KR102367357B1 - 어류의 dna 바코딩과 메타바코딩을 위한 미토콘드리아 16s 리보솜 rna 유전자의 pcr 증폭반응을 수행하고 dna 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 세트 및 어댑터 - Google Patents

어류의 dna 바코딩과 메타바코딩을 위한 미토콘드리아 16s 리보솜 rna 유전자의 pcr 증폭반응을 수행하고 dna 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 세트 및 어댑터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어류를 대상으로 DNA 바코딩(barcoding)과 메타바코딩(metabarcoding)을 수행하기 위해 게놈 DNA 또는 환경 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머(primer) 조합들과 어댑터들에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어류의 미토콘드리아 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 유전자(16S rDNA)의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 조합과 어댑터에 관한 것이다.
본 발명은 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 높여 다양한 어종들의 동정을 용이하게 할 수 있어 어류의 분자계통학적, 생태학적 연구 등에 유용하게 사용된다.

Description

어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위한 미토콘드리아 16S 리보솜 RNA 유전자의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 세트 및 어댑터{PCR primer sets and adapters for amplifying and sequencing mitochondrial ribosomal RNA gene used for DNA barcoding and metabarcoding of fishes}
본 발명은 어류를 대상으로 DNA 바코딩(barcoding)과 메타바코딩(metabarcoding)을 수행하기 위해 게놈 DNA 또는 환경 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머(primer) 세트들과 어댑터들에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어류의 미토콘드리아 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 유전자(16S rDNA)의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 세트와 어댑터에 관한 것이다.
최근 DNA 바코딩 분야가 생물들의 종식별을 위한 방법으로 각광을 받고 있다. DNA 바코딩이란 생물종 고유의 특징적인 짧은 DNA 염기서열을 해독하고 그 정보를 이용하기 때문에 생물종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.
이는 국제적으로 표준화된 방법으로서, 전통적인 형태적 특징들에 근거한 종동정을 보완하며, 형태를 파악하기 불가능한 생물종의 조직 일부를 이용하여 분석할 수도 있어 그 활용범위가 점점 확대되고 있다. DNA 바코딩은 DNA 바코딩 프로젝트(The Consortium for the Barcode of Life (CBOL http://www.barcodeoflife.org/))에 의해 수행되고 있으며, 분석하려는 분류군에 적합한 우수한 PCR 프라이머 조합이 필요하다.
2003년 캐나다 구엘프대학의 P. Hebert가 영국왕립학회지에 발표한 논문 "Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc. R. Soc. B 270: 596-599"에서 처음 DNA 바코딩이란 용어를 공식적으로 사용하였다. 이때 모든 진핵생물의 세포 내에 존재하는 세포소기관인 미토콘드리아 유전체(mitochondrial genome)를 구성하는 유전자들 중에서 사이토크롬 씨 옥시다아제 1 (cytochrome c Oxidase 1; CO1) 유전자를 사용하며, 그로부터 해독되는 DNA 염기서열의 총 길이는 약 650bp이다. 이 방법에 따라 생물종들의 DNA 염기서열이 해독되고 데이터베이스에 그 정보가 축적된다면 기존의 어렵고 때때로 불명확하며 고도로 전문적인 형태적 특징들에 근거한 분류학적 기술을 의존하지 않더라도 간단히 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하는 것만으로 목적으로 하는 시료의 종을 쉽게 식별할 수 있게 된다.
실제 척추동물을 비롯한 무척추동물의 알, 새끼 등은 특징적인 형태형질들이 부족하여 종식별이 불가능한 경우가 많다. 그러나 이들에 공통적으로 존재하는 미토콘드리아 CO1 유전자를 대상으로 하는 DNA 바코딩의 방법은 생물종의 발생단계에 영향을 받지 않는다. 이와 더불어 박물관 등의 오래된 표본시료, 가공되거나 변형된 식품첨가물 등에서도 DNA 염기서열을 해독할 수 있는 점에서 기존 형태분류의 한계를 넘어선 새로운 종식별 수단으로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 생물종의 생태학적, 생태적, 발생학적, 생물지리적 연구, 가공되거나 변형된 식품첨가물의 이력추적 등 다양한 분야들에서 활용되고 응용될 가능성이 크다.
