KR102018798B1

KR102018798B1 - 어류 분류용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법

Info

Publication number: KR102018798B1
Application number: KR1020180113492A
Authority: KR
Inventors: 김현우; 윤태호; 강혜은
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2019-09-05

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 어류 분석용 조성물을 포함하는 어류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석 방법, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스 구축용 제작용 조성물 및 유전자 데이터 베이스 구축 방법에 관한 것이다. 본 발명의 어류 분석 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 어류에 대한 정성적 분석을 경제적이고 신속하게 대량으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 어류상, 어류의 산란장 및 성육장 조사 및 해양 생태계 조사, 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다. 또한 기존의 어류 분석용 유전자 라이브러리를 이용할 수 있을 뿐 아니라, 새로운 어류 분석용 유전자 라이브러리를 구축함으로 좀 더 정확한 어류의 종 동정에 이용된다.

Description

어류 분류용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법{The primer set for identification of fish and methods for their qualitative and quantitative analysis}

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 어류 분석용 조성물을 포함하는 어류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석 방법, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스 제작용 조성물 및 유전자 데이터 베이스 제작 방법에 관한 것이다.

우리나라는 삼면이 바다로 둘러싸여 있으며 다양한 형태의 저류지와 하천이 발달되어 총 1,186종의 자생어류가 서식하고 있다(국립생물자원관, 2011). 특히, 어류는 매우 중요한 단백질 공급원 중의 하나로 이용되고 있으며, 2014년 10월 '나고야 의정서'가 발표됨에 따라 자국 생물자원의 중요성 및 가치가 대두되고 있으며, 이에 따라 해양생명자원의 확보 및 보전에 대한 국가차원의 체계적인 통합관리가 필요하다. 또한, 우리나라의‘해양생태계보전 및 관리에 관한 법률(2007)’에 따르면 원시성을 유지하고 있거나 해양생물 종 다양성이 풍부한 지역 등을 해양보호구역으로 지정하여 조사, 관찰 및 관리하는 기본계획 등을 규정한 바 있다. 수산자원 생물의 관리를 위해서는 우리나라 연근해 전역에 대한 어류 종 조성 및 어종별 산란장 및 산란기 추정에 대한 조사가 필요하다. 또한 해양보호구역과 같은 정책 수립의 일환으로, 산란 및 성육장 파악이 필요하며 이를 위해 과학적인 난, 자치어 종조성 파악이 시급한 실정이다.

대부분의 해산 어류는 연안 가까이 산란하며 부화된 어린 개체들은 언근해에서 성장하기 때문에 생산성 및 생물 종 다양성이 높은 연근해의 과학적인 자원보호와 자원 조성을 위한 연구들이 필요하다. 특히 난, 자치어기는 어류의 초기 생활사 단계에 속하여 종의 번성에 있어 아주 중요한 시기이다. 그러나 우리나라 연근해에서 산란, 부화된 난, 자치어가 성체로의 가입되는 기작 연구나, 아열대성 어종의 국내 유입 및 정착에 대한 연구가 빈약하다. 난, 자치어가 현미경을 통해 종 확인을 하기에 매우 작은 크기이기도 하지만 성어와 달리 성장 단계별로 형태 변화가 아주 크기 때문에 종 확인하는 데에 고도의 전문적인 지식이 필요하다. 과거 형태학적인 분류 특징을 이용한 종 분석이 주로 이루어져 왔으나 최근에는 DNA 마커를 이용한 종 검정이 본격화되고 있다. 분자학적 기법의 발달로 그 중에서도 Sanger sequencing을 이용한 분석법이 많이 시행되고 있으나, 이 분석법은 특정 어류 분류군에 한정되어 모든 어류 분류군에 대한 분석이 어렵다는 단점이 있다.

어류를 분류하기 위해서 과거 형태에 기초한 종동정, 특히 어란이나 자어의 경우 종 동정의 key가 불명확하여 어려움이 많았다. 그러나, 최근 NGS (Next generation sequencing)와 같은 분자동정기법이 개발됨에 따라 그러한 어려움이 상당 해소되었다.

생물학의 발전에 따라 생물 분류 체계에도 변화가 뒤따랐으며, DNA 염기서열을 중심으로 한 분자 형질을 이용하여 생물의 계통을 연구하는 분야를 분자계통학(molecular systematics)라고 하며 이는 전체 생물의 분류체계와 동정법에 큰 변화를 가져왔다. 그 중 DNA 기반 종 분석은 노동 또는 시간 소비 형태분석법과 비교하여 볼 때 유용하고 유망한 도구이다. 어류의 경우 mitochondrial genome 염기서열의 데이터 베이스화가 잘 되어있으며, 그 중 Ribosomal DNA 유전자 영역을 종 분석에 많이 사용한다.

종래에는 기본적으로 모든 시퀀서(sequencer)는 Sanger의 dideoxyribonucleotide analog를 이용한 방식이었는데, 최근 새로운 기법의 시퀀싱 기술이 급속도로 보급되었으며, 그 중 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer)가 개발되었다. 상기 NGS 기술은 종 분석을 위한 바코드의 이용이 가능할 수 있도록, 더 많은 양의 바코드 데이터를 생산할 수 있게 만들어졌다. 현재 NGS 시퀀싱 시스템을 사용한 종 분석은 454 파이로시퀀싱(454 pyrosequencing) 전략에 의해 이루어지고 있다(Roche). 상기 454 파이로시퀀싱 전략은 더 긴 서열을 판독할 수 있지만(700 bp), 유사한 시퀀스 데이터 양을 얻기 위해 상대적으로 고비용이 들며, 현재 454 파이로시퀀싱은 단종이 되어 더 이상 이용할 수 없다는 점 역시도 문제로 대두되고 있다. 최근의 Illumina사의 Hiseq이나 Miseq을 이용한 유전자 분석방법이 나왔으나 454 파이로시퀀싱의 700bp에 비해 상대적으로 짧은 평균적 분석 서열(~ 300 bp) 때문에 바코드 분석에서는 고려되고 있지 않았다. 그러나 Illumina사의 NGS 플랫폼들이 End-paired sequencing이 가능해짐에 따라 최대 (2 x 300 bp)분석 서열의 길이가 늘어났다.

따라서, 개선된 시퀀서 시스템을 적용하여 긴 서열을 분석하는 공정을 통해 생물분류 및 분석, 특히 다양한 어류의 분류 및 분석을 신속하고 경제적으로 수행하기 위한 새로운 방법에 대한 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 차세대 시퀀서(NGS)를 이용하여 어류를 분류하기 위해 연구한 결과, Illumina Miseq sequencer로 분석이 가능한 최적화된 길이(~ 500 bp)의 접합서열 (pair-end contig)를 대량 생산하기 위한 신규한 어류 분류용 범용 프라이머 세트를 디자인하였고 이를 이용하여 증폭된 DNA 서열을 Illumina Miseq sequencer로 분석한 결과, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 어류를 경제적이고 신속하며 대량으로 분류(classification)하며 정성적 분석뿐 아니라 정량적 분석이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 어류 분석용 조성물을 포함하는 어류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석 방법, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스 제작용 조성물 및 유전자 데이터 베이스 제작 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 어류 분석용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 어류의 DNA를 추출하는 단계;(b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계;를 포함하는 어류 분석 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 어류 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 어류의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스 제작용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 어류의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 어류 분석용 유전자 데이터 베이스 제작 방법을 제공한다.

본 발명의 어류 분석 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 어류에 대한 정성적·정량적 분석을 경제적이고 신속하게 대량으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 어류, 어류의 산란장 및 성육장 조사 및 해양 생태계 조사, 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다. 또한 기존의 어류 분석용 유전자 라이브러리를 이용할 수 있을 뿐 아니라, 새로운 어류 분석용 유전자 라이브러리를 구축함으로 좀 더 정확한 어류의 종 동정에 이용된다.

도 1은 어류의 샘플링 영역을 나타낸 도이다.
도 2는 12S와 16S 사이의 ITS 영역중 354-598bp 가변 영역 증폭을 위한 본 발명의 프라이머 영역을 나타낸 도이다.
도 3은 어류 1808종을 대상으로 정방향 및 역방향 프라이머 영역의 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 end-pairing을 이용한 ITS 조립 서열(contiguous sequences)을 모식화한 도이다.
도 5는 본 발명의 어류 분류용 프라이머 세트를 이용하여 어류 분류군을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 어류 분류용 프라이머 세트를 이용하여 분석된 대량 동물 플랑크톤 샘플 대 어류(어류 플랑크톤 - 난자치어(Eggs and Larvae))비율을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용한 어류를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용한 유사 어종의 분포 지역 및 유전자형 분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 어류 종간 유전자 보존 영역을 증폭하여 다양한 어류 유전자를 증폭할 수 있는 부위를 타깃으로 할 수 있으며, 바람직하게는 어류의 분류학적 위치 및 종을 분류하기에 충분한 가변적인 어류의 12S rDNA 및 16S rDNA을 포함한 ITS 조립 서열(contiguous sequences) 영역을 포함하여 증폭할 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물이 차세대 시퀀서(NGS)를 이용하여 어류를 분류하기 위해 최적 크기의 비교 서열을 얻을 수 있도록 서열을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 300bp 내지 600bp의 PCR 산물을 증폭할 수 있다. 300bp 내지 600bp의 유전자를 증폭하는 경우, 기존의 증폭 방법 대비 더 긴 서열의 분석이 가능하여 종 분석의 정확도가 증가될 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 시료 중에 존재하는 다양한 종의 어류의 유전자를 공통적으로 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭될 수 있는 어류 종은 1000 내지 2500종일 수 있으며, 바람직하게는 1500종 내지 2000종 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1808종일 수 있다. 본 발명에 있어 증폭대상 어류는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 하기 표 1에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

