KR100532592B1 - 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석 기법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적에 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 돼지의 형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 유전자 검정방법에 관한 것으로, 돼지의 일당증체량이 우수한 돼지, 등지방두께가 얇은 돼지, 등심단면적이 널은 돼지를 선발할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하여 PCR로 증폭한후 Genetic Analyzer에서 결과를 확인하여 돼지의 genotype을 확인하여 형질이 우수한 돼지를 단시간에 선발할 수 있는 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기 선발 분석 기법에 관한 것이다.

Description

일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기 선발 분석 기법 {Detection method of DNA marker associated to average daily gain(ADG), backfat thickness(BFT) , and loin muscle area(LMA) in pig. }

본 발명은 경제형질이 우수한 돼지를 조기에 선발할 수 있는 유전자에 대한 유전자형 확인용 프라이머를 제작하고 이 프라이머를 사용하여 경제형질이 우수한 돼지를 검정하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히 설명하면 본 발명은 microsatellite marker에 대해서 돼지의 대립유전자형이 어떠한지를 확인하게 되므로서 경제형질과의 연관성을 확인할 수 있는 DNA marker 분석 기법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 DNA maker 분석 기법은 PCR에 의해 microsatellite의 일부분을 증폭하게 되고, 증폭해서 나타나는 결과물의 size는 돼지에 따라 다형화현상으로 나타나게 되며 다양한 결과물 중에서 어떤 size를 나타내는 대립유전자형의 경우에 특이적으로 경제형질과 연관성이 있는 경우가 발생하게 되고, 이러한 대립 유전자형의 경제형질과의 연관성은 일당증체량이 우수한 돼지, 등심단면적이 넓은 돼지, 등지방두께가 얇은 돼지를 선발하는데 판단 기준으로 사용 할 수 있다.

외국의 양돈 선진국에서는 분자생물학의 발전에 따라 다양한 접근을 통하여 돼지에서 가장 중요한 경제형질들을 분석할 수 있는 기술의 개발에 초점을 맞추어 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.

이미 형질과의 연관성이 있는 것으로 밝혀진 major gene 으로서 육질과 관계된 HAL과 RN gene이 있고, 성장과 관련된 IGF2와 MC4R, muscling의 중요 요소인 myostatin, 산자수와 관련된 ESR와 RFLR 유전자 등이 있으며 이러한 형질에 큰 영향을 미치는 유전인자를 찾아서 양돈산업에 보급하고자 하는 노력은 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.

전세계적으로 경제형질과의 연관성을 확인하고 경제형질에 영향을 미치는 유전적 요인을 분석할 수 있는 DNA marker의 실용화는 가장 큰 관심거리로서 많은 연구가들에 의해 양돈농가에 보급하고자 노력을 아끼지 않고 있다.

그러나 분자생물학적 접근에 의한 돼지의 전체 Genome scan 분석을 통해 QTL regions을 확인한 연구 결과들이 최근 10여년에 걸쳐 계속적으로 보고되어지고 있으나, 실제 이용된 공시동물의 차이와 실험실간의 차이로 인해 보편적인 연구 결과를 얻기가 상당히 어렵워 이를 실용화하는 단계에서는 많은 어려움이 따르고 있다.

또한 각종 중요한 경제형질은 하나 이상의 유전자의 연관작용에 의해 큰 영향을 미치므로 경제형질에 중요한 major gene을 찾는 것 자체도 상당한 어려움이 따른다.

지금까지의 연구 결과를 보면, 돼지의 염색체 위치별에 따른 경제형질과의 연관성을 확인한 결과들이 많이 보고되어지고 있으며 특히 돼지의 4번 염색체의 60cM - 80cM사이에서 성장과 등지방두께에 대한 연관성이 높음을 확인한 결과가 많이 보고되었다. (Andersson 등 1994, Walling 등 1998), 또한 S0175와 S0107 marker 사이에서 지방과 연관된 결과를 밝히기도 하였다.

또 7번 염색체에서는 40-70cM 위치에서 등지방두께와의 연관성을 확인한 결과가 보고 되어지기도 하였다(Rothschild et al. 1995; Milan et al. 1998; Moser et al. 1998; Rohrer and Keele 1998; Wang et al. 1998; De Koning et al. 1999; Rattink et al. 2000).

