KR102140463B1 - 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 - Google Patents
등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102140463B1 KR102140463B1 KR1020180142745A KR20180142745A KR102140463B1 KR 102140463 B1 KR102140463 B1 KR 102140463B1 KR 1020180142745 A KR1020180142745 A KR 1020180142745A KR 20180142745 A KR20180142745 A KR 20180142745A KR 102140463 B1 KR102140463 B1 KR 102140463B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- citrus
- viroid
- detecting
- infectious
- isothermal amplification
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의해 감귤 감염성 바이로이드를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감귤류에 감염되어 과실의 상품성 가치를 하락시고 농가에 큰 경제적인 피해를 입히는 바이로이드 중 하나인 Citrus bent leaf viroid(CBLVd)를 등온 증폭 방법으로 검출 및 진단하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머를 이용하여 등온 증폭 방법으로 감귤 감염성 바이로이드를 검출하는 방법에 대한 것이다.
본 발명에 의한 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법은 감귤류에 감염되어 과실의 상품성 가치를 하락시키고 농가에 큰 경제적인 피해를 입히는 바이로이드, Citrus bent leaf viroid(CBLVd)를 등온 증폭 방법에 의해 현장에서 다량으로 증폭시켜 감귤 감염성 바이로이드를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명에 의한 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법은 감귤류에 감염되어 과실의 상품성 가치를 하락시키고 농가에 큰 경제적인 피해를 입히는 바이로이드, Citrus bent leaf viroid(CBLVd)를 등온 증폭 방법에 의해 현장에서 다량으로 증폭시켜 감귤 감염성 바이로이드를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의해 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감귤류에 감염되어 과실의 상품성 가치를 하락시고 농가에 큰 경제적인 피해를 입히는 바이로이드 중 하나인 Citrus bent leaf viroid(CBLVd)를 등온 증폭 방법으로 검출 및 진단하기 위한 프라이머 세트및 이를 이용하여 등온 증폭 방법으로 검출하는 방법에 대한 것이다.
바이로이드(viroid)란 바이러스보다 작은 생물로서, 1971년 미국 농무성 식물바이러스연구소의 TO디너가 감자 마름병(patato spindle disease)의 병원체로서 발견하여 명명하였다. 외피단백질 없이 단일가닥 고리 모양의 RNA만으로 이루어져 있다. 작은 바이러스의 분자량은 20만이고 바이로이드는 9만 정도로 핵산만으로 구성된 생물이다. 바이로이드의 유일한 숙주는 식물체이며, 상품 가치가 높은 과실 및 화훼류에 감염하여 질병을 유발, 상품의 가치를 떨어트려 농가에 큰 피해를 끼치고 있다.
Pospiviroidae 과 Apsecaviroid에 속하는 Citrus bent leaf viroid(CBLVd)는 시트러스 숙주에 반복적으로 악액질 만성 상태를 야기한다. 이 바이로이드는 초기에 시트론에 상위생상성과 탱자나무 뿌리줄기에 주맥성 점괴를 유도하는 Citrus viroid I(CVd-I)로 알려졌다. 이들은 Apple scar skin viroid(ASSVd)의 central domain 부분과 Citrus exocortis viroid의 pathogenicity(P)와 terminal left(TL)를 포함하는 키메라를 생성할 때 나타나는 것으로 알려져 있다. CVd-Ia와 CVd-Ib로 불리는 CBLVd의 두 가지 종들은 시트러스에서 확인되었으며 매우 높은 상동성을 지니고 있다.
감귤을 가해하는 바이로이드는 모두 7종이 보고되고 있으며 우리나라 감귤에서 많이 사용되는 탱자를 대목으로 사용한 감귤이 바이로이드에 특히 약한 것으로 알려져 있다. CBLVd에 감염되면 시트러스 나무 자체가 정상 나무보다 덜 자라게 되며, 각 잎들이 동그랗게 휘어지는 현상이 나타난다.
지난 2015년 10월 4일, 농림축산식품 2015 주요 통계에 따르면 지난해 1인당 연간 감귤 소비량은 14.3 kg으로, 모든 과일을 통틀어 가장 많은 것을 집계되었다. 감귤 범주에는 노지 온주와 하우스 온주 등 일반 감귤 뿐 아니라 한라봉, 천혜향 등도 들어가며 수입 오렌지는 포함되지 않는다. 또한 2014년 감귤 생산량은 약 72만 2천톤으로 국내 전체 과실류 생산량의 27 % 정도를 차지하는 것으로 알려졌다.
