KR101719719B1 - Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 - Google Patents
Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하며 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트, 또는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 폼하며 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 검출용 키트는 참다래 궤양병균주의 감염 여부를 확인하기 위한 다양한 실험에 사용되어 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 참다래 궤양병균주의 존재 여부를 검출하는 동시에 상기 참다래 나무에서 궤양병을 일으키는 균주가 Psa1 그룹, Psa2 그룹 및/또는 Psa3 그룹에 속하는 균주인지 여부를 분류하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제방법을 마련할 수 있다.
Description
본 발명은 참다래 궤양병균 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 간편하게 참다래 궤양병균주의 감염 존재 여부를 검출하는 동시에 Psa1 그룹, Psa2 그룹 또는/및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 분류할 수 있는 참다래 궤양병균 검출용 키트에 관한 것이다.
참다래(키위, kiwifruit)는 다래과에 속하는 덩굴성 낙엽과수로, 그 종으로는 악티니디아 델리시오사(Actinidia deliciosa), 악티니디아 알쿠타(Actinidia arguta), 악티니디아 크리산타(Actinidia chrysantha), 악티니디아 에리안타(Actinidia eriantha), 악티니디아 코로믹타(Actinidia kolomikta), 악티니디아 폴리가마(Actinidia polygama), 악티니디아 키넨시스(Actinidia chinensis) 등이 있다. 참다래는 재배초기 내병성 과수로 알려졌었으나, 1980년 후반 동북아시아로 확대 재배되면서 궤양병이 발생하여 일부 과수원을 폐원시킬 만큼 큰 피해를 주고 있다.
상기 궤양병을 일으키는 병원균은 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)으로 1989년 일본에서 처음 보고되었으며, 이어 우리나라와 이탈리아에서도 발생이 보고된 바 있다(Takikawa, Y. et al., 1989, Ann. Phytopathol. Soc. Japan, 55: 437-444.; Koh, Y.J. et al., 1994, Plant Pathol. J., 28: 423-427.; Scotichini M., 1994, Plant Pathol. 43: 1035-1038.). 참다래 궤양병균이 참다래 나무의 잎에 감염되면 2~3년의 잠복기를 거쳐 병징이 나타난다. 이러한 병징은 2월부터 4월에 격심하게 나타나며, 줄기에 피해를 주는 경우와 그 후 잎이나 신초에 발생하는 경우로 나눌 수 있다. 그 중 잎이나 신초에 발생하는 병징은 여러 가지 곰팡이에 의해 생기는 점무늬병과 유사한 증세를 나타내기 때문에 정확한 육안진단이 어려운 문제가 있다. 이외에도 참다래 궤양병균은 줄기나 가지로부터 병원균을 분리하기 어렵고, 분리된 병원균의 생리 및 생화학적 동정에 많은 시간이 소요되므로 참다래 궤양병균에 대한 방제시기를 놓쳐 우리나라와 일본에서는 궤양병에 의해 폐원되는 등 막대한 경제적 피해가 발생하였다. 반면, 이탈리아에서는 비교적 경미한 증세만 보였을 뿐 궤양병에 의한 경제적 피해는 크지 않았다.
그러나, 최근 2008년 이탈리아 중부지역으로부터 심각한 증상을 일으키는 새로운 분자적·표현형을 나타내는 참다래 궤양병균이 빠른 속도로 전염되어 참다래 과수원을 폐원시키는 커다란 피해가 보고되었으며, 이어 2011년에는 포르투칼, 스페인, 프랑스, 터키, 뉴질랜드, 칠레 등에서도 새로운 참다래 궤양병이 보고되고 있다.
이에 따라 현재는 참다래 품종에서 발생하는 궤양병은 전 세계적으로 참다래 산업의 가장 큰 위협 요인으로 대두 되고 있다(Vanneste, J.L., 2012, N. Z. J. Crop Horticul. Sci. 40: 265-267.). 따라서, 참다래 궤양병균의 분류 및 동정과 유전적 특성을 초기에 빠르고 간편하게 조사할 수 있는 DNA 마커의 개발 및 진단방법 등에 관한 연구가 진행되고 있다.
이와 관련하여, Balestra 등(Balestra, G.M. et al., 2013, Plant Dis. 97:472-478.)은 최근 전 세계적으로 궤양병을 일으키고 있는 균주 중에서 유럽 균주, 뉴질랜드 균주 및 중국 균주를 각각 구별하여 공동적으로 검출할 수 있는 진단 마커에 대하여 기재하고 있으나, 상기 진단 마커는 최근 한국에서 분리된 궤양병균주를 검출하지 못하는 문제가 있다.
