KR101151747B1 - 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 - Google Patents
해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101151747B1 KR101151747B1 KR1020090065213A KR20090065213A KR101151747B1 KR 101151747 B1 KR101151747 B1 KR 101151747B1 KR 1020090065213 A KR1020090065213 A KR 1020090065213A KR 20090065213 A KR20090065213 A KR 20090065213A KR 101151747 B1 KR101151747 B1 KR 101151747B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- species
- dna sequence
- dna
- marine
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
본 발명은 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것으로, 해양생물로부터 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다. 이러한 본 발명은 다양한 해양생물 종의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 기반으로, 해양생물에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 효과가 있다.
해양생물, SNP, 프로브
Description
본 발명은 해양생물의 종을 판별하기 위한 것으로, 특히 다양한 해양생물 종의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 기반으로, 해양생물에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것이다.
국내외 종래의 생물종 분류연구는 형태의 계측형질, 계수형질을 바탕으로 하고 있다.
근래에는 형태형질을 이용한 분류 및 계통연구에 많은 문제점들이 발견되어 분자생물학적 기법이 활발하게 도입되고 있다. 이 방법은 성체를 중심으로 이루어진 기존 의 형태분류의 단점을 보완하는 것으로 발생초기 생물종 혹은 가공된 개체의 경우와 비교할 수 있어 이점으로 작용하고 있다.
하지만 생물다양성 조사를 위한 다양한 생물종을 한번에, 그리고 신속 정확하게 판별할 수 있는 분자 생물학적인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.
본 발명은 다양한 해양생물 종에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 치어(稚魚) 또는 사체 조각 등에 대해서, 하나의 슬라이드 위에 해양생물 시료를 올려 놓는 것만으로도 그 종을 판별할 수 있는 해양생물 판별용 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 또는 키트를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있는 수단을 제공하고자 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 해양생물 종의 판별 방법은, 해양생물로부터 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 특징이다.
그리고, 본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 포함하는 해양생물 종 판별용 프로브 세트일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 포함하는 해양생물 종 판별용 DNA 칩인 것도 가능하다.
이와 함께, 본 발명의 또 다른 실시형태는 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 각각의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브와; 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종 판별용 키트일 수도 있다.
또한, 상기 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 서열번호 6, 서열번호 5와 서열번호 7, 또는 서열번호 8과 서열번호 4의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.
또한, 상기 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 서열번호 6, 서열번호 5와 서열번호 7, 또는 서열번호 8과 서열번호 4의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.
기타 본 발명의 다른 실시형태는 후술하는 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용 및 첨부된 도면에 널리 기재되어 있다.
상기한 본 발명은 다양한 해양생물 종에 대한 유전자형을 분석하여, 상기 해양생물의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 기반으로, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 효과가 있다.
즉, 본 발명은 해양생물을 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 해양생물 종 간에 구별되는 DNA 서열을 임의의 만들어, 해양생물의 종 판별을 간단하고 용이하게 하였다.
또한, 본 발명은 해양생물 종 판별용 프로브, 또는 상기 프로브를 포함하는 DNA 칩이나 키트로 제작되어, 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 치어(稚魚) 또는 사체 조각 등에 대해서도, 하나의 슬라이드 위에 해양생물 시료를 올려 놓는 것만으로도 그 종을 판별할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간이 크게 단축되어, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.
본 발명에 따른 해양생물 종의 판별 방법은, 먼저 해양생물로부터 DNA를 추출하고, 이렇게 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다.
상기 해양생물로부터 DNA를 추출하는 것은 해양생물의 혈액, 세포 또는 조직 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 해양생물의 종을 판별하기 위한 것이기 때문에, 상기 해양생물의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 또는 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.
그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출방법이나 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
또한, 본 발명이 대상으로 하는 해양생물은 강이나 하천, 호수, 바다 등지에 존재하는 어류와 무척추동물로서, 예를 들면, 자리돔, 미역치, 황놀래기, 범돔, 용치놀래기, 개볼락, 돌돔, 매끈이고둥, 끄덕새우, 지중해담치, 홍합, 분홍성게, 둥근성게, 새치성게, 말똥성게, 멸치, 태평양고등어, 망치고등어, 대서양고등어, 대구, 말쥐치, 살오징어, 바위굴, 참굴, 홍게, 대게, 소라, 납작소라 및 앨퉁이(이상, 29종)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
특별히, 본 발명에서는 왕돌초를 포함하는 대한민국의 동해해역에 존재하는 해양생물을 대상으로 그 종을 판별할 수 있다. 상기 왕돌초는 경상북도 울진군 평해면 후포리 앞에서 동쪽으로 약 23km 떨어진 곳에 위치한 수중 암초를 뜻하는 것으로, 상기 왕돌초는 조류의 흐름을 변형시키고, 이로 인해 용존 유기물이 용승함으로써 비교적 다양한 어류 및 아열대성 해양생물이 많이 서식하여 동해남부해역에서 중요한 수산자원 해역으로 알려져 있다. 또한, 상기 왕돌초를 포함하는 동해 해역은 남쪽으로부터 유입되는 난류성 대마난류와 주로 겨울철에 북쪽으로부터 강하게 남하하는 동한한류가 교차하여 동해 중부 연안에 강한 계절적 와류가 형성되면서, 아열대성 서식종과 한류성 종, 연안종 등의 해양생물이 혼재하는 특성을 가지고 있다. 이러한 환경적 특성으로 인해 왕돌초 및 이를 포함하는 동해 해역은 난류의 이동과 확산범위에 대한 연구, 생물지리 연구 및 생물 다양성에 대한 연구 등에 매우 중요한 역할을 한다. 이에 따라, 본 발명에서는 왕돌초 및 이를 포함하는 동해해역에 존재하는 상기 29종의 해양생물을 대상으로 할 수 있고, 이에 따르면 본 발명은 왕돌초를 포함하는 동해해역에 존재하는 해양생물의 종을 판별하기에 특히 더 적합한 것이다.