최근 재배가 급증하고 있는 부지화(한라봉)는 바이로이드가 문제가 되고 있는데 대표적인 증상이 대목 껍질이 벗겨지고(Bark scaling) 수세가 약화되는 증상이다. 2004년도 조사에 의하면 제주도 전체적으로 43%의 부지화(한라봉) 나무들이 이런 대목 껍질이 벗겨지는(bark scaling) 증상을 보이는 것으로 조사되고 있다. 더 중요한 것은 검정 결과 이런 대표적인 바이로이드 증상을 보이지 않는 나무들에서도 많은 바이로이드들이 검정된다는 것이다. 부지화(한라봉)에서는 산함량이 수확기에도 감소되지 않아 그 품질이 점점 나빠지는 경향이 있는데 바이로이드 감염에 의한 수세 약화가 여기에 크게 기여하는 것으로 생각된다.
이와 같이 작물에 감염되어 질병을 유발하며 상품 가치성을 떨어트리는 바이로이드는 한 기주에서 다른 기주로의 전염이 쉽게 발생하므로 조기 진단의 필요성이 대두되고 있다. 그러나, 바이로이드는 외피 단백질이 없기 때문에 바이러스 진단에 많이 사용되는 효소면역활성측정(ELISA)과 같은 혈청학적 방법으로는 검정할 수 없고, 종래 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptiase Polymerase Chain Reaction; 이하 "RT-PCR"라 한다)과 같은 유전자를 이용한 진단법이 사용되고 있다.
하지만 바이로이드는 명확히 바이러스와는 구별되는 특징을 가졌음에도, 현재 바이러스와의 차별성을 둔 검출 및 진단 방법의 개발은 미미한 상태이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 현장에서 신속하고 정확하게 감귤 감염성 바이로이드를 검출할 수 있는 감귤 감염성 바이로이드 검출용 고리매개등온 증폭용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 고리매개등온 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법에 의해 감귤 감염성 바이로이드를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 서열번호 1 내지 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 10 으로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 감귤 감염성 바이로이드 검출용 고리매개등온 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성, 접합 및 신장 단계에서 각각 세 가지 온도변화를 주어야 하는 반면, 고리 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)은 한 가지 온도에서 DNA 증폭 반응이 일어나기 때문에 중합효소 연쇄반응처럼 별도의 특수한 기기 (PCR machine)가 필요하지 않다. LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 등온증폭법은 60 내지 65℃에서 1시간 내에 목표 핵산을 109 copies로 증폭시킬 수 있으므로, 64 ~ 65℃ 정도의 항온 유지 장치만 있으면 측정 가능하고 검사 시간이 30-60분 정도로 짧고 육안으로 관찰이 가능하며, 간편하고 쉽게 DNA를 증폭할 수 있다.
구체적으로 고리 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal gene amplification, LAMP)은 이너 프라이머(Inner-primer, FIP/BIF) 가 DNA에 먼저 결합하여 신장되고, 이어 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 아우터 프라이머(outer-primer, B3/F3c)가 결합되어 신장되면서 가닥 변위가 발생하며 먼저 형성된 가닥은 떨어져 나오게 된다. 떨어져 나온 단일 가닥의 5′-말단에서부터 loop 구조가 형성되며 이는 3′-말단에서도 같은 과정이 반복되고 loop 구조가 신장되게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 감귤 감염성 바이로이드는 Citrus bent leaf viroid 인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 감귤 감염성 바이로이드 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 조성물은 증폭 결과에 따라 색상이 변화하는 시약등을 더 포함하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 감귤 감염성 바이로이드 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
감귤 감염성 바이로이드 서열을 얻는 단계;
검출을 위한 RNA 주형을 합성 및 생성하는 단계;
상기 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 의한 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는 단계; 및
증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법에 있어서, 상기 역전사고리매개등온 증폭반응을 수행하는 단계에서는 60℃ 내지 65℃에서 증폭 반응을 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법은 감귤류에 감염되어 과실의 상품성 가치를 하락시키고 농가에 큰 경제적인 피해를 입히는 바이로이드, Citrus bent leaf viroid(CBLVd)를 등온 증폭 방법에 의해 현장에서 다량으로 증폭시켜 감귤 감염성 바이로이드를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 바이로이드의 공통적인 서열을 획득한 후 이와 가장 유사한 RNA 바이로이드 감염체를 합성하기 위한 과정을 나타낸다.
