KR100615615B1 - 감자ｍ바이러스 진단용 특이 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자에 발생하는 다른 주요 바이러스와 비특이적 반응이 일어나지 않고, 감자M바이러스(Potato virus M, PVM)에만 유일하게 존재하는 DNA(유전자) 염기서열(부분)에만 대응하는 특이한 프라이머 세트(PVMCP5와 PVMCP3)를 제조하는 것에 관한 것이다. 이를 이용하여 감자M바이러스를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 감자바이러스를 예방할 수 있다.

진단용, 특이 프라이머, DNA단편

Description

감자Ｍ바이러스 진단용 특이 프라이머{Specific Primers for detection of Potato virus M}

도1은 설계한 감자M바이러스(PVM) 프라이머의 위치를 나타내는 도표.

도2는감자M바이러스 특이 프라이머(PVMCP5와 PVMCP3)를 이용한 RT-PCR 결과를 보여주는 사진.

본 발명은 감자M바이러스(Potato virus M, PVM)의 진단용 특이 프라이머에 관한 것이다.

감자M바이러스에 감염될 경우 감자(Solanum tuberosum)의 생산량이 10～20% 감소되는 것으로 알려져 있다. 이 바이러스는 병징이 은폐되는 경우가 많으므로 정밀진단이 필요하며, 어린 묘나 조직배양 묘와 같은 소량 시료는 혈청학적방법으로 진단하기 어려워 정밀진단법이 필요하다. 본 발명은 이를 해결하기 위하여 감자M바이러스를 특이적으로 진단할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하고자 하였다.

본 발명은 연쇄중합반응(PCR; Polymerase Chain Reaction)을 이용한 감자M바이러스(Potato virus M, PVM)의 진단용 특이 프라이머에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 감자에 바이러스를 일으키는 감자M바이러스에 특이하게 존재하는 신규의 유전자 단편세트를 분석하여 유전자의 염기서열을 결정하고, 그것을 이용하여 PCR공정에 의해 감자M바이러스를 정확하게 진단하는 방법에 관한 것이다.

감자바이러스에는 감자잎말림바이러스(PLRV), 감자Y바이러스(PVY), 감자M바이러스(PVM), 감자X바이러스(PVX) 등이 있다.

감자잎말림바이러스는 식물체 정단부터 어린잎이 약간 퇴록되고 기부가 안쪽으로 말리는 증상을 초래하게 되는 것으로, 감자에 감염하는 것으로 보고된 바이러스 가운데 감자에 가장 심한 피해를 입히는 바이러스다. 감자바이러스Y(PVY)에 감염되면 식물체가 잘 자라지 못하고 잎에 모자이크 증상이 나타나며 엽맥이 투명해지고 과실의 크기가 작아지며 결과율이 떨어지는 특징이 있다. 감자X바이러스에 감염된 감자의 증상은 엽면에 농담(16～20℃)이 생기나 자라면서 병징이 은폐(28℃이상)된다. 또한 본 발명자들이 관심을 갖는 바이러스인 감자M바이러스는 650nm의 실모양 바이러스로 핵산은 ssRNA형태다. 감자M바이러스는 한국 뿐아니라, 전 세계적으로 감자에서 발견되는 것이 보고되었으며, 바이러스에 감염되면 얼룩모양 및 모자이크 등의 병징이 나타나는 것이 특징이다. 감자M바이러스는 기계적인 접종에 의해 쉽게 전파되고, 진딧물에 의해 비영속 전염되는 것으로 알려져 있다. 이 바이러 스의 불활성화 온도 65~70℃, 희석한도 십만배, 보존한도 2~3일이며, 감염세포의 세포질에 바이러스 입자가 흩어져 있는 것이 특징이다.

바이러스에 의한 피해는 식물체의 바이러스에 대한 저항성을 높이거나, 식물체로의 바이러스 침입 및 확장을 사전에 미리 예방함으로써 해결할 수 있다. 바이러스로부터의 저항성을 높이기 위하여 바이러스 유전체의 일부 또는 전부를 원하는 식물에 도입시켜, 저항성을 창출하는 것이 매우 효과적인 방법으로 알려져 있다. 특히 PLRV에 있어서 복제효소유전자를 이용하는 경우에는 바이러스 외피단백질을 이용할 경우보다 더 높은 저항성 효과를 보이는 것으로 알려져 있다.

초기에 발병 여부를 진단하는 방법으로는 크게 세 가지가 있다. 첫째, 육안으로 감자의 증상을 관찰하는 방법(육안관찰법)과 둘째, 직접 바이러스 또는 병원균을 채취하고 배양하는 방법(생물검정법)― PVM과 같은 바이러스의 경우, 감염이 의심되는 식물체에서 채취된 샘플을 지표식물에 접종하여 병징을 관찰하게 됨―과 셋째, 유전자 수준에서 감자바이러스를 진단하는 방법(유전자감식법)이 있다. 육안관찰법은 감자에서 병의 증상이 겉으로 드러나지 않는 경우 병의 종류를 판별하기 어려운 단점이 있으며, 생물검정법은 적정한 배지에서 바이러스 및 병원균을 배양하고 분리한 후에 동정(identity)하여 미생물의 분류를 확정하는데 오랜 시간이 걸리므로 어려움이 따른다. 특히 바이러스의 경우, 감염이 의심되는 식물체에서 채취한 샘플을 여러 종류의 지표식물에 접종하여 바이러스에 의한 병징을 관찰하게 되므로 지표식물 관리에 어려움이 있으며, 병징 발현에 많은 시간이 소요되므로 신속하게 진단하기 어렵다. 그러나 유전자감식법은 PCR공법을 사용하므로 짧은 시간 내에 다량의 산물을 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 유전자 수준에서 감자M바이러스를 진단하고 예방하도록 하였다.