그 외에도 1번 염색체의 SW373과 SW1301 사이에서 이유시와 56kg시의 ADG에 대한 중요한 QTL을 확인할 수 있었고(Paszek et al. 1999), 6번 염색체의 SW1881(97-98cM) 부근에서 IMF와 BFT에 대한 연관성을 밝히기도 하였다(Ovilo 등 2000).

외국의 다른 연구결과와의 비교를 통해 본 연구의 결과와 동일한 marker에서 경제형질과의 연관성을 확인한 경우도 있었고, 여기에서 새롭게 화보된 경제형질연관 DNA marker로 있었다.

하지만 기존의 연구결과들도 아직까지 경제형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 microsatellite 분석기법은 없는 것으로 판단되고, 여기에서 새롭게 확보되어지는 경우도 발생하였다.

또한 1개 이상의 marker들간의 조합에 의한 분석도 가능하며 23개 DNA marker는 모두 연구 결과 경제형질 연관 DNA marker로 확인되었고, 형질이 우수한 종돈의 진단 기법으로서 양돈 농가에 보급하여 경제형질이 우수한 돼지의 선발에 이용하고자 한다.

본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여 돼지의 혈액이나 조직으로부터 DNA를 추출한 후, 경제형질 연관 DNA marker를 이용하여 PCR을 행한 후, 각 microsatellite 부위의 특정 염기서열을 증폭하여 Genetic Analyzer에서 genotype 을 확인한다. 어떠한 genotype을 가지는지를 확인하여 경제형질이 우수한 돼지를 조기에 선발하는데 이용하였다.

본 발명은 돼지 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; PCR 프라이머 23개를 제작하는 단계; 특정 염기서열부분을 증폭하기 위해 PCR을 수행하는 단계; Genetic Analyzer에서 유전자형(genotype)을 확인하는 단계로 구성되었다

이하 본 발명을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1] 혈액으로부터 게놈 DNA 추출

돼지로부터 채취한 혈액은 Genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 이용하여 순수 DNA를 추출하였다. 혈액 300㎕ 취하여 1 5㎖ E-tube에 넣고 Cell Lysis solution 900㎕과 혼합하여 10분동안 상온에 방치한다. 원심분리기로 3분간원심분리한 후, 흰색의 침점물이 생기면 붉은 색의 상층액 10-20㎕만 남기고 상층액 부분을 pipette을 이용하여 모두 버린다. 흰색의 침전물과 남은 10-20㎕ 상층액을 vortex를 이용하여 흰색 침전물이 보이지 않을 때까지 완전히 섞어 준다. 그런다음 Nuclei Lysis solution 300㎕을 첨가하여 pipette으로 끈적끈적한 용액이 물처럼 풀어질 때까지 완전히 혼합한다. RNase(10mg/㎖) 3㎕을 첨가하고 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 20분동안 배양한다. 상온에서 5분정도 방치한 후, Protein Precipitaion solution 100㎕을 넣고 용액과 vortex로 잘 혼합해 주면 갈색의 작은 단백질 덩어리들이 보이게 된다. 그런 다음 상온에서 13,000rpm으로 5분동안 원심분리하면 갈색 침전물과 흰색의 투명한 상층액으로 분리되어지고, 여기에서 상층액만을 새 깨끗한 E-tube로 이동한다. 여기에 isopropanol 300㎕을 넣고 E-tube를 아래위로 잘 섞어서 DNA가 엉기도록 한다. 흰색 실타래같은 DNA 가닥을 눈으로 확인할 수 있게 되고, 다시 13,00rpm 이상에서 원심분리하면 흰 DNA 침전물과 상층액(용액+isopropanol)이 분리되고, 상층액부분을 E-tube를 거꾸로 세워 완전히 제거한다. 마지막으로 여기에 70% ethanol을 첨가하여 한두번 조심스럽게 흔들어 주고, 13,000rpm 이상에서 재원심분리하고, E-tube의 ethanol을 완전히 제거한다. 침전된 DNA에 깨끗한 증류수 대략 50㎕을 첨가하여 DNA를 잘 녹여서 냉장 보관한다.