본 발명자들은 해양생물을 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 해양생물 종 간에 구별되는 DNA 서열을 만들어서, 해양생물의 종 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.
도 1은 해양생물의 미토콘드리아 DNA 상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 바와 같은 유전자 중에서도, 본 발명은 특별히 COI 유전자 부위에 존재하는 단염기다형성(SNPs) 부위를 이용한 것이며, 이에 따라 상기 해양생물로부터 추출한 DNA는 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성(SNPs)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하기로는 10% 또는 20% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립 형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.
도 2 내지 도 30은 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 해양생물 29종의 미 토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 염기서열과, 특별히 그 중에서 단염기다형성(SNPs) 부위에 속하는 염기서열(볼드체 및 밑줄친 부위)을 함께 나타내고 있다.
본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에 해양생물의 미토콘드리아 DNA의 COI 유전자 중에서, 상기 단염기다형성(SNPs) 부위에 속하는 염기서열을 프로브로 이용하면, 다양한 해양생물의 종을 구별하기에 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 상기 단염기다형성(SNPs) 부위에 속하는 염기서열, 즉 후술하는 서열번호 9 내지 서열번호 41의 DNA 서열을 포함하는 염기서열을 프로브로 이용한 것이다. 이러한 프로브는 해양생물 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 해양생물 종에 속하는 PCR 시료 산물과는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 해양생물의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 서열번호 9 내지 서열번호 41의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1: 왕돌초 및 동해 해역에 서식하는 주요 해양생물 종 판정을 위한 DNA 서열]
| 왕돌초 및 동해해역에 서식하는 주요 해양생물 종 판정을 위한 DNA서열 | |||
| 프로브 명칭 | DNA서열 | 반응어종 | DNA 서열 위치 |
| R1(서열정보 9) | CATCACAATGCTTCTAACCGATCG | 자리돔 | 552-576 |
| R2(서열정보 10) | CTACCTGTTCTTGCAGCTGGAATT | 미역치 | 532-556 |
| R3(서열정보 11) | GGCATTTCTTCTATTCTTGGGGCA | 황놀래기 | 397-421 |
| R4(서열정보 12) | GCCGGCATTACAATACTACTGACA | 범돔 | 547-571 |
| R5(서열정보 13) | GCGGGTATTACTATGCTCCTTACA | 용치놀래기 | 547-571 |
| R6(서열정보 14) | TTGTGTGAGCCGTATTAATTACCG | 개볼락 | 486-513 |
| R7(서열정보 15) | TGCTGTTCTACTTCTCCTTTCCCT | 돌돔 | 510-534 |
| R8(서열정보 16) | ATCATTGCCAGTTTTAGCCGGAG | 매끈이고둥 | 484-517 |
| R9(서열정보 17) | GCCACAGGTATAACATGAGATCG | 끄덕새우1 | 420-443 |
| R10(서열정보 18) | AGCGGGGGTCTCTTCTATTTTAG | 끄덕새우2 | 359-382 |
| R11(서열정보 19) | GGATAAAGGAGTAGGCGCTGGAT | 지중해담치 | 257-280 |
| R12(서열정보 20) | CTCAGGTCTTTAGTGGGAGCTAT | 홍합1 | 366-389 |
| R13(서열정보 21) | ATTTCGATTCCGGTGTTAGGAGG | 홍합2 | 492-515 |
| R14(서열정보 22) | GCCTCCTCCATTTTAGCCTCAAT | 분홍성게1 | 366-389 |
| R15(서열정보 23) | TTTCTCTCCCAGTACTAGCTGGA | 분홍성게2 | 493-516 |
| R16(서열정보 24) | CTTGCTCCTTTTATCTCTACCAG | 둥근성게 | 482-505 |
| R17(서열정보 25) | CGGTGGATCTGTTGACTTAGC | 새치성게 | 320-341 |
| R18(서열정보 26) | CCTCTTCCATCCTAGCCTCAATT | 말똥성게1 | 367-390 |
| R19(서열정보 27) | TTACGATGCTTCTTACTGACCGT | 말똥성게2 | 520-543 |
| R20(서열정보 28) | CTGAGCTGTATTAATCACGGCAG | 멸치 | 356-379 |
| R21(서열정보 29) | TGCAGGTGTGTCCCAATACCA | 태평양고등어 | 512-534 |
| R22(서열정보 30) | ACCTGCAGGTGTATCTCAATACCA | 망치고등어 | 511-534 |
| R23(서열정보 31) | ACCTGCAGGTATCTCTCAATACCA | 대서양고등어 | 511-534 |
| R24(서열정보 32) | GCAGCTGGCATCACGATACTTC | 대구 | 602-623 |
| R25(서열정보 33) | CTTCTCTCCCTGCCTGTACTTGC | 말쥐치 | 581-603 |
| R26(서열정보 34) | TATTGCTACTCTCCTTACCAGTGCTAG | 살오징어 | 602-623 |
| R27(서열정보 35) | ACTACTCTTCCGGTATTGGCTGGA | 바위굴 | 349-372 |
| R28(서열정보 36) | ACTACTCTCCCAGTGTTAGCTGGA | 참굴 | 349-372 |
| R29(서열정보 37) | TCGAAACTTGAATACATCCTTTTTTGA | 홍게 | 584-610 |
| R30(서열정보 38) | TGTTTTAGCTGGAGCAATTACCATACT | 대게 | 549-575 |
| R31(서열정보 39) | TATTTTATTATTATTATCTTTACCTGTATTAGC | 소라 | 341-373 |
| R32(서열정보 40) | AAATTACAGCTATTTTATTACTTCTGTCTT | 납작소라 | 518-547 |
| R33(서열정보 41) | CCCTTCATCTTGCAGGCATCT | 앨퉁이 | 396-416 |
상기 표 2에 기재된 DNA 서열은 해양생물의 종에 따라 구분될 수 있는 염기서열의 일부를 나타내는 것이다. 각 DNA 서열의 위치도 표시하였다.