도 2 내지 도 3은 바이로이드 주형 생성 결과를 나타낸다.
도 4는 바이로이드의 공통 서열내에 위치한 본 발명에 의한 프라이머 세트를 나타낸다.
도 5는 고리 기반 등온 증폭 반응에서 프라이머 농도에 따른 증폭 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 고리 기반 등온 증폭 반응에서 반응 온도에 따른 증폭 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의한 프라이머 및 검출 기법의 특이성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2 내지 도 3은 바이로이드 주형 생성 결과를 나타낸다.
도 4는 바이로이드의 공통 서열내에 위치한 본 발명에 의한 프라이머 세트를 나타낸다.
도 5는 고리 기반 등온 증폭 반응에서 프라이머 농도에 따른 증폭 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 고리 기반 등온 증폭 반응에서 반응 온도에 따른 증폭 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의한 프라이머 및 검출 기법의 특이성을 확인한 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시트러스 바이로이드의 서열 분석 및 주형 가닥 선정
미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 시트러스 감염성 바이로이드인 Citrus bent leaf viroid(CBLVd)의 서열 총 34종을 찾고, Bio-edit 프로그램을 활용하여 공통 서열을 분석하였다.
분석 결과를 바탕으로 공통 서열을 추출하여 이를 NCBI blast 프로그램을 활용하여 가장 비슷한 서열(Genebank no.: AB006734)을 선정하고, 이를 고리 기반 등 증폭 과정을 수행하기 위한 주형 가닥으로 선정하였다.
<실시예 2> 획득된 공통 부위 서열 합성 및 프라이머 선정을 위한 주형의 생성
바이로이드 서열을 인공적으로 합성하여 활용하기 위하여, 바이오니아사(bionner, korea)의 유전자 합성 서비스를 활용하였으며, 합성된 서열은 이중 가닥 DNA로 pBHA vector에 삽입되었다(도 1).
바이로이드 검출을 위한 등온 증폭 방법에 활용될 프라이머 세트 후보군에 대한 증폭 효율을 검증하기 위하여 단일 가닥 RNA보다 상대적으로 안정된 이중 가닥 DNA를 활용하였다. 이를 위하여 vector 내에 존재하는 합성 서열 부위를 정방향 프라이머(CBL-F primer, 서열번호 11)와 역방향 프라이머(CBL-R primer, 서열번호 12)로 증폭하였다.
서열번호 11: CBL-F 프라이머 서열, 5‘-GGAGACTTCTTGTGGTTCCTG-3’
서열번호 12: CBL-R 프라이머 서열, 5‘-GAGGAGCCCTCAGGGGTTC-3’
또한 바이로이드 유전체가 RNA로 존재하기 때문에, 단일 가닥 RNA를 생성하기 위한 주형 가닥도 T7 프로모터 부위(17 bp)가 포함된 정방향 프라이머(CBL-F-T7 primer, 서열번호 13)와 상기 역방향 프라이머(서열번호 12)를 활용하여 중합효소 연쇄 반응으로 증폭하였다.
서열번호 13: CBL-F-T7 프라이머 서열
5‘-TAATACGACTCACTATAGGAGACTTCTTGTGGTTCCTG-3’
증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30 초, 54℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 30 주기 반복한 후, 72℃에서 5 분간 추가로 신장시키고, 증폭 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동으로 확인하였다(도면 2).
도 2에서 보는 바와 같이 증폭 결과, 두 밴드 모두 300 bp와 400 bp 사이에서 나타났으며, RNA 생성을 위하여 T7 프로모터 부위가 삽입된 밴드의 경우 삽입되지 않은 밴드보다 더 위에 나타났으므로, 사이즈가 더 크게 증폭되었다는 것을 확인하였다. 이는 각각 319 bp(레인 1)와 그에 17 bp를 더한 336 bp(레인 2)로 추정된다.