[실시예 2] 프라이머 제작

돼지의 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한지의 여부를 확인할 수 있는 DNA marker는 각 형질별로 11개, 19개, 그리고 9개 였다. 이들 DNA marker는 동일한 marker가 1개 이상의 형질을 분석할 수 있으므로서 중복되는 marker를 제외하고 세 형질을 모두 합하여 총 23개 DNA marker에 대하여 forward 프라이머와 reverse 프라이머를 제작하여 각 DNA marker에 대한 유전자형을 확인하는데 이용하였다. 제작된 각 프라이머에 의한 유전자형은 증폭된 DNA fragment의 size로서 microsatellite의 반복회수의 차이로서 구분되어진다. 23개 프라이머 세트(Forward + Reverse)의 염기서열은 표 1과 같다. 이들에 대해서 foward 프라이머의 5' 말단부위에 형광물질인 6-fam, hex, ned중 한 개를 붙인 프라이머를 합성한다.

[표 1]

프라이머 염기서열

[실시예 3] DNA의 중합효소연쇄반응(PCR) 조건

형질 연관 특이적인 유전자형을 확인하기 위해 실시한 PCR 조건은 표 2에 나타낸 바와 같다.

23개 DNA marker의 프라이머에 따라 PCR 조건은 세 종류의 annealing 온도의 변화가 있어 세 부류로 나누어진 표 2와 같다.

[표 2]

DNA의 중합효소 연쇄반응(PCR)조건

[실시예 4] Genetic Analzyer에 의한 형질 연관 유전자형 확인

혈액에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR한 산물은 Genetic Analyzer에서 형질과 연관된 유전자형을 확인하였다. PCR 산물 15㎕ 중 10㎕을 취하여 95% 에탄올(2.5X) 과 3M 나트륨아세테이트(1/10X)를 첨가하여 ice에 15분동안 꽂아 두었다가 4℃ 초고속원심분리기에서 13,000rpm 이상으로 30분동안 원심분리하였다. 프라이머 합성에 붙여진 형광물질에 따라 색깔있는 침전물과 상층액으로 분리되어지면 이중 상층액부분만을 E-tube을 거꾸로 해서 완전히 제거한다. 그런다음 70% 에탄올 200㎕을 첨가하여 다시 4℃ 원심분리기에서 30분동안 원심분리하여 순수한 DNA 침전물을 얻고, 나머지 상층액은 완전히 제거한다. 완전히 에탄올이 제거되고 dry된 DNA 침전물을 증류수(ddH₂O) 10㎕에 녹여 둔다.

증류수에 녹여진 DNA 중 1㎕을 취하여 formamide 12㎕과 GeneScan Size marker(GS400HD, applied biosystems, USA) 0.5㎕을 함께 섞어준 다음, 95℃에서 5분동안 heating하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시켜 준다음 Genetic Analyzer에 loading으로 결과를 확인한다.

[실험예 1] 일당증체량이 우수한 돼지 선발을 위한 genotype 분석결과

11개 DNA marker를 이용하여 증폭된 DNA의 유전자형으로서 일당증체량이 높은지 낮은지를 확인하였다. 혈액으로부터 gemomic DNA를 분리하고, 11개 프라이머 세트로서 PCR 증폭한 뒤, 에탄올 침전으로 DNA를 순수 분리하고, Genetic Analyzer 에 loading을 할 수 있도록 샘플을 준비하였다. Genetic Analyzer에서 각 marker에 대한 돼지의 genotype을 확인하여 일당증체량이 높은지 낮은지를 분석하였다.

도 4는 혈액의 genomic DNA에 대하여 11쌍의 프라이머를 각각의 튜브에 넣어 PCR 반응시킨 후, Genetic Analyzer에서 분석한 결과이다. 개체가 가지고 있는 microsatellite의 DNA 염기서열이 PCR에 의해 증폭되어진 peak의 크기로서 결과를 확인하게 된다. 11개 marker에 의해 증폭되어진 대립유전자의 크기가 청구항 3에 나타낸 것과 동일한 크기일 때 일당증체량이 우수한 돼지로 확인이 가능하게 된다.