그래서, 본 발명은 상기 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하도록 다수의 프로브를 제작 할 수 있고, 이러한 프로브 중 적어도 하나 이상을 상기에서 얻은 PCR 산물과 결합시킴으로서, 그 결합 여부에 따라 해양생물의 종을 판별할 수 있는 것이다.
즉, 본 발명에 있어서, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 것은, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 자리돔(Chromis notata)으로 판별하고, 서열번호 10의 프로브와 결합하는 경우에는 미역치(Paracentropogon rubripinnis)로 판별하고, 서열번호 11의 경우에는 황놀래기(Pseudolabrus japonicus), 서열번호 12의 경우는 범돔(Microcanthus strigatus), 서열번호 13의 경우는 용치놀래기(Halichoeres poecilopterus), 서열번호 14의 경우는 개볼락(Sebastes pachycephalus), 서열번호 15의 경우는 돌돔(Oplegnathus fasciatus), 서열번호 16의 경우는 매끈이고둥(Kelletia lischkei), 서열번호 17 및 서열번호 18의 경우는 끄덕새우(Rhynchocinetes uritai), 서열번호 19의 경우는 지중해담치(Mytilus galloprovincialis), 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 홍합(Mytilus coruscus), 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 분홍성게(Pseudocentrotus depressus), 서열번호 24의 경우는 둥근성게(Stronylocentrotus nudus), 서열번호 25의 경우는 새치성게(Stronylocentrotus intermedius), 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus), 서열번호 28의 경우는 멸치(Engraulis japonicus), 서열번호 29번의 경우는 태평양고등어(Scomber japonicus), 서열번호 30의 경우는 망치고등어(Scomber australasicus), 서열번호 31의 경우는 대서양고등어(Scomber scombrus), 서열번호 32의 경우는 대구(Gadus macrocephalus), 서열번호 33의 경우는 말쥐치(Thamnaconus modestus), 서열번호 34의 경우는 살오징어(Todarodes pacificus), 서열번호 35의 경우는 바위굴(Crassostrea nippona), 서열번호 36의 경우는 참굴(Crassostrea gigas), 서열번호 37의 경우는 홍게(Chionoecetes japonica), 서열번호 38의 경우는 대게(Chionoecetes opilio), 서열번호 39의 경우는 소라(Batillus cornutus), 서열번호 40의 경우는 납작소라(Pomaulax japonicus), 서열번호 41의 경우는 앨퉁이(Maurolicus japonicus)로 판별하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 프로브는 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하고, 상기 결합은 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어지는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 결합이 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브는 자리돔 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 552-576번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 10의 프로브는 미역치 종의 532-556번째 DNA 서열, 서열 11의 경우는 황놀래기 종의 397-421번째 DNA 서열, 서열 12의 경우는 범돔 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 용치놀래기 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 개볼락 종의 486-513번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 돌돔 종의 510-534번째 DNA 서열, 서 열번호 16의 경우는 매끈이고둥 종의 484-517번째 DNA 서열, 서열번호 17 및 서열번호 18의 경우는 각각 끄덕새우 종의 420-443번째 DNA 서열과 359-382번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 지중해담치 종의 257-280번째 DNA 서열, 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 각각 홍합 종의 366-389번째 DNA 서열과 492-515번째 DNA 서열, 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 각각 분홍성게 종의 366-389번째 DNA 서열과 493-516번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 둥근성게 종의 482-505번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 새치성게 종의 320-341번째 DNA 서열, 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 각각 말똥성게 종의 367-390번째 DNA 서열과 520-543번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 멸치 종의 322-345번째 DNA 서열, 서열번호 29번의 경우는 태평양고등어 종의 512-534번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 망치고등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 대서양고등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 대구 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 말쥐치 종의 581-603번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 살오징어 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 35의 경우는 바위굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 36의 경우는 참굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 37의 경우는 홍게 종의 584-610번째 DNA 서열, 서열번호 38의 경우는 대게 종의 549-575번째 DNA 서열, 서열번호 39의 경우는 소라 종의 341-373번째 DNA 서열, 서열번호 40의 경우는 납작소라 종의 518-547번째 DNA 서열, 서열번호 41의 경우는 앨퉁이 종의 396-416번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
