KR101577529B1

KR101577529B1 - 참다래 궤양병균 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 참다래 궤양병의 진단방법

Info

Publication number: KR101577529B1
Application number: KR1020140041234A
Authority: KR
Inventors: 고영진; 정재성; 고현석; 이영선; 김경희
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2014-04-07
Publication date: 2015-12-17
Also published as: KR20150116524A

Abstract

본 발명은 서열번호 21의 프라이머 및 서열번호 22의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)를 특이적으로 검출하는 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 검출용 키트는 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 참다래 궤양병균주의 감염 여부를 확인하기 위한 다양한 실험에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 동시에 상기 궤양병균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지 여부를 확인하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제 방법을 마련할 수 있다. 뿐만 아니라 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주의 확산을 모니터링하거나 아직까지 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주에 대한 보고가 없는 일본, 중국 등에서 재배되는 참다래 나무에 궤양병을 야기시키는 균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지를 모니터링 하는데 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

참다래 궤양병균 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 참다래 궤양병의 진단방법{Primer set for detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae, diagnositc kit using the same and diagnosis method of bacterial canker of kiwifruit using the same}

본 발명은 참다래 궤양병균 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참다래 궤양병균주에 감염된 참다래를 신속하고, 간편하게 검출할 수 있는 참다래 궤양병균 검출용 키트, 및 상기 키트를 이용한 참다래 궤양병 진단방법에 관한 것이다.

참다래(키위, kiwifruit)는 다래과에 속하는 덩굴성 낙엽과수로, 그 종으로는 악티니디아 델리시오사(Actinidia deliciosa), 악티니디아 알쿠타(Actinidia arguta), 악티니디아 체리산타(Actinidia chrysantha), 악티니디아 에리안타(Actinidia eriantha), 악타나다어 코로믹타(Actinidia kolomikta), 악티니디아 폴리가마(Actinidia polygama), 악티니디아 키넨시스(Actinidia chinensis) 등이 있다. 참다래는 재배초기 내병성 과수로 알려졌었으나, 1980년 후반 동북아시아로 확대 재배되면서 궤양병이 발생하여 일부 과수원을 폐원시킬 만큼 큰 피해를 주고 있다.

상기 궤양병을 일으키는 병원균은 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)으로 1989년 일본에서 처음 보고되었으며, 이어 우리나라와 이탈리아에서도 발생이 보고된 바 있다(Takikawa et al., 1989; Koh et al., 1994; Scotichini, 1994). 참다래 궤양병균이 참다래 나무의 잎에 감염되면 2~3년의 잠복기를 거쳐 병징이 나타난다. 이러한 병징은 2월부터 4월에 격심하게 나타나며, 줄기에 피해를 주는 경우와 그 후 잎이나 신초에 발생하는 경우로 나눌 수 있다. 그중 잎이나 신초에 발생하는 병징은 여러 가지 곰팡이에 의해 생기는 점무늬병과 유사한 증세를 나타내기 때문에 정확한 육안진단이 어려운 문제가 있다. 이외에도 참다래 궤양병균은 줄기나 가지로부터 병원균을 분리하기 어렵고, 분리된 병원균의 생리 및 생화학적 동정에 많은 시간이 소요되므로 참다래 궤양병균에 대한 방제시기를 놓쳐 우리나라와 일본에서는 궤양병에 의해 폐원되는 등 막대한 경제적 피해가 발생하였다. 반면, 이탈리아에서는 비교적 경미한 증세만 보였을 뿐 궤양병에 의한 경제적 피해는 크지 않았다.

그러나 최근 골드 참다래(Actinidia chinensis)가 널리 보급되면서 2008년 이탈리아 중부지역으로부터 심각한 증상을 일으키는 참다래 궤양병균이 빠른 속도로 전염되어 참다래 과수원을 폐원시키는 커다란 피해가 보고되었으며, 이어 2011년에는 포르투칼, 스페인, 프랑스, 터키, 뉴질랜드, 칠레 등에서도 참다래 궤양병이 보고되고 있다. 현재 골드키위 품종에서 발생하는 궤양병은 전 세계적으로 참다래 산업의 가장 큰 위협 요인으로 대두 되고 있다(Vanneste, 2012). 이에 골드키위 품종에 피해를 주는 궤양병균의 분류 및 동정과 유전적 특성을 초기에 빠르고 간편하게 조사할 수 있는 DNA 마커의 개발 및 진단방법 등에 관한 연구가 진행되고 있다.