일반적으로 어류의 DNA 바코딩을 위한 일련의 분석과정은 먼저 분석하고자 하는 어종에서 게놈 DNA를 추출하고, 유전체 중의 특정 유전자 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고, 그로부터 생산된 PCR 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하며, 그로부터 얻어진 DNA 염기서열을 전세계적으로 공개된 유전정보 데이터베이스에서 비교하여 종식별을 수행한다(도 1).
이러한 일련의 분석과정 중에서 가장 중요한 단계는 PCR 증폭반응이며 이 과정을 성공적으로 수행하는 데 필요한 핵심요소는 모든 어류에 공통으로 적용할 수 있는 범용 프라이머(primer) 조합을 설계하는 것이다. 실제 어류의 DNA 바코딩을 위해 연구 또는 분석하려는 어종의 분류학적 위치에 따라 여러 가지 프라이머 조합들을 설계해야 한다. 또한, 기존 프라이머 조합을 이용할 경우, 일부 어종에서는 PCR 증폭산물이 전혀 생산되지 않거나 PCR 증폭효율이 현저히 낮은 경우가 흔하게 발생한다.
구체적으로 어류의 DNA 바코딩을 위해 개발된 기존 프라이머 조합이 결합하여 작용하는 위치는 어종들 사이의 유전적 변이가 비교적 많아 이를 이용하여 PCR 증폭반응을 수행할 경우 그로부터 PCR 증폭산물이 전혀 생산되지 않거나 PCR 증폭효율이 낮은 경우가 흔하게 발생한다. 또한 신규 미토콘드리아 CO1 영역의 PCR 프라이머 조합들(한국등록특허 제10-1955124호)은 그 PCR 증폭산물의 길이가 길어 DNA 메타바코딩 분석에 사용되는 HiSeq® Platform, MiSeq® Platform (Illumina, 미국) 등과 같은 차세대염기서열분석장치에 적용이 어려우며, DNA 메타바코딩 분석의 경우는 미토콘드리아 CO1 영역보다 16S rDNA 영역이 더 유리하다고 보고되고 있다(Deagle et al. 2014). 한편, 본 발명의 신규 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 프라이머 조합들은 기존의 해산어류에 국한되지 않고 해산어류와 담수어류에 모두 적용할 수 있어 범용성이 더 우수하다.
DNA 메타바코딩(metabarcoding)은 환경바코딩(environmental barcoding)이라고도 불리며 일반적으로 생물의 조직 일부를 이용하여 분석하는 DNA 바코딩과 달리 분류학적 정보, 조직시료의 유무, 오염, 변질 등에 관계없이 실질적인 생물다양성을 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 또한 분류군별 범용적이고 특이적 PCR 프라이머 조합들과 PCR 증폭기술, 차세대염기서열분석법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 HTS (High-throughput Sequencing) 기술을 결합하여 사용하면 개방형 또는 폐쇄형 생태계 안의 모든 생물종의 DNA 염기서열을 적은 비용으로 분석할 수 있다. 따라서 생태계 내에 서식하는 모든 생물종의 종조성, 다양성 등을 온전히 분석할 수 있으며, 세균과 진핵생물의 생물다양성 분석에 관한 일련의 연구들을 통해 그 유용성이 충분히 입증되었다. 특히 전통적인 생물의 채집과 순수배양 또는 분리, 고도의 분류학적 지식에 의존하지 않으며, 환경유기물(환경DNA 포함), 포식동물의 배설물 등과 같이 생물종의 조직 일부만 남아있어 분류할 수 없었던 시료들에도 적용할 수 있다. 또한, 멸종위기종, 희귀종, 미기록종 등의 서식과 출현 여부를 비침식적으로(non-invasive) 파악할 수 있으며, 이를 바탕으로 새로운 모니터링 전략을 수립할 수 있다. 세균, 경골어류(척추동물), 육상식물, 산호류 등과 같은 주요 분류군별 범용적이고 특이적인 PCR 프라이머 조합을 적용하는 경우 더 정밀하고 해상력 높은 분석이 가능하다.