*Cyprinus* *carpio*	*Myctophum* *affine*	*Melanocetus* *murrayi*	*Pagrus* *auriga*	*Oncorhynchus* *clarkii henshawi*	*Cranoglanis* *bouderius*
*Petromyzon* *marinus*	*Diaphus* *splendidus*	*Eutaeniophorus* sp *. 033-Miya*	*Notacanthus* *chemnitzii*	*Chirocentrus* *dorab*	*Solea* *senegalensis*
*Protopterus* *dolloi*	Zu *cristatus*	*Monocentris* *japonicus*	*Huso* *huso*	*Jenkinsia* *lamprotaenia*	*Biwia* *zezera*
*Formosania* *lacustris*	*Polymixia* *lowei*	*Ostichthys* *japonicus*	*Carpiodes* *carpio*	*Salanx* *ariakensis*	*Thunnus* *orientalis*
*Polypterus* *ornatipinnis*	*Percopsis* *transmontana*	*Sargocentron* *rubrum*	*Erpetoichthys* *calabaricus*	*Sundasalanx* *mekongensis*	*Galaxiella* *nigrostriata*
*Latimeria* *chalumnae*	*Coelorinchus* *kishinouyei*	*Parazen* *pacificus*	*Saccopharynx* *lavenbergi*	*Scleropages* *formosus*	*Plectropomus* *leopardus*
*Scyliorhinus* *canicula*	*Exocoetus* *volitans*	*Zenion* *japonicum*	*Eurypharynx* *pelecanoides*	*Tetraodon* *nigroviridis*	*Verasper* *moseri*
*Salmo* *salar*	*Scopelogadus* *mizolepis*	*Allocyttus* *niger*	*Katsuwonus* *pelamis*	*Okamejei* *kenojei*	*Oncorhynchus* *nerka*
*Squalus* *acanthias*	*Poromitra* *oscitans*	*Neocyttus* *rhomboidalis*	*Thunnus* *alalunga*	*Oreochromis* *mossambicus*	*Parargyrops* *edita*
*Carassius* *auratus*	*Danacetichthys* *galathenus*	*Indostomus* *paradoxus*	*Auxis* *thazard*	*Cobitis* *sinensis*	*Catostomus* *commersonii*
*Gadus* *morhua*	*Hoplostethus* *japonicus*	*Dactyloptena* *tiltoni*	*Auxis* *rochei*	*Synodus* *variegatus*	*Gobio* *gobio*
*Salvelinus* *fontinalis*	*Antigonia* *capros*	*Scalicus* *amiscus*	*Sebastes* *schlegelii*	*Plesiobatis* *daviesi*	*Tinca* *tinca*
*Salvelinus* *alpinus*	*Mastacembelus* *favus*	*Carangoides* *armatus*	*Acipenser* *dabryanus*	*Melanogrammus* *aeglefinus*	*Cyprinella* *lutrensis*
*Mustelus* *manazo*	*Dactyloptena* *peterseni*	*Caranx* *melampygus*	*Acipenser* *stellatus*	*Merlangius* *merlangus*	*Notemigonus* *crysoleucas*
*Amblyraja* *radiata*	*Helicolenus* *hilgendorfi*	*Emmelichthys* *struhsakeri*	*Elops* *saurus*	*Cypselurus* *hiraii*	*Opsariichthys* *uncirostris*
*Lampetra* *fluviatilis*	*Kareius* *bicoloratus*	*Pterocaesio* *tile*	*Megalops* *atlanticus*	*Lates* *calcarifer*	*Barbus* *barbus*
*Paralichthys* *olivaceus*	*Stephanolepis* *cirrhifer*	*Lycodes* *toyamensis*	*Megalops* *cyprinoides*	*Phractolaemus* *ansorgii*	*Alburnus* *alburnus*
*Sigmops* *gracilis*	*Pagrus* *major*	*Pholis* *crassispina*	*Synaphobranchus* *kaupii*	*Ranzania* *laevis*	*Hypentelium* *nigricans*
*Sardinops* *melanostictus*	*Trachipterus* *trachypterus*	*Salarias* *fasciatus*	*Ophisurus macrorhynchos*	*Cromeria* *occidentalis*	*Xenocypris* *argentea*
*Coregonus* *lavaretus*	*Kryptolebias* *marmoratus*	*Arcos* sp *. KU 149*	*Albula* *glossodonta*	*Denticeps* *clupeoides*	*Gymnocypris* *przewalskii*
*Polymixia* *japonica*	*Lepidosiren* *paradoxa*	*Sufflamen* *fraenatum*	*Aldrovandia* *affinis*	*Grasseichthys* *gabonensis*	*Acheilognathus* *typus*
*Diplophos* *taenia*	*Ictalurus* *punctatus*	*Gadus* *chalcogrammus*	*Elops* *hawaiensis*	*Kneria* sp *. SL-2004*	*Hemibarbus* *barbus*
*Hime* *japonica*	*Takifugu* *rubripes*	*Euthynnus* *alletteratus*	*Pterothrissus* *gissu*	*Parakneria* *cameronensis*	*Rhodeus* *ocellatus kurumeus*
*Trachurus* *japonicus*	*Polyodon* *spathula*	*Esox* *lucius*	*Psephurus* *gladius*	*Rhodeus* *uyekii*	*Pseudorasbora* *pumila*
*Arctoscopus* *japonicus*	*Lophius* *americanus*	*Galaxias* *maculatus*	*Mola* *mola*	*Verasper* *variegatus*	*Pungtungia* *herzi*
*Oncorhynchus* *tshawytscha*	*Oryzias* *latipes*	*Dallia* *pectoralis*	*Masturus* *lanceolatus*	*Cyprinella* *spiloptera*	*Barbus* *trimaculatus*
*Danio* *rerio*	*Gambusia* *affinis*	*Lipolagus* *ochotensis*	*Etheostoma* *radiosum*	*Scomberomorus* *cavalla*	*Aphyocypris* *chinensis*
*Pantodon* *buchholzi*	*Petroscirtes* *breviceps*	*Glossanodon* *semifasciatus*	*Acanthogobius* *hasta*	*Micropterus* *salmoides*	*Chromobotia* *macracanthus*
*Engraulis* *japonicus*	*Lota* *lota*	*Nansenia* *ardesiaca*	*Carassius* *carassius*	*Notropis* *stramineus*	*Cycleptus* *elongatus*
*Osteoglossum* *bicirrhosum*	*Rhyacichthys* *aspro*	*Platytroctes* *apus*	*Chlorurus* *sordidus*	*Lepisosteus* *osseus*	*Gyrinocheilus* *aymonieri*
*Neoceratodus* *forsteri*	*Eleotris* *acanthopoma*	*Salangichthys* *microdon*	*Pangasianodon* *gigas*	*Campostoma* *anomalum*	*Moxostoma* *poecilurum*
*Heterodontus* *francisci*	*Anoplogaster* *cornuta*	*Alepocephalus* *tenebrosus*	*Scomber* *scombrus*	*Gila* *robusta*	*Ischikauia* *steenackeri*
*Chimaera* *monstrosa*	*Cetostoma* *regani*	*Retropinna* *retropinna*	*Myxocyprinus* *asiaticus*	*Phenacobius* *mirabilis*	*Chanodichthys* *mongolicus*
*Monopterus* *albus*	*Aphredoderus* *sayanus*	*Opisthoproctus* *soleatus*	*Anguilla* *anguilla*	*Iberochondrostoma* *lemmingii*	*Labeo* *senegalensis*
*Myripristis* *berndti*	*Beryx* *decadactylus*	*Chanos* *chanos*	*Anguilla* *marmorata*	*Minytrema* *melanops*	*Pethia* *ticto*
*Mugil* *cephalus*	*Melanotaenia* *lacustris*	*Apteronotus* *albifrons*	*Anguilla* *celebesensis*	*Percina* *macrolepida*	*Pseudaspius* *leptocephalus*
*Zeus faber*	*Hypoatherina* *tsurugae*	*Eigenmannia* *sp. CBM-ZF-10620*	*Anguilla* *mossambica*	*Dorosoma* *cepedianum*	*Tribolodon* *nakamurai*
*Chauliodus* *sloani*	*Cottus* *reinii*	*Phenacogrammus* *interruptus*	*Anguilla* *reinhardtii*	*Atractosteus* *spatula*	*Pelecus* *cultratus*
*Elassoma* *evergladei*	*Gymnothorax* *kidako*	*Chalceus macrolepidotus*	*Anguilla* *bicolor bicolor*	*Lophiomus* *setigerus*	*Nipponocypris* *sieboldii*
*Lampris* *guttatus*	*Hypoptychus* *dybowskii*	*Pseudobagrus* *tokiensis*	*Anguilla dieffenbachii*	*Diretmus* *argenteus*	*Gnathopogon* *elongatus*
*Beryx* *splendens*	*Polypterus* *senegalus senegalus*	*Sarcocheilichthys* *variegatus microoculus*	*Anguilla* *australis australis*	*Sirembo* *imberbis*	*Labeo* *batesii*
*Rondeletia* *loricata*	*Scaphirhynchus* *cf. albus*	*Cobitis* *striata*	*Anguilla* *australis schmidti*	*Bregmaceros* *nectabanus*	*Esomus* *metallicus*
*Zenopsis* *nebulosus*	*Carapus* *bermudensis*	*Lefua* *echigonia*	*Anguilla* *megastoma*	*Diretmoides* *veriginae*	*Acantopsis choirorhynchos*
*Cololabis* *saira*	*Bassozetus zenkevitchi*	*Corydoras* *rabauti*	*Anguilla* *obscura*	*Anomalops* *katoptron*	*Barbatula* *toni*
*Ateleopus* *japonicus*	*Cataetyx* *rubrirostris*	*Gonorynchus* *greyi*	*Anguilla* *nebulosa nebulosa*	*Aptocyclus* *ventricosus*	*Pseudohomaloptera* *leonardi*
*Ijimaia* *dofleini*	*Diplacanthopoma* *brachysoma*	*Acipenser* *transmontanus*	*Anguilla* *interioris*	*Trachyrincus* *murrayi*	*Pangio* *anguillaris*
*Chlorophthalmus* *agassizi*	*Physiculus* *japonicus*	*Lepisosteus* *oculatus*	*Anguilla* *malgumora*	*Bathygadus* *antrodes*	*Leptobotia* *mantschurica*
*Harpadon* *microchir*	*Lamprogrammus* *niger*	*Amia* *calva*	*Anguilla* *bengalensis labiata*	*Squalogadus* *modificatus*	*Misgurnus* *nikolskyi*
*Saurida* *undosquamis*	*Chaunax* *abei*	*Thunnus* *thynnus thynnus*	*Carassius* *auratus auratus*	*Ventrifossa* *garmani*	*Schistura* *balteata*
*Neoscopelus* *microchir*	*Chaunax* *tosaensis*	*Hiodon* *alosoides*	*Trachurus* *trachurus*	*Liobagrus* *obesus*	*Vaillantella* *maassi*
*Leptoderma* *lubricum*	*Scomber* *colias*	*Lycengraulis* *grossidens*	*Channa* *argus*	*Labichthys* *carinatus*	*Synodontis* *schoutedeni*
*Leptoderma* *retropinna*	*Scomber* *australasicus*	*Callorhinchus* *callorynchus*	*Labeo* *bata*	*Stemonidium* *hypomelas*	*Auchenoglanis* *occidentalis*
*Narcetes* *stomias*	*Oreochromis* *aureus*	*Callorhinchus* *capensis*	*Paralaubuca* *typus*	*Danio* *dangila*	*Bunocephalus* *coracoideus*
*Talismania* *bifurcata*	*Larimichthys* *polyactis*	*Callorhinchus* *milii*	*Pennahia* *argentata*	*Rasbora* *daniconius*	*Hydrolycus* *scomberoides*
*Alepocephalus* *agassizii*	*Pseudogobio* *esocinus*	*Chimaera* *fulva*	*Nibea* *albiflora*	*Leptobarbus* *hoevenii*	*Siniperca* *scherzeri*
*Alepocephalus* *australis*	*Gila conspersa*	*Hydrolagus* *lemures*	*Anguilla* *japonica*	*Rasbora* *vaterifloris*	*Hemiodopsis* *gracilis*
*Alepocephalus* *bairdii*	*Mylocheilus* *caurinus*	*Harriotta* *raleighana*	*Anguilla* *rostrata*	*Psilorhynchus* *sucatio*	*Hepsetus* *odoe*
*Alepocephalus* *productus*	*Raiamas* *senegalensis*	*Rhinochimaera* *pacifica*	*Latimeria* *menadoensis*	*Barilius* *bendelisis*	*Siniperca* *chuatsi*
*Alepocephalus* *umbriceps*	*Sebastiscus* *marmoratus*	*Collichthys* *lucidus*	*Galaxias* *gollumoides*	*Sewellia* *lineolata*	*Diplomystes nahuelbutaensis*
*Bathytroctes* *breviceps*	*Epinephelus* *bruneus*	*Miichthys* *miiuy*	*Galaxias* sp *. 'southern'*	*Trigonostigma* *espei*	*Heteropneustes* *fossilis*
*Bathytroctes* *macrolepis*	*Clinocottus* *analis*	*Morone* *saxatilis*	*Hypomesus* *nipponensis*	*Cabdio* *morar*	*Malapterurus* *electricus*
*Bajacalifornia* *megalops*	*Hyporthodus* *septemfasciatus*	*Hapalogenys* *nigripinnis*	*Osmerus* *mordax*	*Nicholsicypris* *normalis*	*Apareiodon* *affinis*
*Bathytroctes* *michaelsarsi*	*Hypoplectrus* *gemma*	*Gnathonemus* *petersii*	*Cobitis* *takatsuensis*	*Tanichthys* *albonubes*	*Distichodus* *sexfasciatus*
*Conocara* *macropterum*	*Cheilinus* *undulatus*	*Leiocassis* *longirostris*	*Niwaella* *delicata*	*Yaoshanicus* *arcus*	*Pareutropius* *debauwi*
*Conocara* *murrayi*	*Beryx* *mollis*	*Micropterus* *salmoides salmoides*	*Torquigener hypselogeneion*	*Luciosoma* *bleekeri*	*Pangasius* *larnaudii*
*Pythonichthys* *microphthalmus*	*Rhynchactis* *macrothrix*	*Micropterus* *floridanus*	*Arothron* *hispidus*	*Nannoperca* *australis*	*Pygocentrus* *nattereri*
*Moringua* *microchir*	*Neoceratias* *spinifer*	*Alosa* *sapidissima*	*Canthigaster* *valentini*	*Horadandia* *atukorali*	*Tachysurus* *fulvidraco*
*Simenchelys* *parasitica*	*Haplophryne* *mollis*	*Cottus* *poecilopus*	*Polyspina* *piosae*	*Nannoperca* *obscura*	*Siniperca* *knerii*
*Coloconger* *cadenati*	*Melanocetus* *johnsonii*	*Tachysurus* *nitidus*	*Lagocephalus* *sceleratus*	*Microdevario* *nana*	*Tridentiger* *bifasciatus*
*Kaupichthys* *hyoproroides*	*Himantolophus* *albinares*	*Tachysurus* *vachellii*	*Sphoeroides* *parvus*	*Raiamas* *guttatus*	*Hucho* *bleekeri*
*Nessorhamphus* *ingolfianus*	*Himantolophus* *groenlandicus*	*Silurus* *meridionalis*	*Lagocephalus* *lagocephalus*	*Hemigrammocypris* *rasborella*	*Caulophryne* *pelagica*
*Rhinomuraena* *quaesita*	*Bufoceratias* *thele*	*Gobiobotia* *macrocephala*	*Sphoeroides* *annulatus*	*Salmophasia* *bacaila*	*Lepomis* *macrochirus*
*Derichthys* *serpentinus*	*Diceratias* *pileatus*	*Gobiobotia* *brevibarba*	*Lagocephalus* *laevigatus*	*Macrochirichthys* *macrochirus*	*Oxuderces* *dentatus*
*Anarchias* sp *. Ansp*	*Oneirodes* *thompsoni*	*Microphysogobio* *koreensis*	*Sphoeroides* *testudineus*	*Sarotherodon* *melanotheron*	*Boleophthalmus* *pectinirostris*
*Muraenesox* *bagio*	*Lophiodes* *caulinaris*	*Cynoglossus* *abbreviatus*	*Tetractenos* *glaber*	*Pseudorasbora* *parva*	*Scomberomorus* *niphonius*
*Leptocephalus* *sp. 'type II larva' (Smith, 1989)*	*Sladenia* *gardineri*	*Pungitius* *kaibarae*	*Auriglobus* *modestus*	*Pseudobagrus* *brevicorpus*	*Hucho* *taimen*
*Culter* *alburnus*	*Thaumatichthys* *pagidostomus*	*Pseudopungtungia* *tenuicorpus*	*Omegophora* *armilla*	*Anguilla* *bicolor pacifica*	*Leucoraja* *erinacea*
*Cynoponticus* *ferox*	*Tetrabrachium* *ocellatum*	*Pungitius* *sinensis*	*Carinotetraodon* *lorteti*	*Silurus* *lanzhouensis*	*Lutjanus argentimaculatus*
*Thalassenchelys* sp . *Tht2*	*Cryptopsaras* *couesii*	*Acheilognathus* *somjinensis*	*Marilyna* *darwinii*	*Pleuragramma* *antarctica*	*Sundasalanx* *sp.* *Chao* *Phraya*
*Nemichthys* *scolopaceus*	*Ceratias* *uranoscopus*	*Cottus* *hangiongensis*	*Carinotetraodon* *salivator*	*Notothenia* *coriiceps*	*Glossogobius* *olivaceus*
*Facciolella* *oxyrhyncha*	*Chaunax* *pictus*	*Jenkinsia* sp *. CL54*	*Pelagocephalus* *marki*	*Chaenocephalus* *aceratus*	*Harengula* *jaguana*
*Moringua* *edwardsi*	*Gigantactis* *vanhoeffeni*	*Brachyhypopomus* *occidentalis*	*Rhynchocypris* *lagowskii*	*Tetranematichthys* *quadrifilis*	*Sprattus* *muelleri*
*Hoplunnis* *punctata*	*Coelophrys brevicaudata*	*Heterotis* *niloticus*	*Tetraodon palembangensis*	*Amblydoras* *gonzalezi*	*Hyperlophus* *vittatus*
*Nettastoma* *parviceps*	*Thunnus* *thynnus*	*Hiodon* *tergisus*	*Tylerius spinosissimus*	*Amphilius* *sp. NM-2010*	*Sillago* *sihama*
*Serrivomer* *beanii*	*Thunnus* *obesus*	*Genyomyrus* *donnyi*	*Phoxinus steindachneri*	*Pterygoplichthys* *disjunctivus*	*Sprattus* *antipodum*
*Heteroconger* *hassi*	*Oreochromis* sp *. 'red tilapia'*	*Myomyrus* *macrops*	*Tetraodon* *biocellatus*	*Centromochlus* *perugiae*	*Potamalosa* *richmondia*
*Paraconger* *notialis*	*Thunnus* *albacares*	*Marcusenius* *senegalensis*	*Rhynchocypris* *percnurus*	*Clarias* sp *. NM-2010*	*Odaxothrissa* *losera*
*Myroconger* *compressus*	*Thunnus* *maccoyii*	*Petrocephalus* *soudanensis*	*Tetraodon* *miurus*	*Lebiasina* *astrigata*	*Tenualosa* *ilisha*
*Ariosoma* *shiroanago*	*Carassius* *gibelio*	*Pollachius* *virens*	*Rhynchocypris* *percnurus* *sachalinensis*	*Myleus* sp *. NM-2010*	*Microthrissa* *royauxi*
*Robinsia* *catherinae*	*Silurus* *glanis*	*Pollachius* *pollachius*	*Tetraodon* *mbu*	*Ichthyborus* *sp. NM-2010*	*Chiloscyllium* *punctatum*
*Ilyophis* *brunneus*	*Collichthys* *niveatus*	*Petrocephalus microphthalmus*	*Chrosomus* *eos*	*Micralestes* *sp. NM-2010*	*Potamothrissa* *acutirostris*
*Myrichthys* *maculosus*	*Thryssa* *baelama*	*Leptoderma macrophthalmum*	*Leiodon* *cutcutia*	*Gymnorhamphichthys* sp *. NM-2010*	*Trypauchen* *vagina*
*Oreochromis* *niloticus*	*Amazonsprattus* *scintilla*	*Micromesistius* *poutassou*	*Monotrete cochinchinensis*	*Acestrorhynchus* sp *. NM-2010*	*Konosirus* *punctatus*
*Acheilognathus* *signifer*	*Brevoortia* *tyrannus*	*Cyphomyrus* *discorhynchus*	*Torquigener* *pleurogramma*	*Histiopterus* *typus*	*Microthrissa* *congica*
*Tanakia* *koreensis*	*Pellona* *flavipinnis*	*Paramormyrops* *gabonensis*	*Colomesus* *asellus*	*Arripis* *trutta*	*Potamothrissa* *obtusirostris*
*Acheilognathus* *intermedia*	*Anchoviella* sp *. LBP 2297*	*Clupeonella* *cultriventris*	*Chelonodon* *pleurospilus*	*Pimelodus* *pictus*	*Tenualosa* *toli*
*Rhodeus* *suigensis*	*Lethenteron* *reissneri*	*Merluccius* *merluccius*	*Colomesus* *psittacus*	*Koreocobitis* *naktongensis*	*Amphiprion* *bicinctus*
*Acheilognathus* *macropterus*	*Coilia* *lindmani*	*Carassius* *auratus* *ssp* *. 'Pingxiang'*	*Arothron* *manilensis*	*Chilodus* *punctatus*	*Clupeichthys* *aesarnensis*
*Acheilognathus* *yamatsutae*	*Coilia* *reynaldi*	*Parajulis* *poecilepterus*	*Canthigaster* *jactator*	*Citharinus* *congicus*	*Clupeichthys* *perakensis*
*Scomber* *japonicus*	*Lycothrissa* *crocodilus*	*Protopterus* *aethiopicus*	*Avocettina* *infans*	*Silurus* *asotus*	*Escualosa* *thoracata*
*Sphyraena* *barracuda*	*Chlamydoselachus* *anguineus*	*Acanthorhodeus* *chankaensis*	*Schizothorax* *plagiostomus*	*Cephalopholis* *sexmaculata*	*Ptychobarbus* *dipogon*