이와 관련하여, Balestra 등(2013)은 최근 전 세계적으로 궤양병을 일으키고 있는 균주 중에서 유럽 균주, 뉴질랜드 균주 및 중국 균주를 각각 구별하여 공동적으로 검출할 수 있는 진단 마커에 대하여 기재하고 있으나, 상기 진단 마커는 최근 우리나라에서 분리된 궤양병균주를 검출하지 못하는 문제가 있다.

우리나라는 남해안 지역에서 주로 참다래를 재배되고 있으며, 그 재배면적은 전남지역이 전국의 57%를 차지하고 있다. 그러나, 1990년 수입이 자유화된 이후 참다래 수요는 매년 증가하여 국내에서만 년간 참다래 소비량이 45,000톤에 이를 정도이지만, 생산량은 15,000톤 정도에 불과하므로 매년 30,000톤 정도를 뉴질랜드, 미국, 칠레 등에서 수입하고 있는 실정이다(한국참다래연합회, 2009). 따라서, 국내 참다래의 안정적 생산 및 소비 체계를 구축하기 위해서는 참다래에서 발생하는 주요 병의 정확한 진단을 토대로 재배 농가에 발생된 주요 병의 모니터링과 방제 방법 개발이 더욱 필요하다.

이에 본 발명자들은 참다래에서 궤양병을 일으키는 균주를 조기에 간단하고 정확하게 검출이 가능하면서, 궤양병을 일으키는 균주를 각각 구별하여 동시에 검출할 수 있는 특이적 검출용 키트를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 21의 프라이머 및 서열번호 22의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 검출용 키트에 서열번호 23의 프라이머 및 서열번호 24의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하여 Psa 3에 속하는 참다래 궤양병균주와 Psa 1 그룹 및 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 동시에 검출하는 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 검출용 키트를 이용하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주를 검출하고, 동시에 그 궤양병 균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균지인지 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 21의 프라이머 및 서열번호 22의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)를 특이적으로 검출할 수 있는 검출용 키트에 관한 것이다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 국·내외 참다래 궤양병균주는 지리적 기원에 따라 유전적 변이를 가지고 있다. 한 예로, 1980년대 일본에서 재배되는 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주와 1994년 이탈리아에서 재배되는 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하며, 상기와 같은 특징을 가지는 균주를 Psa 1로 그룹화 하였다. 이에 반하여 1990년 초반 이후 한국에서 재배되는 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주는 COX(coronatine)를 생산하며, 이를 Psa 2로 그룹화 하였다. 그러나, 2008년 이후 이탈리아에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis)로부터 처음 분리된 균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)와 COX(coronatine)를 생산하지 않으며, 2008년 이후 이탈리아 뉴질랜드, 칠레 등 전 세계에서 재배되는 참다래로부터 분리된 균주를 Psa 3로 그룹화 하였다(Chapman et al., 2012).

또한, 2011년 한국에서 재배된 골드 참다래로부터 Psa 3 그룹에 속하는 새로운 타입의 균주가 발견되었다.

구체적으로, 한국에서 병든 골드 참다래 나무의 잎으로부터 병원균을 수집한 후 배지에 배양하여 병원균을 분리 및 확인하고 계통수를 작성한 결과 새로운 균주를 발견하게 되었는데, 그 새로운 균주들은 2008년 이후 발견된 이탈리아 균주(IHL1 및 IKB4 계통)와 동일하게 파세오로독소(phaseolotoxin)와 COX(coronatine)을 생산하지 않는 Psa SYS1 및 Psa SYS4이다. 이들 Psa SYS1 및 Psa SYS4는 농업유전자원센터 미생물은행에 각각 기탁번호 “KACC 16841” 및 “KACC 16843”으로 기탁된 미생물이다.

