JP5656210B2 - マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 - Google Patents
マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5656210B2 JP5656210B2 JP2009196861A JP2009196861A JP5656210B2 JP 5656210 B2 JP5656210 B2 JP 5656210B2 JP 2009196861 A JP2009196861 A JP 2009196861A JP 2009196861 A JP2009196861 A JP 2009196861A JP 5656210 B2 JP5656210 B2 JP 5656210B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- combination
- ahs1250
- ahs0740
- microsatellite
- ahs1023
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 title claims description 162
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 title claims description 100
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 title claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 235000003276 Apios tuberosa Nutrition 0.000 title claims description 19
- 235000010744 Arachis villosulicarpa Nutrition 0.000 title claims description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 89
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 80
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 62
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 62
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 claims description 26
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 13
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 28
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001253 polyvinylpolypyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
別の例では、「ナカテユタカ」と「Jenkins Jumbo」が掛け合わされ育種された「らっかせい関東102号」は、「おおまさり」として登録申請されていたが、超大粒、良食味、多収であり優良品種として認められ、「らっかせい農林15号」として登録されている。
また、特許文献1には、前記南米産品種の識別に用いられるマイクロサテライトマーカーの中に、日本国産ラッカセイ品種の識別に用いられる可能性があることが示唆されている。
一方で、本発明において、日本国産ラッカセイ品種において、品種間だけでなく系統間や個体間でもマイクロサテライトの遺伝子多型が多数生じていることが明らかになり、明確で簡便に該品種を識別するためには、系統間やその個体群の遺伝子多型を考慮しなければならないことも予想される。
また、非特許文献1〜5においても、多系統や個体差を考慮して、前記南米産品種識別用のマイクロサテライトとして決定されていない。
上記のように、明確且つ簡便なラッカセイ品種識別方法、特に、国産品種の品種識別方法の確立は大きな課題となっていた。本発明は、これらの課題に鑑みてなされたものである。
(1)配列番号1〜7で表される各塩基配列からなるマイクロサテライトマーカーからなる群より選んだ1つ以上のマイクロサテライトマーカーを用いて、1つ以上の日本国産ラッカセイ品種を識別することを特徴とする、ラッカセイ品種識別方法。
(2)前記日本国産ラッカセイ品種が、ダイチ、サヤカ、ユデラッカ、土の香、郷の香、ふくまさり、千葉半立、ナカテユタカ、Jenkins Jumbo、及びおおまさりからなる群から選んだ1つ以上のラッカセイ品種である、前記(1)の識別方法。
(3)配列番号1〜7のいずれか1つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4)配列番号1〜7のいずれか1つで表される塩基配列からなる、日本国産ラッカセイの品種識別用のマイクロサテライトマーカー。
(5)前記(4)のマイクロサテライトマーカーを増幅することのできる、日本国産ラッカセイの品種識別用のプライマー又はプライマーセット。
(6)前記(5)のプライマーを少なくとも含む、日本国産ラッカセイの品種識別用の試薬キット。
本発明のラッカセイ品種識別方法は、特定のマイクロサテライトマーカーを用いて、日本国産ラッカセイ品種を識別することを特徴としている。