일반적으로, 유전자 수준에서 생물종을 식별하는 방법으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 방법으로는 핵산지문법(DNA finger print)이 있는데, 이 방법에는 제한효소단편장다형(RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법, 라이보좀 구성 핵산 염기서열의 차이를 이용한 방법, 특정 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법이 있다. 이들 중 RFLP법은 제한효소(restriction enzyme)에 의해 DNA를 절단한 다음 절단단편들을 나이론막에 전사한 후, 방사성 동위원소 등으로 표지한 프로브(probe)를 이용해 DNA 다형성을 검출하는 방법이다. 그리고, PCR법은 10～20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)시킨 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 된다. 이때 DNA 중에 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다.

실제로 PCR 진단에 소요되는 시간은 다른 진단방법에 비해 매우 짧아서 8시간 이내로 걸리고, 진단에 소요되는 비용 또한 매우 적을 뿐 아니라 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이므로, 본 발명에서도 핵산지문법 중 PCR 공정을 이용하여 감자M바이러스만을 진단하고자 하였다.

따라서 특이적 검출반응을 일으키는 새로운 프라이머를 찾아야 할 필요가 있다. 그러나 이를 위해서는 감자M바이러스만을 진단할 수 있는 수백 내지 수천 종류의 프라이머 탐색이 이루어져야 하는데 따른 시간, 노력 및 비용이 요구된다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 특이적인 DNA증폭산물을 만들 수 있는 특정 프라이머 세트가 필요하다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구를 거듭한 바, 감자M바이러스에만 특이적으로 존재하는 프라이머 세트를 발견하였다. 이로써 프라이머가 주형 DNA와 특이적 접촉반응을 하므로, 특이적 DNA 증폭 산물의 검출로 재현성을 높였으며, PCR진단을 이용하므로써 짧은 시간에 비용을 적게 들이고 경제적으로 감자M바이러스만을 검출할 수 있도록 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 감자M바이러스의 감염을 조기에 진단하기 위한 특이 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 감자M바이러스 진단용 PCR키트를 제공하는 것이다.

전기한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은 PVMCP5(서열 1) 또는 PVMCP3(서열 2) 중에서 어느 하나를 필수적으로 포함하는 감자M바이러스(Potato virus M, PVM)에 특이적인 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함한 PCR키트에 관한 것이다.

이를 위하여 본 발명자들은 다음과 같은 과정을 거쳐서 프라이머 세트를 얻었다.

먼저 감자M바이러스 진단용 특이 프라이머의 설계는 분석 염기서열 중 바이러스 외피단백질을 합성하는 유전자 영역을 대상으로 하였다. 프라이머는 감자M바이러스 모든 분리주가 공통으로 갖고 있는 서열 중에서 프라이머로서 조건을 충족하는 부분을 탐색하여 annealing 온도 차이가 5℃ 범위에 있도록 설계하였다. 이 프라이머가 감자에 발생하는 다른 바이러스와 비특이적 반응이 일어나는지 확인하기 위하여 감자잎말림바이러스(PLRV), 감자Y바이러스(PVY), 감자S바이러스(PVS), 감자X바이러스(PVX)에 감염된 이병감자와 건전한 감자에서 핵산을 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. 이 결과 다른 바이러스에서는 반응이 나타나지 않고, 감자M바이러스에서만 반응을 나타내어 감자M바이러스의 특이 프라이머로 선발하게 되었다.

본 발명에 따라 제공되는 프라이머 설계, RT-PCR에 의한 바이러스 진단을 아래에서 실시예에 의해 설명하였다.

하기 실시예에서는 감자M바이러스에만 존재하는 특이 프라이머 세트인 PVMCP5(서열1)과 PVMCP3(서열2)는 두가지 서열 모두 특이성이 있다. 따라서 PVMCP5(서열1)와 다른 비특이적 프라이머를 포함하는 프라이머를 제작할 경우 또는 PVMCP3(서열2)와 비특이적 프라이머를 포함하는 프라이머를 제작할 경우에도 감자M바이러스와 특이적 반응을 할 수 있을 것이다. 이는 당업자가 직접 실험을 하지 않고도 이론상으로 확인가능한 것이므로 하기 실시예에서 생략하였다.