이에, 최근 유전적으로 상이한 균주를 검출하기 위한 진단 마커가 개발되었다. 구체적으로 상기 진단 마커는 유럽, 중국, 한국/일본에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis) 또는 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 궤양병균주를 공통적으로 검출할 수 있다고 개시하고 있다(Balestra et al., 2013).

그러나, 상기 논문에서 개시하고 있는 유럽에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 유럽에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하고, 중국에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 중국과 뉴질랜드에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하며, 한국/일본에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 일본에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주만 검출한다. 그러나, 상기 진단 마커는 Psa 3 그룹에 속하는 2011년 한국에서 재배된 골드 참다래로부터 분리된 균주는 검출하지 못한다(실시예 6 참조).

따라서, 본 발명은 Psa 3 그룹에 속하는 균주를 공통으로 검출할 수 있는 진단 마커를 제공한다.

본 발명의 명세서에서 용어, "프라이머"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 핵산 서열은 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 연속 염기로 구성되며, 주형과 충분히 안정된 염기쌍을 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명에 있어서, 상기 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 Psa SYS4, Psa IHL1 및 Psa IKB4 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 궤양병균주이며, 파세오로독소(phaseolotoxin)와 COX(coronatine)을 생산하지 않는 것을 특징으로 한다.

하나의 구체적 실시에서, 2011년도에 한국과 이탈리아에서 궤양병 병징을 나타내는 골드 참다래 나무의 잎으로부터 병원균을 분리 및 배양한 후 6개의 항존 유전자(cts, gysB, acnB, gapA, pfk 및 pgi)를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 다중 염기서열 분석(multilocus seqeuence analysis, MLSA)를 실시한 결과, cts 유전자의 252번과 432번에 사이토신(cytosine, C)이 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 한국과 이탈리아에서 분리한 병원균들의 16S rRNA를 이용하여 계통수를 작성한 결과, 한국의 골드 참다래로부터 분리한 병원균들은 각각 Psa SYS1 및 Psa SYS4의 염기서열과 100% 일치하였고, 이탈리아의 골드 참다래로부터 분리한 병원균들은 각각 Psa IHL1 및 Psa IKB4의 염기서열과 100% 일치하는 것으로 확인되었다.

본 발명의 키트는 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 유전자를 특정하게 증폭하여 545 bp의 크기를 나타낼 수 있도록 고안된 서열번호 21의 핵산서열을 가지는 전방향 프라이머 및 서열번호 22의 핵산서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예를 들어, 부가, 결실, 치환 등)될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 전기영동에 필요한 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트는 서열번호 23의 프라이머 및 서열번호 24의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하여 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 검출하면서, Psa 1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주 및 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 공통적으로 검출하는 용도로 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 23의 프라이머 및 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭되는 산물의 크기는 311 bp이며, 한국에서 재배되는 참다래로부터 분리된 Psa 2 그룹에 속하는 균주는 물론 이탈리아, 뉴질랜드 및 일본에서 재배되는 참다래로부터 분리된 Psa 1 및 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 공통적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 2008년 이후 한국, 일본, 중국, 뉴질랜드, 칠레, 오스트레일리아, 이탈리아 및 중국 등 전 세계에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis) 또는 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T10_04758, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T10_04758, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T11_0918, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) Psa1A, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) Psa1B, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CRA-FRU 10.22, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CRA-FRU 8.76 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 Psa 1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 일본 및 2008년 이전 이탈리아에서 재배되는 참다래 나무로부터 분리된 궤양병균주로, 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하는 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MAFF 302091, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MAFF 302143, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) ICMP 9855, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) NCPPB 3873, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MCPPB 3871 등의 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 한국에서 재배되는 참다래 나무로부터 분리된 궤양병균주로, COX(coronatine)을 생산하는 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10584, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10594 및 Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10754로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 Pas 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주와 Pas 1 그룹 및 Pas 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 공통적으로 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들은 상기 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 검출용 키트는 궤양병균주의 감염여부가 의심되는 참다래 나무에서 궤양병균의 존재 여부의 검출 및 정량, 이에 따른 참다래 궤양병균의 감염여부의 스크리닝을 위한 다양한 실험에서 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 검출용 키트는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 또는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, m-PCR)에 사용될 수 있다.