나아가, 상술한 본 발명에서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것이 바람직한데, 이와 같이 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합 과정을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 상술한 해양생물의 종 판별 방법에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 29종의 해양생물로부터 DNA 시료를 채취하고, 이를 증폭시켜서 PCR 산물을 증폭시키는데 있어서, 상기 해양생물의 종에 적합한 특별한 염기서열을 상기 증폭을 위한 프라이머로 사용하는 것이다. 이러한 특정한 프라이머는 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 이를 위해 상기와 같이 혈액, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 해양생물이 자리돔, 미역치, 황놀래기, 범돔, 개볼락, 용치놀래기, 돌돔, 태평양고등어, 망치고등어, 대서양고등어, 대구, 말쥐치, 멸치 및 앨퉁이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 경우에는, 하기 표 2에 기재된 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 2: 자리돔, 미역치, 황놀래기, 범돔, 개볼락, 용치놀래기, 돌돔, 태평양고등어, 망치고등어, 대서양고등어, 대구, 말쥐치, 멸치 및 앨퉁이 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열정보 1) | TCA GCC ATC TTA CCT GTG GC |
| 역위 프라이머(서열정보 2) | GGG TGT CCG AAG AAT CAG AA |
또한, 상기 해양생물이 매끈이고둥, 끄덕새우, 지중해담치, 홍합, 분홍성게, 둥근성게, 새치성게, 말똥성게 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 경우에는, 하기 표 3에 기재된 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 3: 매끈이고둥, 끄덕새우, 지중해담치, 홍합, 분홍성게, 둥근성게, 새치성게, 말똥성게 및 살오징어 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열정보 3) | GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G |
| 역위 프라이머(서열정보 4) | TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA |
또한, 상기 해양생물이 굴, 바위굴, 대게 및 홍게로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 경우에는, 하기 표 4에 기재된 서열번호 5과 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 4: 굴, 바위굴, 대게 및 홍게 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열정보 5) | CWA AYC ATA AAG AYA TTG GNA C |
| 역위 프라이머(서열정보 6) | GTA AAY ATR TGR TGN GCT CA |
또한, 상기 해양생물이 납작소라인 경우에는, 하기 표 5에 기재된 서열번호 5와 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 5: 납작소라 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열정보 5) | CWA AYC ATA AAG AYA TTG GNA C |
| 역위 프라이머(서열정보 7) | ACT TCA GGR TGN CCA AAR AAY CA |
또한, 상기 해양생물이 소라인 경우에는, 하기 표 6에 기재된 서열번호 8과 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 6: 소라 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열정보 8) | TTY ATR GTW ATR CCS SSS STA ATT GGN GGN TTY GG |
| 역위 프라이머(서열정보 4) | TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA |
* 상기 서열정보 8에서 "S"는 이노신(Inosine : I)을 의미하는 것으로 정의한다. 이러한 본 발명은 낮은 Tm값을 가지는 이노신(Inosine)을 넣음으로서, 특정 온도에서 거품구조(bubble like structure)를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 유전 자에 비특이적으로 결합되는 것을 차단하여 PCR의 특이성(정확도)을 극대화 시키는 조절자 역할을 하게 할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 이용하는 것이 특징이고, 이에 따라 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브, 이러한 프로브를 포함하는 프로브 세트이거나 DNA 칩 또는 키트일 수 있다.
이러한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수의 해양생물의 종을 동시에 판별할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 칩 및 키트는 상기한 프로브를 포함하여, 종 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로서, 염기서열을 분석하기 않고도 분석하고자 하는 해양생물의 유전자형과 그 종을 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한 상기 해양생물이 속하는 다수의 해양생물 종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 해양생물의 유전자형과 종을 판별하는 방법을 표준화 및 자동화하는 것도 가능하다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 서열번호 1 내지 8의 프라이머의 합성
먼저, 해양생물로부터 추출한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 본 실시예에서 사용한 해양생물과 이에 따른 프라이머는 상기 표 2 내지 표 6에 나타난 것과 동일한 29종의 해양생물 및 이에 따른 프라이머를 사용하였다. 프라이머는 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.