한국은 주로 남해안 지역에서 참다래를 재배하고 있으며, 그 재배면적은 전남지역이 전국의 57%를 차지하고 있다. 그러나, 1990년 수입이 자유화된 이후 참다래 수요는 매년 증가하여 국내에서만 년간 참다래 소비량이 45,000톤에 이를 정도이지만, 생산량은 15,000톤 정도에 불과하므로 매년 30,000톤 정도를 뉴질랜드, 미국, 칠레 등에서 수입하고 있는 실정이다(한국참다래연합회, 2009). 따라서, 국내 참다래의 안정적 생산 및 소비 체계를 구축하기 위해서는 참다래에서 발생하는 주요 병의 정확한 진단을 토대로 재배 농가에 발생된 주요 병의 모니터링과 방제 방법 개발이 더욱 필요하다.
한편, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 국내·외 참다래 궤양병균주는 지리적 기원에 따라 유전적 변이를 가지고 있다. 한 예로, 1980년대 일본에서 재배되는 그린 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주와 1994년 이탈리아에서 재배되는 그린 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하며, 상기와 같은 특징을 가지는 균주를 Psa1로 그룹화 하였다. 이에 반하여 1990년 초반 이후 한국에서 재배되는 그린 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주는 코로나틴(coronatine)을 생산하며, 이를 Psa2로 그룹화 하였다. 그러나, 2008년 이후 이탈리아, 뉴질랜드, 칠레 등에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis)로부터 처음 분리된 균주는 파세오로독소(phasesolotoxin)와 코로나틴(coronatine)을 생산하지 않았다. 이들 균주를 Psa3로 그룹화 하였다(Chapman, J.R., et al., 2012, Aust. Plant Dis. Notes, 6: 67-71.). 또한, 2011년 한국에서 재배된 골드 참다래로부터 Psa3 그룹에 속하는 새로운 타입의 균주가 발견되었다.
이에, 최근 유전적으로 상이한 균주를 검출하기 위한 진단 마커가 개발되었다. 구체적으로 상기 진단 마커는 유럽, 중국, 한국/일본에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis) 또는 그린 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 궤양병균주를 공통적으로 검출할 수 있다고 개시하고 있다(Balestra, G.M. et al., 2013, New Dis. Rep., 22:10.). 그러나 상기 논문에서 개시하고 있는 유럽에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 유럽에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하고, 중국에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 중국과 뉴질랜드에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하며, 한국/일본에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주를 검출하는 진단 마커는 일본에서 재배되는 참다래로부터 분리된 궤양병균주만 검출할 뿐 한국에서 재배되는 참다래 또는 골드 참다래로부터 분리된 궤양병균주는 검출하지 못한다. 즉, 상기 프라이머로는 한국에서 발생되고 있는 참다래 궤양병균이 Psa2 그룹에 속하는지 또는 Psa3 그룹에 속하는지 구분할 수 없다.
따라서, 본 발명자들은 참다래로부터 참다래 궤양병균의 여부를 확인함과 동시에 궤양병균이 존재하는 경우 그 균주가 Psa1 그룹, Psa2 그룹 및 Psa3 그룹 중 어느 그룹에 속하는지를 알 수 있는 진단 마커를 개발하고자 노력하던 중, Psa1 그룹 또는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주가 포함하는 특이적 DNA 단편의 염기서열을 바탕으로 SCAR(sequence characterized amplified region) 프라이머 세트를 개발하고, 상기 SCAR 프라이머 세트와 모든 참다래 궤양병균주를 검출할 수 있는 종래 프라이머 세트를 함께 사용하는 경우 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 참다래 궤양병균주의 존재 여부를 검출하는 동시에 궤양병을 일으키는 균주가 Psa1 그룹, Psa2 그룹 또는 Psa3 그룹 중 어느 그룹에 속하는 균주인지 여부를 분류할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Psa1 그룹, Psa2 그룹 및/또는 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 분류하여 검출할 수 있는 검출용 키트 세트를 제공하는데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)를 특이적으로 검출하는 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 명세서에서 용어, "프라이머"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 핵산 서열은 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 15 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개의 연속 염기로 구성되며, 주형과 충분히 안정된 염기쌍을 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 발명에 있어서, 상기 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 Psa KW11, Psa SUPP 319, Psa SUPP 320 및 Psa NCPPB 3971 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 궤양병균주이며, 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 유전자를 특정하게 증폭하여 481 bp의 크기를 나타낼 수 있도록 고안된 서열번호 3의 핵산서열을 가지는 전방향 프라이머 및 서열번호 4의 핵산서열을 가지는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 실시예로서, 참다래로부터 분리한 참다래 궤양병균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 경우 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서만 481 bp 크기의 특이적 DNA 밴드가 확인되었다(도 4 및 도 5 참조).