이하에서는, 본 발명에 따른 검출방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 참다래로부터 시료를 분리하는 단계이다.

궤양병균주의 감염여부가 의심되는 참다래 나무의 잎, 가지 또는 줄기로부터 생물학적인 DNA를 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분리하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 궤양병균주에 감염되었다고 의심되는 시료를 채취한 후, 이를 멸균수 또는 0.85% 생리식염수에 현탁한 후 프로테나아제 K(proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한다. 그 다음 상기 펠렛을 멸균수로 부유하고 여기에 페놀/콜로로폼(1:1) 혼합액을 처리한 후 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 에탄올을 가한 후 원심분리하여 DNA를 수득할 수 있다.

(2) 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 다중 중합효소연쇄반응(m-PCR)을 수행하는 단계이다.

상기 (1)에서 분리한 시료를 주형으로 하고 본 발명의 서열번호 21 및 서열번호 22를 포함하는 프라이머 세트, 또는 상기 프라이머 세트와 서열번호 23 및 서열번호 24를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하여 참다래 궤양병균의 특정한 유전자를 증폭하는 단계이다.

상기 유전자 증폭은 (ⅰ)변성(denaturation) 단계, (ⅱ) 프라이머의 대상 핵산결합(annealing) 단계 및 (ⅲ) 신장(extention) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 이루어진다.

본 발명의 명세서에서 용어, "사이클"은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 특정의 범위로 한정되지는 않고, 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으나, 바람직하게는 (ⅰ) 90 내지 98℃에서 1 내지 7분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성하는 개시변성과정, (ⅱ) 90 내지 98℃에서 30 내지 60초 동안의 변성과정, (ⅲ) 50 내지 70℃에서 30 내지 60초 동안 프라이머의 대상 핵산결합과정, (ⅳ) 65 내지 75℃에서 30 내지 60초 동안 신장과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계, 및 (ⅴ) 65 내지 75℃에서 5 내지 10분 동안 추가 신장단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 사이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.

(3) 중합효소연쇄반응의 산물을 분석하는 단계이다.

상기 (2) 단계를 통해 생성된 산물을 당업계에 공지된 방법에 따라 DNA 크기별로 분리하여 분석할 수 있다. 구체적으로, 상기 중합효소연쇄반응의 산물은 아가로오스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel) 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하거나 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 (2) 단계의 중합효소연쇄반응을 통해 생성된 산물을 형광분석장치를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 검출방법은 Pas 3 그룹에 속하는 궤양병균주를 검출하면서, Psa 1 그룹 또는/및 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주와 각각 구별하여 공통적으로 존재하는지의 여부를 확인하여 감염을 진단할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 한국과 이탈리아의 참다래로부터 분리 및 동정된 SYS1, SYS4, IHL1 및 IKB4의 새로운 궤양병균주, 종래 참다래 궤양병균 4종(CJW3, JYG6, Kw11 및 PaB1), 및 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종(LMG5092, MAFF302851 및 MAFF302852)을 서열번호 21 내지 24로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응(multiplex-PCR)을 수행한 후 전기영동을 한 결과, 2011년에 분리 및 동정된 새로운 궤양병균주인 SYS1, SYS4, IHL1 및 IKB4는 545 bp와 311 bp 크기의 특이적 DNA 밴드가 확인되었고, 종래 참다래 궤양병균인 CJW3, JYG6, Kw11 및 PaB1은 311 bp 크기의 단편 DNA 밴드만 확인되었으며, 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종인 LMG5092, MAFF302851 및 MAFF302852에서는 DNA 단편이 확인되지 않았다.