대칭 또는 비대칭 PCR에 사용하는 역방향(앤티센스) 프라이머는 교잡화 반응 후에 형광을 확인하기 위하여, 말단에 로다민, cy3, cy5를 부착시켜서 제작하거나 바이오틴을 부착시켰고, 교잡화 반응 후 Syreptavidin-Cyanine과 결합하도록 제작하여 사용하였다.
실시예 2: 해양생물의 DNA 추출과 PCR 반응
왕돌초 및 동해해역에 서식하는 상기 29 종의 주요 해양생물의 DNA는 독일 QIAGEN사의 DNeasy tissue kit을 사용하여 추출하였다.
상기 실시예 1에 따른 프라이머를 이용하여, 하기의 표 7과 같은 조건의 방법으로 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.
[표 7: 프라이머 정상 증폭 확인 조건]
| 반응조성 | 반응 조건 | |
| 멸균증류수 11.5㎕ 10X buffer 2㎕ 2mM dNTP 1㎕ 10μM forward 1㎕ 10μM reverse 1㎕ 1 unit Hot start Taq 0.5㎕ 정제 DNA 2㎕ |
94℃, 15분 |
1 cycle |
| 94℃, 15초 43℃, 45초 72℃, 1분 30초 |
35 cycle |
|
| 72℃, 5분 |
1 cycle |
|
PCR이 끝난 후, PCR 산물 10㎕에 젤 로딩 버터(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2㎕를 넣고 1㎍/㎖ ethidium bromide가 함유된 2% 아가로스젤에서 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer(HITACHI, 일본)에서 PCR 밴드를 확인하였다.
실시예 3: 서열번호 9 내지 41의 프로브 제작
본 실시예에서는 29종 각각의 해양생물에 대한 프로브를 합성하였다. 교잡화 반응을 위한 프로브의 서열정보는 상기 표 1에 나타낸 것과 같다.
먼저, 알데히드 작용기가 처리되어 있는 글라스 위에, 상기한 서열정보를 가지는 폴리뉴클레오티드의 5'말단에 아미노 링크를 수식하고, 교잡화 반응시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키기 위하여, 10-20 개의 올리고(dT)를 부가하여 본 발명에 따른 프로브를 완성하였다. 본 발명에 서 사용한 프로브는 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 4: DNA 칩 제작
올리고뉴클레오티드 칩을 제작하기 위하여, 상기 실시예 3에 따라 CSS-100 Silylatied Slide(Cell Associate사, 미국) 상에 50μM의 농도로 아미도 링크가 수식되어 있는 프로브와 동일한 양의 3X SSC를 혼합하여 집적하였고, 이를 16 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.1% SDS로 5분간 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.
소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4 375ml. PBS 125ml, 100% EtOH)에 제작된 칩을 5분간 반응시킨 후, 끓는 증류수에서 3분간 반응시킨 다음 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조시켰다.
한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위해 perfusion chamber(BioGrace, 미국)로 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
이렇게 제작된 DNA 칩을 3가지 형태로 도 31 내지 도 33에 예시적으로 나타내었다. 도 31 내지 도 33은 각각 본 발명에 따른 프로브를 포함하는 DNA 칩의 서로 다른 구조를 도식화한 모식도이다.
실시예 5: 교잡화 반응
상기 실시예 2에 따라 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 교잡화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우 Syreptavidin-Cyanine을 1㎍/㎖의 농도로 첨가하여 반응시켰다.
그리고, 준비된 교잡화 용액을 상기 실시예 4의 DNA 칩이 포함된 chamber에 도포하여 60도에서 1시간 동안 반응시켰다.
그런 다음, 1X SSC, 0.1% SDS에서 5분 동안 일차 세척 후, 0.1X SSC에서 3분간 이차 세척을 실시하였다. 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.
실험 결과의 확인은 LuxScan-10K/A(CapitalBio, 중국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 34 내지 도 56에 나타낸 바와 같다.
도 34 내지 도 56은 각각 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물 을 결합시킨 결과사진이다.
여기서, 도 34 내지 도 41은 각각 도 31에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과이다. 즉, 도 34는 자리돔, 도 35는 미역치, 도 36은 황놀래기, 도 37은 범돔, 도 38은 용치놀래기, 도 39는 개볼락, 도 40은 돌돔, 도 41은 매끈이고둥에 대한 결과이다.
그리고, 도 42 내지 도 48은 각각 도 32에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과이다. 즉, 도 42는 끄덕새우, 도 43은 지중해담치, 도 44는 홍합, 도 45는 분홍성게, 도 46은 둥근성게, 도 47은 새치성게, 도 48은 말똥성게에 대한 결과이다.
또한, 도 49 내지 도 56은 각각 도 33에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과이다. 즉, 도 49는 태평양고등어, 도 50은 대서양고등어, 도 51은 대구, 도 52는 살오징어, 도 53은 대게, 도 54는 홍게, 도 55는 납작소라, 도 56은 소라에 대한 결과이다.