한편 이러한 DNA 메타바코딩 분석용 PCR 프라이머 조합은 PCR 증폭산물의 길이가 비교적 짧아야 하며(약 150-500 bp) (HiSeq® Platform 또는 MiSeq® Platform 사용시), 범용성이 우수하여 분석하려는 분류군에 속하는 모든 생물종을 균일하게 증폭할 수 있어야 한다. 또한, 해상력이 높고 유전적 변이가 적당히 많아 종수준까지 쉽게 구별할 수 있어야 하며, 때로는 특이성이 높아 특정 분류군들의 PCR 증폭을 선택적으로 배제할 수 있어야 한다. 그러나 기존의 기술들은 어류와 분류학적으로 먼 분류군들의 DNA 바코딩 또는 종식별을 위해 개발되었기 때문에 어류의 DNA 바코딩에 직접 활용하기는 부적절하다. 또한, 기존에 DNA 메타바코딩 분석을 위해 개발된 프라이머 조합은(MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. R. Soc. Open Sci. 2: 150088) 미토콘드리아 12S rDNA 영역을 대상으로 하고 있으나 해상력이 낮고 유전적 변이가 적어 종수준까지 쉽게 구별하기 어렵다.
따라서 어류의 DNA 바코딩과 DNA 메타바코딩 분석시 해상력이 높고 유전적 변이가 적당히 많아 종수준까지 쉽게 구별할 수 있으며 어류만 범용적이면서 특이적으로 분석하기 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 조합의 개발이 필요하다.
한국등록특허 제10-1232878호 한국등록특허 제10-1212326호 한국등록특허 제10-1537165호
본 발명은 어류 조직의 DNA 바코딩 분석과 어류가 서식하고 있는 환경수의 DNA 메타바코딩 분석을 수행하기 위해 필수적인 분석과정인 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 높이고, 그로부터 생산된 PCR 증폭산물에서 DNA 염기서열을 쉽고 간편하게 해독하기 위한 신규 프라이머 세트들과 어댑터들을 제공하는 데 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 어류의 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 핵심요소인 PCR 프라이머 조합들과 DNA 염기서열의 해독을 쉽게 하는 어댑터들을 제공하며, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩 분석을 수행할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 2 중 어느 하나 이상의 정방향 프라이머; 및 서열번호 3 내지 4 중 어느 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 정방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머를 어댑터로 부착한 정방향 프라이머 결합체; 및 상기 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 부착한 역방향 프라이머 결합체를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하여 사용할 경우 DNA 염기서열의 해독이 훨씬 쉽고 정확하다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 PCR 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하기 위한 키트를 제공한다.
아울러 본 발명은 (a) 어류로부터 게놈 DNA (genomic DNA)를 추출하거나 환경수로부터 환경 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 추출된 게놈 DNA 또는 환경 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 PCR 증폭반응에 의해 생산된 PCR 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하는 단계를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 DNA 염기서열을 해독하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 어류의 DNA 바코딩 또는 메타바코딩 영역의 DNA 염기서열을 해독하기 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행할 수 있는 신규 프라이머 세트들은, 미토콘드리아 CO1 영역의 PCR 증폭반응을 수행할 수 있는 기존의 프라이머 세트들과 비교하여 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성이 높고 범용성이 더 우수하여 서식지와 관계없이 훨씬 다양한 어종들을 식별하는 것이 가능하며, 더 다양한 길이의 DNA 염기서열을 해독할 수 있어 어종들 사이의 유전적 변이와 분자계통학적 관계를 더 정확하게 파악하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하여 사용할 경우 DNA 염기서열의 해독이 훨씬 쉽고 정확하다. 아울러 DNA 바코딩 분석을 통해 얻은 각 어종의 DNA 염기서열은 메타바코딩 분석에 필수적인 참조서열(reference sequence) 데이터베이스를 제공할 수 있다.