少なくともこれらのうち1つ以上を用いていれば、さらに別のマイクロサテライトマーカーを組み合わせて用いても良い。例えば、前記文献Guohao He, et al., BMC Plant Biology, 3, 3 (2003)において南米産ラッカセイ品種の識別に用い得る可能性が示唆されているマイクロサテライトマーカー等、海外品種においてマーカーとして確立されたものと組合わせれば、国産ラッカセイ主要品種と海外産品種とをさらに明確に識別することができる。また、SNPs(一塩基多型)、RAPD(random amplified polymorphic DNA)等の品種特定に有用であることが明らかな他のDNAマーカーがあれば、それらを組合わせて用いることもできる。ただし、原則として、より少ないマーカーを用いて品種が特定できることが望ましい。
本発明の試薬キットは、上記1.に詳述したラッカセイの品種識別方法に用いられるためのキットであって、目的のマイクロサテライトマーカーに特異的な塩基配列を増幅するための2種類のプライマーを少なくとも含むことを特徴とする。
本発明は、日本国産ラッカセイ主要品種を識別する方法を提供するものである。本発明で初めて同定された新規なマイクロサテライトマーカーにより、個体間での遺伝子多型を有さず、系統間においても多型が少ない、日本国産ラッカセイ主要品種の識別に有効なマイクロサテライトマーカーの存在が明らかとなり、識別方法が確立された。
なお、下記の実施例において、「TE」は一般的なTE緩衝液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA)を示す。また、DNA操作等に関する一般的な技術については、特に記載のない限り、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.(Sambrook, J. et al., 1989)等に記載の公知の手法に従って行うことができる。
新規ラッカセイ品種識別マーカーのスクリーニング
(1)新規ラッカセイEST−マイクロサテライト座位ライブラリーの作製
本発明者らは、公知の方法に従ってラッカセイの地上部由来のESTからマイクロサテライトを抽出し、遺伝子配列を解析した。その情報を元に、それらを含む90〜300bpのPCR断片が得られるようにプライマーを設計した。下記に記載した基準品のDNA抽出に記載の手法を用いて抽出したラッカセイゲノムDNAを鋳型として、設計したプライマーペアを用いてPCRを行い、ラッカセイEST−マイクロサテライト座位ライブラリーを作製した。
上記で作製したライブラリーをポリアクリルアミド電気泳動(分離限界は、約5bp)で分離し、そのパターンから、目視により、(3)に述べる基準品種8品種で増幅断片長が異なっていて、識別に有効であると予想されるマイクロサテライトとして、約100個を選抜した。
次に、上記の1次スクリーニングにて選抜された約100個のマイクロサテライトについて、増幅断片長の詳細な解析を実施する為、各品種8個体(千葉半立、郷の香は28個体、ナカテユタカは56個体)からそれぞれ抽出されたDNAを用いて、前記ポリアクリルアミドゲル電気泳動よりも分離能力がはるかに勝るキャピラリー式電気泳動(1bpの差も検出でき、断片長の測定も可能)を実施して2次スクリーニングを行い、63個のマイクロサテライトを選抜した。
新規ラッカセイ品種識別マーカーの決定
(1)基準品種
以下に対象とした基準品種の詳細について記載する。国産ラッカセイ基準品種としては、これまでに種苗法による品種登録が行われた6品種(ダイチ(らっかせい農林9号)、サヤカ(らっかせい農林10号)、ユデラッカ(らっかせい農林11号)、土の香(らっかせい農林12号)、郷の香(らっかせい農林13号)、ふくまさり(らっかせい農林14号))と、国内での作付けが多いナカテユタカ(らっかせい農林8号)と千葉半立(未登録)を加えた合計8品種である。これらの種子は、千葉県農林総合研究センター育種研究所が保有するものである。さらに、発明者らは、ラッカセイは同一品種内であっても系統間・個体間で遺伝的なばらつきが比較的高い頻度で存在することを明らかにした。そこで、その事実を考慮し、本発明においては、育種研究所で維持されているナカテユタカ(12系統)、郷の香(5系統)、千葉半立(5系統)の合計22系統からそれぞれ4粒ずつDNA抽出を実施し、試験することでラッカセイ品種識別マーカーの安定性を確認した。育種研究所で維持されている系統は、種子として配布され、一般市場に流通するものである。
前記基準品の種子を各8粒(育種研究所の22系統については各4粒)用意し、莢から取り出した種子を、各々70℃で3時間インキュベート後、室温に冷却し種皮を除いた。種皮には、後のPCR工程における酵素反応を阻害する多糖類が多く含まれているため、この時点で除去するのが望ましい。薄皮を取り除いた種子は個体ごとに粉砕し、15mL容量のチューブに入れ、抽出バッファー(10mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA-2Na、0.1% SDS、5mol/L NaCl 30mL/L)を3600μL、5mol/L塩酸グアニジン400μL、20mg/mLプロテイナーゼK 50μLを加えた。これをローテーターで撹拌しながら、55℃で3時間加温した後、3、000rpmで10分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清各800μLを1.5mL容量のマイクロチューブに移し取り、マイクロチューブ遠心機を用いて15,000rpmで3分間遠心分離を行った。