여기에 도시된 것과 같이, 본 발명에 의하는 경우 해당 생물 종에 따라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 해당 종을 판별할 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 일실시예에 관하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명백한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 해양생물의 미토콘드리아 DNA 상의 유전자 배열을 예시적으로 나타내는 모식도이고,
도 2 내지 도 30은 각각 본 발명에 따른 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 연속된 염기서열을 예시적으로 나타내는 모식도이고,
도 31 내지 도 33은 각각 본 발명에 따른 프로브를 포함하는 DNA 칩의 서로 다른 구조를 예시적으로 도식화한 모식도이고,
도 34 내지 도 41은 각각 도 31에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과 사진이고,
그리고, 도 42 내지 도 48은 각각 도 32에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과 사진이고,
또한, 도 49 내지 도 56은 각각 도 33에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 해양생물의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과 사진이다.
<110> Korea Ocean Research & Development Institute
<120> Identifying Method of Marine Species, Polynucleotide Probe, DNA
Chip and Kit for Identifying The Same
<130> 0001
<160> 41
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
tcagccatct tacctgtggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
gggtgtccga agaatcagaa 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 3
ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 5
cwaaycataa agayattggn ac 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 6
gtaaayatrt grtgngctca 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 7
acttcaggrt gnccaaaraa yca 23
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 8
ttyatrgtwa trccssssst aattggnggn ttygg 35
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Chromis notata
<400> 9
catcacaatg cttctaaccg atcg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Paracentropogon rubripinnis
<400> 10
ctacctgttc ttgcagctgg aatt 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Pseudolabrus japonicus
<400> 11
ggcatttctt ctattcttgg ggca 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Microcanthus strigatus
<400> 12
gccggcatta caatactact gaca 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Halichoeres poecilopterus
<400> 13
gcgggtatta ctatgctcct taca 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Sebastes pachycephalus
<400> 14
ttgtgtgagc cgtattaatt accg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Oplegnathus fasciatus
<400> 15
tgctgttcta cttctccttt ccct 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Kelletia lischkei
<400> 16
atcattgcca gttttagccg gag 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Rhynchocinetes uritai
<400> 17
gccacaggta taacatgaga tcg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Rhynchocinetes uritai
<400> 18
agcgggggtc tcttctattt tag 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Mytilus galloprovincialis
<400> 19
ggataaagga gtaggcgctg gat 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Mytilus coruscus
<400> 20
ctcaggtctt tagtgggagc tat 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Mytilus coruscus
<400> 21
atttcgattc cggtgttagg agg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Pseudocentrotus depressus
<400> 22
gcctcctcca ttttagcctc aat 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Pseudocentrotus depressus
<400> 23
tttctctccc agtactagct gga 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Strongylocentrotus nudus
<400> 24
cttgctcctt ttatctctac cag 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Strongylocentrotus intermedius
<400> 25
cggtggatct gttgacttag c 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Hemicentrotus pulcherrimus
<400> 26
cctcttccat cctagcctca att 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Hemicentrotus pulcherrimus
<400> 27
ttacgatgct tcttactgac cgt 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Engraulis japonicus
<400> 28
ctgagctgta ttaatcacgg cag 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Scomber japonicus
<400> 29
tgcaggtgtg tcccaatacc a 21
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Scomber australasicus
<400> 30
acctgcaggt gtatctcaat acca 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Scomber scombrus
<400> 31
acctgcaggt atctctcaat acca 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Gadus macrocephalus
<400> 32
gcagctggca tcacgatact tc 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Thamnaconus modestus
<400> 33
cttctctccc tgcctgtact tgc 23
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Todarodes pacificus
<400> 34
tattgctact ctccttacca gtgctag 27
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Crassostrea nippona
<400> 35
actactcttc cggtattggc tgga 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Crassostrea gigas
<400> 36
actactctcc cagtgttagc tgga 24
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> Chionoecetes japonica
<400> 37