도 1은 DNA 바코딩과 메타바코딩의 분석과정을 나타낸다.
도 2는 기존 PCR 프라이머 조합을 이용하여 어류 21종들의 게놈 DNA를 대상으로 DNA 바코딩 분석을 위해 미토콘드리아 CO1 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 신규 PCR 프라이머 세트, 즉 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 어류 21종들의 게놈 DNA을 대상으로 DNA 바코딩 분석을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 신규 PCR 프라이머 세트, 즉 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 어류 21종들의 게놈 DNA을 대상으로 DNA 바코딩 분석을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 신규 PCR 프라이머 세트, 즉 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 어류 21종들의 게놈 DNA을 대상으로 DNA 바코딩 분석을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 신규 PCR 프라이머 세트, 즉 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 어류 21종들의 게놈 DNA을 대상으로 DNA 바코딩 분석을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 대표적인 해산어류인 뱀장어(AGTC-FM-0038)와 철갑상어(AGTC-FM-0002)를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 각각 결합하고 이들을 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 서열번호 5와 서열번호 6을 사용하여 해독하고 컨티그(contig)를 제작한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 대표적인 해산어류인 붕장어(AGTC-FM-0003)와 실고기(AGTC-FM-0035)를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 각각 결합하고 이들을 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 서열번호 5와 서열번호 6을 사용하여 해독하고 컨티그(contig)를 제작한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 대표적인 담수어류인 대륙송사리(AGTC-FF-0017)와 메기(AGTC-FF-0092)를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 각각 결합하고 이들을 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하고 서열번호 5와 서열번호 6을 사용하여 컨티그(contig)를 제작한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 대표적인 담수어류인 가숭어(AGTC-FF-0016)와 독중개(AGTC-FF-0020)를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 각각 결합하고 이들을 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하고 서열번호 5와 서열번호 6을 사용하여 컨티그(contig)를 제작한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 환경수인 해수에서 추출된 환경 DNA를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 환경수인 해수에서 추출된 환경 DNA를 대상으로 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 하나인 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행한 후, 차세대염기서열분석장치들 중 하나인 MiSeq® Platform (Illumina, 미국)을 이용하여 그 증폭산물의 DNA 메타바코딩 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 DNA 염기서열을 해독하는 데 있어서 필수적인 분석단계인 PCR 증폭반응에서 핵심요소인 신규 프라이머 세트들과 어댑터들의 활용에 관한 것이다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 상세히 설명한다.
기존 프라이머 조합들은 PCR 증폭반응 시에 어류의 미토콘드리아 유전체를 구성하는 유전자 중 CO1 영역 안에 위치하는 주형 DNA 염기서열과 상보적으로 결합하도록 설계되어 있다. 이때 프라이머가 결합하는 부위들은 어종들 사이의 유전적 변이가 많이 축적되어 있어 보존성이 비교적 낮다. 따라서 기존 프라이머 조합들의 올리고염기서열은 어류 미토콘드리아 유전체의 DNA 염기서열과 완전히 일치하지 않는 경우가 흔하게 발생하므로 모든 어종에서 PCR 증폭반응이 성공적으로 일어날 확률이 낮아지고 일부 어종들에서는 생산되는 PCR 증폭산물의 양이 적어 효율성이 낮아지므로 이후 그들의 DNA 염기서열을 해독하는 데 어려움이 따른다.
그러나 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들은 미토콘드리아 유전체를 구성하는 유전자 중 16S rDNA 영역 안에 위치하는 주형 DNA 염기서열과 상보적으로 결합하도록 설계되어 있다. 이때 프라이머가 결합하는 부위들은 어종들 사이의 유전적 변이가 적게 축적되어 있어 보존성이 비교적 높다. 따라서 신규 프라이머 세트들의 올리고염기서열은 어류 미토콘드리아 유전체의 DNA 염기서열과 완전히 일치하는 경우가 많으므로 모든 어종에서 PCR 증폭반응이 성공적으로 일어날 확률이 높고 그 PCR 증폭산물의 양도 많아 효율성이 높으므로 이후 그들의 DNA 염기서열을 해독하기 쉽다.
