KR20090069898A - 넙치 미세위성마커를 이용한 개체식별 및 친자확인 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 넙치 각 개체의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 8개의 넙치 미세위성마커(microsatellite marker)를 동시에 증폭할 수 있는 조성물을 이용한 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용한 개체식별 방법 및 친자확인 방법은 8개의 넙치 미세위성마커의 유전자형을 동시에 분석함으로써 분석 시간을 단축하고 비용의 절감하게 할 수 있다.
넙치, 미세위성마커, 다중증폭중합효소연쇄반응, 개체식별, 친자확인
Description
본 발명은 넙치 각 개체의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 8개의 넙치 미세위성마커(microsatellite marker)를 동시에 증폭할 수 있는 조성물을 이용한 개체식별 및 친자확인 방법에 관한 것이다.
1. 넙치 유전자형 분석
넙치(Paralichthys olivaceus)는 우리나라 총 어류 양식생산량의 절반 정도를 차지하는 주요 양식어종으로 2006년에 약 43,852톤의 생산량, 생산 금액으로는 약 4,589억원(해양수산부, 어업생산통계, 2006)에 이르는 우리나라 양식 산업의 근간이지만, 최근 생산성 하락으로 양식 어가가 많은 어려움에 처해 있다. 이러한 양식 생산성 하락은 사료비, 인건비 등 생산단가 상승의 외적 요인뿐 아니라 성장률 저하, 질병 저항성의 약화, 기형 발생률 증가, 생존률 감소 등 양식 넙치 품종 자체의 문제점이 원인으로 지적된다. 이러한 내적 요인은 현재 양식 중인 넙치의 유전적인 조성과 밀접하게 관련되어 있어 우리나라 양식산 넙치 집단의 유전자형 분석과 이를 바탕으로 유전적 열성화를 극복할 수 있는 품종개량이 시급하다.
최근 발전하고 있는 분자생물학적인 방법들을 이용하여 넙치의 분자유전학적인 연구에 많은 발전이 이루어졌으며, 특히 게놈 내의 특정 염기서열의 유전자 마커(genetic marker)는 각 개체의 유전적 특성으로 구분되어 집단분석, 개체식별 및 친자확인 등에 응용이 가능하며 궁극적으로 집단 및 개체의 유전적 조성을 고려한 품종개량에 응용될 수 있다.
2. 미세위성마커
미세위성마커(microsatellite)는 게놈 내 DNA 염기 서열 중에서 2~5개의 염기가 특징적으로 반복되는 부위로, 반복 정도에 따라 다양한 대립유전자가 존재하며, 멘델의 유전법칙에 따라 부모에서 자손으로 유전되므로 염색체 지도 작성의 표지로 이용되거나(Maria RM et al., Aquaculture 220:203-218, 2003), 집단 및 개체의 유전적 특성을 규정짓거나(Sekino M & Hara M, Mar Biotechnol 3:572-589, 2001), 친자확인(Hara M & Sekino M, Aquaculture 217:107-114, 2003)등의 유전자형 분석에 많이 이용된다. 이들 미세위성마커 특정 부위는 이를 포함하는 위, 아래쪽 염기서열의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭이 가능하다.
3. 다중증폭 중합효소 연쇄반응
다중증폭 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)은 두 개 이상의 유전자내 지역을 각각의 프라이머를 이용하여 한 번의 반응에서 동시에 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 한 번의 중합효소 연쇄반응을 통해 DNA 상의 여러 지역을 동시에 증폭시킬 수 있어 기존의 개별적인 중합효소 연쇄반응에 비해 시간 및 비용에서 매우 경제적일 뿐 아니라 개체의 유전자형 분석 등에 매우 효율적인 방법이다. 다중증폭 중합효소 연쇄반응은 일반적인 중합효소 연쇄반응과 다소 차이가 있어서, 동시에 반응되는 각 프라이머의 특성 및 농도를 비롯하여 첨가되는 각 시약들의 농도와 양 그리고 중합효소 연쇄반응 조건 등 여러 요인들이 상호로 민감하게 반응하며 결과에 영향을 미친다(Henegariu O et al., Biotechniques 23:504-511).
이에 본 발명자들은 동시에 8개의 넙치 미세위성마커를 분석할 수 있는 프라이머 조합과 최적의 다중증폭 반응조건을 확립함으로써 넙치의 미세위성마커 대립유전자의 유전자형을 이용한 넙치 집단의 유전학적 분석, 개체 식별 및 친자확인이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 DNA 다형성을 갖는 미세위성마커를 동시에 여러 개 분석이 가능한 프라이머 조합의 개발 및 최적의 다중증폭 반응조건을 확립함으로써 넙치의 개체 식별 및 친자확인 등 유전학적 개체인식이 가능하게 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 감별하고자 하는 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 DNA 시료를 상기 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및
3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 넙치 개체 식별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 감별하고자 하는 어류와 상기 어류의 부모 세대 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 DNA 시료를 상기 조성물을 이용하여 각각 증폭하는 단계;
3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 각각 분석하는 단계; 및
4) 단계 3)의 부모 세대 어류의 밴드 패턴과 감별하고자 하는 어류의 밴드 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 친자확인 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 어류의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서 열번호 9 및 10을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다.
이미 알려진 넙치의 미세위성마커 정보(Kim WJ et al., Mol Ecol Notes 3:491-493, 2003; Sekino M & Hara M, Mol Ecol 9:2155-2234, 2000; Coimbra MRM et al., Fisheries Sci 67:358-360, 2001; http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 바탕으로 대립유전자의 수, 반응 산물의 크기, 증폭반응 온도 등을 고려하여 서열번호 1 내지 8의 K1 내지 K8의 미세위성마커를 선정하였다(표 1 참조). 상기 마커를 증폭 할 수 있는 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22 및 서열번호 23 및 24로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍을 디자인하였다(표 2 참조).
상기 프라이머 쌍의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 형광물질로 표지 될 수 있다. 상기 형광물질은 이에 한정되는 것은 아니나, 6-FAM, HEX, NED, ROX 및 JOE등이 포함될 수 있다. 상기 조성물에서 형광물질을 여러 가지로 사용하고 상기 조성물을 이용한 증폭 산물의 크기를 다르게 조합함으로써 서열번호 1 내지 8로 기재되는 넙치 미세위성마커 각각이 특이적으로 증폭되었는지 확인할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9 및 10으로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 1로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 78 내지 138 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 6-FAM 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 11 및 12로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 2로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 136 내지 180 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 11으로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 6-FAM 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 13 및 14로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 3으 로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 192 내지 242 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 13으로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 6-FAM 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 15 및 16으로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 4로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 78 내지 162 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 15로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 HEX 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 17 및 18로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 5로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 163 내지 235 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 HEX 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 19 및 20으로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 6으로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 107 내지 125 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 NED 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 21 및 22로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 7로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로 써 125 내지 169 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 21로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 NED 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다. 서열번호 23 및 24로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍은 서열번호 8로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭함으로써 178 내지 212 bp의 증폭 산물을 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 서열번호 23으로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 NED 형광물질로 표지함으로써 증폭 산물의 크기 및 형광물질의 색상으로 여타 증폭 산물과 구별될 수 있도록 하였다.
상기 프라이머 쌍은 각각 최종 농도 0.1 내지 0.2 μM으로 상기 조성물에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 동결 건조된 상태로 보존될 수 있고, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 수용액 상태로 안정하게 보존하기 위한 완충용액을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 1 내지 8의 넙치 미세위성마커를 증폭할 수 있는 각각 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22 및 서열번호 23 및 24로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍을 디자인하였고, 상기 프라이머 쌍을 하나의 반응액에 혼합하여 동시에 PCR을 수행할 경우 증폭 산물의 크기가 중복되므로 이를 구분하기 위해 본 발명의 바람직한 실시예에서는 정방향 프라이머에 6-FAM, HEX 또는 NED의 형광물질을 표지하였다(표 2 및 도 1 참조). 상기 조성물을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭 여부 및 정도를 1.5% 아가로스 겔상에서 확인한 결과 넙치 어미 및 새끼들 모든 개체에서 각 마커가 동시에 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 2 참조). 이때 넙치 어미 개체의 DNA는 TNES-Urea 완충용액을 이용한 페놀 추출법으로, 새끼 넙치의 DNA는 킬렉스법으로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였으며, 두 경우 모두 양호한 증폭 결과를 나타내었다. 그러나 아가로스 겔의 해상도로는 8개 마커가 동시에 증폭되었을 경우 적게는 8개에서 많게는 16개의 대립유전자 모두를 크기별로 구분할 수 없으므로, 상기 PCR 증폭 산물을 유전자형 분석기(ABI 3100 Genetic analyzer, 미국)를 이용하여 분석한 결과, 넙치의 8개 미세위성마커의 유전자형을 동시에 얻을 수 있었다(도 3 참조). 이 경우 각 피크들로 표시되는 미세위성마커의 대립유전자들은 8개 마커의 크기가 중첩되어 보이게 되나, 각기 달리 표지된 형광염료로써 구분될 수 있다. 푸른색으로 나타나는 피크는 6-FAM으로 형광표지 된 K1, K2, K3 마커를 나타내며, 녹색 피크는 HEX로 표지된 K4, K5 마커를 그리고 검은색 피크는 NED로 표지된 K6, K7, K8 마커를 나타낸다. 또한 붉은색 피크로 나타나는 크기 표준(size standard)인 Genescan 400 HD ROX(ABI, 미국)를 이용하여 각 대립유전자들의 크기(bp)를 알 수 있었다.
또한, 본 발명은
1) 감별하고자 하는 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 DNA 시료를 상기 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및
3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 넙치 개체 식별 방법을 제공한다.
단계 1)에서 DNA 시료는 어류의 지느러미로부터 추출할 수 있으며, 상기 어류는 바람직하게는 넙치일 수 있다.
단계 2)의 증폭 반응은 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램에 따라 수행될 수 있다. PCR 반응은 초기변성, 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 35 내지 45회 반복, 최종 신장 및 쿨링의 프로그램에 따라 이루어질 수 있다. 상기 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램은 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 1차 및 2차로 나누어 수행하는 것을 특징으로 하고, 1차 싸이클의 어닐링 온도보다 2차 싸이클의 어닐링 온도가 낮은 것을 특징으로 하며, 1차 싸이클 보다 2차 싸이클의 반복 횟수가 많은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 1차 싸이클의 어닐링 온도를 60℃, 반복 횟수 20회 및 2차 싸이클의 어닐링 온도를 55℃, 반복 횟수 25회로 하는 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램에 따라 본 발명의 조성물을 이용하여 우리나라 자연산 넙치 및 양식산 넙치 집단의 부모 세대를 대상으로 다중증폭 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 서열번호 1 내지 8로 기재되는 넙치 미세위성마커 각각에 대해 10 내지 39개의 대립유전자 수를 확인하였고, 0.710에서 0.920의 높은 기대치 이형접합률을 확인할 수 있었다(표 3 참조). 이때 각 마커들의 다양한 대립유전자 수는 본 발명의 마커 조합이 유전자 다양성 분석에 매우 유용한 조합임을 나타낸다고 할 수 있다. 또한 분석된 넙치 집단 중 두 개의 대립유전자가 서로 다른 이형접합 개체(heterozygote)의 비율로 계산되어지는 관찰치 이형접합률에 비해 높은 기대치 이형접합률을 보이는 것은 이들 넙치 집단 내에서 무작위적인 교배가 지속되며 집 단이 유지될 경우에 예상되어지는 이형접합 개체의 비율이 현재보다 더 많아질 수 있다는 것으로써 이것은 대립유전자의 수뿐만 아니라 각 대립유전자의 빈도까지도 계산되어지는 결과이므로 결국 우리나라 넙치 집단은 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 마커 조합으로 분석 하였을 때 많은 대립유전자를 갖으며, 각 대립유전자의 빈도도 양호한 집단으로 유전적 다양성이 매우 높다는 것을 의미한다. 또한 상기 부모 세대 넙치 뿐 아니라 자손 세대 넙치를 대상으로 10,000여 마리 이상 유전자형 분석을 수행한 결과에서 각 개체간 동일한 유전자형을 갖는 개체는 발견되지 않았는데, 이와 같은 다양성은 이론적으로 각각의 마커들의 대립유전자들이 모두 같은 경우로 계산할 경우, 동일한 유전자형이 나올 확률이 1 / 8.3ㅧ1010 이하로 계산되어지므로, 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 마커 조합은 유전자형 분석의 비교로 넙치 개체식별이 가능함을 보여준다(도 4 참조).
또한, 본 발명은
1) 감별하고자 하는 어류와 상기 어류의 부모 세대 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 DNA 시료를 상기 조성물을 이용하여 각각 증폭하는 단계;
3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 각각 분석하는 단계; 및
4) 단계 3)의 부모 세대 어류의 밴드 패턴과 감별하고자 하는 어류의 밴드 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 친자확인 방법을 제공한다.
본 발명의 넙치 미세위성마커는 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전됨으로 자손의 유전자형과 부모 집단의 유전자형을 비교하여 친자 확인이 가능할 수 있다. 이에 본 발명의 바람직한 실시예에서는 부모 세대 및 자손 세대 넙치를 대상으로 본 발명의 조성물을 이용하여 다중증폭 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석함으로써 자손 세대의 부모 확인을 수행하였다(도 5 참조). 자손 넙치의 수를 늘려가며 3회에 걸쳐 부모 확인 과정을 수행한 결과, 99.9%의 개체별 유전자형 분석률과 96.7%의 개체의 부모를 확인할 수 있었다(표 4).
즉, 본 발명에 의한 서열번호 1 내지 8의 마커 조합 및 다중증폭 반응조건이 넙치 유전자형 프로파일 분석에 의한 개체 식별 및 친자확인에 매우 경제적이고 효율적으로 사용될 수 있고, 특정 어미 집단에 의해 생산된 자손들의 친자확인이 가능함에 따라 우수한 넙치 품종의 개발, 브랜드화 및 보호를 위한 생산자 확인 및 추적시스템의 구축 등에 활용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 어류의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭반응 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 아울러, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트는 더 나아가 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, HEX, NED, ROX 또는 JOE 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 조성물과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용한 개체식별 방법 및 친자확인 방법은 8개의 넙치 미세위성마커의 유전자형을 동시에 분석함으로써 분석 시간을 단축하고 비용의 절감하게 할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 넙치 게놈 DNA의 추출
<1-1> 장기 보관용 DNA 추출
넙치 게놈 DNA 추출을 위해 가슴지느러미 조직 일부를 절취하였다. 지느러미 조직은 절취 후 재생이 용이하도록 가능한 극조 부위를 제외한 연조부위를 1 ㎝ 정도 절취하여 TNES-Urea 완충용액(10 mM Tris-Cl; pH 7.5, 125 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 6 M Urea,) 600㎕에 넣고, 단백질 분해효소 K(proteinase K)를 최종농도 100 ㎍/㎖로 처리하여 37℃에서 밤새 용해한 후, 동량의 페놀/클로로포름/이 소프로판올 넣고 흔들어 섞은 다음 12,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층을 수거하기를 2회 반복하여 세포 파쇄물 및 단백질 등을 제거하여 DNA를 정제하였다. 이후 수거된 DNA 용액의 2배 분량의 100% 에탄올을 넣어 12,000 rpm에서 30초간의 원심분리로 침전물을 수거하였고 70% 에탄올로 여분의 염을 수세한 후 TE(10 mM Tris-Cl; pH 8.0, 1 mM EDTA) 완충용액에 용해하여 냉장보관하며 분석에 이용하였다
<1-2> 단기 보관용 DNA 추출
DNA 추출 후 장기 보관이 필요 없는 경우는 시간 절약 및 비용면에서 경제적인 킬레이팅 수지법(chelating resin method; Walsh PS et al., Biotechniques 10:506-518, 1991; Suenaga E & Nakamura H, J Chromatography B 820:137-141, 2005)을 변형한 방법을 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 넙치의 가슴지느러미 조직을 메스를 이용하여 0.1 ㎎ 이하로 잘라 5% 킬렉스 100(Bio-Rad, 미국) 200 ㎕와 단백질 분해효소 K가 최종 농도 100 ㎍/㎖로 포함된 용액에 넣고 42℃에서 15분, 50℃에서 15분간 배양하였다. 이어 100℃에서 5분간 끓인 후, 교반(vortexing)함으로써 세포를 파괴시켜 DNA를 수용액 내로 노출하였다. 이때 상기 추출액에 포함된 세포내 효소 및 세포 파쇄물들을 킬렉스 레진(Bio-Rad, 미국)에 흡착하게 되며, 상기 킬렉스 레진을 포함하는 추출액을 6,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 침전시킨 후 상층액을 취하여 DNA를 수득하였다.
<실시예 2> 프라이머 제작
<2-1> 미세위성마커 선정
이미 알려진 넙치의 미세위성마커 정보(Kim WJ et al., Mol Ecol Notes 3:491-493, 2003; Sekino M & Hara M,Mol Ecol 9:2155-2234, 2000; Coimbra MRM et al., Fisheries Sci 67:358-360, 2001; http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 바탕으로 대립유전자의 수, 반응 산물의 크기, 증폭반응 온도 등을 고려하여 미세위성마커를 선정하였다.
그 결과, K1 내지 K8의 마커를 선정하였고, 선정된 마커의 특성은 표 1과 같다.
| 좌위 (Locus) | 서열번호 | 반복서열(Repeat motif) | 반복되는 중심크기 (Size range of repeat motifs; bp) | Genbank accession no. |
| K1 | 1 | (CA)6CG(CA)14 | 42 | AY328958 |
| K2 | 2 | (CT)14AT(CT)4 | 38 | AY328977 |
| K3 | 3 | (TC)24 | 48 | AY328973 |
| K4 | 4 | (CT)5CA(CT)14 | 40 | AY328982 |
| K5 | 5 | (GT)5AT(GT)5AA(GA)4TT(GA)3AA(GA)5TT(GA)6GTAA(GA)3GT(GA)18 | 114 | AY328981 |
| K6 | 6 | (GACA)2(CA)10 | 28 | AY328959 |
| K7 | 7 | (CT)6CA(CT)14(GT)6 | 54 | AY328976 |
| K8 | 8 | (AC)5AA(CA)17AT(AC)2TC(TG)2TTT(TG)9 | 79 | AY328965 |
<2-2>
프라이머
제작
실시예 2-1의 방법으로 선정된 마커 K1 내지 K8의 증폭을 위한 프라이머 쌍을 각각 서열번호 9 내지 24로 표 2와 같이 결정하였다. 상기 프라이머 쌍을 이용하여 상기 마커들을 증폭할 경우, 그 생성물의 크기가 중복되므로 이를 구분하기 위해 상기 프라이머 쌍의 생합성 과정 동안 정방향 프라이머에 6-FAM, HEX 또는 NED의 형광물질이 표지 되도록 하였다(표 2 및 도 1).
| 마커 | 서열번호 | 프라이머 서열(5'→3') | 형광표지 | 어닐링 온도(℃) | 생성물의 크기(bp) |
| K1 | 9 | F: GCG ACT CTC AAA AAT CCG TCA G | 6-FAM | 65 | 78-138 |
| 10 | R: GGA CTT TGT GGG GTT TCA GGA | - | |||
| K2 | 11 | F: GTG TAT GTG TTT CGT TTC CTG C | 6-FAM | 62 | 136-180 |
| 12 | R: TGA AGG CTG TTG TTG CTG TAG | - | |||
| K3 | 13 | F: GAA GGA TCT GGA CTC ATG GTG AC | 6-FAM | 67 | 192-242 |
| 14 | R: CAG CAG CAA AGG CAG AAA GAG | - | |||
| K4 | 15 | F: TCC TTC ACA CTA ATG GAG TCC A | HEX | 60 | 78-162 |
| 16 | R: GTG TCC GAA AGG AAA ACT AGG | - | |||
| K5 | 17 | F: ACA GTA AAA CAG TCC CTC CTG AAC | HEX | 60 | 163-235 |
| 18 | R: AGG AGT CTG GAA CCA AAT GTC TG | - | |||
| K6 | 19 | F: AGA GGA TAT CGA GGG GAG G | NED | 65 | 107-125 |
| 20 | R: CAG CAG TAG CCG ATC TTA GTG | - | |||
| K7 | 21 | F: TTG AAA CTG GAT GCC TCA C | NED | 60 | 125-169 |
| 22 | R: TCT CAC GTT TCC ATG TCA G | - | |||
| K8 | 23 | F: ATC AGG AAC GGG AGA GAC TC | NED | 63 | 178-212 |
| 24 | R: GAG TTC GTC CTT CGT CTT CA | - |
<실시예 3> 유전자형 분석
<3-1> 다중증폭 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)
우선, 실시예 1의 방법으로 넙치 가슴지느러미 조직으로부터 수득한 DNA를 주형 DNA로 하고, 5 ㎕의 주형 DNA(50 ng), 1.5 ㎕의 10ㅧ 반응완충용액(Slogent, 한국), 1.5 ㎕의 5ㅧ Band Doctor(Slogent, 한국), 0.3 ㎕의 10 mM dNTP(Slogent, 한국), 0.3 ㎕의 f-Taq(Slogent, 한국), 및 최종농도 0.1 내지 0.2 μM의 서열번호 9 내지 서열번호 24의 프라이머 쌍이 혼합된 프라이머 세트로 총 15 ㎕의 반응액을 수득하였다. 이때 동시에 혼합되는 프라이머 세트의 농도는 자세하게는 서열번호 1의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.10 μM, 서열번호 2의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.13 μM, 서열번호 3의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.10 μM, 서열번호 4의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.13 μM, 서열번호 5의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.20 μM, 서열번호 6의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.10 μM, 서열번호 7의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.20 μM, 서열번호 8의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 각각 최종농도 0.20 μM로 사용할 경우 최적의 증폭 정도를 나타내었다. 상기의 총 15 ㎕의 PCR 반응용액을 잘 섞은 후, 95℃, 10분; 95℃ 20초, 60℃ 40초, 72℃ 1분, 20회; 95℃ 20초, 55℃ 40초, 72℃ 1분, 25회; 72℃ 10분의 조건으로 Dyad PCR 기기(Bio-Rad, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였고 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 TNES-Urea 완충용액을 이용한 페놀 추출법으로 수득한 넙치 어미의 DNA를 주형으로 PCR 반응을 수행한 한 경우와 킬렉스를 이용하여 수득한 넙치 자손들의 DNA를 주형으로 PCR 반응을 수행한 경우 모두 모든 개체에서 각 마커가 동시에 양호하게 증폭되었음을 확인 할 수 있었다.
<3-2> 유전자형 분석
실시예 3-1의 방법으로 수득한 PCR 반응 산물은 유전자형 분석을 위한 희석배율을 결정하기 위해 무작위로 추출한 4개의 시료에 대해 10배, 30배, 50배, 80배의 비율로 희석하여 그 중 1 ㎕와 크기 표준(size standard)인 GeneScan 400HD ROX(ABI, 미국) 0.2 ㎕, 그리고 HiDi formamide(ABI, 미국) 10 ㎕를 섞어 유전자형 분석기(3100 genetic analyzer; ABI, 미국)로 분석 피크의 강도가 4000 rfu 정도를 보이는 희석 농도를 확인하고 나머지 시료에 대해 확인된 비율로 적정 희석하여 상기의 방법으로 유전자형을 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 동시에 넙치의 8개 미세위성마커의 유전자형을 얻을 수 있었다. 이 경우 각 피크들로 표시되는 미세위성마커의 대립유전자들은 8개의 마커가 크기가 중첩되어 보이게 되었나, 각기 달리 표지된 형광염료로써 구분될 수 있었다(도 3a). 푸른색으로 나타나는 피크는 6-FAM으로 형광표지 된 K1, K2, K3 마커를 나타내며, 녹색 피크는 HEX로 표지된 K4, K5 마커를 그리고 검은색 피크는 NED로 표지된 K6, K7, K8 마커를 나타내었다. 또한 붉은색 피크로 나타나는 크기 표준인 Genescan 400 HD ROX(ABI, 미국)를 이용하여 각 대립유전자들의 크기(bp)를 알 수 있었다(도 3b).
<실시예 4> 개체식별
<4-1> 부모집단의 유전자형 분석
우리나라 자연산 넙치 389마리 및 양식산 넙치 집단 735마리로부터 실시예 1의 방법으로 DNA를 수득하였다. 상기 DNA를 주형 DNA로 하여 실시예 3의 방법으로 유전자형을 분석하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 각 마커에 대해 10 내지 39개의 대립유전자 수가 확인되었으며, 관찰치 이형접합률은 0.677에서 0.902의 높은 이형접합률 수치를 확인할 수 있었다. 또한 분석된 넙치 집단 중 두개의 대립유전자가 서로 다른 이형접합 개체(heterozygote)의 비율로 계산되어지는 관찰치 이형접합률에 비해 0.710에서 0.920의 높은 기대치 이형접합률 수치를 나타내었다.
| Locus | K1 | K2 | K3 | K4 | K5 | K6 | K7 | K8 | 평균 |
| 분석 마리 수 (No. of fishes) | 1124 | 1124 | 1124 | 1124 | 1123 | 1122 | 1102 | 1036 | 1124 |
| 대립유전자 수 (No. of Alleles) | 30 | 22 | 26 | 39 | 30 | 10 | 23 | 18 | 24.75 |
| 대립유전자 크기 범위 (Allele size range; bp) | 78-138 | 136-180 | 192-242 | 78-162 | 163-235 | 107-125 | 125-169 | 178-212 | - |
| 관찰치 이형접합률, Ho (Observed heterozygosity) | 0.853 | 0.890 | 0.881 | 0.880 | 0.902 | 0.677 | 0.844 | 0.788 | 0.839 |
| 기대치 이형접합률, He (Expected heterozygosity) | 0.876 | 0.910 | 0.907 | 0.893 | 0.920 | 0.710 | 0.872 | 0.850 | 0.867 |
| PIC* | 0.865 | 0.903 | 0.900 | 0.884 | 0.914 | 0.656 | 0.861 | 0.835 | 0.852 |
* Polymorphism information content(Botstein D et al ., American J Human Genetics 32:314-331, 1980)
<4-2> 자손집단의 유전자형 분석
실시예 4-1의 자연산 및 양식산 넙치 집단의 자손 집단 10,000여 마리의 유전자형의 분석 및 유전자형의 차이 정도를 비교하였다.
구체적으로, 상기 총 1124마리 중 자연산 넙치 210 마리 및 양식산 넙치 366 마리를 어미 집단으로 하여 이로부터 인공수정으로 생산된 자손 집단 중 무작위적으로 선발된 10,000여 마리로부터 실시예 1의 방법으로 DNA를 수득하였다. 상기 DNA를 주형 DNA로 하여 실시예 3의 방법으로 유전자형을 분석하였다.
또한 유전자형 비교는 MSA(Microsatellite Analyzer; Dieringer, D & Schlㆆtterer, C, Mol Ecol Notes 3:167-169, 2002) 프로그램을 이용하여 각 개체간의 유전자형의 기초로 유전적 거리를 분석할 수 있는 Nei's standard genetic distance(Nei, M., Genetics 89:538-590, 1978) matrix로 분석하였다.
이때 동일한 유전자형의 경우를 0으로 하여 유전자형이 모두 다를 경우 1까지의 수치로 나타나는 개체간의 유전적 거리를 확인한 결과 각 개체간 동일한 유전자형을 갖는 개체는 발견되지 않았다(도 4 참조). 이와 같은 다양성은 이론적으로 각각의 마커들의 대립유전자들이 모두 같을 경우로 계산할 경우, 동일한 유전자형이 나올 확률이 1 / 8.3ㅧ1010 이하로 계산되어 지므로, 본 발명의 서열번호 1 내지 8의 마커 조합은 유전자형 분석의 비교로 넙치 개체식별이 가능함을 보여준다.
<실시예 5> 친자확인
실시예 4의 결과에서 개체마다 고유한 유전자형 프로파일은 개체식별뿐 아니라 이들 마커가 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전됨으로 부모 집단의 유전자형과 비교하여 친자 확인이 가능성을 나타낸다.
넙치 암컷 221마리, 수컷 200마리의 부모로부터 생산된 자손 넙치 244 마리를 대상으로 유전자형 분석 및 부모 확인을 수행하였다. 이후, 자손 넙치의 수를 늘려 802마리를 대상으로 2차 분석을 수행하였고, 자손 넙치의 수를 더욱 늘려 4300마리를 대상으로 3차 분석을 수행하였다.
상기 자손 넙치로부터 실시예 1-2의 방법으로 DNA를 수득하였다. 상기 DNA를 주형 DNA로 하여 실시예 3의 방법으로 유전자형을 분석하였다. 상기 분석 결과를 토대로 자손의 마커별 대립유전자형에 해당하는 부모 개체만을 순차적으로 찾아감으로써 최종으로 부모 개체를 확인하는 친자 분석을 수행하였다(도 5 참조).
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 99.9%의 개체별 유전자형 분석률과 96.7%의 개체의 부모를 확인할 수 있었다.
| 1차 분석 | 2차 분석 | 3차 분석 | 계 | |
| 분석 마리수 | 244 | 803 | 4300 | 5347 |
| Genotyping (%) | 244(100) | 802(99.9) | 4300(100) | 5346(99.9) |
| 가계확인 (%) | 244(100) | 757(94.4) | 4168(96.9) | 5169(96.7) |
도 1은 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸 도이다.
도 2는 서열번호 9 내지 24로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 다중증폭 반응조건에 의해 서열번호 1 내지 8의 마커를 동시에 증폭한 결과를 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 결과를 나타낸 도이다. 이때 넙치 어미 개체의 DNA는 페놀 추출법으로, 새끼 넙치의 DNA는 킬렉스법으로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다(M: 1Kb ladder; 레인 1∼12: 넙치 어미 개체 #1∼12; 레인 13∼24 넙치 새끼 개체 #1∼12).
도 3은 넙치의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 미세위성 마커의 대립유전자를 나타낸 도이다:
a: 넙치 개체 3마리의 유전자형 분석결과의 예로 8개의 마커가 동시에 중첩되어 피크로 나타남[푸른색 피크: 6-FAM으로 형광표지 된 K1, K2, K3 마커; 녹색 피크: HEX로 표지된 K4, K5 마커; 검은색 피크: NED로 표지된 K6, K7, K8 마커; 붉은색 피크: 크기 표준인 Genescan 400 HD ROX(ABI, 미국); 피크 위쪽의 숫자: 각 유전자들의 크기(bp)]; 및,
B: 넙치 개체 1마리의 유전자형 분석결과(피크 위쪽의 회색막대: 각 마커의 이름 및 크기 범위).
도 4는 넙치 각 개체간의 유전적 거리를 나타낸 도이다. 각 개체의 유전자형이 동일할 경우를 0으로 하여 유전자형이 모두 다를 경우 1까지의 수치로 유전적 거리를 나타낸다. 동일한 개체의 경우에만 대각선으로 보이는 0으로 나타난다.
도 5는 자손의 유전자형을 부모 집단의 유전자형과 비교하여 친부모를 확인하는 과정을 나타낸 도이다.
<110> National Fisheries Research and Development Institute
<120> Method for identification and parentage using microsatellite
marker in Olive flounder
<130> 7P-10-68
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K1
<400> 1
cacacacaca cacgcacaca cacacacaca cacacacaca ca 42
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K2
<400> 2
ctctctctct ctctctctct ctctctctat ctctctct 38
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3
<400> 3
tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctc 48
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K4
<400> 4
ctctctctct cactctctct ctctctctct ctctctctct 40
<210> 5
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K5
<400> 5
gtgtgtgtgt atgtgtgtgt gtaagagaga gattgagaga aagagagaga gattgagaga 60
gagagagtaa gagagagtga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaga 114
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K6
<400> 6
gacagacaca cacacacaca cacacaca 28
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K7
<400> 7
ctctctctct ctcactctct ctctctctct ctctctctct ctgtgtgtgt gtgt 54
<210> 8
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K8
<400> 8
acacacacac aacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaatac actctgtgtt 60
ttgtgtgtgt gtgtgtgtg 79
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K1 forward primer
<400> 9
gcgactctca aaaatccgtc ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K1 reverse primer
<400> 10
ggactttgtg gggtttcagg a 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K2 forward primer
<400> 11
gtgtatgtgt ttcgtttcct gc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K2 reverse primer
<400> 12
tgaaggctgt tgttgctgta g 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3 forward primer
<400> 13
gaaggatctg gactcatggt gac 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3 reverse primer
<400> 14
cagcagcaaa ggcagaaaga g 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K4 forward primer
<400> 15
tccttcacac taatggagtc ca 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K4 reverse primer
<400> 16
gtgtccgaaa ggaaaactag g 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K5 forward primer
<400> 17
acagtaaaac agtccctcct gaac 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K5 reverse primer
<400> 18
aggagtctgg aaccaaatgt ctg 23
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K6 forward primer
<400> 19
agaggatatc gaggggagg 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K6 reverse primer
<400> 20
cagcagtagc cgatcttagt g 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K7 forward primer
<400> 21
ttgaaactgg atgcctcac 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K7 reverse primer
<400> 22
tctcacgttt ccatgtcag 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K8 forward primer
<400> 23
atcaggaacg ggagagactc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K8 reverse primer
<400> 24
gagttcgtcc ttcgtcttca 20
Claims (12)
- 서열번호 1의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 2의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 11 및 12를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 3의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 13 및 14를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 4의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 5의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 17 및 18을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 6의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 19 및 20을 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 7의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍, 서열번호 8의 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 23 및 24를 각각 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 넙치 미세위성마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 프라이머 쌍의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드가 형광 물질로 표지 된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2항에 있어서, 형광물질은 6-FAM, HEX, NED, ROX 및 JOE으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 프라이머 쌍은 각각 최종 농도 0.1 내지 0.2 μM으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 1) 감별하고자 하는 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;2) 단계 1)의 DNA 시료를 제 1항의 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 넙치 개체 식별 방법.
- 제 5항에 있어서, 단계 2)의 증폭 반응은 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 다중증폭 중합효소 연쇄반응 프로그램은 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 1차 및 2차로 나누어 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 1차 싸이클의 어닐링은 2차 싸이클의 어닐링 보다 3 내지 7℃ 높은 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 2차 싸이클의 반복 횟수는 1차 싸이클의 반복 횟수보다 3 내지 7회 많은 것을 특징으로 하는 방법.
- 1) 감별하고자 하는 어류와 상기 어류의 부모 세대 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;2) 단계 1)의 DNA 시료를 제 1항의 조성물을 이용하여 각각 증폭하는 단계;3) 단계 2)의 증폭 산물의 밴드 패턴을 각각 분석하는 단계; 및4) 단계 3)의 부모 세대 어류의 밴드 패턴과 감별하고자 하는 어류의 밴드 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 친자확인 방법.
- 제 1항의 조성물을 포함하는 어류의 개체 식별 및/또는 친자 확인용 키트.
- 제 11항에 있어서, 사전혼합물(premix) 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
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