*Eumegistus* *illustris*	*Heptranchias* *perlo*	*Zacco* *platypus*	*Coilia* *grayii*	*Isurus* *paucus*	*Rhinogobio* *cylindricus*
*Taractes* *asper*	*Notorynchus* *cepedianus*	*Mystacoleucus* *marginatus*	*Liachirus* *melanospilos*	*Gymnura* *poecilura*	*Sebastes* *oblongus*
*Pteraclis* *aesticola*	*Hexanchus* *griseus*	*Potamotrygon* *motoro*	*Achirus* *lineatus*	*Grammistes* *sexlineatus*	*Decapterus* *maruadsi*
*Kali* *indica*	*Hexanchus* *nakamurai*	*Pleurogrammus* *azonus*	*Trinectes* *maculatus*	*Protosalanx* *hyalocranius*	*Squalidus* *gracilis*
*Sphyraena* *japonica*	*Somniosus* *pacificus*	*Hemibagrus* *spilopterus*	*Abbottina* *rivularis*	*Pristiophorus* *japonicus*	*Oxyeleotris* *marmorata*
*Nesiarchus* *nasutus*	*Pseudotriakis* *microdon*	*Mystus* *rhegma*	*Parazacco* *spilurus*	*Platysmacheilus* *exiguus*	*Tanakia* *lanceolata*
*Promethichthys* *prometheus*	*Odontobutis* *sinensis*	*Cynoglossus* *sinicus*	*Gymnodiptychus* *pachycheilus*	*Atractosteus* *tropicus*	*Pteroplatytrygon* *violacea*
*Thyrsitoides* *marleyi*	*Prionace* *glauca*	*Zebrias* *quagga*	*Metzia* *mesembrinum*	*Cultrichthys compressocorpus*	*Lutjanus* *johnii*
*Ruvettus* *pretiosus*	*Pristis* *clavata*	*Cynoglossus* *bilineatus*	*Onychostoma* *macrolepis*	*Trachinotus* *carolinus*	*Protonibea* *diacanthus*
*Assurger* *anzac*	*Alopias* *pelagicus*	*Paraplagusia* *bilineata*	*Phoxinus* *ujmonensis*	*Draconetta* *xenica*	*Xenophysogobio* *boulengeri*
*Evoxymetopon* *poeyi*	*Scleropages* *jardinii*	*Paraplagusia* *blochii*	*Paramisgurnus* *dabryanus*	*Solenostomus* *paradoxus*	*Discogobio* *tetrabarbatus*
*Gymnosarda* *unicolor*	*Aetobatus* *flagellum*	*Cynoglossus* *puncticeps*	*Thamnaconus* *tessellatus*	*Doryrhamphus* *japonicus*	*Platax* *teira*
*Ariomma* *lurida*	*Sicyopterus* *lagocephalus*	*Cynoglossus* *lineolatus*	*Maccullochella* *peelii*	*Mulloidichthys* *vanicolensis*	*Salvelinus* *curilus*
*Ariomma* *indicum*	*Rhinobatos hynnicephalus*	*Cyclocheilichthys* *enoplos*	*Pastinachus* *atrus*	*Dactyloptena* *orientalis*	*Plectorhinchus* *cinctus*
*Tetragonurus* *cuvieri*	*Salvelinus leucomaenis*	*Tor tambroides*	*Nematalosa* *nasus*	*Fistularia* *petimba*	*Pseudogyrinocheilus* *prochilus*
*Tetragonurus* *atlanticus*	*Saurogobio* *dabryi*	*Pampus* *echinogaster*	*Amphiprion* *polymnus*	*Phycodurus* *eques*	*Carcharhinus* *plumbeus*
*Pampus* *punctatissimus*	*Epinephelus* *bleekeri*	*Sebastes* *koreanus*	*Amphilophus* *citrinellus*	*Parupeneus multifasciatus*	*Triplophysa anterodorsalis*
*Peprilus* *triacanthus*	*Leptobotia rubrilabris*	*Cetorhinus* *maximus*	*Lophius* *litulon*	*Neosynchiropus* *moyeri*	*Jinshaia* *sinensis*
*Rexea* *nakamurai*	*Pseudobrama* *simoni*	*Plesiomyzon* *baotingensis*	*Schizothorax* *prenanti*	*Callionymus* *enneactis*	*Pavoraja* *nitida*
*Benthodesmus* *tenuis*	*Misgurnus* *bipartitus*	*Esox* *reichertii*	*Huso* *dauricus*	*Synchiropus* *splendidus*	*Jinshaia* *abbreviata*
*Epinnula* *magistralis*	*Aspiorhynchus* *laticeps*	*Paracheirodon* *axelrodi*	*Clarias* *fuscus*	*Syngnathus* *schlegeli*	*Lepturichthys* *fimbriata*
*Aphanopus* *carbo*	*Pethia* *conchonius*	*Polypterus* *palmas buettikoferi*	*Zearaja* *chilensis*	*Takifugu* *flavidus*	*Solea* *ovata*
*Pomatomus* *saltatrix*	*Barbatula* *nuda*	*Squalidus* *argentatus*	*Cobitis* *elongatoides*	*Microdevario* *kubotai*	*Triplophysa* *siluroides*
*Echeneis* *naucrates*	*Schizopyge* *niger*	*Mugilogobius* *abei*	*Carcharhinus amblyrhynchoides*	*Sparus* *aurata*	*Schizothorax* *chongi*
*Epinephelus* *merra*	*Schizothorax* *esocinus*	*Glyphis* *garricki*	*Rhinobatos* *schlegelii*	*Poecilia* *reticulata*	*Ladislavia* *taczanowskii*
*Apogon* *semilineatus*	*Onychostoma* *rara*	*Schizothorax* *labiatus*	*Rexea* *solandri*	*Samariscus* *latus*	*Glyptothorax* *sinensis*
*Pterapogon* *kauderni*	*Liobagrus* *marginatus*	*Schizothorax* *progastus*	*Coreoperca* *whiteheadi*	*Lamna* *ditropis*	*Brachymystax* *tumensis*
*Paracirrhites* *arcatus*	*Thymallus* *grubii*	*Rita* *rita*	*Amphiprion* *percula*	*Hemibagrus* *nemurus*	*Metzia* *longinasus*
*Parabramis* *pekinensis*	*Hemiculter leucisculus*	*Acrossocheilus* *fasciatus*	*Amphiprion* *clarkii*	*Barbonymus schwanenfeldii*	*Cottus* *dzungaricus*
*Sphyrna* *lewini*	*Romanogobio* *tenuicorpus*	*Macquaria* *australasica*	*Carangoides* *malabaricus*	*Squatina* *japonica*	*Pterois* *miles*
*Rhodeus* *shitaiensis*	*Gobiobotia* *intermedia*	*Symphurus* *plagiusa*	*Nemipterus* *japonicus*	*Culter* *recurviceps*	*Culter* *erythropterus*
*Isurus* *oxyrinchus*	*Caranx* *ignobilis*	*Cynoglossus* *itinus*	*Pseudaesopia* *japonica*	*Hemibagrus* *wyckioides*	*Anabas* *testudineus*
*Rhinogobius* *giurinus*	*Sarcocheilichthys* *lacustris*	*Colistium* *nudipinnis*	*Belligobio* *nummifer*	*Pseudobagrus* *emarginatus*	*Macropodus* *ocellatus*
*Tor* *sinensis*	*Monotrete* *leiurus*	*Peltorhamphus novaezeelandiae*	*Hemibagrus* *guttatus*	*Carcharhinus* *melanopterus*	*Schizothorax pseudoaksaiensis*
*Microphysogobio* *brevirostris*	*Garra* *rufa*	*Rhincodon* *typus*	*Mastacembelus* *armatus*	*Aseraggodes* *kobensis*	*Elopichthys* *bambusa*
*Pseudobagrus* *trilineatus*	*Labeo* *chrysophekadion*	*Sebastes* *inermis*	*Schizothorax* *dolichonema*	*Ptychidio* *jordani*	*Petenia* *splendida*
*Odontobutis* *potamophila*	*Labeo* *pierrei*	*Decapterus* *macrosoma*	*Saurida* *microlepis*	*Megalobrama* *skolkovii*	*Saurida* *umeyoshii*
*Trachinotus* *ovatus*	*Garra* *spilota*	*Microphysogobio* *tafangensis*	*Clarias* *batrachus*	*Rhinogobio* *typus*	*Gnathopogon* *polytaenia*
*Plagiognathops* *microlepis*	*Labeo* *angra*	*Pampus* *argenteus*	*Pangasius* *pangasius*	*Paracanthobrama* *guichenoti*	*Amphiprion* *frenatus*
*Misgurnus* *mohoity*	*Osteochilus* *nashii*	*Boleophthalmus* *boddarti*	*Selar* *crumenophthalmus*	*Coreoperca* *loona*	*Amphiprion* *perideraion*
*Channa* *marulius*	*Labiobarbus* *ocellatus*	*Heterotilapia* *buttikoferi*	*Trachinotus* *blochii*	*Siniperca* *roulei*	*Premnas* *biaculeatus*
*Cobitis* *lutheri*	*Schismatorhynchos* *nukta*	*Sinocyclocheilus* *anophthalmus*	*Salmo* *trutta*	*Siniperca* *undulata*	*Acrossocheilus* *kreyenbergii*
*Oxygymnocypris* *stewartii*	*Labeo* *cyclorhynchus*	*Cobitis* *melanoleuca granoei*	*Epinephelus* *tukula*	*Pareuchiloglanis* *sinensis*	*Percilia* *irwini*
*Rhinogobio* *ventralis*	*Henicorhynchus* *lineatus*	*Pleurogrammus* *monopterygius*	*Pampus* *chinensis*	*Gadopsis* *marmoratus*	*Bostockia* *porosa*
*Rhodeus* *sinensis*	*Osteochilus* *schlegelii*	*Carcharias* *taurus*	*Rasbora* *borapetensis*	*Glyphis* *glyphis*	*Gadopsis* *bispinosus*
*Hippocampus* *erectus*	*Thynnichthys* *polylepis*	*Carcharhinus* *sorrah*	*Dipturus kwangtungensis*	*Hemibarbus* *medius*	*Macquaria* *ambigua*
*Silurus* *soldatovi*	*Garra* *flavatra*	*Carcharhinus* *leucas*	*Leptobotia microphthalma*	*Leuciscus* *baicalensis*	*Percalates* *novemaculeata*
*Hasemania* *nana*	*Labiobarbus* *leptocheilus*	*Alepes* *kleinii*	*Carcharhinus* *acronotus*	*Hippocampus* *ingens*	*Nannoperca* *variegata*
*Pseudobagrus* *ondon*	*Labiobarbus* *lineatus*	*Himantura* *granulata*	*Mogurnda* *adspersa*	*Liza* *haematocheila*	*Howella* *brodiei*
*Pseudobagrus* *albomarginatus*	*Labeo* *lineatus*	*Paraneetroplus* *synspilus*	*Siganus* *puellus*	*Sinogastromyzon* *sichangensis*	*Tilodon* *sexfasciatum*
*Helostoma* *temminkii*	*Campylomormyrus* *compressirostris*	*Mustelus* *griseus*	*Siganus* *guttatus*	*Hippocampus* *barbouri*	*Bidyanus* *bidyanus*
*Rhynchocypris* *percnurus mantschuricus*	*Luvarus* *imperialis*	*Cobitis* *choii*	*Lutjanus* *bengalensis*	*Scobinichthys* *granulatus*	*Chitala* *blanci*
*Barbonymus* *gonionotus*	*Zanclus* *cornutus*	*Oncorhynchus* *gorbuscha*	*Aluterus* *scriptus*	*Scarus* *forsteni*	*Chitala* *lopis*
*Oncorhynchus* *masou ishikawae*	*Spicara* *maena*	*Acanthopagrus* *latus*	*Lactoria* *diaphana*	*Paraluteres* *prionurus*	*Chitala* *ornata*
*Oncorhynchus* *masou* *masou*	*Centropyge* *loricula*	*Oplegnathus* *fasciatus*	*Thamnaconus* *modestus*	*Paramonacanthus* *choirocephalus*	*Papyrocranus* *congoensis*
*Opsariichthys* *bidens*	*Zebrasoma* *flavescens*	*Platichthys* *stellatus*	*Xenobalistes tumidipectoris*	*Pervagor* *janthinosoma*	*Notopterus* *notopterus*
*Oncorhynchus* *masou formosanus*	*Lethrinus* *obsoletus*	*Capros* *aper*	*Cantherhines* *pardalis*	*Pseudomonacanthus* *peroni*	*Xenomystus* *nigri*
*Gymnogobius* *petschiliensis*	*Coreoperca* *kawamebari*	*Sphoeroides* *pachygaster*	*Anoplocapros* *lenticularis*	*Balistoides* *conspicillum*	*Lutjanus* *malabaricus*
*Tropheus* *duboisi*	*Lutjanus* *rivulatus*	*Lutjanus* *russellii*	*Chilomycterus* *reticulatus*	*Canthidermis* *maculata*	*Lutjanus* *sebae*
*Neolamprologus* *brichardi*	*Chaetodon* *auripes*	*Arothron* *firmamentum*	*Scarus* *rubroviolaceus*	*Scarus* *schlegeli*	*Cynoglossus* *semilaevis*
*Astronotus* *ocellatus*	*Heniochus* *diphreutes*	*Canthigaster* *coronata*	*Micropterus* *dolomieu*	*Melichthys* *vidua*	*Branchiostegus* *japonicus*
*Cymatogaster* *aggregata*	*Chaetodontoplus* *septentrionalis*	*Canthigaster* *rivulata*	*Xiphophorus* *maculatus*	*Odonus* *niger*	*Branchiostegus* *albus*
*Amphiprion* *ocellaris*	*Doederleinia* *berycoides*	*Monotaxis* *grandoculis*	*Xenotoca* *eiseni*	*Pseudobalistes* *flavimarginatus*	*Gillichthys* *mirabilis*
*Ditrema* *temminckii*	*Diodon* *holocanthus*	*Gonorynchus* *abbreviatus*	*Fundulus* *olivaceus*	*Brachaluteres* *ulvarum*	*Branchiostegus* *argentatus*
*Pseudolabrus* *sieboldi*	*Naso* *lopezi*	*Sagamichthys* *abei*	*Jordanella* *floridae*	*Rhinecanthus* *aculeatus*	*Gillichthys* *seta*
*Abudefduf* *vaigiensis*	*Diagramma* *picta*	*Alepocephalus* *bicolor*	*Elassoma* *zonatum*	*Abalistes* *stellaris*	*Thymallus* *thymallus*
*Halichoeres* *melanurus*	*Triacanthodes* *anomalus*	*Bathyprion* *danae*	*Aulichthys* *japonicus*	*Xanthichthys auromarginatus*	*Thymallus* *arcticus*
*Olisthops* *cyanomelas*	*Trixiphichthys* *weberi*	*Bathytroctes* *microlepis*	*Gasterosteus* *wheatlandi*	*Balistapus* *undulatus*	*natural gynogenetic Carassius auratus red var.*
*Labracinus* *cyclophthalmus*	*Triodon* *macropterus*	*Leptochilichthys* *agassizii*	*Pungitius* *pungitius*	*Acanthaluteres* *brownii*	*Oryzias* *minutillus*
*Oreochromis* *sp. KM-2006*	*Monodactylus* *argenteus*	*Maulisia* *mauli*	*Anguilla* *luzonensis*	*Balistes* *vetula*	*Oryzias* *dancena*
*Conger myriaster*	*Parapristipoma* *trilineatum*	*Narcetes* *erimelas*	*Culaea* *inconstans*	*Acreichthys* *tomentosus*	*Oryzias* *luzonensis*
*Plecoglossus* *altivelis*	*Macrorhamphosodes* *uradoi*	*Normichthys* *operosus*	*Lutjanus* *kasmira*	*Amanses* *scopas*	*Oryzias* *javanicus*
*Cyprinodon rubrofluviatilis*	*Triacanthus* *biaculeatus*	*Hemibarbus* *labeo*	*Apeltes* *quadracus*	*Eubalichthys* *mosaicus*	*Erimyzon* *oblongus*
*Oncorhynchus* *kisutch*	*Kentrocapros* *aculeatus*	*Hemibarbus* *mylodon*	*Spinachia* *spinachia*	*Meuschenia* *hippocrepis*	*Ictiobus* *bubalus*
*Oncorhynchus* *masou '* *Biwa* '	*Ostracion* *immaculatus*	*Hemibarbus* *longirostris*	*Scarus* *ghobban*	*Sinogastromyzon* *puliensis*	*Xenocypris* *davidi*
*Pagellus* *bogaraveo*	*Stylephorus* *chordatus*	*Coreoleuciscus* *splendidus*	*Takifugu* *poecilonotus*	*Chaetodermis penicilligerus*	*Moxostoma* *congestum*
*Clupea* *harengus*	*Salmo* *trutta trutta*	*Epinephelus* *coioides*	*Takifugu* *exascurus*	*Eutaeniophorus* *festivus*	*Takifugu* *fasciatus*
*Sardina* *pilchardus*	*Puntigrus* *tetrazona*	*Epinephelus* *akaara*	*Chelonodon* *patoca*	*Parataeniophorus* *gulosus*	*Xiphophorus* *hellerii*
*Clupea* *pallasii*	*Acanthurus* *lineatus*	*Mylopharyngodon* *piceus*	*Takifugu* *chrysops*	*Ataxolepis* *apus*	*Platax* *orbicularis*
*Alosa* *pseudoharengus*	*Boreogadus* *saida*	*Pseudopungtungia* *nigra*	*Takifugu* *niphobles*	*Barbourisia* *rufa*	*Girella* *punctata*
*Engraulis* *encrasicolus*	*Arctogadus* *glacialis*	*Tylochromis* *polylepis*	*Takifugu* *obscurus*	*Procetichthys* *kreffti*	*Kyphosus* *cinerascens*
*Sardinella* *maderensis*	*Hypophthalmichthys* *molitrix*	*Etroplus* *maculatus*	*Takifugu* *pardalis*	*Cetomimus* *sp. AMS I34481001*	*Labracoglossa argentiventris*
*Sprattus* *sprattus*	*Hypophthalmichthys* *nobilis*	*Aplocheilus* *panchax*	*Takifugu* *porphyreus*	*Gyrinomimus* *sp.* *UW 113191*	*Scorpis* *lineolata*
*Dorosoma* *petenense*	*Odontobutis* *platycephala*	*Paratilapia* *polleni*	*Takifugu* *stictonotus*	*Gyrinomimus* *myersi*	*Rhynchopelates* *oxyrhynchus*
*Etrumeus* *teres*	*Xyrauchen* *texanus*	*Oryzias* *sarasinorum*	*Takifugu* *snyderi*	*Pseudolabrus* *eoethinus*	*Kuhlia* *mugil*
*Siganus* *fuscescens*	*Hippocampus* *kuda*	*Ablennes* *hians*	*Takifugu* *vermicularis*	*Fundulus* *heteroclitus*	*Oplegnathus* *punctatus*
*Alosa* *alosa*	*Aulostomus* *chinensis*	*Hypselecara* *temporalis*	*Takifugu* *xanthopterus*	*Gadus* *ogac*	*Psenes* *cyanophrys*
*Ethmalosa* *fimbriata*	*Oostethus* *brachyurus*	*Ptychochromoides* *katria*	*Takifugu* *chinensis*	*Fundulus* *grandis*	*Siganus* *unimaculatus*
*Spratelloides* *gracilis*	*Macroramphosus* *scolopax*	*Paretroplus* *maculatus*	*Takifugu* *oblongus*	*Fundulus* *diaphanus*	*Hyperoglyphe* *japonica*
*Ilisha* *elongata*	*Eurypegasus* *draconis*	*Menidia* *menidia*	*Takifugu* *ocellatus*	*Chiloscyllium* *plagiosum*	*Cubiceps* *pauciradiatus*
*Coilia* *nasus*	*Pegasus volitans*	*Hyporhamphus* *sajori*	*Torquigener* *brevipinnis*	*Acipenser gueldenstaedtii*	*Toxotes* *chatareus*
*Ilisha* *africana*	*Fistularia commersonii*	*Odontesthes* *sp.* *Odsp* *-001*	*Lagocephalus* *wheeleri*	*Acipenser* *sinensis*	*Enoplosus* *armatus*
*Nematalosa* *japonica*	*Aulorhynchus* *flavidus*	*Iso* *hawaiiensis*	*Pampus* sp *. LY-2009*	*Istiompax* *indica*	*Microcanthus* *strigatus*
*Spratelloides* *delicatulus*	*Solenostomus* *cyanopterus*	*Halichoeres* *trimaculatus*	*Larimichthys* *crocea*	*Istiophorus* *platypterus*	*Scophthalmus* *maximus*
*Odaxothrissa* *vittata*	*Aeoliscus* *strigatus*	*Halichoeres* *tenuispinis*	*Epinephelus* *lanceolatus*	*Xiphias* *gladius*	*Sinocyclocheilus* *altishoulderus*
*Pellonula* *leonensis*	*Ctenopharyngodon* *idella*	*Procypris* *rabaudi*	*Trichiurus* *japonicus*	*Kajikia* *audax*	*Sinocyclocheilus* *grahami*
*Hippoglossus* *hippoglossus*	*Pteragogus flagellifer*	*Distoechodon* *tumirostris*	*Nothobranchius* *furzeri*	*Tetrapturus angustirostris*	*Lagocephalus* *lunaris*
*Reinhardtius hippoglossoides*	*Megalobrama* *amblycephala*	*Psilorhynchus* *homaloptera*	*Mitsukurina* *owstoni*	*Makaira* *mazara*	*Oryzias* *sinensis*
*Hippoglossus* *stenolepis*	*Arapaima* *gigas*	*Misgurnus anguillicaudatus*	*Nelusetta* *ayraudi*	*Brienomyrus* *niger*	*Serrivomer* *sector*
*Anarhichas* *lupus*	*Chionodraco* *myersi*	*Rhodeus* *ocellatus*	*Rudarius* *ercodes*	*Gymnarchus* *niloticus*	*Rastrelliger* *brachysoma*
*Acanthurus* *leucosternon*	*Carassius* *cuvieri*	*Rachycentron* *canadum*	*Monacanthus* *chinensis*	*Anyperodon leucogrammicus*	*Herwigia* *kreffti*
