CN106119414A - 一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果褪绿叶斑病毒的逆转录‑环介导恒温扩增(RT‑LAMP)检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。本发明还公开了对苹果褪绿叶斑病毒进行检测的方法。本发明的试剂盒及检测方法具有快速、操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适合基层实验室的快速诊断，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法
本发明是申请号为201610125355.2、申请日为2016年3月7日、发明名称为“一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法”的专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术
苹果属蔷微科苹果属，多年生落叶果树，原产于亚洲中部、欧洲东南及新疆西部。苹果病毒是导致苹果果树传染病的主要因素，大多通过嫁接、修剪等传染。若病毒在植株体内长年积累，将会引发严重后果。由于病毒是专性寄生，当其大量繁殖时，会干扰果树正常繁殖代谢，引起树体长势减弱、叶片萎缩翻卷和果实畸形、风味变劣，果树提早枯死，甚至绝产，严重影响苹果的产量。因此，早期对苹果果树进行病毒检测以及时采取防控措施，已迫在眉睫。
苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是果树传染病的最主要病原体之一，又名苹果潜隐病毒1，属于纤毛病毒属(Trichovirus)，主要侵染苹果、梨、核果类果树及蔷藻科观赏品种等。被苹果褪绿叶斑病毒侵染的果树植株，树体长势日趋衰退，叶片上会出现褪绿色如黄色斑点或条状斑，卷缩变小或向对侧弯曲，严重影响叶片的光合作用面积。
苹果褪绿叶斑病毒是一种正义单链RNA病毒，为弯曲柔软的纤维状条形，无鞘膜，其碱基长度约为7.5kb，核酸分子量大概是2500kDa，外壳蛋白由多肽组装而成，分子量约为22kDa。目前对苹果褪绿叶斑病毒的检测，多采用传统的肉眼观察、血清学法以及分子生物学检测方法，如RT-PCR。然而，传统方法耗时长，灵敏度不高，特异性差，对检测人员的水平要求相对较高；血清学方法费用昂贵，操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体发生非特异性反应的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛；而常规RT-PCR的特异性和灵敏度也不高。为了适应产业发展需求，有必要开发一种能够更加快速、准确地对苹果褪绿叶斑病毒进行检测的方法。
环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplificationof DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
逆转录-环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒，其特征在于包括4条特异性引物：外引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示；外引物B3，其序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP，其序列如SEQ ID NO:4所示。引物序列具体如下：
外引物F3：ATGGAGGATCAGAAAGTGAT(SEQ ID NO:1)
外引物B3：TGGTTGTAAAGAGGTTTGTGA(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：TGGGTCCGAAGATGTAGTCTTGA-GTCATACA
ATCTGAAGGAGGT(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：TCAGCAACATGACTTTCCGTCAG-CCTTTATAC
TTCAATTTCACCAAC(SEQ ID NO:4)。
优选所述外引物F3和B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和BIP的浓度均为40pmol/μl。
进一步地，本发明的试剂盒还可以包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgSO4组成。
优选所述核酸染料为SYBR Green I。
进一步地，本发明的试剂盒还可以包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
在另一个方面中，本发明还提供了一种苹果褪绿叶斑病毒检测方法，其利用RT-LAMP技术，包括以下步骤：
(1)提取待测样品RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)建立25μl的RT-LAMP反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F3 1μl、5pmol/μl的外引物B3 1μl、40pmol/μl的内引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、2U AMV逆转录酶1μl、8U Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以苹果褪绿叶斑病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(4)LAMP反应：将步骤(3)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(5)分析判断反应产物结果：在(4)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，根据反应液的颜色判断是否存在苹果褪绿叶斑病毒。
在本发明的检测方法中，所述外引物F3的序列如SEQ ID NO:1所示，外引物B3的序列如SEQ ID NO:2所示，内引物FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，内引物BIP的序列如SEQ IDNO:4所示。
优选所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mMMgSO4组成。
优选所述核酸染料为SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测样品中不含ACLSV；如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有ACLSV。
本发明的苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒和检测方法利用RT-LAMP技术，针对ACLSV保守区域设计4条特异性引物，其识别ACLSV的6个特定区域，特异性和灵敏度更高。反应在等温(63℃)条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴定简便，较传统的检测方法优势显著，适合基层实验室的快速诊断，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1苹果褪绿叶斑病毒特异性检测
1.1试剂的准备
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；QIAamp RNA Mini Kit购自Qiagen；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBRGreen I购自Invitrogen；其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
同时，配制以下RT-LAMP反应中所需试剂：
反应缓冲液，按照以下配方配制：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱、50mM MgSO4；
引物：外引物F3，其序列如SEQ ID NO:l所示；外引物B3，其序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其序列如SEQ ID NO:3所示，内引物BIP，其序列如SEQ ID NO:4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度为40pmol/μl。
2U的AMV逆转录酶；
8U的Bst DNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBR Green I；
阳性对照：苹果褪绿叶斑病毒基因组DNA；
阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
1.2RT-LAMP检测
待测样品包括采自河北农业大学标本园带有花叶症状且采用血清学方法确定已感染苹果褪绿叶斑病毒的4株果树幼嫩枝条以及感染苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒的室内组培苗各1株。
按照以下步骤对苹果褪绿叶斑病毒进行检测：
(1)利用QIAamp RNA Mini Kit提取待测样品RNA；
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其中四种引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、2U AMV逆转录酶1μl、8U Bst DNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以苹果褪绿叶斑病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl1000×SYBR GreenI，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性；如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
1.3检测结果
确定已感染苹果褪绿叶斑病毒的4株果树幼嫩枝条以及阳性对照的PCR管中均呈现绿色，而另外3种常见的侵染苹果果树的病毒：苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、苹果茎痘病毒以及阴性对照的显色结果均为橙色，表明引物对于苹果褪绿叶斑病毒具有很强的特异性。
实施例2苹果褪绿叶斑病毒灵敏度检测
2.1RT-LAMP灵敏度检测
按照实施例1的步骤(1)提取4株枝条的RNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7个梯度。
RT-LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例1的步骤(2)-(4)。
2.2检测结果
除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pg DNA，灵敏度很高。

Claims (5)

1.一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒，其特征在于，可以包括4条特异性引物：外引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示；外引物B3，其序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP，其序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgSO4组成。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述核酸染料为SYBR Green I。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
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