KR100794881B1

KR100794881B1 - 돼지 등지방 및 도체지방 선발에 활용 가능한 PIK3C3 유전자 유래 DNA marker의 개발

Info

Publication number: KR100794881B1
Application number: KR1020050011580A
Authority: KR
Inventors: 전진태; 김재환; 임현태; 서보영; 이상호
Original assignee: 전진태
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2008-01-14
Also published as: KR20060090133A

Abstract

본 발명은 돼지의 육질과 연관된 경제형질들과 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 형질이 우수한 돼지를 조기에 선발할 수 있는 유전자 검정방법에 관한 것이다.

이를 위하여 본 발명은, 돼지 PIK3C3 (phosphoinositide-3-kinase, class 3) 유전자의 염기서열 및 유전자 내 exon 24에서 염기다형 부위를 새롭게 발견하였고, 이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작한 후 PCR-RFLP 분석을 실시한 결과 나타나는 유전자형과 한국재래돼지와 렌드레이스 두 품종의 교잡으로부터 생산된 F₂ 개체들과의 유의성 검정 결과, 등지방 및 도체지방과 유의성을 보이는 대립유전자형을 발견하였으며, 이는 보다 쉽고 유의적이며 경제적인 돼지의 육질 검사방법, 특히 낮은 등지방 및 도체지방을 나타낼 수 있는 돼지를 조기에 검사할 수 있는 방법이다.

돼지, DNA marker, PIK3C3 유전자, PCR-RFLP, 등지방, 도체지방, 대립유전자

Description

돼지 등지방 및 도체지방 선발에 활용 가능한 PIK3C3 유전자 유래 DNA marker의 개발{Development of DNA markers derived from PIK3C3 gene available for the selection of backfat and carcass fat in pigs}

도 1은 본 발명에서 발견된 돼지 PIK3C3 유전자의 CDS 내에서 발견된 5개 염기변이의 위치를 보여주고 있다.

도 2는 상기 도 1에서 보여지는 돼지 PIK3C3 유전자의 염기변이 중 exon 24번에서 나타나는 염기변이로서, C 염기와 T 염기를 나타내는 피크가 겹쳐있는 것을 확인할 수 있다.

도 3은 상기 도 2의 염기변이를 포함하는 PCR 산물을 Hpy8I 제한효소로 절단한 후 실시한 전기영동 결과이다.

본 발명은 낮은 등지방과 도체지방을 나타내는 돼지를 조기에 선발 ·분석하는 방법에 관한 것으로서, 돼지의 혈액으로부터 추출된 DNA를 사용하여 PIK3C3 (phosphoinositide-3-kinase, class 3) 유전자의 exon 24번에서 나타나는 염기다형성의 유전자형을 PCR-RFLP 기법을 통해 분석하여 시간적, 경제적으로 손쉽게 낮은 등지방과 도체지방을 나타낼 수 있는 돼지를 조기 분석 ·선발할 수 있도록 한 방법에 관한 것이다.

돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로서, 각각의 시대 상황 및 사람들의 기호에 맞게 사육되어져 왔으며, 최근 들어 낮은 등지방과 높은 성장률 및 근내지방을 나타내는 돼지의 선택적 사육이 이루어지고 있다. 그러나 등지방와 근내지방은 유전적으로 정의 관계를 갖기 때문에, 근내지방이 높거나 혹은 근내지방과는 독립적으로 등지방을 낮출 수 있는 유전자의 발견 및 분자적 marker가 절실히 요구되는 것이 현 실정이다.

또한 돼지의 경우 거의 30주령까지 사육 후 도체되어 육질판정이 이루어지기 때문에 이 기간동안 투입되는 시간적, 경제적 손실이 크므로 매우 비효율적인 생산 시스템에 의해서 돼지의 육종이 이루어지고 있는 실정이다. 이에 따라 우수한 육질을 나타내는 비육돈의 조기 판별을 위한 방법이 요구되고 있다.

최근 들어 분자생물학이 발달함에 따라 이와 연관된 고도의 기법들을 이용해서 염색체 상의 위치 및 기능에 초점을 맞추어 다양한 경제형질들과 연관된 유전자들을 분석하고 있는 실정이다. 또한 PCR에 의한 microsatellite 유전자형의 분석과 육질 및 육량과 연관된 경제형질들과의 연관성을 밝히는 연구 역시 활발히 진행되고 있다.

지금까지 보고에 따르면, 돼지 6번 염색체가 등지방, 근내지방과 연관성이 높으며 (De Koning, D.J. et al., Genetics 152:1679-1690, 2000; Ovilo, C. et al., Genet. Sel. Evol. 34:465-479, 2002), 6번 염색체 내 SW1823과 S0003 marker 사이에 등지방 및 근내지방에 영향을 줄 수 있는 유전자가 존재할 가능성이 높다고 보고하였다 (Grindflex, E.J. et al., Mamm. Genome.12:299-304, 2001). 현재 등지방과 근내지방에 영향을 미치는 유전자로는 HFABP(heart-fatty acid binding protein)가 보고되어 있으며, 이 유전자는 돼지 6번 염색체의 SW1823과 S0003 marker 사이에 위치하고 있다.

PIK3C3 단백질은 간, 근육, 지방 등 전형적인 인슐린 연관 세포에서 포도당 합성 및 이동, 항-지방분해 등 체내 에너지 대사를 조절하여 포유류의 발생 및 인슐린의 대사활성과 관련된 세포성 기능을 담당하고 있다 (Czech & Corvera, J. Biol. Chem. 274:1865-1868, 1999; Shepherd. P.R. et al, Biochem. J. 333:471-490, 1998). 이런 유전자의 기능들은 돼지 PIK3C3 유전자가 등지방과 근내지방에 영향을 줄 수 있는 중요한 후보유전자의 가능성을 제시해준다.

따라서 본 발명의 목적은 도체 후 육안으로 육질을 판별하는 기존의 시간적, 경제적으로 비효율적인 방법에서 벗어나 등지방 및 근내지방과 연관성 높은 돼지 6번 염색체 내에 위치하고 있는 PIK3C3 유전자의 유전자형 및 형질과의 연관성 분석을 통하여 낮은 등지방 및 도체지방을 나타내는 돼지를 조기에 판별할 수 있는 분자유전학적인 기법을 통한 DNA marker의 개발에 있다.

등지방두께와 근내지방도에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있는 돼지 6번 염색체내 S0228과 SW1881 marker 사이에 위치하는 PIK3C3 유전자에서 발견된 DNA 다형성과 한국재래돼지와 Landrace와의 교잡에 의해 생산된 F₂ 303두와의 유의성 검정 결과 등지방 및 도체지방과 높은 유의성을 보이는 대립유전자형을 발견함으로서, 낮은 등지방 및 도체지방을 나타내는 사육돼지의 조기선발을 위한 분자적 marker의 개발을 목적으로 한다.

본 발명은 한국재래돼지와 렌드레이스의 근육조직으로부터 total RNA분리 및 cDNA를 합성하는 단계; PIK3C3 유전자의 서열을 분석하기 위한 primer 제작 및 증폭하는 단계; 두 품종간의 염기서열을 분석하여 품종 간 염기변이를 확인하는 단계; 한국재래돼지와 렌드레이스의 교잡으로 생산된 F₂ 145두의 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 염기변이에 따른 유전자형을 분석하기 위한 프라이머를 제작하고 증폭한 후 PCR-RFLP 기법으로 분석하는 단계; F₂ 145두 각각에서 분석된 경제형질들과 염기변이와의 연관성 분석 단계로 구성된다.

제1단계. 근육조직으로부터 total RNA 분리 및 cDNA 합성

액체질소를 사용하여 마쇄된 한국재래돼지와 렌드레이스의 근육조직 각각 100 mg과 Trizol Reagent (Gibco BRL, USA) 1 ㎖를 혼합하고 chloroform 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 상온에서 3분 동안 방치하였다. 원심분리 후 상징액만을 회수하고 이소프로판올과 70% 에탄올을 순차적으로 처리한 후 상온에서 수분을 증발시켰다. 튜브 바닥에 있는 total RNA는 RNase가 포함되어 있지 않은 증류수를 첨가하였다. cDNA 합성은 SmartTM Race cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)를 이용하여 1 ㎕의 total RNA를 첨가하여 수행하였다.

제2단계. PIK3C3 유전자의 서열분석을 위한 primer제작 및 증폭

돼지 PIK3C3 유전자의 전체 CDS 서열을 증폭하기 위해서 GenBank database의 사람 (GenBank accession no ; NM_002647)과 마우스 (GenBank accession no ; NM_181414)의 mRNA 서열을 이용하여 서열번호 2와 3에 기재된 개시코돈이 포함된 forward primer (5'-ATG GGG GAA GCA GAG AAG TTT CAC TAC ATC-3')와 종결코돈이 포함된 reverse primer (5'-AGA TTA CAA TGT TCT CTT CCT TGC TCG TTA GTC-3')를 제작하였다. 상기 준비된 한국재래돼지와 렌드레이스로부터 합성된 cDNA를 사용한 PCR 반응에서 Taq polymerase 1.5 unit (TaKaRa, Japan), 10×buffer 2.5 ㎕, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 10 pmol primer 각각 1.5 ㎕, genomic DNA 2 ㎕ 그리고 증류수 13.7 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕로 반응하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃에서 90초를 1 cycle로 하여 35회 반복하였으며 72℃에서 5분간 신장시킨 후 4℃에서 종료하였다. 모든 반응은 Applied Biosystems 3700 DNA sequencer (PE Applied Biosystems, USA)에서 수행하였고, 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 반응유무를 확인하였다.

제3단계. 염기서열 분석 및 염기변이 확인

PCR product는 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)를 사용해서 ligation을 실시한 후 Top 10 F' competent cell 내부로 형질전환시켰다. Plasmid 추출은 Minipreps DNA Purification System (Promega, USA)를 이용하였으며, DNA sequencing은 Applied Biosystems 3700 DNA sequencer (PE Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. 결정된 한국재래돼지와 렌드레이스의 염기서열은 Clustal x version 1.83 (Thompson 등, 1997)을 이용하여 다중비교하여 염기변이 위치를 확인 하였다. 염기서열 분석 결과 도 1에서 보는 바와 같이 5개의 염기변이가 발견되었다.

제4단계. F₂ 145두의 혈액으로부터 DNA를 추출

한국재래돼지와 렌드레이스 두 품종의 교잡으로부터 생산된 F₂ 145두로부터 혈액을 채취하여 EDTA가 처리된 튜브에 넣어서 응고되지 않도록 잘 섞어준 후 약 300 ㎕를 이용하여 Genomic DNA 추출 키트 (Promega, USA)로 DNA를 추출하였으며, 4℃에 보관하였다.

제5단계. 프라이머 제작 및 PCR-RFLP 분석

상기 제3단계에서 발견된 염기변이에 대한 F₂ 개체들의 유전자형을 PCR-RFLP 기법에 의해 분석하기 위해서 서열번호 4와 5에 기재된 forward primer (5'-ATT TCG TCT AGA CCT GTC CG-3')와 reverse primer (5'-CTA CCA CCG CAG CAA ACA GAG C-3')를 제작하였다. PCR 반응은 Taq polymerase 1.5 unit (TaKaRa, Japan), 10×buffer 2.5 ㎕, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 10 pmol primer 각각 1.5 ㎕, genomic DNA 2 ㎕ 그리고 증류수 13.7 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕를 반응하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 신장시킨 후 4℃에서 종료하였다. 제한효소 Hpy8I로 절단하기 위하여 5 ㎕의 PCR 산물에 2.5 unit의 제한효소, 0.1배의 10× 완충액 및 3차 증류수를 첨가하여 총 10 ㎕ 반응액이 되도록 한 후 37℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 그 후 10% polyacrylamide gel을 제작하여 150V에서 1시간 동안 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인한 결과 도 3에서 보는 바와 같이 3개의 유전자형 (TT, TC, CC)이 관찰되었다.