*Clupeoides* *borneensis*	*Dissostichus* *eleginoides*	*Gymnocypris* *eckloni*	*Phoxinus* *phoxinus*	*Pseudobagrus* *crassilabris*	*Epinephelus* *sexfasciatus*
*Ethmidium* *maculatum*	*Champsocephalus* *gunnari*	*Phoxinus* *keumkang*	*Lepomis* *cyanellus*	*Pseudobagrus* *truncatus*	*Neotrygon* *kuhlii*
*Clupeoides* sp *. Chao* *Phraya*	*Brachymystax* *lenok*	*Aphyocypris* *kikuchii*	*Schizothorax* *wangchiachii*	*Plectropomus* *areolatus*	*Pseudorasbora* *elongata*
*Gudusia* *chapra*	*Brachymystax* *lenok* *tsinlingensis*	*Pararasbora* *moltrechti*	*Pseudohemiculter* *dispar*	*Liobagrus* *nigricauda*	*Garra* *orientalis*
*Ehirava* *fluviatilis*	*Bahaba* *taipingensis*	*Rastrelliger* *kanagurta*	*Paedocypris* *progenetica*	*Schizopygopsis* *younghusbandi*	*Hongeo* *koreana*
*Tenualosa* *thibaudeaui*	*Cyprinus* *carpio 'color'*	*Coilia* *ectenes*	*Dasyatis* *bennetti*	*Ancherythroculter* *nigrocauda*	*Raja* *rhina*
*Clupeichthys* *goniognathus*	*Hemibarbus* *maculatus*	*Neosalanx* *taihuensis*	*Moolgarda* *cunnesius*	*Chanodichthys* *dabryi*	*Scatophagus* *argus*
*Sundasalanx* *praecox*	*Oryzias* *melastigma*	*Onychostoma* *barbatum*	*Ammodytes* *hexapterus*	*Gymnocypris* *dobula*	*Aesopia* *cornuta*
*Sardinella* *albella*	*Acanthopagrus* *schlegelii*	*Taeniura* *meyeni*	*Pseudolaubuca* *engraulis*	*Gymnocypris* *namensis*	*Onychostoma* *simum*
*Sciaenops* *ocellatus*	*Trematocranus* *placodon*	*Dasyatis* *zugei*	*Gobiobotia* *naktongensis*	*Schizopygopsis* *thermalis*	*Sahyadria* *denisonii*
*Seriola* *quinqueradiata*	*Diplotaxodon* *limnothrissa*	*Coilia* *mystus*	*Lethenteron camtschaticum*	*Megachasma* *pelagios*	*Variola* *louti*
*Seriola* *lalandi*	*Petrotilapia* *nigra*	*Harpadon* *nehereus*	*Setipinna* *taty*	*Sander canadensis*	*Variola* *albimarginata*
*Seriola* *dumerili*	*Nimbochromis* *linni*	*Hapalogenys* *analis*	*Schizothorax* *waltoni*	*Anodontostoma* *chacunda*	*Triso* *dermopterus*
*Catla* *catla*	*Pseudotropheus* *crabro*	*Odontamblyopus* *rubicundus*	*Sarcocheilichthys* *nigripinnis*	*Nematalosa* *come*	*Aethaloperca* *rogaa*
*Chrysochir* *aureus*	*Astatotilapia* *calliptera*	*Squaliobarbus* *curriculus*	*Carcharhinus* *obscurus*	*Schizothorax* *richardsonii*	*Cephalopholis* *argus*
*Acipenser* *baerii*	*Dimidiochromis* *compressiceps*	*Perca* *flavescens*	*Polypterus* *ansorgii*	*Epinephelus* *quoyanus*	*Cephalopholis* *sonnerati*
*Dendrophysa* *russelii*	*Genyochromis* *mento*	*Alburnus* *istanbulensis*	*Polypterus* *retropinnis*	*Microphysogobio* *alticorpus*	*Acrossocheilus* *monticola*
*Labeo* *rohita*	*Rhamphochromis* *esox*	*Alburnus* *tarichi*	*Polypterus* *teugelsi*	*Pseudopentaceros* *wheeleri*	*Enophrys* *diceraus*
*Argyrosomus* *japonicus*	*Cynotilapia* *afra*	*Luciogobius* *platycephalus*	*Gasterochisma* *melampus*	*Hippocampus* *histrix*	*Orectolobus* *japonicus*
*Cirrhinus* *mrigala*	*Sahyadria* *chalakkudiensis*	*Sinocyclocheilus* *furcodorsalis*	*Cheilochromis* *euchilus*	*Hexagrammos* *agrammus*	*Spinibarbus* *caldwelli*
*Oncorhynchus* *keta*	*Repomucenus* *curvicornis*	*Rasbora* *steineri*	*Thunnus* *tonggol*	*Psenopsis* *anomala*	*Pristipomoides* *multidens*
*Schizothorax* *biddulphi*	*Clupanodon* *thrissa*	*Channa* *maculata*	*Coregonus* *nasus*	*Epinephelus* *epistictus*	*Mesocottus* *haitej*
*Agonostomus* *monticola*	*Percocypris* *pingi*	*Sinibrama* *macrops*	*Stenodus* *leucichthys*	*Onychostoma* *alticorpus*	*Cirrhinus* *molitorella*
*Aldrichetta* *forsteri*	*Koreocobitis* *rotundicaudata*	*Pseudopentaceros* *richardsoni*	*Coregonus* *clupeaformis*	*Gagata* *dolichonema*	*Acrossocheilus* *hemispinus*
*Bostrychus* *sinensis*	*Leptobotia* *elongata*	*Psettodes* *erumei*	*Prosopium* *williamsoni*	*Glyptosternon* *maculatum*	*Acrossocheilus* *barbodon*
*Chaenomugil* *proboscideus*	*Tachysurus* *eupogon*	*Coreius* *guichenoti*	*Prosopium* *cylindraceum*	*Euchiloglanis* *kishinouyei*	*Pseudogobius* *javanicus*
*Chiloscyllium* *griseum*	*Glyptothorax* *fokiensis fokiensis*	*Coreius* *heterodon*	*Coregonus* *oxyrinchus*	*Creteuchiloglanis* *kamengensis*	*Saurogobio* *dumerili*
*Chelon* *labrosus*	*Trachidermus* *fasciatus*	*Epinephelus* *fuscoguttatus*	*Synechogobius* *ommaturus*	*Glaridoglanis* *andersonii*	*Biwia* *springeri*
*Crenimugil* *crenilabis*	*Epinephelus* *awoara*	*Hyporthodus* *octofasciatus*	*Polypterus* *delhezi*	*Exostoma* *labiatum*	*Gnathopogon* *strigatus*
*Liza* *affinis*	*Triplophysa* *bleekeri*	*Homatula* *variegata*	*Polypterus* *weeksii*	*Liobagrus anguillicauda*	*Squalidus* *wolterstorffi*
*Scartelaos* *histophorus*	*Mobula* *japanica*	*Puntius semifasciolatus*	*Epinephelus fasciatomaculosus*	*Pareuchiloglanis* *gracilicaudata*	*Microphysogobio* *longidorsalis*
*Mugil* *curema*	*Sarcocheilichthys* *parvus*	*Puntius* *snyderi*	*Lophiogobius* *ocellicauda*	*Pseudexostoma* *yunnanensis*	*Hemibarbus* *umbrifer*
*Triplophysa* *stoliczkai*	*Scaphiodonichthys* *acanthopterus*	*Acrossocheilus* *wenchowensis*	*Epinephelus latifasciatus*	*Pseudecheneis* *sulcata*	*Galeocerdo* *cuvier*
*Epinephelus* *moara*	*Trichiurus* *lepturus nanhaiensis*	*Scopelengys* *tristis*	*Epinephelus* *areolatus*	*Bagarius* *yarrelli*	*Carcharodon* *carcharias*
*Myxus* *capensis*	*Petrochromis* *trewavasae*	*Neoscopelus macrolepidotus*	*Chaeturichthys* *stigmatias*	*Oreoglanis* *macropterus*	*Pleuronichthys* *cornutus*
*Oedalechilus* *labeo*	*Tropheus* *moorii*	*Lampadena* *atlantica*	*Polypterus* *endlicherii*	*Glyptothorax* *trilineatus*	*Crossorhombus* *azureus*
*Opistognathus* *jacksoniensis*	*Megalobrama* *terminalis*	*Sinibotia* *superciliaris*	*Schizothorax* *oconnori*	*Epinephelus* *trimaculatus*	*Pseudorhombus* *cinnamoneus*
*Rhinomugil* *nasutus*	*Oreoleuciscus* *potanini*	*Hippocampus* *comes*	*Hippocampus* *trimaculatus*	*Cromileptes* *altivelis*	*Acipenser* *ruthenus*
*Sicamugil* *cascasia*	*Phoxinus* *oxycephalus* *jouyi*	*Liobagrus* *kingi*	*Liobagrus marginatoides*	*Heterodontus* *zebra*	*Novumbra* *hubbsi*
*Trachinops* *taeniatus*	*Tribolodon* *brandtii*	*Luciobarbus* *capito*	*Dasyatis* *akajei*	*Spinibarbus* *denticulatus*	*Umbra* *pygmaea*
*Cyprinus* *carpio* *carpio*	*Tribolodon* *hakonensis*	*Schizothorax* *macropogon*	*Epinephelus* *stictus*	*Psenes* *pellucidus*	*Metzia* *formosae*
*Cyprinus* *carpio 'xingguonensis'*	*Tribolodon sachalinensis*	*Pseudobagrus* *ussuriensis*	*Cephalopholis* *boenak*	*Eleutheronema* *tetradactylum*	*Spinibarbus* *sinensis*
*Cyprinus* *carpio haematopterus*	*Protopterus* *annectens*	*Oxyurichthys* *formosanus*	*Siniperca* *obscura*	*Onychostoma* *barbatulum*	*Sarcocheilichthys* *sinensis*
*Cyprinus* *carpio 'wuyuanensis'*	*Tridentiger* *barbatus*	*Acentrogobius chlorostigmatoides*	*Ammodytes* *personatus*	*Parahucho* *perryi*	*Kurtus* *gulliveri*
*Onychostoma* *lini*	*Glossogobius* *circumspectus*	*Amoya* *chusanensis*	*Paraplagusia* *japonica*	*Pangasianodon* *hypophthalmus*	*Istiophorus* *albicans*
*Lateolabrax* *maculatus*	*Leuciscus* *waleckii*	*Helicolenus* *avius*	*Zebrias* *zebra*	*Tor* *putitora*	*Colisa* *lalia*
*Stiphodon* *alcedo*	*Sicyopterus* *japonicus*	*Perccottus* *glenii*	*Osteochilus* *salsburyi*	*Acipenser* *schrenckii*	*Parachanna* *insignis*
*Acentrogobius* *pflaumii*	*Triplophysa* *rosa*	*Blicca* *bjoerkna*	*Scomberomorus* *munroi*	*Pentaceros* *japonicus*	*Platycephalus* *indicus*
*Gobiocypris* *rarus*	*Hemibagrus macropterus*	*Abramis* *brama*	*Scomberomorus* *semifasciatus*	*Schedophilus* *velaini*	*Dysalotus* *alcocki*
*Anoplopoma* *fimbria*	*Gymnocypris* *przewalskii ganzihonensis*	*Leucaspius* *delineatus*	*Pseudobagrus brevicaudatus*	*Micropercops* *swinhonis*	*Champsodon* *cf.* *snyderi* *CBM-ZF 10876*
*Cirrhitichthys* *aprinus*	*Coregonus* *peled*	*Schizopygopsis* *pylzovi*	*Decapterus* *macarellus*	*Lagocephalus* *spadiceus*	*Chlorophthalmus* *nigromarginatus*
*Cheilodactylus* *zonatus*	*Squatina* *nebulosa*	*Schizopygopsis* *kialingensis*	*Acheilognathus* *imberbis*	*Trichogaster* *microlepis*	*Symphurus* *orientalis*
*Carcharhinus* *macloti*	*Eudontomyzon* *morii*	*Himantura* *gerrardi*	*Trichogaster* *leerii*	*Liza* *macrolepis*	*Clarias* *gariepinus*
*Schizopygopsis* *malacanthus*	*Lampetra* *appendix*	*Taeniura* *lymma*	*Epinephelus* *corallicola*	*Gnathopogon* *imberbis*	*Lefua* *nikkonis*
*Siganus* *canaliculatus*	*Hypostomus plecostomus*	*Sorubim* *cuspicaudus*	*Hemitriakis* *japanica*	*Gnathopogon* *taeniellus*	*Cobitis* *biwae*
*Chirostoma* *humboldtianum*	*Platydoras* *armatulus*	*Vanmanenia* *pingchowensis*	*Drepane* *longimana*	*Phoxinus* *oxycephalus*	*Nipponocypris* *temminckii*
*Rhodeus* *lighti*	*Siganus* *vulpinus*	*Pseudocarcharias* *kamoharai*	*Colisa* *fasciata*	*Coregonus* *autumnalis*	*Tanakia* *tanago*
*Heteromycteris* *japonicus*	*Hucho* *hucho*	*Labeo* *fimbriatus*	*Carcharhinus* *tjutjot*	*Terapon* *jarbua*	*Cirrhigaleus* *australis*
*Microphysogobio* *fukiensis*	*Platysmacheilus* *nudiventris*	*Bangana* *decora*	*Chaetodontoplus* *conspicillatus*	*Beaufortia szechuanensis*	*Schizothorax* *kozlovi*
*Acrossocheilus* *stenotaeniatus*	*Triplophysa* *robusta*	*Atule* *mate*	*Oxyeleotris* *lineolata*	*Enchelynassa* *canina*	*Trichopodus* *leerii*
*Zapteryx* *exasperata*	*Drepane* *punctata*	*Lagocephalus* *suezensis*	*Ophiodon* *elongatus*	*Gymnomuraena* *zebra*	*Danio* *nigrofasciatus*
*Brycon* *orbignyanus*	*Ponticola* *kessleri*	*Gazza* *minuta*	*Hexagrammos* *lagocephalus*	*Aluterus* *monoceros*	*Prochilodus* *argenteus*
*Prochilodus* *lineatus*	*Carangoides* *equula*	*Lobotes* *surinamensis*	*Erilepis* *zonifer*	*Haplochromis* *burtoni*	*Prochilodus* *costatus*
*Salminus* *brasiliensis*	*Ochetobius* *elongatus*	*Gerres* *oyena*	*Cheilodactylus* *variegatus*	*Thymallus* *pallasii*	*Ephippus* *orbis*
*Arnoglossus* *polyspilus*	*Coregonus* *ussuriensis*	*Polydactylus* *plebeius*	*Abbottina obtusirostris*	*Thymallus* *tugarinae*	*Nemipterus* *virgatus*
*Bothus* *pantherinus*	*Diptychus* *maculatus*	*Polynemus* *paradiseus*	*Melanotaenia* *parkinsoni*	*Thymallus* *yaluensis*	*Scorpaenopsis* *cirrosa*
*Crossorhombus* *kobensis*	*Seriolella* *porosa*	*Pempheris* *schwenkii*	*Lampetra* *aepyptera*	*Thymallus* *burejensis*	*Plotosus* *japonicus*
*Cyclopsetta* *fimbriata*	*Andinoacara* *rivulatus*	*Pelotretis* *flavilatus*	*Parachromis* *managuensis*	*Thymallus* *brevirostris*	*Ancherythroculter* *lini*
*Laeops* *lanceolata*	*Leporinus* *piavussu*	*Himantura* *microphthalma*	*Selenotoca multifasciata*	*Acipenser* *sturio*	*Perca* *schrenkii*
*Lepidoblepharon* *ophthalmolepis*	*Procypris* *mera*	*Triaenodon* *obesus*	*Lophiosilurus* *alexandri*	*Rhodeus* *fangi*	*Oncorhynchus* *mykiss*
*Neoachiropsetta* *milfordi*	*Choerodon* *schoenleinii*	*Schizothorax* *lantsangensis*	*Acheilognathus* *barbatus*	*Sebastes* *vulpes*	*Aspasma* *minima*
*Piaractus* *mesopotamicus*	*Sphyrna* *zygaena*	*Pomacanthus* *xanthometopon*	*Brycon* *henni*	*Sebastes* *taczanowskii*	*Porichthys* *myriaster*
*Zebrias* *zebrinus*	*Gymnocephalus* *cernua*	*Pomacanthus* *imperator*	*Diploprion* *bifasciatum*	*Sebastes* *hubbsi*	*Oxymonacanthus* *longirostris*
*Channa* *asiatica*	*Samaris* *cristatus*	*Anoxypristis* *cuspidata*	*Eleotris* *oxycephala*	*Sebastes* *minor*	*Pseudalutarius* *nasicornis*
*Cottus* *czerskii*	*Macropodus opercularis*	*Perca* *fluviatilis*	*Coilia* *brachygnathus*	*Sebastes steindachneri*	*Cyema* *atrum*
*Nipponocypris* *koreanus*	*Euthynnus* *affinis*	*Centropyge* *interrupta*	*Acrossocheilus* *parallens*	*Sebastes* *trivittatus*	*Monognathus* *jesperseni*
*Pterois* *volitans*	*Sillago* *aeolus*	*Holacanthus* *clarionensis*	*Synanceia* *verrucosa*	*Sebastes* *thompsoni*	*Mallotus* *villosus*
*Metahomaloptera* *omeiensis*	*Argyrosomus* *amoyensis*	*Neosalanx* *tangkahkeii*	*Scombrops* *boops*	*Botia* *lohachata*	*Labeo* *calbasu*
*Sillago* *indica*	*Saurida* *wanieso*	*Megalobrama* *pellegrini*	*Strongylura* *anastomella*	*Himantura* *hortlei*	*Scoliodon* *macrorhynchos*
*Xenophysogobio* *nudicorpa*	*Oedalechilus* *labiosus*	*Hyporhamphus* *intermedius*	*Luciogobius* *pallidus*	*Tor tor*	*Johnius* *belangerii*
*Rhabdosargus* *sarba*	*Atlantoraja* *castelnaui*	*Colossoma* *macropomum*	*Bangana* *tungting*	*Triplophysa* *yarkandensis*	*Pardachirus* *pavoninus*
*Ptychobarbus* *kaznakovi*	*Parasinilabeo* *assimilis*	*Mugilogobius* *chulae*	*Thamnaconus* *hypargyreus*	*Dipturus* *trachyderma*	*Hoplolatilus* *cuniculus*
*Nibea* *coibor*	*Ichthyoelephas* *longirostris*	*Apolemichthys* *kingi*	*Carcharhinus* *brevipinna*	*Macrognathus* *aculeatus*	*Citharoides macrolepidotus*
*Piaractus* *brachypomus*	*Curimata* *mivartii*	*Chaetodontoplus* *mesoleucus*	*Plectorhinchus* *orientalis*	*Cetonurus* *globiceps*	*Cynoglossus* *trigrammus*
*Discogobio* *yunnanensis*	*Chelmon* *rostratus*	*Pseudoplatystoma* *magdaleniatum*	*Plectorhinchus* *vittatus*	*Orestias* *ascotanensis*	*Tanakia* *himantegus*
*Homatula* *potanini*	*Mobula* *eregoodootenkee*	*Ictiobus* *cyprinellus*	*Pterocryptis cochinchinensis*	*Odontobutis* *interrupta*	*Polydactylus* *sextarius*
*Rhodeus* *sericeus*	*Dicentrarchus* *labrax*	*Sander lucioperca*	*Odontobutis* *yaluensis*	*Holacanthus* *africanus*
*Squatina* *formosa*	*Dicentrarchus* *punctatus*	*Pterophyllum* *scalare*	*Schizothorax lissolabiatus*	*Holacanthus* *tricolor*
*Rasbora* *trilineata*	*Brachirus* *orientalis*	*Pygoplites* *diacanthus*	*Coreoperca* *herzi*	*Icelus* *spatula*
*Sillago* *asiatica*	*Sebastes* *longispinis*	*Onychostoma* *gerlachi*	*Microphysogobio* *yaluensis*	*Leptoclinus* *maculatus*
*Raja* *pulchra*	*Neolissochilus* *hexagonolepis*	*Hypomesus* *olidus*	*Kichulchoia multifasciata*	*Apolemichthys* *griffisi*
*Narcine* *entemedor*	*Oreochromis* *variabilis*	*Parachaenichthys* *charcoti*	*Liobagrus mediadiposalis*	*Holacanthus* *passer*
*Tanakia* *limbata*	*Coptodon* *zillii*	*Poecilia* *sphenops*	*Sinocyclocheilus* *rhinocerous*	*Holacanthus* *ciliaris*
*Plectorhinchus* *lineatus*	*Sinibrama* *taeniatus*	*Trichogaster* *trichopterus*	*Sinocyclocheilus* *anshuiensis*	*Genicanthus semifasciatus*
*Thunnus* *atlanticus*	*Devario* *laoensis*	*Betta* *splendens*	*Scortum* *barcoo*	*Genicanthus* *bellus*
*Carcharhinus* *longimanus*	*Parabotia* *banarescui*	*Symphysodon* *discus*	*Ambastaia* *sidthimunki*	*Centropyge* *venusta*
*Ichthyomyzon* *fossor*	*Parabotia* *fasciata*	*Hemiculterella* *sauvagei*	*Pristis* *pectinata*	*Paracentropyge* *multifasciata*
*Ichthyomyzon* *unicuspis*	*Spinibarbus* *hollandi*	*Carcharhinus* *amboinensis*	*Seriola* *rivoliana*	*Ulcina* *olrikii*
*Oreochromis* *esculentus*	*Leptobotia* *taeniops*	*Sinobdella* *sinensis*	*Conger japonicus*	*Tor* *khudree*
*Garra* *imberba*	*Sebastes* *owstoni*	*Pseudolaubuca* *sinensis*	*Tarimichthys* *bombifrons*	*Himantura* *dalyensis*
*Megalaspis* *cordyla*	*Grundulus* *bogotensis*	*Triplophysa* *strauchii*	*Barbatula* *barbatula*	*Centropyge* *multicolor*
*Alectis* *ciliaris*	*Schizothorax* *davidi*	*Ageneiosus* *pardalis*	*Chaenogobius* *gulosus*	*Centropyge* *joculator*