특히 서열번호 1 내지 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3 내지 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하여 PCR 증폭반응을 수행하면 이후 DNA 염기서열을 더욱 편리하고 정확하게 해독할 수 있다.
이와 더불어 본 발명에 따른 신규 프라이머 세트들 중 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 사용하거나 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용할 경우 그 PCR 증폭산물의 크기가 적절하여 각각 차세대염기서열분석장치의 일종인 HiSeq® Platform 내지 MiSeq® Platform (Illumina, 미국)를 이용한 DNA 메타바코딩 분석이 가능하다.
상기와 같이 신규 프라이머 세트들을 설계하고 기존 프라이머 조합과 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 비교하기 위해 다양한 어류 조직들과 환경수를 대상으로 PCR 증폭반응을 수행한 후 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하는 일련의 실험을 진행하였다.
<실시예>
1. DNA 바코딩 분석
1.1. 어류 표본정보
우리나라 하천에서 담수어류를 채집하였고, 수산시장 등에서 해산어류를 구매하여 어류 21종들의 표본들을 확보하였고 그 정보를 표 1에 나타내었다.
표본번호 종명 국명 분류군 비고
AGTC-FM-0038 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 해산어류
AGTC-FM-0037 Chimaera phantasma 은상어 은상어목 은상어과 해산어류
AGTC-FM-0002 Acipenser baerii 철갑상어 철갑상어목 철갑상어과 해산어류
AGTC-FM-0003 Conger myriaster 붕장어 뱀장어목 붕장어과 해산어류
AGTC-FM-0035 Syngnathus schlegeli 실고기 실고기목 실고기과 해산어류
AGTC-FM-0009 Lophiomus setigerus 아귀 아귀목 아귀과 해산어류
AGTC-FM-0006 Salmo salar 대서양연어 연어목 연어과 해산어류
AGTC-FM-0005 Engraulis japonicus 멸치 청어목 멸치과 해산어류
AGTC-FM-0020 Paralichthys olivaceus 넙치 가자미목 넙치과 해산어류
AGTC-FM-0011 Trachurus japonicus 전갱이 농어목 전갱이과 해산어류
AGTC-FM-0033 Fowleria variegata 동갈돔류 쿠르투스목 동갈돔과 해산어류
AGTC-FM-0007 Gadus macrocephalus 대구 대구목 대구과 해산어류
AGTC-FM-0023 Takifugu porphyreus 흑밀복 복어목 참복과 해산어류
AGTC-FF-0017 Oryzias sinensis 대륙송사리 동갈치목 송사리과 담수어류
AGTC-FF-0019 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과 담수어류
AGTC-FF-0092 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 담수어류
AGTC-FF-0014 Plecoglossus altivelis 은어 바다빙어목 바다빙어과 담수어류
AGTC-FF-0016 Liza haematocheila 가숭어 숭어목 숭어과 담수어류
AGTC-FF-0020 Cottus koreanus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 담수어류
AGTC-FF-0136 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 담수어류
AGTC-FF-0018 Gasterosteus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 담수어류
1.2. 게놈 DNA 추출
확보된 어류 21종들의 지느러미 조직시료를 적당한 크기로 잘라내고 DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen, 독일) 등을 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 정제하였다. 분광광도계를 이용하여 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 확인하고 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.
1.3. 기존 범용 프라이머 조합을 이용한 PCR 증폭반응
Ivanova et al.(2007)에 따른 기존 PCR 프라이머 조합을 이용하여 어류의 미토콘드리아 CO1 영역의 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 AccuPower ® PCR PreMix (바이오니아, 대한민국)를 사용하여 아래와 같이 PCR 반응액을 조제하였다(표 2). 이때 정방향 프라이머로 VF2_t1와 FishF2_t1을 함께 혼합하여 사용하였고, 역방향 프라이머로 FishR2_t1와 FR1d_t1을 함께 혼합하여 사용하였으며, 이들 프라이머의 올리고염기서열을 표 3에 나타내었다.