또한 상용화되어 있는 T7 promotor를 활용한 RNA 생성 키트(MEGAscript™ T7 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 활용하여 RNA를 생성하였으며, 이에 대한 결과를 원액, 1/10 희석, 1/100 희석하여 아가로오즈 겔 전기영동을 통하여 확인하였다(도면 3).
<실시예 3> 프라이머 구축 및 실험을 통한 선정
상기 실시예에서 획득된 바이로이드 유전체 서열을 바탕으로 고리 기반 등온 증폭 방법의 특이적 프라이머 세트 후보군을 선정하였다.
프라이머 선정을 위해 문헌 조사를 수행하였으며, 다음과 같은 조건에서 프라이머 세트를 구성하였다.; GC rich 조건, F1c와 Blc 크기는 15 bp-22 bp 사이, F2와 B2 크기는 15 bp-20 bp 사이, F3와 B3 크기는 15 bp-20 bp사이로 고정하였다.
각각의 프라이머의 Tm 값은 F1c와 Blc는 64-66℃, F2와 B2, F3과 B3는 59-61℃로 고정하였다. 또한 프라이머들의 GC rate는 50-65%로 고정되었으며, 각 프라이머 사이의 길이는 F2에서 B2는 120-170 bp 사이, F1c에서 F2 사이의 길이는 40-60 bp 사이, F2와 F3 사이는 60 bp 내외, F1c와 B1c 사이는 100 bp로 고정되었다.
이러한 조건으로 주형 물질에 특이적으로 부착되어 등온 증폭을 수행할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하였으며, 디자인된 프라이머 세트는 아래 표 1에 나타내었다. 구축된 프라이머들의 서열 상의 위치는 도 4에 표시하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열(5'→3') | Tm | 크기 (bp) |
|
| 서열번호 1 | CBL-F3 | TCAGCCCTACCTGCGAA | 54 | 17 | |
| 서열번호 2 | CBL-B3 | GAGCCCTCAGGGGTTCA | 56 | 17 | |
| 서열번호 3 | CBL-FIP | GCCAGTCGACCCCAACCTCAGAGGAGCTGACTGGTCGT | 38 | F1c+F2 | |
| 서열번호 4 | CBL-F1c | GCCAGTCGACCCCAACCTC | 61.4 | ||
| 서열번호 5 | CBL-F2 | AGAGGAGCTGACTGGTCGT | 57.1 | ||
| 서열번호 6 | CBL-BIP | TAACCGGACCGGTCCCCTTCTTCACCCTCTCCCCGC | 36 | B1c+B2 | |
| 서열번호 7 | CBL-B1c | TAACCGGACCGGTCCCCTT | 59.2 | ||
| 서열번호 8 | CBL-B2 | CTTCACCCTCTCCCCGC | 58 | ||
| 서열번호 9 | CBL-LF | CTGACGAGCCTTCGTCGACG | 61.6 | 20 | |
| 서열번호 10 | CBL-LB | CTAGTCGAGCGGACTTCCAAGTC | 62 | 23 |
고리 기반 등온 증폭을 위해서는 각 프라이머의 Tm 값이 중요하므로 그 값을 표 1에 표시하였다. 또한 FIP는 F1c 서열과 F2 서열, BIP는 B1c 서열과 B2 서열이 합해진 프라이머로 두 가지 서열을 따로 표시하였다.
<
실시예> 등온증폭반응시
최적
프라이머
농도 결정
각 프라이머 후보군의 효율을 실험하기 위하여 프라이머 세트를 활용하여 프라이머 농도를 결정하기 위한 반응을 수행하였으며, 그와 같은 과정은 다음과 같다.;
등온 증폭 효소 버퍼 2.5 ul, 농도별 프라이머 세트(도 5), 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 1 μL을 넣어 총 24 μL가 되도록 증류수로 채웠다.
그 다음 95℃에서 5분간 가열하고 실온에서 5분 간 식힌 다음, bst 중합 효소(NEB, england) 1 μL (8 unit)을 넣고 63℃에서 1시간 동안 반응을 수행하였고 반응의 중단을 위하여 85℃에서 1분 동안 반응하였다. 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동을 활용하여 확인하였다(도 5).