본 발명에 따른 상기 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예를 들어, 부가, 결실, 치환 등)될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 전기영동에 필요한 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 일본 및 2008년 이전 이탈리아에서 재배되는 참다래 나무로부터 분리된 궤양병균주로, 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하는 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MAFF 302091, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MAFF 302143, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) ICMP 9855, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) NCPPB 3873, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) MCPPB 3871, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KW11, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) SUPP 319, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) SUPP 320 등의 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)를 특이적으로 검출하는 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 Psa CJW7, Psa KBE9 및 Psa KBE29 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 궤양병균주이며, 코로나틴(coronatine)을 생산하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 유전자를 특정하게 증폭하여 413 bp의 크기를 나타낼 수 있도록 고안된 서열번호 7의 핵산서열을 가지는 전방향 프라이머 및 서열번호 8의 핵산서열을 가지는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 실시예로서, 참다래로부터 분리한 참다래 궤양병균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 경우 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서만 413 bp 크기의 특이적 DNA 밴드가 확인되었다(도 8 및 도 9 참조).
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있으며, 상기 시약들은 상기 상술한 바와 같으므로 이하에서는 생략한다.
본 발명에 있어서, 상기 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 한국에서 재배되는 참다래 나무로부터 분리된 궤양병균주로, 코로나틴(coronatine)을 생산하는 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10584, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10594, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KACC 10754, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CJW7, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KBE9, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) KBE29 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 상기 Psa1 그룹 또는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트는 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 함께 사용하여 Psa1 그룹 또는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 분류하여 검출하면서, Psa1 그룹, Psa2 그룹 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 모두 검출하는 용도로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭되는 산물의 크기가 311 bp이며, Psa1 그룹, Psa2 그룹 또는 Psa3 그룹에 속하는 국내·외 참다래 궤양병균주를 모두 검출할 수 있는 프라이머 세트를 말한다.
하나의 구체적 실시예로서, 참다래로부터 분리한 참다래 궤양병균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행한 경우 Psa2 그룹에 속하는 참다래 균주 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서는 311 bp 크기의 단편 DNA 밴드만 확인되었으나, Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서는 481 bp 크기의 특이적 DNA 밴드와 311 bp 크기의 밴드가 확인되었다(도 6 참조). 또한, 서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행한 경우 Psa1 그룹에 속하는 참다래 균주 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서는 311 bp 크기의 단편 DNA 밴드만 확인되었으나, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서는 413 bp 크기의 특이적 DNA 밴드와 311 bp 크기의 밴드가 확인되었다(도 10 참조).
본 발명에 있어서, 상기 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 2008년 이후 한국, 일본, 중국, 뉴질랜드, 칠레, 오스트레일리아, 이탈리아 및 중국 등 전 세계에서 재배되는 골드 참다래(Actinidia chinensis) 또는 그린 참다래(Actinidia deliciosa)로부터 분리된 균주를 말한다. 예를 들어, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T10_04758, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T10_04758, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) T11_0918, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) Psa1A, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) Psa1B, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CRA-FRU 10.22, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CRA-FRU 8.76, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) SYS1, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) SYS4, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) IHL1, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) CFBP 7286, Psa(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) NZ1 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Psa1 그룹 또는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트와 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하는 경우 Psa1 그룹, Pas2 그룹 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 공통적으로 검출하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있으며, 상기 시약들은 상기 상술한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 Psa1 그룹, Psa2 그룹 및/또는 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 분류하여 검출할 수 있는 검출용 키트 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 본 발명자들에 의해 고안되어 특허출원(출원번호 10-2014-0041234)된 것으로, Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 유전자를 특정하게 증폭하여 546 bp의 크기를 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 국내·외 참다래 궤양병균주를 모두 검출할 수 있는 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와 함께 사용하여 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 분류하여 검출하면서, Psa1 그룹, Psa2 그룹 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 모두 검출할 수 있다. 그 구체적 예는 본 발명자들이 출원한 특허(출원번호 10-2014-0041234)에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 상기 검출용 키트 세트는 Psa1 그룹, Psa2 그룹 또는 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 유전자를 특정하게 증폭하여 각각 481 bp, 431 bp 및 546 bp의 다른 크기를 나타내므로, 궤양병균주의 감염여부가 의심되는 참다래 나무로부터 참다래 궤양병균주의 존재여부를 검출하는 동시에 참다래 궤양병균이 속하는 그룹을 분류하여 참다래 나무에서 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제방법을 마련할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 키트 또는 검출용 키트 세트는 궤양병균주의 감염여부가 의심되는 참다래 나무에서 궤양병균의 존재 여부의 검출 및 정량, 이에 따른 참다래 궤양병균의 감염여부의 스크리닝을 위한 다양한 실험에서 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 검출용 키트는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 또는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, m-PCR)에 사용될 수 있다.
이하에서는, 본 발명에 따른 검출방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(1) 참다래로부터 시료를 분리하는 단계이다.
궤양병균주의 감염여부가 의심되는 참다래 나무의 잎, 가지 또는 줄기로부터 생물학적인 DNA를 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분리하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 궤양병균주에 감염되었다고 의심되는 시료를 채취한 후, 이를 멸균수 또는 0.85% 생리식염수에 현탁한 후 프로테나아제 K(proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한다. 그 다음 상기 펠렛을 멸균수로 부유하고 여기에 페놀/콜로로폼(1:1) 혼합액을 처리한 후 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 에탄올을 가한 후 원심분리하여 DNA를 수득할 수 있다.
(2) 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 다중 중합효소연쇄반응(m-PCR)을 수행하는 단계이다.
상기 (1)에서 분리한 시료를 주형으로 하고 본 발명의 (ⅰ) 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, (ⅱ) 서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, (ⅲ) 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 10의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는 상기 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 프라이머 세트와 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 함께 사용하거나, (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)으로 이루어진 프라이머 세트 키트를 사용하여 참다래 궤양병균의 특정한 유전자를 증폭하는 단계이다.
상기 유전자 증폭은 (ⅰ) 변성(denaturation) 단계, (ⅱ) 프라이머의 대상 핵산결합(annealing) 단계 및 (ⅲ) 신장(extension) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 이루어진다.
본 발명의 명세서에서 용어, "사이클"은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 특정의 범위로 한정되지는 않고, 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으나, 바람직하게는 (ⅰ) 90 내지 98℃에서 1 내지 7분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성하는 개시변성과정, (ⅱ) 90 내지 98℃에서 30 내지 60초 동안의 변성과정, (ⅲ) 50 내지 70℃에서 30 내지 60초 동안 프라이머의 대상 핵산결합과정, (ⅳ) 65 내지 75℃에서 30 내지 60초 동안 신장과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계, 및 (ⅴ) 65 내지 75℃에서 5 내지 10분 동안 추가 신장단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 사이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
(3) 중합효소연쇄반응의 산물을 분석하는 단계이다.
상기 (2) 단계를 통해 생성된 산물을 당업계에 공지된 방법에 따라 DNA 크기별로 분리하여 분석할 수 있다. 구체적으로, 상기 중합효소연쇄반응의 산물은 아가로오스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel) 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하거나 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 (2) 단계의 중합효소연쇄반응을 통해 생성된 산물을 형광분석장치를 이용하여 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 검출방법은 참다래 나무로부터 궤양병균주의 감염 여부를 검출하면서, Pas1 그룹, Psa2 그룹 또는/및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 분류하여 궤양병균주의 감염을 진단할 수 있으며, 그에 따라 참다래 나무에서 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제작업이 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 키트는 참다래 궤양병균주의 감염 여부를 확인하기 위한 다양한 실험에 사용되어 참다래 나무로부터 병징이 나타나기 전에 신속하고 정확하게 참다래 궤양병균주의 존재 여부를 검출하는 동시에 상기 참다래 나무에서 궤양병을 일으키는 균주가 Psa1 그룹, Psa2 그룹 및/또는 Psa3 그룹에 속하는 균주인지 여부를 분류하여 참다래 궤양병을 일으키는 균주에 적합한 방제방법을 마련할 수 있다. 뿐만 아니라 한국의 경우 Psa2 그룹 및/또는 Psa3 그룹에 속하는 궤양병균주의 확산을 모니터링하거나 아직까지 Psa1 그룹에 속하는 궤양병균주에 대한 보고가 없는 한국, 중국 등에서 재배되는 참다래 나무 또는 Psa3 그룹에 속하는 궤양병균주에 대한 보고가 없는 일본, 중국 등에서 재배되는 참다래 나무에 궤양병을 야기시키는 균주가 Psa1 그룹 또는 Psa3 그룹에 속하는 균주인지 모니터링 하는데 유용하게 쓰일 수 있다.
도 1은 참다래 궤양병균주를 대상으로 다중 염기서열 분석(multilocus seqeuence analysis, MLSA)을 실시하여 7개의 항존 유전자(acn, cts, gapA, gyrB, pfk, pgi 및 rpoB)의 변이에 따라 계통수를 작성한 것이다.
도 2는 참다래로부터 분리한 참다래 궤양병균주의 게놈 DNA를 주형으로 argK 유전자 또는 cfl 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 3은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종의 DNA에 랜덤 프라이머인 OPA-02 프라이머를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 4는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 5는 참다래 궤양병균주와 종이 다른 유사세균 15종에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다. 양성 대조군으로는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(P. syringae pv. actinidiae) KW11을 사용하였다.
도 6은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 세트를 함께 혼합하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 6은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종의 DNA에 랜덤 프라이머인 OPA-16 프라이머를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 8은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 9는 참다래 궤양병균주와 종이 다른 유사세균 15종에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다. 양성 대조군으로는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(P. syringae pv. actinidiae) CJW7을 사용하였다.
도 10은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 세트를 함께 혼합하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 2는 참다래로부터 분리한 참다래 궤양병균주의 게놈 DNA를 주형으로 argK 유전자 또는 cfl 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 3은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종의 DNA에 랜덤 프라이머인 OPA-02 프라이머를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 4는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 5는 참다래 궤양병균주와 종이 다른 유사세균 15종에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다. 양성 대조군으로는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(P. syringae pv. actinidiae) KW11을 사용하였다.
도 6은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 세트를 함께 혼합하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 6은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종의 DNA에 랜덤 프라이머인 OPA-16 프라이머를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 8은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 9는 참다래 궤양병균주와 종이 다른 유사세균 15종에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트를 혼합하고 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다. 양성 대조군으로는 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(P. syringae pv. actinidiae) CJW7을 사용하였다.
도 10은 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 4종, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 3종 및 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 5종의 DNA에 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 세트를 함께 혼합하고 다중 중합효소연쇄반응을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 등은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: Psa1, Psa2 또는 Psa3 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 준비
한국, 일본, 이탈리아 또는 뉴질랜드의 참다래로부터 궤양병균주를 분리한 후 각 그룹을 구별하는 특성 중 하나인 파세오로독소(phaseolotoxin) 또는 코로나틴(coronatine) 합성과 관련된 유전자의 존재 여부를 PCR로 확인하여 Psa 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 준비하였다.
구체적으로, 한국, 일본, 이탈리아 또는 뉴질랜드의 참다래로부터 궤양병균주를 분리한 후 이들 궤양병균주로부터 게놈 DNA을 추출하였다. 그 다음 식물독소 중 파세오로독소(phaseolotoxin)의 저항성을 나타내는 유전자인 argK 유전자 또는 코로나틴(coronatine)를 생합성하는 유전자인 cfl 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 argK 유전자 또는 cfl 유전자를 증폭하였다. 이때, argK 유전자의 증폭은 Sawada, H et al(Appl. Environ. Microbiol. 63: 282-288., 1997)에 기재된 프라이머 세트와 PCR 조건에 따라 실시하였으며, cfl 유전자의 증폭은 Bereswill, S. et al.(Appl. Environ. Microbiol. 60: 2924-2930., 1994)에 기재된 프라이머 세트와 PCR 조건에 따라 실시하였다. 그 다음 증폭된 argK 유전자 또는 cfl 유전자는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, argK 유전자(1,098bp)가 증폭된 참다래 궤양병균주는 Psa1 그룹에 속하는 일본과 이탈리아에서 분리된 궤양병균주임을 확인할 수 있었으며, cfl 유전자(655bp)가 증폭된 참다래 궤양병균주는 Psa2 그룹에 속하는 한국에서 분리된 궤양병균주임을 확인할 수 있었다. 반면, argK 유전자 및 cfl 유전자가 모두 증폭되지 않은 참다래 궤양병균주는 Psa3 그룹에 속하는 한국, 이탈리아 및 뉴질랜드에서 분리된 궤양병균주임을 확인할 수 있었다.
이를 토대로, 본 발명자들은 한국, 일본, 이탈리아 또는 뉴질랜드의 참다래로부터 분리한 12개의 균주 중 argK 유전자(1,098bp)가 증폭된 일본 참다래 궤양병균주 3종(KW11, SUPP 319, SUPP 320)과 이탈리아 참다래 궤양병균주 1종(NCPPB 3871)을 Psa1로 그룹화 하였고, cfl 유전자(655bp)가 증폭된 한국 참다래 궤양병균주 3종(CJW7, KBE9, KBE29)을 Psa2로 그룹화 하였으며, argK 유전자(1,098bp) 및 cfl 유전자(655bp)가 모두 증폭되지 않은 한국 참다래 궤양병균주 2종(SYS1, SYS4), 이탈리아 궤양병균주 2종(IHL1, CFBP 7286) 및 뉴질랜드 참다래 궤양병균주 1종(NZ1)을 Psa3로 그룹화 하였다.
| 번호 | 그룹분류 | 계통 | 발생국 | 발생연도 |
| 1 | Psa2 | CJW7 | 한국 | 1999 |
| 2 | KBE9 | 한국 | 2008 | |
| 3 | KBE29 | 한국 | 2011 | |
| 4 | Psa1 | KW11 | 일본 | 1984 |
| 5 | SUPP 319 | 일본 | - | |
| 6 | SUPP 320 | 일본 | - | |
| 7 | NCPPB 3871 | 이탈리아 | 1992 | |
| 8 | Psa3 | SYS1 | 한국 | 2011 |
| 9 | SYS4 | 한국 | 2011 | |
| 10 | IHL1 | 이탈리아 | 2011 | |
| 11 | CFBP 7286 | 이탈리아 | 2011 | |
| 12 | NZ1 | 뉴질랜드 | 2011 |
실시예 2: 게놈 DNA의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 분석에 의한 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 특이적 DNA 단편 검출 및 염기서열 결정
2-1. Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균의 특이적 DNA 단편 검출
상기 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 또는 Psa3(SYS1, IHL1 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주들로부터 게놈 DNA을 추출한 후 랜덤 프라이머 OPA-02(operon biotechnologies, USA; 5'-TGCCGAGCTG-3')를 사용하여 PCR을 실시하여 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 증폭하였다. 이때 PCR은 94℃에서 5분 동안 전변성(pre-denaturation)시킨 후 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 37℃에서 60초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 60초 동안 연장(extension)을 40 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보듯이, Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주에서만 약 650 bp 크기의 DNA 절편이 증폭됨을 확인할 수 있었다.
2-2. 유전자 클로닝 및 염기서열 결정
상기 2-1에서 추출한 650bp 크기의 DNA 단편을 AccuPrep 겔 추출 키트(gel purification kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 추출한 후 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 삽입하고 라이게이션(ligation)시킨 후 E.coli에 형질전환시키고, 배양하여 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 클로닝한 후 솔젠트(주)에 의뢰하여 벡터에 있는 T7의 프라이머로 사용하여 염기서열을 분석하였다.
그 결과, Pas1 그룹에 속하는 균주로부터 추출한 DNA 단편은 서열번호 1의 염기서열(641bp)을 나타내었으며, DNA의 양 말단에 OPA-02 프라이머의 서열인 5'-TGCCGAGCTG-3'가 확인되었다. 상기 염기서열을 BLAST를 통해 상동성을 검색한 경우 P. syringae pv. Phaseolocola strain 1302A의 PPHGI-1 게놈 DNA(GeneBank accession number AJ870974)와 93%의 상동성을 보였다.
실시예 3: Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 진단을 위한 특이적 프라이머 세트 제작 및 프라이머 세트의 특이성 확인
상기 실시예 2-2에서 확인한 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주가 포함하는 특이적 DNA 단편의 염기서열을 바탕으로 Psa1 그룹에 특이적인 SCAR(sequence characterized amplified region) 프라이머 세트(forward primer; F 및 reverse primer; R)를 합성하였다. 상기 합성된 Psa1 그룹에 특이적인 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타내었다. 그 다음 상기 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 또는 Psa3(SYS1, SYS4, IHL1, CFBP 7286 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주들 및 P. syringae 병원형 중 pv. actinidiae와 유연관계가 가까운 10개의 병원형을 포함하는 참다래 궤양병균주 15종의 DNA를 하기 표 2의 Psa1 그룹에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이때 상기 중합효소연쇄반응은 94℃에서 5분 동안 전변성(pre-denaturation)한 후 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 65℃에서 30초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 30 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 양성 대조군으로는 Psa1 그룹에 속하는 P. syringae pv. actinidiae KW11을 사용하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
| 프라이머 염기서열(5'→3') | 증폭온도 | 증폭산물크기(bp) | |
| PsJ-F | GACGTCGACGACAAGGTGAT(서열번호 3) | 65℃ | 481 |
| PsJ-R | AGTAAACCGTGCCGTCATCTC(서열번호 4) |
도 4 및 도 5에서 보듯이, 481 bp 크기의 밴드는 Psa1 그룹에 속하는 일본 참다래 궤양병균주, 이탈리아 참다래 궤양병균주(도 4, lanes 4-7) 및 양성 대조군으로 사용한 Psa 1 그룹에 속하는 P. syringae pv. actinidiae KW11 균주(도 5, lane 16)에서만 확인되었다.
실시예 4: Multiplex-PCR 시스템을 이용한 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 검출 확인
상기 실시예 3에서 합성한 PsJ-F/PsJ-R 프라이머 세트가 국내·외 참다래 궤양병균을 모두 검출 가능한 프라이머 세트[Psa-F: 5'-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3'(서열번호 5), Psa-R: 5'-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3'(서열번호 6); Balestra et al., 2013]와 동시에 사용 가능한지 여부를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 또는 Psa3(SYS1, SYS4, IHL1, CFBP 7286 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주 12종을 Psa-F/Psa-R 세트와 상기 실시예 3에서 제작한 PsJ-F/PsJ-R 프라이머 세트를 사용하여 상기 실시예 3과 동일한 PCR 조건에서 반응시켰다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보듯이, 311 bp 크기의 밴드는 모든 참다래 궤양병균주에서 증폭되었으며, Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주들에서는 311 bp 및 481 bp의 두 개의 밴드가 확인되었다.
실시예 5: 게놈 DNA의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 분석에 의한 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균의 특이적 DNA 단편 검출 및 염기서열 결정
5-1. Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균의 특이적 DNA 단편 검출
상기 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 또는 Psa3(SYS1, IHL1 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주들로부터 게놈 DNA을 추출한 후 랜덤 프라이머 OPA-16(operon biotechnologies, USA; 5'-AGCCAGCGAA-3')을 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 증폭하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보듯이, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균에서만 약 450 bp 크기의 DNA 절편이 증폭됨을 확인하였다.
5-2. 유전자 클로닝 및 염기서열 결정
상기 5-1에서 추출한 450bp 크기의 DNA 단편을 AccuPrep 겔 추출 키트(gel purification kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 추출한 후 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 삽입하고 라이게이션(ligation)시킨 후 E.coli에 형질전환시키고, 배양하여 참다래 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 솔젠트(주)에 의뢰하여 벡터에 있는 T7의 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다.
그 결과, Pas2 그룹에 속하는 균주로부터 추출한 DNA 단편은 서열번호 2의 염기서열(462bp)을 나타내었으며, DNA의 양 말단에 OPA-16 프라이머의 서열인 5'-AGCCAGCGAA-3'가 확인되었다. 상기 염기서열을 BLAST를 통해 상동성을 검색한 경우 상기 염기서열과 상동성이 있는 염기서열은 발견되지 않았다.
실시예 6: Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주의 진단을 위한 특이적 프라이머 세트 제작 및 프라이머 세트의 특이성 확인
상기 실시예 5-2에서 확인한 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주가 포함하는 특이적 DNA 단편의 염기서열을 바탕으로 Psa2 그룹에 특이적인 SCAR(sequence characterized amplified region) 프라이머 세트(forward primer; F 및 reverse primer; R)를 합성하였다. 상기 합성된 Psa2 그룹에 특이적인 프라이머 세트는 하기 표 3에 나타내었다. 그 다음 상기 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 또는 Psa3(SYS1, SYS4, IHL1, CFBP 7286 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균들 및 P. syringae 병원형 중 pv. actinidiae와 유연관계가 가까운 10개의 병원형을 포함하는 참다래 궤양병균주 15종의 DNA를 하기 표 3의 Psa2 그룹에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이때 상기 중합효소연쇄반응은 94℃에서 5분 동안 전변성(denturation)한 후 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 65℃에서 30초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 30 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 5분 동안 실시하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 양성 대조군으로는 Psa2 그룹에 속하는 P. syringae pv. actinidiae CJW7을 사용하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
| 프라이머 염기서열(5'→3') | 증폭온도 | 증폭산물크기(bp) | |
| PsK-F | GACAAAGCCAAAAAGGCGA(서열번호 7) | 65℃ | 413 |
| PsK-R | TGCCAAGCCCAAGTATCCAAGC(서열번호 8) |
도 8 및 도 9에서 보듯이, 413 bp 크기의 밴드는 Psa2 그룹에 속하는 한국 참다래 궤양병균주(도 8, lanes 1-3) 및 양성 대조군으로 사용한 Psa2 그룹에 속하는 P. syringae pv. actinidiae CJW7 균주(도 9, lane 16)에서만 확인되었다.
실시예 7: Multiplex-PCR 시스템을 이용한 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균의 검출 확인
상기 실시예 6에서 합성한 PsK-F/PsK-R 프라이머 세트가 국내·외 참다래 궤양병균을 모두 검출 가능한 프라이머 세트[Psa-F: 5'-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3'(서열번호 5), Psa-R: 5'-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3'(서열번호 6); Balestra et al., 2013]와 동시에 사용 가능한지 여부를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 준비한 Psa1(KW11, SUPP 319, SUPP 320 및 NCPPB 3871), Psa2(CJW7, KBE9 및 KBE29) 및 Psa3(SYS1, SYS4, IHL1, CFBP 7286 및 NZ1) 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주 12종을 Psa-F/Psa-R 세트와 상기 실시예 6에서 제작한 PsK-F/PsK-R 프라이머 세트를 사용하여 상기 실시예 6과 동일한 PCR 조건에서 반응시켰다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보듯이, 311 bp 크기의 밴드는 모든 참다래 궤양병균주에서 증폭되었으며, Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주들에서는 311 bp 및 413 bp의 두 개의 밴드가 확인되었다.
<110> Industry-academic Cooperation Foundation of Sunchon national university
<120> Kit for detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae
<130> PA-15-0167
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 641
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pas1 group strains specific DNA sequence
<400> 1
tgccgagctg gacgtcgacg acaaggtgat cctcttctgc gagtatcagg aatccgtggc 60
cacgttacgt gaacactgcc tcaagatggg cgtcgggtgt gtgacgttgg taggcagtga 120
ctcgcccaag aaacgacaga aggcgattga tgccttccag caggatccgg actgcagggt 180
gttcatcggg accaggtcgg ccgccggcac aggttacaac ctgacagcgg cgaactatgt 240
attctttctg ggacttccat ggacaccggg gctgcaagac caagctgagg atcgagccta 300
tcgcaacggg cagttgcgca tggttgtcgt caaaatccct ctagctgagg acaccatcga 360
ccagcagctg tggcagatgc tcatggacaa acgcgcgcta gcccgcgatt tgatagaccc 420
cgaagcagaa gaaaaaagta aaatggctct cgcgaatcag ctaaaaattt gagatgacgg 480
cacggtttac tgtgggctgt tcagcaacat gattggcaac cctctaagtt acaaatcgct 540
taggcacgtg cttccaatac gacgtcgaaa ttgcggacgg ttatcaacgg cgagatcttt 600
cagggtggcg gtgatccctt tcacaactca acagctcggc a 641
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pas2 group strains specific DNA sequence
<400> 2
agccagcgaa gacaaagcca aaaaggcgag gaaggacttt gaaaagctca agacagatag 60
caagcctgtt cgtgattggg ctgctcagcc tctgcctgat ggcctgcgcg gcaaagccgg 120
tgctggtgac aaagacatca gcggtaagaa tcgagccccc tgagctgatc ccatgcgagc 180
gcatcaacgc tgatgaggcc gatctgcggt tgaacggtga tgtgtgggag ctgaaagatc 240
aggccatcaa actgctggat acgtgcgctg accaggttga cgcgcagatc ctgcgcagcc 300
agagcaagta gacaacctca attcattcac ccgccatata tggcgagcac cgaggcaaca 360
accatggcat cgaaaaccaa ctcatcgaca gcggtatccg cgcttggata cttgggcttg 420
gcagccattg tggccgccgg cttcctgctc tattcgctgg ct 462
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsJ-Forward primer
<400> 3
gacgtcgacg acaaggtgat 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsJ-Reverse primer
<400> 4
agtaaaccgt gccgtcatct c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Psa Forward primer
<400> 5
cagaggcgct aacgaggaaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Psa Reverse primer
<400> 6
cgagcataca tcaacaggtc a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsK-Forward primer
<400> 7
gacaaagcca aaaaggcga 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsK-Reverse primer
<400> 8
tgccaagccc aagtatccaa gc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tac-Forward primer
<400> 9
cgggctagac agtacgctgt 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tac-Reverse primer
<400> 10
caggcccttc taccgctac 19
Claims (6)
- 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하며, Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)를 특이적으로 검출하는 검출용 키트.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 검출용 키트는 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주는 Psa KW11, Psa SUPP 319, Psa SUPP 320 및 Psa NCPPB 3971 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 궤양병균주이며, 파세오로독소(phasesolotoxin)를 생산하는 것을 특징으로 하는 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균주를 특이적으로 검출하는 검출용 키트.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150131119A KR101719719B1 (ko) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150131119A KR101719719B1 (ko) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 |
Related Child Applications (2)
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|---|---|---|---|
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| KR1020170022540A Division KR101719720B1 (ko) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 |
Publications (1)
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| KR101719719B1 true KR101719719B1 (ko) | 2017-03-24 |
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ID=58500419
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| KR1020150131119A KR101719719B1 (ko) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107326091A (zh) * | 2017-08-25 | 2017-11-07 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo168引物及应用 |
| CN107338318A (zh) * | 2017-08-25 | 2017-11-10 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20000009387A (ko) * | 1998-07-23 | 2000-02-15 | 고영진 | 참다래 궤양병균 동정용 프로브 및 프라이머와 이를 이용한참다래 궤양병 진단방법 |
-
2015
- 2015-09-16 KR KR1020150131119A patent/KR101719719B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN107338318A (zh) * | 2017-08-25 | 2017-11-10 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物及应用 |
| CN107338318B (zh) * | 2017-08-25 | 2020-10-16 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物及应用 |
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