본 발명에 따른 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법은 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 궤양병균에 의한 감염 여부를 확인하고, 동시에 상기 궤양병균이 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지 여부를 확인하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제 방법을 마련할 수 있다. 뿐만 아니라 한국의 경우 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주의 확산을 모니터링하거나 아직까지 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주에 대한 보고가 없는 일본, 중국 등에서 재배되는 참다래 나무에 궤양병을 야기시키는 균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지를 모니터링 하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 검출용 키트는 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 참다래 궤양병균주의 감염 여부를 확인하기 위한 다양한 실험에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 동시에 상기 궤양병균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지 여부를 확인하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제 방법을 마련할 수 있다. 뿐만 아니라 한국의 경우 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주의 확산을 모니터링하거나 아직까지 Psa 3 그룹에 속하는 궤양병균주에 대한 보고가 없는 일본, 중국 등에서 재배되는 참다래 나무에 궤양병을 야기시키는 균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지를 모니터링 하는데 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 참다래 궤양병균주를 대상으로 다중 염기서열 분석(multilocus seqeuence analysis, MLSA)을 실시하여 7개의 항존 유전자(acn, cts, gapA, gyrB, pfk, pgi 및 rpoB)의 변이에 따라 계통수를 작성한 것이다.
도 2는 항존유전자(housekeeping gene, cts, gysB, acnB, gapA, pfk 및 pgi), 궤양병을 일으키는 effetor 유전자(hrpL, hrpS 및 hrpZ) 또는 16S rRNA 유전자를 증폭할 수 있는 각 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 뒤 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 판독한 결과이다.
도 3은 본 발명의 신규한 참다래 궤양병균 4종, 종래 참다래 궤양병균 4종 및 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종에 서열번호 21 내지 24를 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 신규한 참다래 궤양병균주 분리

2011년 4월에 전남 고흥군 도덕면에서 재배되고 있는 골드키위 품종인 Yellow king(Actinidia chinensis)의 잎에서 궤양병 병징을 나타내는 병환부로부터 병원세균을 일반적인 방법으로 분리하였다. 또한, 2011년 5월 이탈리아를 방문하여 궤양병이 가장 창궐하고 있는 Lazio주에서 재배되고 있는 병든 골드 참다래(Actinidia chinensis) 나무의 잎에서 병원세균을 분리하여 상기와 같은 방법으로 분리하였다.

실시예 2 : 신규한 참다래 궤양병균주의 동정

상기 실시예 1에서 한국 및 이탈리아의 골드 참다래 잎으로부터 분리된 신규한 참다래 궤양병균 4종, 종래 참다래 궤양병균 4종, 및 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종을 펩톤 수크로오스 고체배지(PSA, peptone 10g, sucrose 10g, agar 15g, 증류수 1,000ml, pH 7.4)에 접종하여 26℃의 온도가 유지되는 항온기에서 각각 배양하였다. 그 다음 게놈 DNA 추출 키트(genomic DNA extract kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 알카라인 라이시스(alkaline lysis) 방법으로 이들의 DNA를 추출하였다. 그 다음 상기 참다래 궤양병균들의 DNA를 하기 표 1의 프라이머 세트 및 16S rRNA프라이머를 이용하여 항존유전자(housekeeping gene, cts, gysB, acnB, gapA, pfk 및 pgi), 궤양병을 일으키는 effetor 유전자(hrpL, hrpS 및 hrpZ) 및 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 뒤 솔젠트(주)에서 MLSA(multilocus sequence analysis) 및 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 판독하여 동정하였다. 상기 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 개시변성(initial denaturation)을 거친 후 94℃에서 30초간 변성(denaturation)을 하고, 30초간 프라이머 대상 핵산결합(annealing)을 하고, 72℃에서 30초 동안 신장(extension)을 하는 프로그램을 30회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 후기-신장(post-extension)을 통해 DNA를 증폭하였다. 이때, 각 프라이머의 핵산결합(annealing) 온도는 하기 표 1에 나타내었다. 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.