도 5에서 보는 바와 같이 내부 프라이머인 FIP, BIP 프라이머의 농도는 각기 3.2 μM, 외부 프라이머인 F3, B3 프라이머는 각기 0.4 μM, 루프 프라이머인 LF, LB 프라이머는 각기 0.8 uM을 활용한 반응에서 비특이적인 반응 없이 증폭이 수행되었다.
<실시예> 등온증폭반응에서의 반응 온도 결정
반응 온도에 따라 증폭력이 달라지므로, 최적 반응 온도를 확인하기 위하여 반응 온도별 반응을 수행하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
Bst 중합효소의 경우, 60~65℃에서 활성을 가진다는 이론을 바탕으로, 61℃, 63℃, 65℃에서 반응을 수행하였다. 이 때, 등온 증폭 반응의 주형 가닥은 상기 실시예에서 구축한 RNA를 활용하였다. 이를 위하여 반응액은 RNA에서 DNA를 생성하기 위한 M-MLV 역전사 효소 200 U이 포함되었다.
도 6에서 보는 바와 같이 2.5% 아가로오즈 겔 전기영동 수행 결과, 61℃에서는 주형 가닥이 포함되지 않은 반응 액에서 비특이적인 반응이 확실히 보였고, 63℃에서도 약간의 비특이적인 반응이 보였다. 65℃의 경우, 비특이적인 반응은 확인되지 않았으며 특이적인 반응이 확인되어 이를 최종 온도로 결정하였다.
<실시예> 프라이머 특이성 확인
상기 실시예에서 구축된 본 발명의 프라이머 세트의 특이성을 확인하기 위하여 숙주인 시트러스에 감염되는 다른 바이로이드로서 Citrus exocortis viroid(CEVd)와 Citrus dwarfing viroid(CDVd)에 대하여 상기 실시예에서 구축된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 각 바이로이드의 서열을 표적으로 한 등온 증폭 반응을 수행하여 비교하였다.
CEVd, CDVd 서열은 상기에 서술된 바처럼 NCBI 기반의 서열 정보를 바탕으로 공통 서열을 구축하여 CEVd(Genebank no.: EF494677), CDVd(Genebank no.: AF184147) 서열을 활용하여 RNA를 생성하고, 생성된 CEVd, CDVd 주형 가닥들을 활용하여, 상기 실시예에서 사용된 반응액 및 프라이머 세트를 사용하여 특이성을 검증하고 그 결과를 도 7에 나타내었다(도 7).
2.5% 아가로오즈 겔 전기영동 수행 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 주형 가닥이 CBLVd RNA인 경우 증폭이 나타났으나 CEVd와 CDVd에서는 증폭이 나타나지 않아 본 발명의 실시예에서 선정된 프라이머가 CBLVd RNA에 대해 특이성이 있음을 확인하였다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> PRIMER SET FOR CITRUS INFECTIOUS VIROID DETECTING USING
LOOP-MEDIATED ISOTHEMAL AMPLIFICATION AND LOOP-MEDIATED ISOTHEMAL
AMPLIFICATION USING THE SAME
<130> DP-2018-0319-KR
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-F3 primer
<400> 1
tcagccctac ctgcgaa 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-B3 primer
<400> 2
gagccctcag gggttca 17
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-FIP primer
<400> 3
gccagtcgac cccaacctca gaggagctga ctggtcgt 38
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-F1c primer
<400> 4
gccagtcgac cccaacctc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-F2 primer
<400> 5
agaggagctg actggtcgt 19
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-BIP primer
<400> 6
taaccggacc ggtccccttc ttcaccctct ccccgc 36
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-B1c primer
<400> 7
taaccggacc ggtcccctt 19
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-B2 primer
<400> 8
cttcaccctc tccccgc 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-LF primer
<400> 9
ctgacgagcc ttcgtcgacg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-LB primer
<400> 10
ctagtcgagc ggacttccaa gtc 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-F primer
<400> 11
ggagacttct tgtggttcct g 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-R primer
<400> 12
gaggagccct caggggttc 19
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBL-F-T7 primer
<400> 13
taatacgact cactatagga gacttcttgt ggttcctg 38
Claims (6)
- 서열번호 1 내지 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 시트러스 벤트 립 바이로이드(Citrus bent leaf viroid) 검출용 고리매개등온 증폭용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항의 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 시트러스 벤트 립 바이로이드(Citrus bent leaf viroid) 검출용 조성물.