分離後、2mL容量のマイクロチューブに上清各500μLを移し取り、市販の核酸精製キット(Wizard DNA Cleanupsystem:プロメガ社製)を用いてDNAの精製を行った。精製は、全てキットに収載のプロトコールに従って行い、個体ごとにDNA溶液を1.5mLマイクロチューブに得た。
次に、上記(2)において得られた各品種のDNA溶液を用いて、国内品種において多型を示したEST由来のマイクロサテライトの解析を行った。
上記(2)において得られたDNA溶液は、TE(pH8.0)で5ng/μLの濃度になるよう調整し、これより1μをPCRの鋳型DNAとしてPCR反応に用いた。
PCR反応に用いるプライマーとしては、スクリーニング解析にて使用した配列を基本として、後述するキャピラリー式電気泳動、及び、蛍光イメージアナライザーによる解析のために、フォワードプライマーは予め5'末端を蛍光標識して用いた。蛍光標識プライマーとしては、VIC、PET、NED、およびFAMで標識されたものを外注し、リバースプライマーは、Tailed reverseプライマーとした(ABI社製)。
PCR反応の結果得られた増幅産物を次工程に供して解析した。
予め純水100μLを分注した96穴プレートに、上記(2)において得られたPCR増幅産物を2μLずつ加え、50倍希釈とした。Hi-di Formamide(ABI社製)に1/200量の分子量マーカー(500 LIZ Size Standard:ABI社製)を加えた。Hi-di Formamideを検出用96穴プレート(TCll Reaction Plate)に10μLずつ分注し、前記50倍希釈液を1μLずつ加え、蓋をした。混和後、遠心し、95℃で5分加温した後、直ちに氷中に置き10分間冷却した。前記プレートをキャピラリー式電気泳動装置「3730 DNA Analyzer」(ABI社製)にセットして、電気泳動を開始した。解析ソフト「GeneMapper」(ABI社製)を起動して、フラグメント解析機能を使って増幅断片のサイズ(長さ)を測定した。各マーカーごとに、8品種それぞれにおいてどのような増幅断片が得られたかを検出し、長さに基づいてアルファベットのAから順にタイプ分けした(表2)。
上記手法により実施例1のスクリーニングで得られたマイクロサテライトの解析を順次進めた結果、6個のマイクロサテライト多型情報を適切に組み合わせることによって、主要8品種のうち6品種(サヤカとナカテユタカを除く)の識別を行えることがわかった。すなわち、これら6個のマイクロサテライトにおける多型のタイプの組合せが、前記6品種の間で全て異なる組合せとなることが見出されたものである。しかしながら、上記の、選抜された6種類のマイクロサテライトマーカーで識別できなかった2品種は、いずれも比較的栽培面積が多いため、これらを無視することはできない。よって、更なるDNAマーカーの探索が必要であった。
よって、ここで見出された7個のマイクロサテライトマーカーは、AHS0021、AHS0039、AHS0116、AHS0740、AHS1023、AHS1250、及びAhM013であった。なお、ここで選択された7個以外のマイクロサテライトは、前記8種には存在しないと考えられたもの(PCR反応によって増幅産物が得られない)、存在していても前記8種間で多型が見られないもの(各品種において増幅される増幅産物に差がない)、8種間で多型は見られても品種識別には有用でないもの(8種のうちいずれかのものの間では増幅産物の差が見られたものの、組み合わせても8種すべてを特定できない)等であった。
次に、上記で基準品種とした以外のラッカセイ品種に対する識別マーカーの決定を試みた。対象品種は、種苗法が適用されている、おおまさり(らっかせい農林15号)、適用外であるが、国内での作付けが多いJenkins Jumbo(未登録)である。これらの種子は、千葉県農林総合研究センター育種研究所が保有するものである。識別マーカーの決定は、育種研究所で維持されているおおまさり(1系統)、Jenkins Jumbo(1系統)の合計2系統からそれぞれ8粒ずつDNA抽出を実施し、上記の手順に従って行った。
その結果、おおまさり及びJenkins Jumboも上記の決定された7個のマイクロサテライトマーカー(AHS0021、AHS0039、AHS0116、AHS0740、AHS1023、AHS1250、及びAhM013)によって、識別が可能であることがわかった。
ここで得られた結果を、前記10品種における各マーカーの多型の一覧表(表1)、及び、各マーカーにおける多型のタイプ(表2)にまとめた。これらの表を用いることにより、日本国産ラッカセイ主要品種の識別を簡便に行うことができる。
なお、育種研究所のサンプルの解析の結果、千葉半立及びナカテユタカで、AHS1023に関してそれぞれ2種類のタイプを含んでいること、及びJenkins Jumboで、AhM013に関して2種類のタイプを含んでいることが明らかになった。よって、10品種7マイクロサテライトマーカーで得られるタイプは、表1の通り、13タイプになった。
さらに、それぞれの品種を識別することができるマイクロサテライトマーカーの組合せを解析したところ、表3のようになった。さらに、10品種を一度に識別することができるマイクロサテライトマーカーを解析したところ、表4に示すように、AHS0039、AHS0116、AHS0740、AHS1023、AHS1250、AhM013の6種類のマイクロサテライトの組合せが使用できることがわかった。
蛍光イメージアナライザーを用いた増幅断片の解析によるラッカセイ品種識別マーカーの確認