조성물 첨가량(단독 기준) 첨가량(21개 기준)
게놈 DNA (20 ng/μl) 1 μl 21 μl
정방향 프라이머 (5 pmol) 1 μl 21 μl
역방향 프라이머 (5 pmol) 1 μl 21 μl
멸균증류수 17 μl 357 μl
총량 20 μl 420 μl
프라이머 올리고염기서열 정보(5‘→3’) 방향성
VF2_t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 정방향
FishF2_t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC 정방향
FishR2_t1 CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 역방향
FR1d_t1 CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA 역방향
PCR 증폭반응장치 ProFlex PCR System (Life Technologies, 미국)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR 증폭반응을 수행하였으며, 그 조건은 아래 표 4에 나타내었다.
반응 온도 시간 횟수
초기변성 95°C 3분 1
변성 95°C 30초 35
결합 55°C 30초
신장 72°C 40초
최종신장 72°C 2분 1
기존 프라이머 조합(Ivanova et al. 2007)의 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 확인하기 위해 어류 21종들의 게놈 DNA를 대상으로 미토콘드리아 CO1 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과 어류 21종들 중에서 16종들에서만 예상되는 크기(약 650bp)의 PCR 증폭산물들이 명확하게 생산되었고, 나머지 5종들에서는 PCR 증폭산물들이 생산되지 않았거나 비교적 희미한 PCR 증폭산물들이 생산되었다.
1.4. 신규 프라이머 세트들을 이용한 PCR 증폭반응
본 발명에서 신규로 개발된 PCR 프라이머 세트들을 이용하여 어류의 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 표 2와 같이 PCR 반응액을 조제하였다. 이때 정방향 프라이머로 서열번호 1 내지 2를 사용하였고, 역방향 프라이머로 서열번호 3 내지 4를 사용하였으며, 이들 프라이머의 올리고염기서열을 표 5에 나타내었다. 또한, 이들 정방향과 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 각각 서열번호 5 내지 6의 프라이머를 어댑터로 부착하였으며, 이들 어댑터의 올리고염기서열을 표 6에 나타내었다.
서열번호 올리고염기서열 정보(5‘→3’) 방향성
1 CYYGTACCTTTTGCATCATG 정방향
2 AGACGAGAAGACCCTDTGGA 정방향
3 CTGTTATCCCTDGGGTAACT 역방향
4 TCCGGTCTGAACTCAGATCA 역방향
서열번호 올리고염기서열 정보(5‘→3’) 방향성
5 AGTCATGCGCATTCAGGT 정방향
6 CTGACGATTACGGACTTGAC 역방향
PCR 증폭반응장치 ProFlex PCR System (Life Technologies, 미국)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR 증폭반응을 수행하였으며, 그 조건은 아래 표 7에 나타내었다.
반응 온도 시간 횟수
초기변성 95°C 3분 1
변성 95°C 30초 35
결합 55°C 30초-1분 30초
신장 72°C 40초
최종신장 72°C 2분 1
신규 프라이머 세트들, 즉 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 사용한 경우, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용한 경우, 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 사용한 경우, 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용한 경우의 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 확인하기 위해 어류 21종들의 게놈 DNA를 대상으로 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 각각 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다. 그 결과 모든 프라이머 세트들에서 예상되는 크기(각각 약 1,180 bp, 약 1,320 bp, 약 250 bp, 약 400 bp)의 PCR 증폭산물들이 생산되었다.
또한, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하여 이들 프라이머 세트들을 PCR 증폭반응에 사용했을 때도 위와 동일한 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 보였다. 그 결과 모든 프라이머 세트들에서 예상되는 크기(각각 약 1,220 bp, 약 1,360 bp, 약 290 bp, 약 440 bp)의 PCR 증폭산물들이 생산되었다.
AccuPrep ® PCR Purification Kit (바이오니아, 대한민국)을 사용하여 이들 PCR 증폭산물들을 정제하였다.
1.5. DNA 염기서열해독
본 발명에서 신규로 개발된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하고 이들 PCR 프라이머 세트들을 이용하여 어류의 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하였고, 그 PCR 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하였다. 그러나 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 각각 어댑터로 부착하는 것은 본 실시예에만 제한적으로 적용되지 않으며 모든 프라이머 세트들에 동일하게 적용되며 동일한 결과를 얻을 수 있다.
이들 정제된 PCR 증폭산물들 중에서 대표적으로 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 어댑터와 서열번호 6의 어댑터를 각각 결합하고 이들을 사용하여 PCR 증폭반응을 수행하였다. BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, 미국)과 DNA Analyzer 3730xl (Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 그로부터 생산된 PCR 증폭산물들의 DNA 염기서열을 해독하였다. 이때 정방향 프라이머에 부착된 서열번호 5의 프라이머와 역방향 프라이머에 부착된 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 cycle sequencing 반응을 수행하였다. 분석이 완료된 원본데이터는 BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/ bioedit.html) (Biological Sequence Alignment Editor) (Hall 1999)를 이용하여 오류를 수정하고 불필요한 부분을 적절히 잘라낸 후 콘티그(contig)를 만들어 전장 DNA 염기서열을 최종적으로 얻었다.
도 7 내지 10은 어류 21종들 중에서 대표적 해산어류인 뱀장어(AGTC-FM-0038), 철갑상어(AGTC-FM-0002), 붕장어(AGTC-FM-0003), 실고기(AGTC-FM-0035)와 대표적 담수어류인 대륙송사리(AGTC-FF-0017), 메기(AGTC-FF-0092), 가숭어(AGTC-FF-0016), 독중개(AGTC-FF-0020)를 대상으로, 서열번호 1의 정방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머를 어댑터로 부착한 정방향 프라이머 결합체와 서열번호 4의 5‘ 말단에 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 부착한 역방향 프라이머 결합체를 이용하여 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 PCR　증폭산물들의 DNA 염기서열을 해독하였던 결과를 나타낸 것이다. 해독된 DNA 염기서열의 총 길이는 1,116~1,155 bp의 범위를 보였다. 이들을 이용하여 미국 국립생물정보센터(National Center of Biotechnology Information, NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST 검색을 수행하였던 결과 모두 동일속의 동일종과 가장 높은 유전적 유사도를 보였다.
2. DNA 메타바코딩
2.1. 환경수 채집과 환경 DNA 추출
우리나라 경상남도 통영시에서 멸균된 채수병을 이용하여 환경수를 채집하였고, cellulose nitrate 막여과지, 유리섬유(glass fiber) 여과지 등을 이용하여 환경수 안의 환경 DNA를 농축하였으며, DNeasy® Tissu & Blood Kit (Qiagen, 독일) 등을 이용하여 환경 DNA를 추출하고 정제하였다.
2.2. 신규 프라이머 세트들을 이용한 PCR 증폭반응
본 발명에서 신규로 개발된 PCR 프라이머 세트들, 즉 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 환경 DNA에서 어류의 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 AccuPower ® Pfu PCR PreMix (바이오니아, 대한민국)를 사용하여 표 2와 같이 PCR 반응액을 조제하였다. 이때 차세대염기서열분석용 어탭터의 올리고염기서열은 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, 미국)을 참조하였고, 이들을 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 부착하여 사용하였다. PCR 증폭반응장치 ProFlex PCR System (Life Technologies, 미국)을 이용하여 표 4의 조건으로 PCR 증폭반응을 수행하였다.
신규 프라이머 세트, 즉 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성을 확인하기 위해 환경 DNA를 대상으로 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 아가로즈겔 전기영동을 수행한 결과를 도 11에 나타내었다. 그 결과 예상되는 크기(약 420 bp)의 PCR 증폭산물이 생산되었다.
AccuPrep ® PCR Purification Kit (바이오니아, 대한민국)을 사용하여 생산된 PCR 증폭산물을 정제하였다.