실시예 1. 프라이머 설계

감자M바이러스의 계통에 사용할 수 있는 진단용 특이 프라이머를 개발하기 위하여 지금까지 알려진 감자M바이러스와 주요 감자바이러스의 유전정보를 분석하였다. 분석에 사용한 감자M바이러스 분리주 및 주요 감자바이러스들은 표 1에 나타내었다.

프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질(coat protein, CP) 영역을 대상으로 하였으며, 이 영역에서 모든 감자M바이러스가 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하였다. 이때 annealing 온도가 5℃ 이하로 차이가 나도록 프라이머를 합성하였고, 이 과정을 거쳐 제작된 프라이머의 염기서열 및 산물의 크기는 표 2와 같다. 또한, 합성한 프라이머의 위치는 도 1에 나타내었다.

본 발명의 경우 감자M바이러스 진단용 프라이머 세트의 산물크기는 919bp이었다. 그렇지만, PVMCP5(서열1) 한 가닥과 비특이적 서열 한 가닥이 한 세트일 경우, 또는 PVMCP3(서열2) 한 가닥과 비특이적 서열 한 가닥이 한 세트일 경우에는 산물의 크기가 달라질 수도 있을 것이다.

실시예 2. RT-PCR

본 발명을 위해 사용한 total RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 다음과 같다.

1) Total RNA를 분리

Total RNA는 guanidinium acid-phenol 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 감염식물체 50 ㎎에 변성완충액 (4 M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.5% sarcosyl, 100 mM 2-mercaptoethanol) 600 ㎕를 넣고 유발과 유봉을 이용하여 마쇄하였다. 여기에 2 M sodium acetate (pH 4.0) 60 ㎕ 첨가한후, Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1) 600 ㎕ 첨가하여 혼합한 다음 얼음에서 15분간 정치한 다음 10,000 g에서 20분간 원심분리하였다. 그리고 RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 같은 양의 isopropanol과 혼합한 다음 -20℃에서 30분간 둔 다음 10,000 g에서 20분간 원심분리하였다. 침전물을 변성완충액 500 ㎕로 녹인 다음, 같은 양의 isopropanol과 혼합하여 -20℃에서 30분간 둔 다음 10,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 침전물을 75% 에탄올과 원심분리로 3회 세척한 다음, 100 ㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관하였다.

2) 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)

다음으로, 전기 실시예 2의 1)에서 얻어진 total RNA를 주형으로 하여, RT-PCR을 실험하였다. RT-PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.

역전사는 5배 역전사완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl₂, 150 mM KCl, 5 mM dithiothreithol, pH 8.5) 4 ㎕, AMV reverse transcriptase 2.5 U, 10 mM dNTP 2 ㎕, RNase inhibitor 10 U, downstream primer 25 pmole, 그리고 total RNA 2 ㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20 ㎕로 만들어, 42℃에서 30분간 역전사 반 응을 실시하고 95℃에서 2분간 처리한 다음 4℃로 냉각시켰다.

PCR은 역전사반응액 20 ㎕에 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂, 500 mM KCl, pH 8.3) 8 ㎕, upstream 프라이머 25 pmole, Taq DNA polymerase 2.5 U를 넣고 증류수로 첨가하여 100 ㎕ 반응액으로 만들었다.

PCR은 반응액을 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 90초을 35회 실시하였다.

PCR 산물은 1% agarose gel에서 분석하였다. 분석한 결과는 도 2에 첨부하였다. 도에서 M은 100bp 단위의 DNA 마커, 레인 1 내지 레인 5는 각각 PLRV (Potato leafroll virus, 감자잎말림바이러스), PVM (Potato virus M, 감자M바이러스), PVY (Potato virus Y, 감자Y바이러스), PVS (Potato virus S, 감자S바이러스), PVX (Potato virus X, 감자X바이러스), 레인 6은 Healthy check(건전 대조구)를 나타낸다.

도 2에서 알 수 있듯이, 감자잎말림바이러스(PLRV), 감자S바이러스(PVS), 감자Y바이러스(PVY), 감자X바이러스(PVX)에서는 특이적 반응을 일으키지 않아서 밴드로 나타나지 않는다. 반면에 감자M바이러스(PVM)에만 유일하게 특이적 반응을 일으켜서 밴드로 나타난다. 이와 같은 실험결과로 보아, 본 발명에 의한 상기 프라이머 세트에 의해 감자M바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음이 명백히 확인되었다.

감자M바이러스 진단용 특이 프라이머를 사용한 RT-PCR 진단은 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계가 높다. 따라서 조직배양 묘나 양액재배와 같은 작은 양의 시료에서도 진단이 가능하다. 그리고 다른 감자의 주요 바이러스와 비특이적 반응이 나타나지 않아 정밀하게 감자M바이러스를 진단할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific Primers for detection of Potato virus M <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for detecting PVM <400> 1 gagtatggga gattcaacga agaa 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for detecting PVM <400> 2 ggttacgtcc ttcattttct attag 25

Claims (6)

1. 삭제
2. PVMCP5(서열 1)과 PVMCP3(서열 2)으로 이루어진 감자M바이러스 진단을 위한 프라이머 세트.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 2 항에 의한 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 감자M바이러스 진단용 PCR키트.
6. 삭제

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