上記実施例2においては、増幅断片の解析にキャピラリー式電気泳動装置と解析ソフトを用いた。そこで、得られた前記7個のマイクロサテライトマーカーについて、ゲル板式電気泳動法と蛍光イメージアナライザーによって電気泳動パターンを検出することにより増幅断片の解析を行い、いずれの方法によっても同じ結果が得られるかどうかを確認した。ゲル板式電気泳動法は、キャピラリー式電気泳動法に比較すると分解能や感度が低いことが知られているが、装置が安価で汎用性が高い点では有用である。
前記7個のマイクロサテライトマーカーには、増幅断片長の差が小さく判定が難しいと考えられる2bp繰返しのマイクロサテライトが複数含まれていたので、ゲルとしては分解能が高いシークエンスゲルを用いた。
マーカーAHS0021(配列番号1)の増幅にはAHS0021 (F)(配列番号8;配列番号1の168〜187)及びAHS0021 (R)(配列番号9;配列番号1の258〜277の相補配列)、
マーカーAHS0039(配列番号2)の増幅にはAHS0039 (F)(配列番号10;配列番号2の1〜22)及びAHS0039 (R)(配列番号11;配列番号2の158〜177の相補配列)、
マーカーAHS0116(配列番号3)の増幅にはAHS0116 (F)(配列番号12;配列番号3の388〜407)及びAHS0116 (R)(配列番号13;配列番号3の502〜521の相補配列)、
マーカーAHS0740(配列番号4)の増幅にはAHS0740 (F)(配列番号14;配列番号4の333〜352)及びAHS0740 (R)(配列番号15;配列番号4の588〜607の相補配列)、
マーカーAHS1023(配列番号5)の増幅にはAHS1023 (F)(配列番号16;配列番号5の14〜33)及びAHS1023 (R)(配列番号17;配列番号5の288〜307の相補配列)、
マーカーAHS1250(配列番号6)の増幅にはAHS1250 (F)(配列番号18;配列番号6の22〜41)及びAHS1250 (R)(配列番号19;配列番号6の287〜306の相補配列)、
マーカーAhM013(配列番号7)の増幅にはAhM013 (F)(配列番号20;配列番号7の4〜24)及びAhM013 (R)(配列番号21;配列番号7の167〜187の相補配列)
を用いた。各フォワードプライマーは、上記実施例2と同様に5'末端を蛍光標識したものを外注した。各マイクロサテライトマーカーと各プライマーセットを、まとめて表5に示す。
電気泳動終了後、蛍光イメージアナライザーFMBIO(日立ソフトウェアエンジニアリング社製)を用いて、反応産物の断片長を解析した。増幅断片長は分子量マーカーに基づいてバンドの位置の差として検出した。
本発明の方法による日本国産ラッカセイの品種識別
本発明の品種識別方法の有用性を確認するため、市販品の食用生ラッカセイを用いて品種識別を行った。
この市販品の食用生ラッカセイには国産ラッカセイが使用されていると考えられたが、どのような品種のラッカセイが使用されているかは記載されていなかった。そこで、上記実施例1で得られた7個のマイクロサテライトマーカー全てについて解析を行うこととした。
上記実施例1と同様にして、前記種子3粒からDNA抽出を行った。
次に、上記実施例1と同様に、PCR反応を行い、前記7個のマイクロサテライトマーカーの増幅断片長をキャピラリー式電気泳動法により解析した。その結果、この商品に用いられているラッカセイは、AHS0021でタイプAの多型を示すことがわかった。また、AHS0039はタイプAC、AHS0116はタイプAB、AHS0740はタイプBC、AHS1023はタイプA、AHS1250はタイプAB、AhM013はタイプAを示すSSR (Simple Sequence Repeat)を有していた。
この結果は、前記表1においてナカテユタカ−1であることを示す多型の組合せと一致し、該食用生ラッカセイに用いられているラッカセイがナカテユカタであることが確認された。
Claims (6)
- 配列番号1〜7で表される各塩基配列からなるマイクロサテライトマーカーからなる群より選んだ1つ以上のマイクロサテライトマーカーを用いて、ダイチ、サヤカ、ユデラッカ、土の香、郷の香、ふくまさり、千葉半立、ナカテユタカ、Jenkins Jumbo、及びおおまさりからなる群から選んだ1つ以上の日本国産ラッカセイ品種を識別する、ラッカセイ品種識別方法。
- 下記(1)〜(10):
(1)マイクロサテライトマーカーAHS0740及びAHS1250及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1023及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS0740及びAHS1250の組み合わせを用いてダイチを識別する、
(2)マイクロサテライトマーカーAHS0116及びAHS0740及びAhM013、又はAHS0740及びAHS1023及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1250及びAhM013の組み合わせを用いてサヤカを識別する、
(3)マイクロサテライトマーカーAHS0021、又はAHS1023、又はAHS0740、又はAHS0039及びAHS0116及びAHS1250の組み合わせを用いてユデラッカを識別する、
(4)マイクロサテライトマーカーAHS0740及びAHS1023及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS1023及びAHS1250の組み合わせを用いて土の香を識別する、
(5)マイクロサテライトマーカーAHS0039及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS0740の組み合わせ、又はAHS0021及びAHS0039及びAHS0116の組み合わせを用いて郷の香を識別する、
(6)マイクロサテライトマーカーAHS0740及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1023の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS0740の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS0116の組み合わせ、又はAHS0021及びAHS0039及びAHS1250の組合せを用いてふくまさりを識別する、
(7)マイクロサテライトマーカーAHS0740及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0116及びAHS1250及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0116及びAHS0740及びAHS1250の組み合わせを用いて千葉半立を識別する、
(7−1)マイクロサテライトマーカーAHS1023及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS1023及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1023の組み合わせを用いて千葉半立のグループ1の系統を識別する、
(7−2)マイクロサテライトマーカーAHS1023及びAHS1250の組み合わせを用いて千葉半立のグループ2の系統を識別する、
(8)マイクロサテライトマーカーAHS1023及びAhM013を用いてナカテユタカを識別する、
(8−1)マイクロサテライトマーカーAHS1023及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1023の組み合わせを用いてナカテユタカのグループ1の系統を識別する、
(9)マイクロサテライトマーカーAHS0039及びAHS0116の組み合わせ、又はAHS0039及びAHS0116及びAhM013の組み合わせを用いてJenkins Jumboを識別する、
(9−1)マイクロサテライトマーカーAHS0116及びAhM013の組み合わせ、又はAHS1023及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0740及びAHS1250及びAhM013の組合せを用いてJenkins Jumboのグループ2の系統を識別する、
(10)マイクロサテライトマーカーAHS0116及びAHS0740及びAHS1250の組み合わせ、又はAHS0116及びAHS1250及びAhM013の組み合わせ、又はAHS0116及びAHS1023及びAHS1250の組み合わせを用いておおまさりを識別する、
からなる群より選択される1またはそれ以上の特徴を有する、請求項1に記載の方法。 - 配列番号1〜7のいずれか1つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号1〜7のいずれか1つで表される塩基配列からなる、日本国産ラッカセイの品種識別用のマイクロサテライトマーカー。
- 請求項4に記載のマイクロサテライトマーカーを増幅することのできる、日本国産ラッカセイの品種識別用のプライマー又はプライマーセット。
- 請求項5に記載のプライマーを少なくとも含む、日本国産ラッカセイの品種識別用の試薬キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009196861A JP5656210B2 (ja) | 2008-08-28 | 2009-08-27 | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008219042 | 2008-08-28 | ||
JP2008219042 | 2008-08-28 | ||
JP2009196861A JP5656210B2 (ja) | 2008-08-28 | 2009-08-27 | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010075176A JP2010075176A (ja) | 2010-04-08 |
JP5656210B2 true JP5656210B2 (ja) | 2015-01-21 |
Family
ID=42206408
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009196861A Active JP5656210B2 (ja) | 2008-08-28 | 2009-08-27 | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5656210B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016002005A (ja) * | 2014-06-13 | 2016-01-12 | 公益財団法人かずさDna研究所 | イチゴ種子のdna粗抽出液を用いたイチゴf1種子の純度検定法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5190596B2 (ja) * | 2005-12-22 | 2013-04-24 | 三菱化学メディエンス株式会社 | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別方法 |
-
2009
- 2009-08-27 JP JP2009196861A patent/JP5656210B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010075176A (ja) | 2010-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114606332A (zh) | 用于判断西瓜果肉硬度的SNP位点、Hf-KASP1标记及其应用 | |
JP2007054020A (ja) | Pb1遺伝子と連鎖する分子マーカーを指標にイネの穂いもち抵抗性を識別する方法 | |
KR100842434B1 (ko) | 인삼에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도 | |
KR102163233B1 (ko) | 양송이 품종 새정, 새아, 설강 구별을 위한 ssr 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
Moniruzzaman et al. | Development of microsatellites: a powerful genetic marker. | |
CN109517921B (zh) | 大麦P3G和C3G合成主效QTL紧密连锁的InDel分子标记及其应用 | |
KR101010446B1 (ko) | 고추 탄저병 균주(Colletotrichum capsici)에 대한 저항성주동유전자 연관 분자표지 개발 및 이의 이용 | |
JP5106743B2 (ja) | マイクロサテライトマーカーを用いるイネ品種の識別法 | |
JP5656210B2 (ja) | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 | |
JP2010094070A (ja) | ブルーベリー品種の識別方法 | |
JP5190596B2 (ja) | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別方法 | |
KR101878539B1 (ko) | 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
JP5849317B2 (ja) | 栄養繁殖作物の品種識別マーカー | |
JP2016002005A (ja) | イチゴ種子のdna粗抽出液を用いたイチゴf1種子の純度検定法 | |
KR20100079527A (ko) | 팥에서 분리된 ssr 프라이머 및 이의 용도 | |
KR100532592B1 (ko) | 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석 기법 | |
JP2022025729A (ja) | カンキツ品種の識別方法 | |
Sujipuli et al. | PCR-based SNP markers for sex identification in date palm (Phoenix dactylifera L.) cv. KL1 | |
JP2010154802A (ja) | キク属植物の種を識別する方法 | |
Thangjam et al. | Detection of genetic diversity in Parkia timoriana (DC.) Merr. using randomly amplified polymorphic DNA analysis | |
KR101892461B1 (ko) | 핵내유전자적 웅성불임성 유전인자인 ms3 판별용 분자마커 및 이를 이용한 검정방법 | |
US9816146B2 (en) | Method for identifying variety of hop | |
KR101480155B1 (ko) | 베치에서 유래한 ssr 프라이머 및 이의 용도 | |
Dangl et al. | A new system for strawberry cultivar identification developed at foundation plant services (FPS), University of California, Davis, using simple sequence repeat (SSR) primers | |
JP4574263B2 (ja) | マイクロサテライトdnaを用いたホップ品種鑑定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120803 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120803 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140507 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141021 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141119 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5656210 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |