KR101715408B1 - 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 국화황화모틀바이로이드 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국화황화모틀바이로이드의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 국화황화모틀바이로이드를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 국화재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 국화 감염성 바이로이드를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 국화 바이로이드 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 국화황화모틀바이로이드 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국화황화모틀바이로이드의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다.
국화는 세계 3대 화훼작물 중 하나로, 우리나라의 국화 재배면적은 626ha, 연간 평균 판매액은 약 860억원이며, 연간 수출액은 602만불로 주요 화훼 작물이다(‘09, 농림부 화훼재배현황). 국화의 재배에 가장 큰 피해를 주는 병은 바이로이드병인 국화왜화바이로이드(chrysanthemum stunt viroid, CSVd)와 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum Chlorotic Mottle Viroid, CChMVd)로서, 국화왜화바이로이드는 1997년에 우리나라에 처음 발생한 이후 현재 전국 국화 주산지에 확산되어 있으며, 국화황화모틀바이로이드는 2006년에 최초 보고되었고, 2005년 조사에 의하면 재배 국화의 44.3%가 상기 바이로이드에 중복 감염되어 상품성이 전혀 없게 되는 문제를 야기하고 있다. 기타의 식물 바이러스들과는 다르게 바이로이드에 의한 병증의 발현은 식물체내에서 특정한 단백질을 생성하거나 짧은 단편의 폴리펩티드들을 생성하지 않는 병원체로서 기존의 식물 바이러스병 진단을 위한 기술들의 사용이 제한적이다.
종래의 바이로이드 검출 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 바이로이드 유전자를 증폭한 뒤, 증폭된 유전자를 전기영동을 통하여 확인하고, 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 바이로이드 유전자를 검증하는 일련의 과정을 거쳐야하였다. 이러한 종래의 기술적 방법은 중합효소연쇄반응기와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구된다. 또한 최종 확인을 위한 증폭 산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다.
상기와 같은 바이로이드 검출방법은 전통적인 중합효소연쇄반응을 통해 유전자를 증폭하고 증폭된 유전자 조각의 염기서열 분석을 통해 바이로이드임을 확인하는 복잡하고 전문적인 과정이 요구된다. 이러한 일련의 과정을 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며, 전기영동이나 염기서열분석과 같은 전문 장비가 요구되고, 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기에 분석장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력이 떨어진다. 이와 같이 국화황화모틀바이로이드를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR방법과 유사하나 기존 PCR 방법이 변성, 접합, 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 조성물에 온도의 변화를 주어야 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 국화황화모틀바이로이드 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성되는, 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 국화황화모틀바이로이드는 SSHA6 종(strain) 또는 msim34 종(strain)인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 국화에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 역전사효소를 이용하여 cDNA로 전환하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 제3항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid) 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 국화황화모틀바이로이드는 SSHA6 종(strain) 또는 msim34 종(strain)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 검출방법으로 인하여, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 국화황화모틀바이로이드를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 국화재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 국화 감염성 바이로이드를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 국화 바이로이드 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 은 국화황화모틀바이로이드 SSHA6 종의 염기서열 정보 및 등온증폭법을 위한 프라이머의 위치 및 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 2 는 국화황화모틀바이로이드 SSHA6 종 및 msim34 종의 염기서열 정보 및 등온증폭법을 위한 universal 프라이머의 위치 및 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3 은 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4 는 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2 는 국화황화모틀바이로이드 SSHA6 종 및 msim34 종의 염기서열 정보 및 등온증폭법을 위한 universal 프라이머의 위치 및 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3 은 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4 는 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명자들은 국화황화모틀바이로이드를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성되는, 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 국화황화모틀바이드로이드를 검출하기 위하여 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였다. 등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5’ 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3’ 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.
본 발명자들은 등온증폭법을 이용하여 국내에서 보고된 바 있는 국화황화모틀바이로이드 msim34 종(strain)과 SSHA6 종(strain)을 모두 검출하는데 사용할 수 있는 프라이머를 작성하고자 Primerexplorer V4 소프트웨어를 이용하였으나, msim34 종에 대한 프라이머 세트는 상기 소프트웨어를 사용할 경우에 작성이 되지 않았다(도 1 참조). 이에 본 발명자들은 SSHA6 종의 프라이머 세트를 기준으로 msim34 종에도 적용될 것으로 예상되는 프라이머 세트를 재조합하여 작성하였다(도 2 참조). 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 것이 바람직하나, 국화황화모틀바이로이드를 진단할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트라면 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 국화에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 역전사효소를 이용하여 cDNA로 전환하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid) 검출방법을 제공한다. 국화로부터 직접 RNA를 추출할 수도 있지만, 검출을 위한 임상 검체 및 배양 세포 등에도 적용가능하다.
본 발명의 일실시예에서는 universal 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법을 수행하여 SSHA6 종(strain) 및 msim34 종(strain)을 모두 검출 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하면 자연광하에서 육안으로 검출 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1.
국화황화모틀바이로이드
유전자 수집
국화황화모틀바이드로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)의 검출방법을 연구하기 위하여, 국화황화모틀바이로이드를 수집하고 클로닝(cloning)하고자 하였다. 국내에서 보고된 국화황화모틀바이로이드 종류는 약한 병증을 보이는 msim34 종(strain)과 강한 병증으로 보이는 SSHA6 종(strain)으로 나뉘어진다. 각각의 바이로이드(viroid)는 노지에서 이병된 국화에서 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 통하여 증폭한 후 pGEM-T easy 유전자 클로닝 벡터(Promega Corporation, USA)에 삽입하여 사용하였으며, 유전자 정보는 미국 national center for biotechnology information의 Genbank에 등록되어 있는 SSHA6의 정보 DQ450682.1와 msim34의 정보 DQ402041.1을 이용하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 5 및 서열번호 6에 표기하였다.
실시예
2.
프라이머
작성
국화황화모틀바이드로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 통하여 검출하기 위하여 프라이머(primer)를 Primerexplorer V4를 이용하여 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, SSHA6 종에 대한 프라이머 세트는 Primerexplorer V4를 이용하여 작성할 수 있었으나 msim34 종에 대한 프라이머 세트는 상기 소프트웨어를 사용할 경우에 작성이 되지 않았다. Primerexplorer V4를 이용하여 작성된 SSHA6 종에 대한 프라이머 세트는 도 1에 나타내었다. 이에 본 발명자들은 SSHA6 종의 프라이머 세트를 기준으로 msim34 종에도 적용될 것으로 예상되는 프라이머 세트를 재조합하여 작성하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, SSHA6 종의 F3와 BIP 프라이머의 특정 염기서열을 변경하여 두 종류의 바이로이드에 모두 적용될 것으로 예상되는 프라이머 세트(universal primer set)를 제작하였다. 대조군으로는 SSHA6 종에 최적화된 프라이머 세트(서열번호 7 내지 서열번호 10)와 msim34 종에 최적화된 프라이머세트 (서열번호 11 내지 서열번호 14)를 제작하여 사용하였다.
실시예
3. 식물 검체의 채집
실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 국화황화모틀바이드로이드를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 국화 재배 온실에서 식물 검체를 채집하였다. 식물 검체는 외형적으로 바이로이드 증상이 나타나지 않은 건전주와 국화황화모틀바이로이드의 증상을 보이는 이병주의 두 가지 집단으로 나누어 채집하였으며, 채집된 검체의 잎 조직 1g에서 전체 RNA를 추출하고 이중 일부를 역전사효소(reverse transcription enzyme)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 역전사 반응에는 6개의 임의서열로 제작된 프라이머를 사용하였다. 합성된 cDNA는 이후 등온증폭법의 주형으로 사용하였다.
실시예
4. 등온증폭법의 시행 및 유용성 확인
실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 국화황화모틀바이드로이드를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 2uL의 10배(10X) Bst 중합효소(polymerase) 반응버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 10mM KCl, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100), 1.6ul의 10mM dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 10mM씩 섞인 혼합물), 0.4ul의 10uM F3와 B3 프라이머, 1.6ul의 10uM FIP와 BIP 프라이머, 1ul의 20mM MgSO4, 1ul(8 Unit) Bst 중합효소, 주형 cDNA 1ul, 및 증류수 11.5ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 65℃ 반응 용기에서 1시간 30분동안 반응시켜 등온증폭하였다. 반응이 완료된 후에는 총 20ul의 반응물 중 8ul를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 이후 동일한 반응물로 재반응(65℃, 1시간 30분)시킨 후에 10,000배로 농축된 SYBR Green I을 반응물 20ul 당 1ul씩 첨가하여 발색 반응을 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 상기 바이로이드 유전자의 증폭된 양상을 관찰한 전기영동 결과와 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 비교하여 유의성을 검증하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 구현하고자하는 유전자의 증폭에 최적 프라이머 세트를 확인하기 위하여 서열 1내지 서열 4에서 명기한 프라이머 세트외에 하기의 3가지 종류의 프라이머 세트를 시험하였으나 비감염주 (lane 2, lane 5, lane 8)에서 프라이머 간의 연결에 의한 증폭(세트 1과 세트 3)이나 감염주를 주형(SSHA6 주형: lane 3, lane 6, lane 9; msim34 주형: lane 4, lane 7, lane 10)으로 하였음에도 증포결과를 보여주지 않는(세트 2) 등 바이러스의 검출에 적합지 못한 결과를 보여주었다.
도 3에 나타난 바와 같이, universal primer set를 사용한 경우에는 비감염균주(lane 2)에서는 유전자가 증폭되지 않은 반면, SSHA6 종(lane 3)과 msim34 종(lane 4)을 주형으로 이용한 경우에는 모두 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. SSHA6 종에 최적화된 프라이머 세트를 이용한 경우에는 SSHA6 종(lane 7)을 주형으로 사용한 경우에만 증폭된 것을 확인할 수 있었으며, msim34 종에 최적화된 프라이머 세트를 이용한 경우에는 msim34 종(lane 12)을 주형으로 사용한 경우에만 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, SYBR Green I을 고농도로 농축하여 증폭된 유전자(universal primer set sample)를 염색한 경우에도 SSHA6 또는 msim34에 감염된 감염주와 SSHA6 및 msim34 복합 감염주 모두 유전자가 증폭되어 자연광하에서 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트는 SSHA6 종 및 msim34 종 모두 검출하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SYBR GreenI을 10,000배로 농축하여 사용할 경우 자연광하에서 육안으로 감염여부를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY FOUNDATION FOR CORPORATE
<120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification
reaction for detecting Chrysanthemum Chlorotic Mottle Viroid, and
use thereof
<130> PB11-09958
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal_CChMVd-F3 primer
<400> 1
ygacgaagat ccatgacagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal_CChMVd-B3 primer
<400> 2
ygaccggaac tggatctgtt c 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal_CChMVd-FIP primer
<400> 3
tcctgacgag gctgtggaga tcttccagtt tcggcttgtg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Universal_CChMVd-BIP primer
<400> 4
tccyctctaa gcggagtaga ggtccccatc cctttcctcc 40
<210> 5
<211> 400
<212> DNA
<213> CChMVd_SSHA6
<400> 5
ggcacctgac gtcggtgtcc cgacgaagat ccatgacagg atcgaaacct cttccagttt 60
cggcttgtgc gggagtaaag ctttcactct ctccacagcc tcgtcaggaa acccacttca 120
ggtctcgact ggaaggtcgt taaacttccc ctctaagcgg agtagaggta aatacctccg 180
tcccatcccg ggaggaaagg gatggggacc cggaacagat ccagttccgg tcctttggag 240
tccatttttc tcgttggata ttctcctcgg agaagggaaa tggggccagt cccagtcggt 300
tcgctctcgt agtcacagcc gctggggaac ctaggcagaa ggctggacgg agtcttagtc 360
cactccaaag gaccttgggt ttagaaaccc ccaggaggtc 400
<210> 6
<211> 400
<212> DNA
<213> CChMVd_msim34
<400> 6
ggcacctgac gtcggtgtcc tgacgaagat ccatgacagg atcgaaacct cttccagttt 60
cggcttgtgc gggagtaaat cgaaagatct ctccacagcc tcgtcaggaa acccacttca 120
ggtctcgact ggaaggtcgt aaaacttcct ctctaagcgg agtagaggta aatacctccg 180
tcccatcccg ggaggaaagg gatggggacc cggaacagat ccagttccgg tcctttggag 240
tccatttttc tcgttggata ttctcctcgg agaagggaaa tggggccagt cccagtcggt 300
tcgctctcgt agtcacagcc gctggggaac ctaggcagaa ggctggacgg agtcttagtc 360
cactccaaag gaccttgggt ttagaaaccc ccaagaggtc 400
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_SSHA6-F3 primer
<400> 7
aacccacttc aggtctcga 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_SSHA6-B3 primer
<400> 8
agcggctgtg actacgag 18
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_SSHA6-FIP primer
<400> 9
atccctttcc tcccgggatg gaaacttccc ctctaagcgg a 41
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_SSHA6-BIP primer
<400> 10
ggacccggaa cagatccagt tcggccccat ttcccttctc 40
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_msim34-F3 primer
<400> 11
gtcggtgtcc tgacgaagat c 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_msim34-B3 primer
<400> 12
ggtccccatc cctttcct 18
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_msim34-FIP primer
<400> 13
ttcctgacga ggctgtggag agacctcttc cagtttcggc t 41
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CChMVd_msim34-BIP primer
<400> 14
acccacttca ggtctcgact gggggacgga ggtatttacc tcta 44
Claims (8)
- 서열번호 1 내지 4로 구성되는, 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서,
상기 국화황화모틀바이로이드는 SSHA6 종(strain) 또는 msim34 종(strain)인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는, 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 국화에서 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 역전사효소를 이용하여 cDNA로 전환하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로 제3항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 국화황화모틀바이로이드(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid) 검출방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 국화황화모틀바이로이드는 SSHA6 종(strain) 또는 msim34 종(strain)인 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110114820A KR101715408B1 (ko) | 2011-11-04 | 2011-11-04 | 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110114820A KR101715408B1 (ko) | 2011-11-04 | 2011-11-04 | 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130049670A KR20130049670A (ko) | 2013-05-14 |
| KR101715408B1 true KR101715408B1 (ko) | 2017-03-13 |
Family
ID=48660351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110114820A KR101715408B1 (ko) | 2011-11-04 | 2011-11-04 | 국화황화모틀바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101715408B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190051536A (ko) | 2017-11-07 | 2019-05-15 | 대한민국(농촌진흥청장) | 사과 바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 진단방법 |
-
2011
- 2011-11-04 KR KR1020110114820A patent/KR101715408B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Boubourakas, I.N. 외, 21st International Conference on Virus and other Graft Transmissible Diseases of Fruit Crops (2010) |
| Plant Disease 95(10):1320-1320 · October 2011 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190051536A (ko) | 2017-11-07 | 2019-05-15 | 대한민국(농촌진흥청장) | 사과 바이로이드를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 진단방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130049670A (ko) | 2013-05-14 |
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