	프라이머 염기서열(5′→3′)	증폭온도(℃)	타겟유전자	증폭크기(bp)
cts-F	AGTTGATCATCGAGGGCGCWGCC(서열번호 1)	56	cts	480
cts-R	TGATCGGTTTGATCTCGCACGG(서열번호 2)
gyrB-F	MGGCGGYAAGTTCGATGACAAYTC(서열번호 3)	63	gyrB	620
gyrB-R	TRATBKCAGTCARACCTTCRCGSGC(서열번호 4)
acn-F	ACATCCCGCTGCACGCYCTGGCC(서열번호 5)	60	acn	332
acn-R	GTGGTGTCCTGGGAACCGACGGTG(서열번호 6)
gapA-F	CGCCATYCGCAACCCG(서열번호 7)	62	gapA	700
gapA-R	CCCAYTCGTTGTCGTACCA(서열번호 8)
pfk-F	ACCMTGAACCCKGCGCTGGA(서열번호 9)	55	pfk	850
pfk-R	ATRCCGAAVCCGAHCTGGGT(서열번호 10)
pgi-F	TTCAGCATGCGCGAAGCG(서열번호 11)	55	pgi	448
pgi-R	TGCGCCAGGTACCAGG(서열번호 12)
hrpL-F	TTTTGGCTGGCAYGGTTATCGCTATA(서열번호 13)	60	hrpL	555
hrpL-R	TGTGGTTTTGCGTGCGAGTTGGTTCC(서열번호 14)
hrpS-F	CTSCAGGCCAAGCTGCTGAGGGTGC(서열번호 15)	60	hrpS	240
hrpS-R	TTGAGCTCRCGGATATTGCCGGGCC(서열번호 16)
hrpZ-F	GCTGTGATCGATCAGCTGGT(서열번호 17)	60	hrpZ	993
hrpZ-R	TCAGGCCACAGCCTGGTTAG(서열번호 18)
27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(서열번호 19)	55	16S rRNA	1,535
1525R	AAAGGAGGTGATCCAGCC(서열번호 20)

번 호	P. syringae 병원형	계 통	발생국	연도
1	pv. actinidiae	SYS1	한국	2011
2		SYS4	한국	2011
3		IHL1	이탈리아	2011
4		IKB4	이탈리아	2011
5		CJW3	한국	1999
6		JYG6	한국	1999
7		Kw11	일본	1989
8		PaB1	일본	1989
9	pv. theae	LMG5092	일본	1970
10		MAFF302851		1993
11		MAFF302852		1993

실험결과, 상기 실시예 1에서 한국과 이탈리아의 참다래로부터 분리한 균주는 Psa(P. syringae pv. actinidiae) SYS1, SYS4, IHL1 및 IKB4 계통의 16S rRNA의 염기서열과 100% 일치하는 것으로 확인되었다.

또한, 6개의 항존 유전자(cts, gysB, acnB, gapA, pfk 및 pgi)에 대한 다중 염기서열 분석 결과, 파세오로독소(phasesolotoxin)와 COX(coronatine)를 생산하지 않는 Psa 3 그룹에 속하는 것으로 사료된다.

실시예 3 : 게놈 DNA의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 분석에 의한 신규한 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편 검출

상기 실시예 2에서 동정된 신규한 참다래 궤양병균인 SYS1, SYS4, IHL1 및 IKB4로부터 게놈 DNA을 추출한 후 94℃에서 15초 동안 변성(denaturation), 45℃에서 30초 동안 증폭(annealing), 72℃에서 90초 동안 연장(extention)을 47 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extention)을 5분 동안 실시하여 증폭하였다. 그 다음 랜덤 프라이머 OPA-01(operon biotechnologies, USA)를 사용하여 신규한 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 검출하고, 이들 단편을 AccuPrep 겔 추출 키트(gel purification kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 추출하였다.