[실험예 2] 등지방두께가 얇은 돼지 선발을 위한 genotype 분석결과

19개 DNA marker를 이용하여 증폭된 DNA의 유전자형으로서 등지방두께가 두꺼울지 얇을지를 미리 확인하였다. 혈액으로부터 gemomic DNA를 분리하고, 19개 프라이머 세트로서 PCR 증폭한 뒤, 에탄올 침전으로 DNA를 순수 분리하고, Genetic Analyzer에 loading을 할 수 있도록 샘플을 준비하였다. Genetic Analyzer에서 각 marker에 대한 돼지의 genotype을 확인하여 등지방두께가 두꺼운지 얇은지를 분석하였다.

도 5는 혈액의 genomic DNA에 대하여 19쌍의 프라이머를 각각의 튜브에 넣어 PCR 반응시킨 후, Genetic Analyzer에서 분석한 결과이다. 개체가 가지고 있는 microsatellite의 DNA 염기서열이 PCR에 의해 증폭되어진 peak의 크기로서 결과를 확인하게 된다. 19개 marker에 의해 증폭되어진 대립유전자의 크기가 청구항 3에 나타낸 것과 동일한 크기일 때 등지방두께가 얇은 돼지로 확인이 가능하게 된다.

[실험예 3] 등심단면적이 넓은 돼지 선발을 위한 genotype 분석결과

9개 DNA marker를 이용하여 증폭된 DNA의 유전자형으로서 등심단면적이 넓을지 적을지를 미리 확인하였다. 혈액으로부터 gemomic DNA를 분리하고, 9개 프라이머 세트로서 PCR 증폭한 뒤, 에탄올 침전으로 DNA를 순수 분리하고, Genetic Analyzer에 loading을 할 수 있도록 샘플을 준비하였다. Genetic Analyzer에서 각 marker에 대한 돼지의 genotype을 화인하여 등심단면적이 큰지 작은지를 분석하였다.

이하에는 혈액의 genomic DNA에 대하여 9쌍의 프라이머를 각각의 튜브에 넣어 PCR 반응시킨 후, Genetic Analyzer에서 분석한 결과이다. 개체가 가지고 있는 microsatellite의 DNA 염기서열이 PCR에 의해 증폭되어진 peak의 크기로서 결과를 확인하게 된다. 9개 marker에 의해 증폭되어진 대립유전자의 크기가 청구항 3에 나타낸 것과 동일한 크기일 때 등심단면적이 큰 돼지로 확인이 가능하게 된다.

본 발명을 구성을 상기 실시예와 실험예를 통하여 예시 하였으나 상기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니며 하기 청구범위에 기재되어 있는 기술 사상의 범위 내에서는 변형이 가능하다.

이상, 상기 실시예와 실험예에서 설명한 바와 같이 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 23개 DNA marker에 대해서 형광물질을 부착한 프라이머를 제작하고 PCR 증폭한 후, Genetic Analyzer에서 유전자형을 확인하므로서 형질이 우수한 돼지의 조기 선발에 이용할 수 있어 양돈육종사업에서 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1a, 1b, 1c, 1d 은 돼지의 microsatellite 유전자의 염기서열이다.

도 2a, 2b, 2c, 2d, 2f, 2g, 2h, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 2n, 2o, 2p, 2q, 2r, 2s, 2t, 2u, 2v,2w, 2x, 2y, 2z, 3a,3b, 3c, 3d, 3f, 3g, 3h, 3i, 3j, 3k, 3l, 3m, 3n, 3o은 혈액과 조직의 DNA를 주형으로 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 한 튜브에서 반응시킨 후 Genetic Analyzer에서 genotype을 확인한 peak의 사진도 이다.

도 4는 1개 이상 marker의 조합으로 분석하는 일당증체량 연관성을 나타낸 도표

도 5는 1개 이상 marker의 조합으로 분석하는 등지방두께 연관성 나타낸 도표

Claims (7)

1. 삭제
2. 돼지로부터 채취된 23개의 forward 프라이머와 reverse 프라이머 세트 시료 중 1개 혹은 1개이상의 조합을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 1단계와; 상기 1단계의 PCR 산물을 Genetic Analyzer에서 확인하여 유전자형을 결정하는 2단계로 돼지의 일당증체량, 등심단면적, 등지방두께의 특징을 분석함에 있어서,

   1개 marker를 이용하여 일당증체량이 우수한 돼지를 선발하되, SW2547 marker가 99bp의 대립유전자를 가질 때, SW497 marker가 107bp의 대립유전자를 가질 때, SWR308 marker가 126bp의 대립유전자를 가질 때, SW256 marker가 96bp의 대립유전자를 가질 때, SW864 marker가 170bp의 대립유전자를 가질 때, S0355 marker가 236bp와 256bp의 대립유전자를 가질 때, S0038 marker가 116bp의 대립유전자를 가질 때, SW1349 marker가 143bp의 대립유전자를 가질 때, S0355 marker가 236bp와 256bp의 대립유전자를 가질 때, S0038 marker가 116bp의 대립유전자를 가질 때, SW1349 marker가 143bp의 대립유전자를 가질 때 일당증체량이 낮으며,

   SWR308 marker가 150bp의 대립유전자를 가질 때, S0102 marker가 129bp의 대립유전자를 가질 때, SW1881 marker가 152bp의 대립유전자를 가질 때, S0291 marker가 153bp의 대립유전자를 가질 때 일당증체량이 높은 것으로 하여 경제형질이 우수한 돼지의 검정이 가능할 수 있도록 함을 특징으로 하는 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석기법.
3. 제 2항에 있어서,

   1개 marker를 이용하여 등지방두께가 얇은 돼지를 선발하되, SWR308 marker가 126bp의 대립유전자를 가질 때, SW2404 marker가 165bp의 대립유전자를 가질 때, S0038 marker가 116bp의 대립유전자를 가질 때, SW353 marker가 145bp의 대립유전자를 가질 때, SW497 marker가 105bp의 대립유전자를 가질 때, S0355 marker가 246bp의 대립유전자를 가질 때, SW373 marker가 160bp의 대립유전자를 가질 때, S0102 marker가 125bp의 대립유전자를 가질 때, SW964 marker가 228bp의 대립유전자를 가질 때, S0019 marker가 203bp의 대립유전자를 가질 때 등지방두께가 얇으며,

   SW2404 marker가 171bp와 141bp의 대립유전자를 가질 때, SW497 marker가 117bp의 대립유전자를 가질 때, SW835 marker가 238bp의 대립유전자를 가질 때, SW2040 marker가 172bp와 148bp의 대립유전자를 가질 때, S0102 marker가 129bp와 195bp의 대립유전자를 가질 때, SW2185 marker가 167bp의 대립유전자를 가질 때, SW919 marker가 95bp의 대립유전자를 가질 때, SW210 marker가 216bp의 대립유전자를 가질 때, SW256 marker가 100bp의 대립유전자를 가질 때, SW1881 marker가 170bp의 대립유전자를 가질 때, S0291 marker가 163bp의 대립유전자를 가질 때, SW1632 marker가 197bp의 대립유전자를 가질 때 등지방두께가 두꺼운 것으로 하여 경제형질이 우수한 돼지의 검정이 가능할 수 있도록 함을 특징으로 하는 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석기법.
4. 제 2항에 있어서,

   1개 marker를 이용하여 등심단면적이 넓은 돼지를 선발하되, SW373 marker가 158bp의 대립유전자를 가질 때, SW2404 marker가 167bp의 대립유전자를 가질 때, SW835 marker가 222bp의 대립유전자를 가질 때, SW1349 marker가 125bp의 대립유전자를 가질 때 등심단면적이 작으며,

   SW373 marker가 156bp의 대립유전자를 가질 때, SW2404 marker가 161bp의 대립유전자를 가질 때, SW353 marker가 141bp의 대립유전자를 가질 때, SW1349 marker가 139bp의 대립유전자를 가질 때, S0102 marker가 125bp의 대립유전자를 가질 때, S0291 marker가 155bp의 대립유전자를 가질 때 등심단면적이 큰 것으로 하여 경제형질이 우수한 돼지의 검정이 가능할 수 있도록 함을 특징으로 하는 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석기법.
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