상기 "분석"은 "정량적 분석" 및 "정성적 분석"으로 나눌 수 있으며, 상기 "정량적 분석"은 혼합된 샘플상에서 특정 분류군이 어떤 비율을 차지하는지를 알아내는 것을 말한다. "정성적 분석"은 혼합된 샘플상에서 어떠한 생물종이 있는지 확인할 수 있음을 뜻한다. 상기 "분석"은 어류의 종류 분석, 어류의 비율 분석, 및 어류 분포지역 분석을 말한다. 어류 종류 분석은 채집한 샘플 시료에 있어서 특정 지역에 분포하는 어류의 종류에 관해 어떤 어류가 있는지를 확인하는 것을 말한다. 상기 어류 비율 분석은 동물 플랑크톤 대비 어류의 비율을 말하며, 예컨대 시료에 존재하는 어류종이 차지하는 비율을 말한다. 또한, 어류 분포지역 분석은 분석용 프라이머 세트를 이용하여 각 지역에서 수집된 시료를 증폭하여 어종의 비율을 분석함으로써 어종의 분포지역을 분석하는 것을 말한다.

상기 어류를 분석하기 위한 샘플은 어란(fish egg), 치어(the young of fishes), 유생(larva) 및 어류의 비늘 등과 같은 분비물에서 얻을 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 어류 분석 프라이머 세트를 제작하고, 상기 각 프라이머 세트를 이용하여 어류의 DNA를 증폭한 후 DNA 라이브러리를 구축하였다. 그 후, Illumina Miseq sequencer를 이용하여 어류의 DNA 서열을 분석하여 데이터를 구축하였다. 그 후 상기 데이터로 생성된 조립서열(354bp 내지 598bp)를 사용하여 Mitochondria DNA 데이터를 기반으로 하는 BLASTn search(상동성 = 97%)를 수행하여 어류의 종을 분석하였다. 본 발명의 어류 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 어류를 경제적이고 신속하며 대량으로 분류할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.

상기 (b)단계의 증폭은 PCR을 이용하여 15 내지 25회를 반복할 수 있으며, 바람직하게는 총 20회 반복하여 수행할 수 있다. 초기 변성은 94℃에서 3분; 변성은 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72 ℃에서 30초씩 20회 반복 수행하였고, 최종 연장은 72℃에서 3분간 수행 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 (c) 단계에서 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 것은 차세대 시퀀서(NGS)를 이용할 수 있고, 바람직하게는 Illumina Miseq sequencer를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 상기 "Illumina Miseq sequencer"는 기존의 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer) 기법을 이용하는 것 중 하나이다. 상기 NGS는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어내는 것으로, 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 고체상 증폭(solid-phase amplification)을 사용한다. 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법 (chemistry)을 그대로 유지하면서 장비의 가격이 낮고 다양한 응용성을 가지고 있어 경제적이다. 기존의 454 sequencer를 이용했을 때 하나의 COI 서열을 읽는데 드는 비용이 1센트 정도라면 본 발명에서 적용하는 Illumina Miseq sequencer는 2 x 300bp 에서 0.02 센트로 약 50배 정도의 가격 경쟁력을 가지게된다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 어류 분석을 위한 어류 DNA 유전자 라이브러리를 생성할 수 있다. 본 발명에서 '유전자 라이브러리'는 염색체의 전체 DNA를 제한효소 등으로 절단하여 얻게된 단편을 벡터에 도입한 집합 및 다양성을 지닌 유전자를 포함하고 있는 균주의 집합체로서 다양성은 한개 또는 다수의 유전자의 무작위적 변이 유도에 의하여 생성되거나 또는 유전체(genome)로부터 유래된 유전자의 집합체로부터 생성된 것을 말한다. 유전자 라이브러리는 유전자 은행과 동일하게 교환하여 사용이 가능하며, 염색체상의 모든 DNA 영역을 포함하고 있으므로 검색하고자 하는 어류 유전자의 클론을 라이브러리 속에서 찾을 수 있다. 이때, 검색 대상인 유전자에서 변이 유전자의 존재 비율은 묻지 않는다. 예를 들어, 100%가 야생형 유전자일수 있고, 50%가 야생형 유전자이고 나머지 50%가 변이 유전자일 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 1500 내지 2000종의 어종의 유전자를 공통적으로 증폭함으로써, 어류 분석을 위한 어류 DNA 유전자 라이브러리를 효과적으로 형성하고 이를 이후 차세대 시퀀서를 이용한 분석 등에 사용할 수 있도록 할 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 어류의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법을 제공한다.

본 발명의 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하면 MiSeq 플랫폼에 최적화된 사이즈를 증폭시켜 어류 분석을 위한 유전자 라이브러리를 효과적으로 구축할 수 있다.

본 발명의 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하면 기존에 등록되어있지 않은 어류 종의 유전자 염기서열을 확보하여 새로운 어류 유전자 데이터 베이스를 제작할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "유전자 데이터 베이스"는 유전자의 총합을 모은 뒤 이를 데이터 베이스화한 정보의 집합을 말하며, 유전체 정보은행인 미국 국립생물정보센터(NCBI)등에서 제공하는 유전자 정보를 말한다. 특히 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하면 기존의 차세대 시퀀서보다 시퀀싱 길이가 더 긴 서열을 효과적으로 종폭할 수 있어, 종래유전자 데이터 베이스상에 등록되어 있지 않은 새로운 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스를 효과적으로 제작할 수 있다.

본 발명의 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 약 670 내지 680bp의 유전자를 증폭할 수 있어, 상기 프라이머 세트를 이용하면 MiSeq 플랫폼보다 더 긴 서열을 증폭하여 분석할 수 있으며, 종래에 등록되어 있지 않은 새로운 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스를 효과적으로 제작할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 어란의 채집과 DNA 추출

산란, 부화된 난자치어(Eggs and Larvae)를 분류 또는 분석하기 위하여, 어란등이 포함된 플랑크톤 샘플을 채집하고, DNA를 추출하였다.

남부해역을 선정하고(도 1), CTD(Conductivity, Temperature, Depth)를 통하여 정점의 수온, 염분 등 해수의 특징을 관측하였다. 그 후, 봉고 네트(330㎛)를 이용하여 어란이 혼재되어있는 플랑크톤을 채집한 후 알코올로 고정하였다. 상기 채집된 샘플은 육안 관찰용과 DNA 분석용으로 나눈 뒤, 생물체량(g)을 측정하였다. 그 후, DNA 분석용 샘플을 균질기를 이용하여 균질화한 뒤, DNA를 추출하였다.

실시예 2. 어류 분석용 프라이머 제작

어류의 종을 분석하기 위하여 하기와 같이 프라이머를 디자인하였다.

2-1. 어류분석용 프라이머 제작

비교하는 서열이 길면 길수록 더 많은 종, 혹은 개체군의 비교가 가능하기 때문에 본 프라이머의 디자인에서 가장 중요한 첫번째 요소는 Illumina Miseq sequencer를 이용한 최대의 길이를 확보하는 것이다. Miseq 분석 시스템의 최대 판독 서열은 600 bp (300 + 300)이기 때문에, 약 300~600 bp로 증폭하는 프라이머 세트에 대한 보존 영역을 찾았다. 구체적으로, 전장 12S rDNA와 16S rDNA 유전자의 1,808개 핵산 시퀀스를 범용 프라이머로 디자인하기 위해 배열하였다. 상기 시퀀스 데이터를 이용한 어류 1,808 종에 디자인된 범용 프라이머는 어류의 분류학적 위치 및 종을 분류하기에 충분한 매우 가변적인 12S rDNA와 16S rDNA 증폭하도록 디자인하였으며(도 2), 어류 1,808 종을 대상으로 정방향 및 역방향 프라이머 영역의 염기서열을 비교 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 디자인된 어류 분석용 프라이머(서열번호 1 내지 3)를 하기 표 2에 나타내었다. 서열번호 1 및 2으로 이루어진 프라이머 세트는 350 내지 600bp를 증폭할 수 있어, Miseq 플랫폼에 최적화된 사이즈로 증폭시키며, 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트는 특히 670 내지 680bp의 유전자를 증폭할 수 있어 Miseq 플랫폼보다 더 긴 서열의 유전자 증폭이 가능하다.

Primer Name	서열번호	Sequences 5'-3'
정방향	서열번호 1	ACAYACCGCCCGTCACYCTC
역방향	서열번호 2	CATGATGCAAAAGGTACRRG
정방향	서열번호 3	CCMYCTAGAGGAGCCTGTYCTRDAA

실시예 3. 어류 분석용 프라이머 세트를 이용한 DNA 증폭 및 어류 분석을 위한 라이브러리 및 어류 유전자 데이터 베이스 제작

상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 어류의 DNA를 증폭한 후 각 DNA 라이브러리 및 유전자 데이터 베이스를 제작하였다.

3-1. 어류 분석용 프라이머 세트를 이용한 어류의 DNA 증폭

증폭은 서열번호 1, 2로 각각 표시되는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, PCR 반응액은 1μg의 채취한 어류의 DNA 샘플, 2μl의 F1(서열번호 1) 및 R1(서열번호 2) 프라이머(200pM), 4μl의 dNTPs (10 mM), 0.4μl의 Ex Taq Hot Start Version (2U)(Takara Bio Inc. Japan) 및 4μl의 10X buffer를 혼합하여 총 40μl으로 맞추어 이용하였다. PCR은 총 20회 반복하고 하기와 같은 조건으로 수행하였다: 초기 변성(initial denaturation)은 94℃에서 3분; 변성은 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 20회 반복 수행; 최종 연장은 72℃에서 3분간 수행. PCR 산물은 AccuPrep^® Gel Purification Kit(Bioneer, Republic of Korea)를 이용하여 정제한 후, 20μl의 용해 버퍼로 용해하였다.

그 후, 전기영동 장치를 이용하여 PCR 산물의 사이즈를 선별하여 PCR 과정 중 변성 단계에서 생긴 비 표적 유전자를 제거하였다. 이 후, 예상되는 사이즈(약 350-600 bp)를 포함하는 증폭 산물(Amplicons)을 an AccuPrep® Gel Purification Kit(Bioneer, Republic of Korea)를 이용하여 정제하였다. 그 후 정제된 증폭 산물은 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)을 이용하여 정성 및 정량 분석하였다.

3-2. DNA 라이브러리 구축 및 Illumina Miseq seruencer를 이용한 서열 분석

DNA 라이브러리는 Nextera XT index kit (Illumina, USA)를 이용하여 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 어류 DNA(약 350-600bp)를 포함하는 증폭 산물(Amplicons)을 주형으로 하여 Nextera XT indexing primer(N7XX 1ul, S5XX 1ul)를 사용하였다. 이후, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 이용하여 라이브러리 정량을 확인하였고, 시퀀싱은 Illumina Miseq (2 * 300 bp pair-ends)을 이용하여 어류의 DNA 서열 분석을 수행하였다.

3-3. DNA 데이터 베이스 제작 및 서열 분석

DNA 데이터베이스 구축을 위한 증폭은 서열번호 2 및 3으로 각각 표시되는 역방향 및 정방향 프라이머를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, PCR 반응액은 1μg의 채취한 어류의 DNA 샘플 및 2μl의 F2(서열번호 3) 및 R1(서열번호 2)을 이용하여 실시예 3-1과 동일한 조건으로 어류의 DNA를 증폭하고, 정제된 증폭 산물을 분석하였고, 라이브러리 제작용 프라이머로 구축한 표 1의 1808 종 외에 서열번호 2 및 3으로 각각 표시되는 역방향 및 정방향 프라이머를 이용하여 추가적으로 확보한 어류 데이터베이스를 표 3에 나타내었다.

연번	종명	연번	종명
1	Apogon lineatus	31	Muraenesox cinereus
2	Foetorepus altivelis	32	Bembras japonica
3	Gymnocanthus herzensteini	33	Neoditrema ransonnetii
4	Hemilepidotus gilberti	34	Setipinna tenuifilis
5	Lagocephalus wheeleri	35	Coelorinchus multispinulosus
6	Sarda orientalis	36	Hoplobrotula armata
7	Uraspis helvola	37	Maurolicus muelleri
8	Zoarces elongatus	38	Parascolopsis inermis
9	Acanthogobius flavimanus	39	Inimicus japonicus
10	Amblychaeturichthys hexanema	40	Narke dipterygia
11	Chelidonichthys kumu	41	Chaetodon modestus
12	Cleisthenes herzensteini	42	Uranoscopus japonicus
13	Dexistes rikuzenius	43	Cociella crocodila
14	Hapalogenys mucronatus	44	Erisphex pottii
15	Lepidotrigla alata	45	Scorpaena onaria
16	Pennahia argentata	46	Cynoglossus robustus
17	Pseudopleuronectes herzensteini	47	Paratrypauchen microcephalus
18	Pterois lunulata	48	Sphyraena pinguis
19	Saurida wanieso	49	Urolophus aurantiacus
20	Scyliorhinus torazame	50	Neobythites sivicola
21	Anisarchus medius	51	Uranoscopus bicinctus
22	Dasycottus setiger
23	Stichaeus nozawae
24	Hemitripterus villosus
25	Glyptocephalus stelleri
26	Lutjanus ophuysenii
27	Tanakius kitaharae
28	Blepsias cirrhosus
29	Platycephalus indicus
30	Niphon spinosus

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 2 및 3으로 각각 표시되는 역방향 및 정방향 프라이머을 이용하면 종래 데이터 베이스에 포함되지 않았던 어류 30종을 추가로 염기서열을 확보할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하면 효과적으로 새로운 어류 종에 대한 데이터 베이스를 제작할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 어류분석 결과

4-1. 데이터 분석을 통한 어류의 분류

상기 실시예 3에서 Illumina Miseq sequencer를 이용하여 얻은 데이터 중 어댑터/인덱스 및 QV = 20 서열은 CLC Genomics Workbench v8.0(CLC Bio, USA)를 이용하여 잘라내었다(도 4). Mothur software package v1.35.0(Schloss, Westcott et al. 2009)을 이용하여 6 bp를 초과하는 오버랩핑(overlapping) 서열 및 2 bp 미만의 미스매치가 있을 시에만 정방향 및 역방향을 조립하였다. 조립된 콘디그(contig)는 pdiffs=0 옵션 조건으로 Mothur software package v1.35.0을 이용하여 잘라내었다. 본 연구에 의해 생성된 콘디그 간의 오버랩핑 서열은 약 350-600 bp이기 때문에, 현재의 데이터 프로세스에 대한 영역을 사용하였다. 그 후 프라이머 영역 부분을 제거하고 잘려진 서열에 대한 어류의 종 배열은 NCBI(GenBank)의 데이터를 기반으로 하는 BLASTn search (상동성 = 97%) 결과를 이용하여 측정하였다. 상동성이 90% 미만인 BLASTn 검색 결과가 나타나면, 그 서열은 "unknown"로, 상동성이 90% 인 서열은 "-류"로 표기하였다. 그 결과를 도 5 내지 8 및 표 4에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용하여 남부해역의 어류를 분석한 결과 상동성 97% 이상인 서열이 약 82여 종임을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용하여 샘플에서 동물플랑크톤 대비 어류(어류의 난자치어(Eggs and Larvae)를 포함하는 플랑크톤의 샘플)의 비율이 상대적으로 많은 hot spot 지역을 확인하였고, 이를 이용해 어류 비율이 높은 지역에서 효율적으로 샘플을 채집하여 어류를 분류할 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용하여 샘플링 지역1에서 나타난 종 수는 unknown을 제외하고 총 17 종으로 멸치(Engraulis japonicas)- 21.18 %, 멸치류(Engraulis sp.)- 11.27 %, 꽁치류(Cololabis sp.)- 9.66 %, 샛멸(Glossanodon semifasciatus)- 7.53 %, 까나리(Ammodytes personatus)- 6.14 %, 볼락류(Sebastiscus sp.)- 4.84 %, 망치고등어(Scomber australasicus)- 4.04 %, 눈퉁멸(Etrumeus micropus)- 3.42 %, 넙치류(Microstomus sp.)-3.15 %, 방어(Seriola quinqueradiata)- 2.83 %, 동가리류(Parapercis sp.)- 2.43 %, 황매퉁이류(Trachinocephalus sp.)- 2.43 %, 황아귀(Lophius litulon)- 1.93 %, 꼬리투라치(Trachipterus trachipterus)- 1.22 %, 정어리(Sardinops melanostictus)- 1.22 %, 까나리류(Ammodytes sp.)- 1.22 %, 용가자미(Hippoglossoides pinetorum)- 1.22 %로 확인하였다.

샘플링지역 2에서는 멸치(Engraulis japonicas)-14.29 %, 쏨뱅이(Sebastiscus marmoratus)- 10.76 %, 물가자미(Eopsetta grigorjewi)- 9.37 %, 볼락류(Sebastiscus sp.)- 9.04 %, 도화망둑(Amblychaeturichthys hexanema)- 8.21 %, 멸치류(Engraulis sp.)- 7.80 %, 용서대(Cynoglossus abbreviates)- 6.11 %, 성대류(Lepidotrigla sp.)- 3.87 %, 까나리(Ammodytes personatus)- 3.37 %, 넙치(Paralichthys olivaceus)- 3.05 %, 황매퉁이류(Trachinocephalus sp.)- 2.31 %, 얼룩통구멍(Uranoscopus japonicas)- 2.31 %, 물가자미류(Eopsetta sp.)- 1.91 %, Leptoclinus sp. - 1.31 %, 망치고등어(Scomber japonicas)- 0.82 %, 방어류(Seriola sp.)- 0.82 %, 망둑류(Amblychaeturichthys sp.)- 2.47 %, Diaphus sp. - 0.82 %, 방어(Seriola quinqueradiata)- 0.82 %, 줄비늘치류(Coelorinchus sp.)- 0.82 %, 도루묵(Arctoscopus japonicas)- 0.82 %, 까나리류(Ammodytes sp.)- 0.82 % 로 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 어류 분석용 프라이머 세트를 이용하여 형태적으로 구분하기 어려운 유사종인 방어(Seriola lalandi)와 부시리(Seriola quinqueradiata)의 유전자형를 분석한 결과, 유전자 형은 총 4개로 부시리의 유전자형 1개와 방어의 유전자형 3개를 확인하였다. 또한, 부시리의 경우 샘플링 지역 중 3, 5 지역에 분포하며 방어는 1~9 모든 샘플링 지역에 분포하고 있음을 확인하였으며, 각 지역에서의 방어 및 부시리의 비중을 확인하였다.

Speices /Group	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Alcichthys alcicornis						0.95			0.50
Amblychaeturichthys hexanema		8.21	3.33			12.59	1.64	15.00	3.38
Amblychaeturichthys sp .		2.47				3.61		7.01
Ammodytes personatus	6.14	3.37	4.46
Ammodytes sp .	1.22	0.82
Arctoscopus japonicus		0.82
Aulopus japonicus				3.48	6.22		2.45	1.63	5.31
Auxis rochei									0.79
Benthosema sp .					4.67	0.95	5.36		6.08
Callanthias japonicas					6.45		4.91	1.03
Callionymus enneactis							1.12
Choerodon azurio									1.15
Cociella crocodile					0.59
Coelorinchus sp .		0.82							5.62
Cololabis sp .	9.66
Coryphaena hippurus					1.53				0.50
Cynoglossus abbreviatus		6.11	0.90	9.09
Cynoglossus robustus						3.01
Cypselurus sp .									4.48
Dasycottus setiger						1.50
Dasycottus sp .			1.80
Dexistes rikuzenius						2.67
Diaphus sp .		0.82			5.55	1.90	8.15		1.98
Engraulis japonicus	21.18	14.29	15.83	16.38	7.81	16.55	9.88	16.16	9.01
Engraulis sp .	11.27	7.80	8.55	7.19	1.96	6.36	4.65	16.62	5.00
Eopsetta grigorjewi		9.37							0.50
Eopsetta sp .		1.91
Erisphex pottii									0.50
Etrumeus micropus	3.42				2.78		1.99		2.96
Glossanodon semifasciatus	7.53
Gymnocanthus herzensteini			2.53					1.63
Hexagrammos sp .			2.33
Hippoglossoides pinetorum	1.22
Hoplobrotula armata					0.59	2.20			2.72
Istiophorus sp .								2.05
Lagocephalus gloveri									0.99
Lepidotrigla guentheri					0.59
Lepidotrigla sp .		3.87			4.30		0.71
Leptoclinus sp .		1.31
Liparis tanakae						2.85
Lophius litulon	1.93					4.46
Microstomus sp .	3.15
Muraenesox cinereus									1.39
Myctophum asperum			2.99	2.26	8.54	9.04	0.71		4.18
Myctophum sp .					2.25
Niphon spinosus						0.95		2.66
Pagrus sp .					3.25		5.82
Pampus argenteus						3.28
Paralichthys olivaceus		3.05
Parapercis multifasciata				1.54	1.53
Parapercis sp .	2.43
Pseudopleuronectes yokohamae				3.08
Sardinops melanostictus	1.22
Saurida elongate						1.50
Scomber australasicus	4.04		10.34			2.45	6.75		3.82
Scomber japonicus		0.82	4.13	3.60
Scopelosaurus sp .				4.77
Scyliorhinus torazame						0.95
Sebastes inermis									0.50
Sebastes sp .			1.80	5.81				9.90
Sebastes steindachneri			0.90
Sebastes thompsoni			11.38	8.54		2.45
Sebastes trivittatus								3.91	1.94
Sebastiscus marmoratus		10.76	3.33	12.26	4.67	1.50
Sebastiscus sp .	4.87	9.04	2.33	11.61
Seriola lalandi			8.86		4.07
Seriola quinqueradiata	2.83	0.82	3.33	0.97	8.93	2.20	7.25	1.03	7.48
Seriola sp .		0.82			3.69		1.42		3.19
Trachinocephalus sp .	2.43	2.31	4.02	2.73	1.37	5.78	11.15	2.66	0.79
Trachipterus trachipterus	1.22
Trachurus japonicus						2.45	8.94		5.28
Trachurus sp .									0.99
Trichiurus sp .					5.72		6.69	5.97
Unknown	14.26	8.05	3.60	6.69	8.54	5.91	10.41	12.76	6.86
Upeneus japonicus			1.43						7.17
Upeneus sp .									3.47
Uranoscopus bicinctus									0.50
Uranoscopus japonicas		2.31	1.80
Uraspis helvola									0.50
Urolophus aurantiacus						1.90
Ventrifossa garmani					4.40
Zoarces gillii									0.50
합	100	100	100	100	100	100	100	100	100
OTU수	18	23	22	16	24	26	19	15	33

상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 바다에 존재하는 매우 다양한 종의 어류를 한꺼번에 효과적으로 증폭할 수 있으므로, 증폭산물분석을 통해 특정 해역에 존재하는 어종을 효과적으로 검출하고 이를 분류할 수 있을 뿐만 아니라, 관심대상 지역의 어종 분포까지 확인할 수 있음을 확인하였다.

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> The primer set for identification of fish and methods for their qualitative and quantitative analysis <130> 1-46P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer sequence <400> 1 acayaccgcc cgtcacyctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer sequence <400> 2 catgatgcaa aaggtacrrg 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence for making gene data base <400> 3 ccmyctagag gagcctgtyc trdaa 25

Claims

서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 어류 분석용 조성물로, 상기 어류 분석은 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 어류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 어류의 12S rDNA 및 16S rDNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 어류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 300 내지 600bp의 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는, 어류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 1500 내지 2000종 어류의 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 어류 분석용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 어류는 하기 표 1에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 어류 분석용 조성물.
[표 1]
삭제
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 어류 분석용 키트로, 상기 어류 분석은 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 어류 분석용 키트.
(a) 어류의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하고, 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 분석하는 어류 분석 방법.
제8항에 있어서, 상기 (c)단계의 분석은 차세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, NGS)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 어류 분석 방법.
서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 어류 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물로, 상기 어류 분석은 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 어류 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물.
(a) 어류의 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법으로, 상기 어류 분석은 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 어류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법.
서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 분석하는 어류 분석을 위한 유전자 데이터 베이스 제작용 조성물.
(a) 어류의 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 어류 분석용 유전자 데이터 베이스 제작 방법으로, 상기 어류 분석은 어류의 종류, 어류의 비율, 및 어류의 분포지역 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 어류 분석용 유전자 데이터 베이스 제작 방법.