2.3. 차세대염기서열분석
Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent Technologies, Inc. 미국)과 Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina 미국)를 이용하여 PCR 증폭산물에 인덱스를 붙이는 2차 PCR 증폭반응을 수행하였다. 차세대염기서열분석장치들 중 하나인 MiSeq® Platform (Illumina, 미국)을 사용하여 2차 PCR 증폭산물을 분석하고 원본데이터를 생산하였다. 이후 원본데이터에서 PCR 프라이머와 어댑터의 올리고염기서열을 제거하고 유사도 97%를 기준으로 원본데이터의 집단화(clustering)를 수행하여 조작분류단위(operational taxonomic unit, OTU)를 생성하였다. 각 OTU를 대상으로 NCBI에서 BLAST 검색을 수행하여 종동정을 수행하였으며, 이를 종조성과 출현비로 나타낸 결과를 도 12에 나타냈다.
3. 어류 DNA 바코딩과 메타바코딩 키트
본 발명은 신규 프라이머들과 어댑터들을 포함하는 어류 DNA 바코딩과 메타바코딩 키트를 제공한다. 어류 DNA 바코딩과 메타바코딩 키트는 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머들과 어댑터들, DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 완충액, 멸균증류수 등을 포함한다.
본 발명의 어류 DNA 바코딩과 메타바코딩 키트는 선택적으로 PCR 증폭반응에 필요한 시약들, 예컨대, 신규 프라이머들과 어댑터들, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformimim, Thermis flavusim, Thermococcus literalis, Pyrococcus fuaqosus (Pfu) 등으로부터 추출된 열안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자, dNTP 혼합물, 완충액, 멸균증류수 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 어류 DNA 바코딩과 메타바코딩 키트는 상기한 시약성분들을 포함하는 다수의 별도 포장 또는 구성품으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위한 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 그 PCR 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머들과 어댑터들은 기존 프라이머 조합들보다 PCR 증폭반응의 성공률과 효율성이 높아 다양한 어종들을 서식지와 시료의 종류와 관계없이 정확하고 신속하게 동정할 수 있는 방법을 제공한다.
따라서 본 발명은 미동정 해수어류 또는 담수어류의 종동정, 이들의 미발생난 또는 새끼의 종동정, 건어물, 젓갈, 통조림, 어포, 맛살, 어묵과 같은 가공수산물의 종동정, 절단되거나 발효된 식품첨가물의 종동정, 고부가 수산종자의 종동정 등의 DNA 바코딩 분석과 환경수에 존재하는 어류 환경 DNA의 DNA 메타바코딩 분석 등에 용이하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라 그들의 분자계통학적, 생태학적, 발생학적 연구 등에 유용하게 활용될 수 있다.
<110> Aquagentech Co. Ltd. <120> PCR primer sets and adapters for amplifying and sequencing mitochondrial ribosomal RNA gene used for DNA barcoding and metabarcoding of fishes <130> PNC-2020-001 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 1 cyygtacctt ttgcatcatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 2 agacgagaag accctdtgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 3 ctgttatccc tdgggtaact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 4 tccggtctga actcagatca 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 5 agtcatgcgc attcaggt 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for mitochondrial 16S rDNA <400> 6 ctgacgatta cggacttgac 20

Claims (4)

  1. 서열번호 1 내지 2 중 어느 하나 이상의 정방향 프라이머; 및
    서열번호 3 내지 4 중 어느 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항의 정방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 5의 프라이머를 어댑터로 부착한 정방향 프라이머 결합체; 및
    제1항의 역방향 프라이머의 5‘ 말단에 서열번호 6의 프라이머를 어댑터로 부착한 역방향 프라이머 결합체를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트; 및
    PCR 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하고 DNA 염기서열을 해독하기 위한 키트.
  4. (a) 어류로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하거나 환경수로부터 환경 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 게놈 DNA 또는 환경 DNA를 주형 DNA으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 PCR 증폭반응에 의해 생산된 PCR 증폭산물의 DNA 염기서열을 해독하는 단계를 포함하는, 어류의 DNA 바코딩과 메타바코딩을 위해 미토콘드리아 16S rDNA 영역의 PCR 증폭반응을 수행하여 DNA 염기서열을 해독하는 방법.

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