제6단계. 염기변이와 경제형질들과의 연관성 분석

도 3에서 제시된 3개의 유전자형에 대한 대립유전자와 생장형질 및 지방관련 형질들과의 연관성은 두 모델을 사용하여 분석하였다.

첫째, F₂ 145두 각각의 대립유전자와 경제형질들과의 연관성 분석으로서, 모델식은 다음과 같다.

Null model

Mean = μ + s

Variances = V_e + V_g + V_a

Full model

Means = μ + s + x

Variances = V_e + V_g + V_a

둘째, F₂ 145두의 가계간·가계내 연관성 분석으로서, 모델식은 다음과 같다.

Null model

Mean = μ + s + b

Variances = V_e + V_g + V_a

Full model

Means = μ + s + b + w

Variances = V_e + V_g + V_a

여기서 μ는 전체 평균, s는 성 효과의 평균, x는 대립유전자형 효과의 평균, b는 가계간 효과의 평균 그리고 w는 가계내 효과의 평균을 나타내며, V_e는 환경 분산 성분, V_g는 다형유전 분산 성분 그리고 V_a는 상가적 유전 분산 성분을 의미한다.

상기 모델의 필요 요인들을 모두 포함하는 추정치에 대한 통계적 유의성은 likelihood방법을 이용하였으며, 다음의 식을 이용하여 QTDT 프로그램을 사용하여 분석하였다.

2[ln (L1) - ln (L0)]

여기서 L0는 null mode1의 likelihood 그리고 L1,은 full model의 likelihood 값을 나타낸다.

[표 1] F₂ 145두 각각의 대립유전자와 경제형질들과의 연관성 분석 결과

[표 2] F₂ 145두의 혈통간 ·혈통내 대립유전자와 경제형질과의 연관성 분석

표 1에서 보는 바와 같이 F₂ 145두 각각의 대립유전자와 경제형질들과의 연관성 분석 결과, 30주령의 체중 (5%) 및 도체지방 (1%)과 유의성을 보였으며, 등지방두께(0.5%)와는 고도의 유의성을 보였다. 또한 표 2에서 보는 바와 같이 F₂ 145두의 혈통간·혈통내 대립유전자와 경제형질과의 연관성 분석 결과, 도체지방과 등지방에서 5%의 유의성을 보였으며, 30주령의 체중과는 유의차를 보이지 않았다. 결국 두 통계분석법을 이용한 경제형질과의 연관성분석에서 C 대립유전자형이 도체지방 및 등지방과 신뢰적 유의차를 보였으며, 이런 결과는 T 대립유전자형이 낮은 도체지방 및 등지방을 나타내는 돼지의 조기선발을 위한 유전적 DNA marker로써 효과적이라고 보인다.

이상의 실시 예를 통하여 명백한 바와 같이, 돼지 PIK3C3 (phosphoinositide-3-kinase, class 3) 유전자의 exon 24번에서 등지방 및 도체지방과 높은 유의성을 보이는 대립유전자형을 발견하였으며, 이로 인하여 본 발명은 도체시 육안으로 육질을 판별하는 기존의 방법과는 다르게 돼지의 주요 형질, 특히 낮은 등지방 및 도체지방을 나타내는 돼지를 조기에 선발하기 위한 DNA marker로써 효과가 있으며, 축산업상 유용한 발명일 것이다.

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서열번호 4와 5에 기재된 프라이머를 사용하여 돼지 혈액으로부터 추출된 DNA를 증폭하고 이를 제한효소 Hpy8I으로 절단하여 서열번호 1에 기재된 돼지 PIK3C3 유전자의 cDNA 서열 중 2677번째 염기가 Y (C 혹은T)로 확인된 염기변이에 의해 나타나는 유전자형의 양상을 파악함으로서 낮은 등지방 및 도체지방의 조기예측을 특징으로 하는 검사방법