tcgaaacttg aatacatcct tttttga 27
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> Chionoecetes opilio
<400> 38
tgttttagct ggagcaatta ccatact 27
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Batillus cornutus
<400> 39
tattttatta ttattatctt tacctgtatt agc 33
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Pomaulax japonicus
<400> 40
aaattacagc tattttatta cttctgtctt 30
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Maurolicus japonicus
<400> 41
cccttcatct tgcaggcatc t 21
Claims (12)
- 해양생물로부터 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;상기 PCR 산물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및,상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 해양생물은 자리돔, 미역치, 황놀래기, 범돔, 용치놀래기, 개볼락, 돌돔, 매끈이고둥, 끄덕새우, 지중해담치, 홍합, 분홍성게, 둥근성게, 새치성게, 말똥성게, 멸치, 태평양고등어, 망치고등어, 대서양고등어, 대구, 말쥐치, 살오징어, 바위굴, 참굴, 홍게, 대게, 소라, 납작소라 및 앨퉁이로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출한 DNA는 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 포함하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 것은,서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 자리돔(Chromis notata)으로 판별하고, 서열번호 10의 프로브와 결합하는 경우에는 미역치(Paracentropogon rubripinnis)로 판별하고, 서열번호 11의 경우에는 황놀래기(Pseudolabrus japonicus), 서열번호 12의 경우는 범돔(Microcanthus strigatus), 서열번호 13의 경우는 용치놀래기(Halichoeres poecilopterus), 서열번호 14의 경우는 개볼락(Sebastes pachycephalus), 서열번호 15의 경우는 돌돔(Oplegnathus fasciatus), 서열번호 16의 경우는 매끈이고둥(Kelletia lischkei), 서열번호 17 및 서열번호 18의 경우는 끄덕새우(Rhynchocinetes uritai), 서열번호 19의 경우는 지중해담치(Mytilus galloprovincialis), 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 홍합(Mytilus coruscus), 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 분홍성게(Pseudocentrotus depressus), 서열번호 24의 경우는 둥근성게(Stronylocentrotus nudus), 서열번호 25의 경우는 새치성게(Stronylocentrotus intermedius), 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus), 서열번호 28의 경우는 멸치(Engraulis japonicus), 서열번호 29번 의 경우는 태평양고등어(Scomber japonicus), 서열번호 30의 경우는 망치고등어(Scomber australasicus), 서열번호 31의 경우는 대서양고등어(Scomber scombrus), 서열번호 32의 경우는 대구(Gadus macrocephalus), 서열번호 33의 경우는 말쥐치(Thamnaconus modestus), 서열번호 34의 경우는 살오징어(Todarodes pacificus), 서열번호 35의 경우는 바위굴(Crassostrea nippona), 서열번호 36의 경우는 참굴(Crassostrea gigas), 서열번호 37의 경우는 홍게(Chionoecetes japonica), 서열번호 38의 경우는 대게(Chionoecetes opilio), 서열번호 39의 경우는 소라(Batillus cornutus), 서열번호 40의 경우는 납작소라(Pomaulax japonicus), 서열번호 41의 경우는 앨퉁이(Maurolicus japonicus)로 판별하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하고, 상기 결합은 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별방법.
- 제5항에 있어서, 상기 결합이 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은,서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브는 자리돔 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 552-576번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 10의 프로브는 미역치 종의 532-556번째 DNA 서열, 서열 11의 경우는 황놀래기 종의 397-421번째 DNA 서열, 서열 12의 경우는 범돔 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 용치놀래기 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 개볼락 종의 486-513번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 돌돔 종의 510-534번째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 매끈이고둥 종의 484-517번째 DNA 서열, 서열번호 17 및 서열번호 18의 경우는 각각 끄덕새우 종의 420-443번째 DNA 서열과 359-382번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 지중해담치 종의 257-280번째 DNA 서열, 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 각각 홍합 종의 366-389번째 DNA 서열과 492-515번째 DNA 서열, 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 각각 분홍성게 종의 366-389번째 DNA 서열과 493-516번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 둥근성게 종의 482-505번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 새치성게 종의 320-341번째 DNA 서열, 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 각각 말똥성게 종의 367-390번째 DNA 서열과 520-543번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 멸치 종의 322-345번째 DNA 서열, 서열번호 29번의 경우는 태평양고등어 종의 512-534번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 망치고등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 대서양고등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 대구 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 말쥐치 종의 581-603번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 살오징어 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 35의 경우는 바위굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 36의 경우는 참굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 37의 경우는 홍게 종의 584-610번째 DNA 서열, 서열번호 38의 경우는 대게 종의 549-575번째 DNA 서열, 서열번호 39의 경우는 소라 종의 341-373번째 DNA 서열, 서열번호 40의 경우는 납작소라 종의 518-547번째 DNA 서열, 서열번호 41의 경우는 앨퉁이 종의 396-416번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법.
- 서열번호 9 내지 서열번호 41 의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 포함하는 해양생물 종 판별용 프로브 세트.
- 서열번호 9 내지 서열번호 41 의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 포함하는 해양생물 종 판별용 DNA 칩.
- 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 각각의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브와;상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종 판별용 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 4, 서열번호 5와 서열번호 6, 서열번호 5와 서열번호 7, 또는 서열번호 8과 서열번호 4의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 해양생물 종 판별용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090065213A KR101151747B1 (ko) | 2009-07-17 | 2009-07-17 | 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090065213A KR101151747B1 (ko) | 2009-07-17 | 2009-07-17 | 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110007666A KR20110007666A (ko) | 2011-01-25 |
| KR101151747B1 true KR101151747B1 (ko) | 2012-06-15 |
Family
ID=43614047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020090065213A KR101151747B1 (ko) | 2009-07-17 | 2009-07-17 | 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101151747B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180083988A (ko) | 2017-01-13 | 2018-07-24 | 부경대학교 산학협력단 | 투스킨 주꾸미, 원스킨 주꾸미, 낙지 및 살오징어의 판별을 위한 초고속 실시간 pcr용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101308541B1 (ko) * | 2011-05-24 | 2013-09-23 | 한국해양과학기술원 | 연안 해수의 용존 산소량 변화에 대응하는 지중해담치의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 |
| KR101437383B1 (ko) * | 2013-08-21 | 2014-09-11 | 대한민국 | 대게 원산지 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법 |
| KR101437381B1 (ko) * | 2013-08-21 | 2014-09-11 | 대한민국 | 참굴 삼배체 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법 |
| KR101508689B1 (ko) * | 2014-08-11 | 2015-04-08 | 대한민국 | 중국젓새우의 원산지 판별 마커 |
| CN109207613B (zh) * | 2018-11-28 | 2022-03-04 | 宁波大学 | 一种鉴定厚壳贻贝和地中海贻贝杂交个体母本来源的分子标记 |
| CN109658978A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-19 | 海南热带海洋学院 | 一种基于coi基因序列片段的软珊瑚鉴定方法 |
| CN109652523B (zh) * | 2019-01-16 | 2019-11-22 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| KR102224827B1 (ko) * | 2019-07-18 | 2021-03-08 | 곽인실 | 보구치 위내용물 분석용 프라이머 세트 및 이를 이용한 보구치 위내용물 분석 방법 |
| KR102367357B1 (ko) * | 2020-06-16 | 2022-02-24 | 아쿠아진텍주식회사 | 어류의 dna 바코딩과 메타바코딩을 위한 미토콘드리아 16s 리보솜 rna 유전자의 pcr 증폭반응을 수행하고 dna 염기서열을 해독하기 위한 신규 프라이머 세트 및 어댑터 |
| CN112322759A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-02-05 | 镇江华大检测有限公司 | 一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法 |
-
2009
- 2009-07-17 KR KR1020090065213A patent/KR101151747B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Trans. Am. Fish. Soc., Vol.135, pp.1698-1721(2006.11.30.) 1부. * |
| Trans. Am. Fish. Soc., Vol.135, pp.1698-1721(2006.11.30.) 1부.* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180083988A (ko) | 2017-01-13 | 2018-07-24 | 부경대학교 산학협력단 | 투스킨 주꾸미, 원스킨 주꾸미, 낙지 및 살오징어의 판별을 위한 초고속 실시간 pcr용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20110007666A (ko) | 2011-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101151747B1 (ko) | 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| KR101211068B1 (ko) | 대한민국 남해 어류의 종 판별 방법과 이에 따른 어류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| Umehara et al. | Molecular identification of Anisakis simplex sensu stricto and Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae) from fish and cetacean in Japanese waters | |
| Okumuş et al. | Fish population genetics and molecular markers: II-molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture | |
| Clusa et al. | An extremely sensitive nested PCR-RFLP mitochondrial marker for detection and identification of salmonids in eDNA from water samples | |
| KR100806208B1 (ko) | 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| Mandal et al. | Molecular markers reveal only two mud crab species of genus Scylla (Brachyura: Portunidae) in Indian coastal waters | |
| Chakraborty et al. | Genetic differences among three species of the genus Trichiurus (Perciformes: Trichiuridae) based on mitochondrial DNA analysis | |
| CN107058603A (zh) | 一种鲶鱼dna条形码标准检测序列及其应用 | |
| CN107119143A (zh) | 一种鲶鱼dna条形码标准检测序列及其应用 | |
| KR101151757B1 (ko) | 대한한국 연안 해파리류의 종 판별 방법과 이에 따른 해파리류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| Lin et al. | AFLP analysis on genetic diversity and population structure of small yellow croaker Larimichthys polyactis | |
| KR101196640B1 (ko) | 오징어류의 종 판별 방법과 이를 위한 오징어 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| KR101131789B1 (ko) | 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법과 이에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| Hamaguchi et al. | Occurrences of the Indo-West Pacific rock oyster Saccostrea cucullata in mainland Japan | |
| Kurniawan et al. | Genetic diversity analysis and phylogeography of Osteochilus spilurus (Cyprinidae: Labeoninae) from Bangka, Belitung, and Kalimantan Islands using Cytochrome b gene | |
| Wang et al. | Haplosporidium nelsoni and H. costale in the Pacific oyster Crassostrea gigas from China’s coasts | |
| Yalla et al. | DNA barcoding of commercially important cephalopods from Andaman Islands, India | |
| Catanese et al. | An incubation water eDNA method for a non-destructive rapid molecular identification of Pinna nobilis and Pinna rudis bivalve juveniles | |
| KR102017236B1 (ko) | 두족류 분석용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법 | |
| Koyee et al. | Molecular-based identification of Polystoma integerrimum by 28S rDNA, phylogenetic and secondary structure analysis | |
| Krishna et al. | Identification of selected estuarine fishes by DNA barcoding from river Krishna region, Andhra Pradesh, India | |
| Liu | Fish genomics and analytical genetic technologies, with examples of their potential applications in management of fish genetic resources | |
| Masaoka et al. | Natural hybridization between Pinctada fucata and Pinctada maculata inferred from internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal RNA genes | |
| Kimura et al. | Maternal identification of hybrid eggs in Hexagrammos spp. by means of multiplex amplified product length polymorphism of mitochondrial DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150513 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160525 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170518 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180503 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190409 Year of fee payment: 8 |