- 제1항의 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 시트러스 벤트 립 바이로이드(Citrus bent leaf viroid) 검출용 키트.
- 감귤로부터 시료을 수집하는 임상샘플수집단계;
시료에서 바이로이드 RNA를 분리하는 단계;
상기 RNA를 주형으로 하고, 제1항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭반응을 수행하는 단계; 및
증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 시트러스 벤트 립 바이로이드(Citrus bent leaf viroid) 검출 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 고리매개등온 증폭반응을 수행하는 단계에서는 60℃ 내지 70℃ 에서 증폭 반응을 수행하는 것인
시트러스 벤트 립 바이로이드(Citrus bent leaf viroid) 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180142745A KR102140463B1 (ko) | 2018-11-19 | 2018-11-19 | 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180142745A KR102140463B1 (ko) | 2018-11-19 | 2018-11-19 | 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200058130A KR20200058130A (ko) | 2020-05-27 |
| KR102140463B1 true KR102140463B1 (ko) | 2020-08-03 |
Family
ID=70911164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180142745A KR102140463B1 (ko) | 2018-11-19 | 2018-11-19 | 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102140463B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101024493B1 (ko) | 2008-07-22 | 2011-03-24 | 대한민국 | 사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를이용한 진단방법 |
-
2018
- 2018-11-19 KR KR1020180142745A patent/KR102140463B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Lee 등, 2017 한국생물공학회 춘계학술발표대회 및 국제심포지엄, 페이지 429 (2017.04.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200058130A (ko) | 2020-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gang et al. | Analysis of fungicide sensitivity and genetic diversity among Colletotrichum species in sweet persimmon | |
| CN111363856A (zh) | 多重rt-pcr同时检测四种番茄病毒的方法 | |
| CN108559783B (zh) | 一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法 | |
| Raj et al. | Molecular evidence for association of Tomato leaf curl New Delhi virus with leaf curl disease of papaya (Carica papaya L.) in India | |
| KR102140463B1 (ko) | 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 등온 증폭 방법에 의한 감귤 감염성 바이로이드 검출 방법 | |
| JP2019013169A (ja) | ウイルス診断法 | |
| CN103849691A (zh) | 一种甘薯病毒检测引物及方法 | |
| CN103820462B (zh) | 禾谷缢管蚜act1内参基因部分序列、克隆方法及应用 | |
| CN106434879B (zh) | 快速高效检测蛹虫草不同菌种交配型的方法 | |
| KR101719719B1 (ko) | Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 | |
| CN107893129A (zh) | 检测苹果绿皱果病毒的方法 | |
| KR101577529B1 (ko) | 참다래 궤양병균 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 참다래 궤양병의 진단방법 | |
| CN103820463B (zh) | 禾谷缢管蚜gapdh内参基因部分序列、克隆方法及应用 | |
| KR101855965B1 (ko) | 붉은 곰팡이병 진단용 조성물 | |
| KR101909786B1 (ko) | 로젤리니아 네카트릭스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| Ameyaw et al. | Variable detection of Cacao swollen shoots disease-associated badnaviruses by PCR amplification | |
| CN106755541B (zh) | 一种荷叶离褶伞鉴别用分子标记及引物和探针 | |
| KR101983456B1 (ko) | 네스티드 pcr을 이용한 토양 내 보리누른모자이크 바이러스의 검출방법 | |
| CN113430289B (zh) | 一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法 | |
| KR101750837B1 (ko) | MNSV, SqMV, WMV, 및 CABYV 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| KR101498110B1 (ko) | 검은점뿌리썩음병 저항성 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR102228116B1 (ko) | 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사과 줄기 바이러스병 진단방법 | |
| KR101391555B1 (ko) | 인삼 병원균 검출용 동시다중 유전자 증폭용 검출 방법 | |
| CN105543417A (zh) | 一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法 | |
| KR101719721B1 (ko) | 참다래 궤양병균 검출용 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |