KR101423395B1 - 토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 토마토황화잎말림바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 토마토황화잎말림바이러스의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 토마토황화잎말림바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 토마토재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 토마토 감염성 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 토마토 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용{Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Tomato yellow leaf curl virus, and use thereof}

본 발명은 토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 토마토황화잎말림바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 토마토황화잎말림바이러스의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다.

우리나라에서 최초로 토마토 재배시설에서 발견된 제미니바이러스(Geminivirus)는, 2008년 통영지역에서 발견되어 본 발명자들에 의하여 보고된 베고모바이러스인 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV; Tomato yellow leaf curl virus)로서 하나의 게놈을 갖는 것으로 확인되었다. 토마토황화잎말림바이러스는 베고모바이러스(Begomovirus) 중에서도 가장 많은 종류의 변이주(variant strain)들을 갖고 있는 것으로 보고되어 있으며, 담배가루이(Whitefly)에 의하여 매개 되는 것으로 알려져 있다. 담배가루이는 이미 국내에 토착화가 이루어진 상태로 방제가 매우 어려운 실정이기 때문에 토마토황화잎말림바이러스에 의한 감염의 근절은 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 또한 담배가루이에 의해 매개되는 다양한 바이러스 변이주들이 지속적으로 보고되고 있기 때문에 새로운 바이러스 변이주들의 출현, 및 복합감염에 대한 가능성도 배제할 수 없다. 토마토황화잎말림바이러스는 원래 토마토가 기주식물인 것으로 알려져 있었으나, 최근 박과, 콩과, 고추과 등의 작물에도 감염이 가능한 것으로 보고된 바 있다. 토마토황화잎말림바이러스는 국내에서 매우 심각한 농작물 피해를 야기하고 있으며, 아직까지 국내에서 보고되지 않은 신규 토마토황화잎말림바이러스 변이주들 또한 수출입 과정에서 국내로 충분히 유입될 가능성이 있기 때문에 이에 대한 신속한 진단법의 개발이 반드시 필요하다.

제미니바이러스는 게놈의 구조, 기주의 범위 및 매개충의 종류에 따라 네 개 속(Genus)인 마스트레바이러스(Mastrevirus), 컬토바이러스(Curtovirus), 토포쿠바이스(Topocuvirus), 및 베고모바이러스(Begomovirus)로 구분되며 세계적으로 주요 경제작물에 심각한 피해를 야기하고 있다. 제미니바이러스 속인 베고모바이러스는 제미니바이러스 중 가장 다양한 바이러스 변이주들을 포함하고 있으며 담배가루이 (Whitefly, Bemisia tabaci, Gennadius)에 의해 매개되는 특징을 갖고 있다. 따라서 대부분의 제미니바이러스에 관련된 연구는 담배가루이가 서식하기 알맞은 열대 또는 아열대 기후 지역에서 보고된 것이 많다. 아시아 지역에서는 1960년대에 중국의 토마토 재배 지역에서 제미니바이러스가 관찰되었다는 보고가 있었으나, 일부 지역에 국한되어 있었고 피해 정도가 경미해 연구가 거의 이루어지지 않았다. 그러나 최근 10년 사이 아시아 지역 주요 국가들의 토마토 재배 지역에서 담배가루이가 관찰되었으며, 이 후 제미니바이러스가 검출되었다는 보고가 급증하고 있다.