실시예 4 : 유전자 클로닝 및 염기서열 결정

상기 실시예 3에서 추출한 DNA 단편을 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 삽입하고 라이게이션(ligation)시킨 후 E.coli에 형질전환시키고, 배양하여 신규한 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 클로닝한 후 솔젠트(주)에 의뢰하여 RARD 마커(GenBank under accession number KF772879)를 주형으로 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 신규한 참다래 궤양병균은 분자표지인 SCAR(sequence characterized amplified region)을 포함하고 있음을 확인하였다.

실시예 5 : 신규한 참다래 병원균 진단을 위한 특이적 프라이머 제작

상기 실시예 4의 특이적 DNA 단편의 염기서열을 기초로 하여 프라이머 세트(forward primerl F 및 reverse primer; R)를 합성하고, 신규한 참다래 궤양병균 게놈 DNA에 공시하여 PCR을 실시하였으며, 상기 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에 나타내었다.

	프라이머 염기서열(5'→3')	증폭온도	타겟 유전자	증폭산물크기(bp)
Tac-F	CGGGCTAGACAGTACGCTGT(서열번호 21)	65℃	-	545
Tac-R	CAGGCCCTTCTACCGCTAC(서열번호 22)	65℃	-	545

실시예 6 : Multiplex-PCR 시스템을 이용한 참다래 궤양병균의 검출 확인

상기 실시예 2에서 동정된 신규한 참다래 궤양병균 4종, 종래 참다래 궤양병균 4종 및 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종을 단 1회의 중합효소연쇄반응으로 검출가능한지 여부를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로, 상기 신규한 참다래 궤양병균 4종, 종래 참다래 궤양병균 4종 및 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종의 DNA에 국·내외 참다래 궤양병균을 모두 검출 가능한 프라이머 세트[P.s.a-F: 5'-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3'(서열번호 23), P.s.a-R: 5'-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3'(서열번호 24); Balestra et al., 2013]와 본 발명에 따른 상기 실시예 5에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 상기 실시예 5와 동일한 PCR 조건에서 반응시켰다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 EDTA로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험결과, 311 bp 크기의 밴드는 참다래 궤양병균(lane 1-9)에서만 확인되었으며, 신규한 참다래 궤양병균에서는 311 bp 및 545 bp의 두 개의 밴드가 확인되었다.

실시예 7 : 종래 Balestra et al. , 2013의 논문에서 사용된 프라이머 세트를 이용한 참다래 궤양병균주 검출 재확인

상기 실시예 2에서 동정된 신규한 참다래 궤양병균 4종, 종래 참다래 궤양병균 4종, 병원형과 종 및 속이 다른 유사세균 3종, 중국에서 재배된 참다래로부터 분리된 균주 CH2010-5, 스위스에서 재배된 참다래로부터 분리된 균주 LSV 38.17, 프랑스에서 재배된 참다래로부터 분리된 균주 14F, 스페인에서 재배된 참다래로부터 분리된 균주 829 및 포르투칼에서 재배된 참다래로부터 분리된 균주 820을 종래 Balestra et al ., 2013의 논문에서 사용된 프라이머 세트를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 EtBr(Ethidum bromide)로 염색하여 확인하였다. 상기 프라이머 세트의 서열은 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머 명	프라이머 염기서열(5′→3′)
P.s.a-F	CAGAGGCGCTAACGAGGAAA(서열번호 23)
P.s.a-R	CGAGCATACATCAACAGGTCA(서열번호 24)
유럽-F	TGGTGATCGTCTGGATGTGT(서열번호 25)
유럽-R	ATTATGCTCCTGGCTCATGG(서열번호 26)
중국-F	GGAGTTCCAGCAACTGACG(서열번호 27)
중국-R	CGCTCAAGATCCTTTTCCAT(서열번호 28)
일본/한국-F	AGCAACGGTGGTTTGTTTTC(서열번호 29)
일본/한국-R	AAATGTTTGCCAGCCAAGTC(서열번호 30)

실험결과, 도면에는 기재하지 않았으나 2011년 한국에서 재배된 골드 참다래로부터 분리된 신규한 참다래 궤양병균(SYS1 및 SYS4)에서 밴드가 확인되지 않았다.

