵산 단편을 증폭시키기 위한 정방향 및 역방향의 프라이머이다.

본 발명에 있어서 “프라이머”란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기증을 하는 짧은 핵산서열을 의미한다.

본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 및 blastx 프로그램을 이용하여 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열정보를 탐색하고, 상기 특이 핵산 서열을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 및 Real-tim PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 식물체 검체의 백문우병 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.

따라서 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)에 특이적인 핵산 증폭산물이 존재하면, 해당 식물체 검체는 벼의 세균병에 감염된 것으로 진단할 수 있다.

본 발명에 있어서 “식물체 검체”란 백문우병의 원인균인 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 감염 여부를 확인하고자 하는 대상 식물체를 의미하며, 이에 한정되는 것은 아니지만 배나무, 사과나무, 포도나무, 감나무, 귤나무, 모과나무, 유자나무, 석류나무, 호두나무 또는 은행나무에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

식물체 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 증폭은 통상적인 PCR 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 증폭 반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 PCR 증폭 반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 리얼타임 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 컨벤셔널 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산시물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 조성물에 관한 것이다.

상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트를 이용하여 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 건기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)를 검출하기 위해 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

로젤리니아 네카트릭스( Rosellinia necatrix ) 검출용 프라이머 제작

본 발명자들은 수목의 백문우병을 일으키는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 검출용 프라이머를 제작하기 위하여 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 지놈 염기서열에서 종 특이성을 가지는 100bp씩 3개의 염기서열을 발견하였고, 이들을 클로닝하여 염기서열을 획득하였으며, 이 염기서열을 바탕으로 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)의 검출을 위한 프라이머 세트 RL-RN-M-01, RL-RN-M-02, RL-RN-M-03을 디자인 및 제작하였다(표 1 참조).

본 발명의 로젤리니아 네카트릭스 검출용 프라이머 세트 서열

프라이머	서열(5’-3’)	서열번호
RL-RN-M-01F	CCACATGCGGTGTCATCAA	1
RL-RN-M-01R	ATTCGGCGTTTGTTAGAAGCA	2
RL-RN-M-02F	CCTGTTTTGTCGTGGGTGATG	3
RL-RN-M-02R	CTCCCTTACCTCCCTGGTCAA	4
RL-RN-M-03F	TCCTTGCAGGGATCCTTTCA	5
RL-RN-M-03R	TTATTCTTGGCCCCCTGTTG	6

< 실시예 2>

PCR 수행

로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균주는 농촌진흥청 산하 농업유전자원센터에서 2개의 균주를 분양받아 (KACC 40445/ 40168) 사용하였다. 2개의 독립적인 균주에서 Genomic DNA를 추출하여 20 ng의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 본 발명의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행한 결과는 도 1에 나타내었다.

PCR 수행 결과 각각에 해당하는 상기 마커를 검출한 것을 검정색 밴드로 확인할 수 있다.

또한, 도 2는 본 발명의 프라이머 서열이 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix)만의 DNA 서열을 특이적으로 인식하여 PCR을 통해 증폭이 되는지를 알아보기 위하여 실험한 결과이다.

상기 실험을 위하여 먼저, 토양에 존재하는 곰팡이병 10개에 (Chenopodium album, Cylindrocarpon obtusisporum, Alternaria panax , Alternaria populi , Botryotinia fuckeliana , Colletorichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum , Fusarium solani , Plectosphaerella cucumeria , Trichoderma asperellum) 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 3개 프라이머(RL-RN-M-01, RL-RN-M-02, RL-RN-M-03)를 이용한 PCR 결과에서는 전혀 DNA의 증폭이 일어나지 않지만, RL-RN-M-04의 경우 4번 균주 Alternaria populi 의 DNA에서는 증폭이 일어나는 것을 확인하여 해당 특허에서는 RL-RN-M-04의 프라이머 서열은 제외하였다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 RL-RN-M-01, RL-RN-M-02 또는 RL-RN-M-03 프라이머는 다른 10종의 곰팡이성 토양 병원균에서는 검출되지 않고 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 균에서만 특이적으로 검출될 수 있으며, 빠르고 간편하게 사용할 수 있는 장점이 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting Rosellinia necatrix and method for detecting using the same <130> PN1608-279 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-01F primer <400> 1 ccacatgcgg tgtcatcaa 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-01R primer <400> 2 attcggcgtt tgttagaagc a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-02F primer <400> 3 cctgttttgt cgtgggtgat g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-02R primer <400> 4 ctcccttacc tccctggtca a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-03F primer <400> 5 tccttgcagg gatcctttca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-RN-M-03R primer <400> 6 ttattcttgg ccccctgttg 20

Claims

서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-01 프라이머 쌍;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-02 프라이머 쌍; 또는
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 RL-RN-M-03 프라이머 쌍을 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 기탁번호 KACC 40445 또는 기탁번호 KACC 40168 검출용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 기탁번호 KACC 40445 또는 기탁번호 KACC 40168의 검출 방법.
제2항에 있어서,
상기 식물체 검체는 배나무, 사과나무, 포도나무, 감나무, 귤나무, 모과나무, 유자나무, 석류나무, 호두나무 또는 은행나무에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 기탁번호 KACC 40445 또는 기탁번호 KACC 40168의 검출 방법.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 기탁번호 KACC 40445 또는 기탁번호 KACC 40168 검출용 조성물.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 로젤리니아 네카트릭스(Rosellinia necatrix) 기탁번호 KACC 40445 또는 기탁번호 KACC 40168 검출용 키트.