베고모바이러스는 게놈(genome)의 구조에 따라 크게 두 개의 게놈(DNA-A 및 DNA-B)을 가지는 바이러스와 하나의 게놈(DNA-A)을 가지는 바이러스로 분류할 수 있다. 두 개의 게놈(DNA-A 및 DNA-B)을 가지는 베고모바이러스에서 DNA-A는 복제 및 전사 기능을 제공하며, DNA-B는 세포 내에서 바이러스 유전체의 이동에 필요한 이동단백질을 암호화하는 기능을 제공한다. 반면에, 하나의 게놈(DNA-A)을 가지는 베고모바이러스 중 몇몇 바이러스들은 복제를 완성하기 위하여 하나의 게놈 이외에 단일가닥의 DNA 분자인 베타위성 DNA(Beta-satellite DNA: DNA β)을 필요로 한다. 현재까지의 문헌 및 보고에 따르면, 베고모바이러스는 아프리카, 아시아를 포함하는 구대륙(동반구, 유럽, 아프리카, 아시아 및 오스트레일리아)에서는 한 개의 게놈(DNA-A)을 갖는 바이러스가 주로 분포되어 있으며, 신대륙(아메리카)에는 두 개의 게놈(DNA-A 및 DNA-B)을 갖는 바이러스가 주로 분포하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상이 나타나는 이유는 베고모바이러스는 한 개의 게놈을 갖는 바이러스에서 두 개의 게놈을 갖는 바이러스로 진화하고 있기 때문으로 예상되고 있다. 지금까지 국내에서 발견된 제미니바이러스는 대부분 하나의 게놈을 갖는 베고모바이러스일 가능성이 높은 것으로 확인되고 있지만, 두 개의 게놈 또는 베타위성 DNA를 갖는 바이러스일 가능성도 배제할 수 없다.

한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하, PCR이라 함) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다. 최근에는 바이러스를 진단하기 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있으나, PCR을 이용한 진단 방법은 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열 분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야한다. 더불어 이러한 방법은 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 최종 확인을 위한 증폭산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 또한 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 이와 같이 바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 DNA Taq 중합효소(DNA Taq polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst polymerase)를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 토마토황화잎말림바이러스 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성되는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 11 내지 14로 구성되는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 토마토황화잎말림바이러스는 TYLCV Jordan1 변이주(strain), Jordan3 변이주(strain), Israel 변이주(strain), Spain 변이주(strain), USA 변이주(strain), 및 Korea 변이주(strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 토마토에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; 상기 gDNA를 주형으로 상기 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 토마토황화잎말림바이러스는 TYLCV Jordan1 분리주(isolate), Jordan3 분리주(isolate), Israel 분리주(isolate), Spain 분리주(isolate), USA 분리주(isolate) 및 Korea 분리주(isolate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 검출방법으로 인하여, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 토마토황화잎말림바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 토마토재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 토마토 감염성 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 토마토 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 토마토황화잎말림바이러스 Jordan1 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 2 는 토마토황화잎말림바이러스 Jordan3 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3 은 토마토황화잎말림바이러스 Israel 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 4 는 토마토황화잎말림바이러스 Spain 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 5 는 토마토황화잎말림바이러스 USA 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 6 은 토마토황화잎말림바이러스 Korea 분리주의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 7 은 토마토황화잎말림바이러스 6분리주의 유전자 염기서열 유사 부위를 나타낸 도면이다.
도 8 은 토마토황화잎말림바이러스의 등온증폭을 위한 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 9 는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10 은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11 은 상기 도 10에서와 동일한 증폭산물을 UV 광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명자들은 토마토황화잎말림바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 11 내지 14로 구성되는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 토마토황화잎말림바이러스를 검출하기 위하여 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였다. 등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5’ 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3’ 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.

기존에 토마토황화잎말림바이러스의 등온증폭을 위한 방법에 관하여 국외에서 보고된 바가 있으나, 매우 한정적인 토마토황화잎말림바이러스의 유전자 정보만을 이용하였기 때문에 다양한 변이주를 검출하는데는 한계가 있다. 본 발명에서는 기존의 토마토황화잎말림바이러스의 기주식물인 토마토에서 감염성을 나타내는 변이주들 뿐만이 아니라 박과(EU143745, EF433426), 콩과(AF071228, X15656), 고추과(AY530931) 등에서도 감염성을 나타내는 것으로 보고된 토마토황화잎말림바이러스 유전자 정보들을 모두 이용하였다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 11 내지 14로 구성되는 프라이머 세포를 포함하는 조성물은 기존에 국내에서 보고된 변이주들 뿐만이 아니라 새로운 변이주들의 국내 유입 또는 발생 시에도 진단이 가능하다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 11 내지 14로 이루어지는 것이 바람직하나, 토마토황화잎말림바이러스를 진단할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트라면 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은 토마토에서 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus) 검출방법을 제공한다. 토마토로부터 직접 게놈 DNA를 추출할 수도 있지만, 검출을 위한 임상 검체 및 배양 세포 등에도 적용가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 universal 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법을 수행하여 6 종류의 토마토황화잎말림바이러스를 모두 검출 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하면 자연광하에서 육안으로 검출 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 토마토황화잎말림바이러스 유전자 수집

토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)의 검출방법을 연구하기 위하여, 토마토황화잎말림바이러스를 수집하고 클로닝(cloning)하고자 하였다. 각각의 바이러스는 노지에서 이병된 토마토에서 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 통하여 증폭한 후 pGEM-T easy 유전자 클로닝 벡터(Promega Corporation, USA)에 삽입하여 사용하였으며(HM856911), 국내 미 발병 분리주의 유전자 정보는 미국 National center for biotechnology information(NCBI)의 GenBank에 등록되어 있는 Jordan1의 정보 EU143745, Jordan2의 정보 EF433426, Israel의 정보 X15656, Spain의 정보 AF071228, 및 USA의 정보 AY530931을 이용하였다. 각각의 염기서열은 도 1 내지 도 6에 나타내었다.

실시예 2. 프라이머 작성

토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하여 검출하기 위해 PrimerExplorer V4 프로그램을 이용하여 프라이머(primer)를 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용해야 한다. PrimerExplorer V4를 이용하여 작성된 프라이머 세트는 도 8에 나타내었다.

실시예 3. 식물 검체의 채집

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 토마토황화잎말림바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 토마토 재배 온실에서 식물 검체를 채집하였다. 식물 검체는 외형적으로 바이러스 증상이 나타나지 않은 건전주와 토마토황화잎말림바이러스의 증상을 보이는 이병주의 두 가지 집단으로 나누어 채집하였으며, 채집된 검체의 잎 조직 1g에서 전체 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고 이후 등온증폭법의 주형으로 사용하였다.

실시예 4. 등온증폭법의 시행 및 유용성 확인

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 토마토황화잎말림바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 2ul의 10배(10X) Bst 중합효소(polymerase), 반응버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 10mM KCl, 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100), 1.6ul의 10mM dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 10mM씩 섞인 혼합물), 0.4ul의 10uM F3와 B3 프라이머(각각 서열번호 1, 2), 1.6ul의 10uM FIP와 BIP 프라이머(각각 서열번호 3, 4), 1ul의 20mM MgSO₄, 1ul(8 Unit) Bst 중합효소, 주형 gDNA 1ul, 및 증류수 11.5ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 65℃ 반응 용기에서 1시간 30분동안 반응시켜 등온증폭하였다. 반응이 완료된 후에는 총 20ul의 반응물 중 8ul를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다. 이후 동일한 반응물로 재반응(65℃, 1시간 30분)시킨 후에 10,000배로 농축된 SYBR Green I을 반응물 20ul 당 1ul씩 첨가하여 발색 반응을 확인하였다. 그 결과는 도 10 및 도 11에 나타내었다. 상기 바이러스 유전자의 증폭된 양상을 관찰한 전기영동 결과와 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 비교하여 유의성을 검증하였다.

또한 본 발명자들은 0.4ul의 10uM F3와 B3 프라이머(각각 서열번호 11, 12), 1.6ul의 10uM FIP와 BIP 프라이머(각각 서열번호 13, 14)를 사용하고 증폭 반응 온도 및 재반응 온도를 63 ℃로 하고 나머지 조건은 상기 실험과 동일하게 하여 실험을 수행하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, universal primer set를 사용한 경우에는 비감염균주(lane 2)에서는 유전자가 증폭되지 않은 반면, TYLCV Jordan1 변이주(lane 3), Jordan3 변이주(lane 4), Israel 변이주(lane 5), Spain 변이주(lane 6), USA 변이주(lane 7) 및 Korea 변이주(lane 8)을 주형으로 이용한 경우에는 모두 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, SYBR Green I을 고농도로 농축하여 증폭된 유전자(universal primer set sample)를 염색한 경우에도 변이주 모두 유전자가 증폭되어 자연광하에서 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 TYLCV Jordan1 변이주, Jordan3 변이주, Israel 변이주, Spain 변이주, USA 변이주, 및 Korea 변이주 모두 검출하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SYBR GreenI을 10,000배로 농축하여 사용할 경우 자연광하에서 육안으로 감염여부를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Tomato yellow leaf curl virus, and use therof <130> PB12-11047 <150> KR 11/0114822 <151> 2011-11-04 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV F3 primer <400> 1 cccatgtaaa gtccagtctt 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV B3 primer <400> 2 cctgattagt gtgattctgc t 21 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV FIP primer <400> 3 cagatccacg agtaacatca ctaacgcaac gggatgatat taagc 45 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV BIP primer <400> 4 attactcaca gagtgggtaa gaggtcttga tattttcatc catccag 47 <210> 5 <211> 2791 <212> DNA <213> TYLCV Jordan 1 strain <400> 5 accggatggc cgcgcctttt tcttttatgt ggtccccacg agggttccac agacgtcact 60 gtcaaccaat 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tatgcgtcgt tggcagattg ctgacctcct ctagctgatc tgccatcgat ttggaaaact 2280 ccaaaatcaa tgaagtctcc gtctttctcc acgtaggtct tgacatctgt tgagctctta 2340 gctgcctgaa tgtttggatg gaaatgtgct gacctgtttg gggataccag gtcgaagaac 2400 cgttggttct tacattggta tttgccttcg aattggataa gcacatggag atgtggttcc 2460 ccattctcgt ggaattctct gcaaactttg atgtattttt tatttgttgg ggtttctatg 2520 ttttttaatt gggaaagtgc ttcctcttta gagagagaac aattgggata tgttaggaaa 2580 taattcttgg catatatttt aaataaacga ggcatgttga aatgaatcgg tgtccctcaa 2640 agctctatgg caatcggtgt atcggtgtct tactaatacc tcgacaccta atggcaattt 2700 ggtaatttca taaatgttca ttgcaattca aaattcaaaa ttcaaaaatc aaatcattaa 2760 agcggtcatc cgtataatat t 2781 <210> 10 <211> 2774 <212> DNA <213> TYLCV Korea strain <400> 10 accggatggc cgcgcctttt ccttttatgt ggtccccacg agggttacac agacgtcacc 60 gtcaaccaat caaattgcat cctcaaacgt tagataagtg ttcatttgtc tttatatact 120 tggtccccaa gttttttgtc ttgcaatatg tgggacccac ttcttaatga gtttcctgaa 180 tctgttcacg gatttcgttg tatgttagct attaaatatt tgcagtccgt tgaggaaact 240 tacgagccca atacattggg ccacgattta attagggatc ttatatctgt tgtaagggcc 300 cgtgactatg tcgaagcgac caggcgatat aatcatttcc acgcccgtct cgaaggttcg 360 ccgaaggctg aacttcgaca gcccatacag cagccgtgct gctgtcccca ttgtccaagg 420 cacaaacaag cgacgatcat ggacgtacag gcccatgtac cgaaagccca gaatatacag 480 aatgtatcga agccctgatg ttccccgtgg atgtgaaggc ccatgtaaag tccagtctta 540 tgagcaacgg gatgatatta agcatactgg tattgttcgt tgtgttagtg atgttactcg 600 tggatctgga attactcaca gagtgggtaa gaggttctgt gttaaatcga tatatttttt 660 agggaaagtc tggatggatg aaaatatcaa gaagcagaat cacactaatc aggtcatgtt 720 cttcttagtc cgtgatagaa ggccctatgg aagcagccca atggattttg gacaggtttt 780 taatatgttc gataatgagc ccagtaccgc aaccgtgaag aatgatttgc gggataggtt 840 tcaagtgatg aggaaatttc atgctacagt tattggtgga ccctctggaa tgaaggaaca 900 ggcattagtt aagagatttt ttaaaattaa cagtcatgta acttataatc atcaggaggc 960 agccaagtac gagaaccata ctgaaaacgc cttgttactg tatatggcat gtacgcatgc 1020 ctcgaatcca gtgtatgcaa ctatgaaaat acgcatctat ttctatgatt caatatcaaa 1080 ttaataaaat ttatatttta tatcatgagt ttctgttaca tttattgtgt tttcaagtac 1140 atcatacaat acatgatcaa ctgatctgat tacattgtta atggaaatta caccaagact 1200 atctaaatac ttaagaactt catatctaaa tactcttaag aaatgaccag tctgaggatg 1260 taatgtcgtc caaattcgga agttgagaaa acatttgtga atccccatga ccttcctgat 1320 gttgtggttg aatcttatct gaatggaaat gatgtcgtgg ttcattagaa atggcctctg 1380 gctgtgttct gttatcttga aatagagggg attgtttatc tcccagataa aaacgccatt 1440 ctctgcctga ggagcagtga tgagttcccc tgtgcgtgaa tccatgatta ttgcagttga 1500 ggtggaggta gtatgagcag ccacagtcta ggtctacacg cttacgcctt attggtttct 1560 tcttggctat cttgtgttgg accttgattg atacttgcga acagtggctc gtagagggtg 1620 acgaaggttg cattcttgag agtccaattt ttcaaggata tgtttttttc ttcgtctaga 1680 tattccttat atgaggaggt aggtccttga ttgcagagga agatagtggg aattccccct 1740 ttaatttgaa tgggcttccc gtactttgtg ttgctttgcc agtccctttg ggcccccata 1800 aattccttga agtgctttaa ataatgcggg tctacgtcat caatgacgtt gtaccacgca 1860 tcattgctgt acacctttgg gcttaggtct agatgtccac ataaataatt atgtgggcct 1920 agagacctgg cccacattgt tttccctgtt ctgctatcac cctcaatgac aatacttatg 1980 ggtctccatg gccgcgcagc ggaagacacg acgttctcgg cgacccactc ttcaagttca 2040 tctggaactt gattaaaaga agaagaaaga aatggagaaa cataaacttc taaaggagga 2100 ctaaaaatcc tatctaaatt tgaacttaaa ttatgaaatt gtaaaatata gtcctttggg 2160 gccttctctt ttaatatatt gagggcctcg gatttactgc ctgaattgag tgcttcggca 2220 tatgcgtcgt tggcagattg ctgacctcct ctagctgatc tgccatcgat ttggaaaact 2280 ccaaaatcaa tgaagtctcc gtctttctcc acgtaggtct tgacatctgt tgagctctta 2340 gctgcctgaa tgttcggatg gaaatgtgct gacctgtttg gggataccag gtcgaagaac 2400 cgttggttct tacattggta tttgccttcg aattggataa gcacatggag atgtggttcc 2460 ccattctcgt ggagttcttt gcaaactttg atgtattttt tatttgttgg ggtttctagg 2520 ttttttaatt gggaaagtgc ttcctcttta gagagagaac aattgggata tgttaggaaa 2580 taatttttgg catatatatt aaataaacga ggcatgttga aatgaatcgg tgtccctcaa 2640 agctctatgg caatcggtgt atcggtgtct tacttatacc tggacaccta atggctattt 2700 ggtaatttca tgaatgttca ttgtaattca aaattcaaaa atcaaatcat taaagcggcc 2760 atccgtataa tatt 2774 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV F3 primer <400> 11 gtatcgaagc cctgatgtt 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV B3 primer <400> 12 cctgattagt gtgattctgc t 21 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV FIP primer <400> 13 cacaacgaac aataccagta tgcttgaagg cccatgtaaa gtcc 44 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal TYLCV BIP primer <400> 14 ctggaattac tcacagagtg ggtgatattt tcatccatcc agact 45

Claims (9)

1. 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 11 내지 14로 구성되는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 토마토황화잎말림바이러스는 TYLCV Jordan1 변이주(strain), Jordan3 변이주(strain), Israel 변이주(strain), Spain 변이주(strain), USA 변이주(strain) 및 Korea 변이주(strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
   
4. 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 토마토에서 게놈 DNA(gDNA)를 추출하는 단계;
   상기 gDNA를 주형으로 제4항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
   상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus) 검출방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 토마토황화잎말림바이러스는 TYLCV Jordan1 변이주(strain), Jordan3 변이주(strain), Israel 변이주(strain), Spain 변이주(strain), USA 변이주(strain) 및 Korea 변이주(strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   
8. 제 6 항에 있어서,
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   
9. 삭제

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