반면, 유럽의 참다래로부터 분리된 균주를 검출하는 프라이머는 유럽의 참다래로부터 분리된 균주를 검출하였고, 중국의 참다래로터 분리된 균주를 검출하는 프라이머는 중국과 뉴질랜드의 참다래로부터 분리된 균주를 검출하였으며, 한국/일본의 참다래로부터 분리된 균주를 검출하는 프라이머는 일본의 참다래로부터 분리된 균주만 검출하는 것을 확인하였다.

<110> Sunchon University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae, diagnositc kit using the same and kiwifrut bacterial canker method of diagnosis using the same <130> PA-14-0084 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cts forward primer <400> 1 agttgatcat cgagggcgcw gcc 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cts reverse primer <400> 2 tgatcggttt gatctcgcac gg 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gryB forward primer <400> 3 mggcggyaag ttcgatgaca aytc 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gryB reverse primer <400> 4 tratbkcagt caraccttcr cgsgc 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acn forward primer <400> 5 acatcccgct gcacgcyctg gcc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acn reverse primer <400> 6 gtggtgtcct gggaaccgac ggtg 24 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapA forward primer <400> 7 cgccatycgc aacccg 16 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapA reverse primer <400> 8 cccaytcgtt gtcgtacca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk forward primer <400> 9 accmtgaacc ckgcgctgga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pfk reverse primer <400> 10 atrccgaavc cgahctgggt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgi forward primer <400> 11 ttcagcatgc gcgaagcg 18 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgi reverse primer <400> 12 tgcgccaggt accagg 16 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpL forward primer <400> 13 ttttggctgg cayggttatc gctata 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpL reverse primer <400> 14 tgtggttttg cgtgcgagtt ggttcc 26 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpS forward primer <400> 15 ctscaggcca agctgctgag ggtgc 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpS reverse primer <400> 16 ttgagctcrc ggatattgcc gggcc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpZ forward primer <400> 17 gctgtgatcg atcagctggt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hrpZ reverse primer <400> 18 tcaggccaca gcctggttag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27 forward primer <400> 19 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1525 reverse primer <400> 20 aaaggaggtg atccagcc 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac forward primer <400> 21 cgggctagac agtacgctgt 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac reverse primer <400> 22 caggcccttc taccgctac 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P.s.a forward primer <400> 23 cagaggcgct aacgaggaaa 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P.s.a reverse primer <400> 24 cgagcataca tcaacaggtc a 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Europe forward primer <400> 25 tggtgatcgt ctggatgtgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Europe reverse primer <400> 26 attatgctcc tggctcatgg 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> china forward primer <400> 27 ggagttccag caactgacg 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> china reverse primer <400> 28 cgctcaagat ccttttccat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> japan/korea forward primer <400> 29 agcaacggtg gtttgttttc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> japan/korea reverse primer <400> 30 aaatgtttgc cagccaagtc 20

Claims

서열번호 21의 프라이머 및 서열번호 22의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)를 특이적으로 검출하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제1항에 있어서, 상기 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 Psa SYS1, Psa SYS4, Psa IHL1 및 Psa IKB4 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 궤양병균주이며, 파세오로독소(phasesolotoxin)와 COX(coronatine)을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제1항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열번호 23의 프라이머와 서열번호 24의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제3항에 있어서, 상기 검출용 키트는 Psa 3 그룹에 속하는 모든 참다래 궤양병균주와 Psa 1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주 및 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 공통적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 Psa 3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)과 COX(coronatine)을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 Psa 1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 Psa 2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는COX(coronatine)를 생산하는 것을 특징으로 하는 참다래 궤양병균주의 검출용 키트.
참다래 나무로부터 생물학적 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 상기 제1항 또는 제4항의 키트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 다중 중합효소연쇄반응(m-PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 중합효소연쇄반응 산물을 이용하여 참다래 궤양병균주의 감염 여부 및 상기 감염된 참다래 궤양병균주가 Psa 3 그룹에 속하는 균주인지의 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 특정한 참다래 궤양병균주를 검출하는 방법.