KR101308541B1 - 연안 해수의 용존 산소량 변화에 대응하는 지중해담치의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 - Google Patents

연안 해수의 용존 산소량 변화에 대응하는 지중해담치의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 연안 해수의 용존 산소량 변화에 대응하는 지중해담치의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지중해담치의 유전자를 집적하는 마이크로어레이칩 및 이를 이용한 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이크로어레이 칩은 용존 산소량 감소에 대응하는 지중해담치의 유전자를 집적하기 때문에, 본 발명의 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 진단방법 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

연안 해수의 용존 산소량 변화에 대응하는 지중해담치의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법{Dissolved oxygen change responsive genes in Mytilus galloprovincialis and the method for diagnosing marine ecosystem using the same}
본 발명은 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법에 관한 것이다.
지중해담치(Mytilus galloprovincialis)는 유럽의 지중해가 원산지로 기록되어 있으나, 이들의 분포는 선박 등의 이동에 의해 세계 전역으로 확산되었다. 우리나라의 경우에도 전 연안에서 쉽게 발견되므로, 생물을 이용한 연안의 환경 평가에 좋은 실험재료로 활용될 수 있다. 이전의 홍합과의 생태적 경쟁에서 우위를 점하여, 홍합을 대체하고 있다. 홍합에 비해 상품성은 떨어지나, 식품으로 활용되고 있고, 본 종을 대상으로 양식도 이루어지고 있는 등, 경제적으로도 중요한 생물이다.
연안 해역의 빈산소(hypoxia, 저산소) 상태라 함은 저서동물이 폐사하기 시작하는 용존 산소량 2 - 3 ㎎/L 이하의 상태를 뜻하며, 용존 산소량이 부족한 해역을 빈산소 해역이라고 한다. 빈산소 해역의 형성은 주로 연안의 부영양화와 성층 형성에 기인하는데, 부영양화에 의해 1차 생산자가 대량 발생하게 되어, 저층으로 다량의 유기물이 공급되게 되며, 유기물을 분해하는 저층 박테리아의 호흡량이 급증하고, 해수면의 온도상승으로 성층(또는 수온약층)이 형성되어 산소 공급이 제한된다. 이로 인해 연안의 저층에 빈산소 상태의 물 덩어리인 빈산소 수괴가 형성되는데, 이 상태가 장기간 지속되면 용존산소는 점차 감소하여 무산소 상태로 변화된다. 성층은 해수 순환이 원활하지 않은 반폐쇄성이나 폐쇄성 내만에서 많이 발생한다. 여름에는 강우 등에 의한 담수의 대량 유입으로 수온 약층이 형성되며, 표층수와 저층수사이의 염분차이에 의해 밀도성층이 강하게 형성되어 빈산소 환경이 형성된다. 또한 내만은 외해에 비해 유기물의 오염도가 높아 빈산소 수괴가 빈번히 발생된다. 이러한 빈산소 해역 또는 빈산소 수괴는 북아메리카, 유럽, 태평양 연안 등 전 세계적으로 수천 킬로미터에 달하는 연안에서 발생하고 있다.
빈산소 환경의 형성은 수생생물의 호흡 및 생리작용에 영향을 미치고, 생태계의 균형 파괴, 생물의 이동과 산란 형태의 변화, 서식지의 감소, 포식자에 대한 민감도 증가, 외부 병원체에 대한 감염률의 증가, 먹이사슬의 변화 등을 유발하여, 저서생물 군집의 출현종과 개체수의 감소를 초래한다. 이 영향이 지속될 경우에는 해당 지역에 서식하는 생물들의 대량 폐사를 유도하여, 생물다양성의 훼손을 초래하며, 이는 연안의 생산력 저하로 연결되어, 막대한 경제적 손실로 이어진다. 또한 빈산소 수괴의 형성은 수생동물의 군집과 유전적인 다양성 유지에 심각한 위협이 되고 있으므로, 산소 감소가 수계 생태계에 미치는 영향을 다방면으로 이해하고 해결하려는 노력이 필요할 것으로 생각된다.
환경의 변화에 대응하기 위해, 생물들은 자신의 특정 유전자의 발현량을 조절하여 생리 또는 대사를 변화시킴으로써, 어느 수준까지는 능동적으로 환경변화에 대처한다. 그러므로 용존 산소량 변화와 같은 외부 환경변화에 발현량이 변화되는 유전자들을 발굴하여 생체지표로 이용함으로써, 환경변화에 반응하는 생물체의 유전자 발현 변화를 이용한다면 특정지역의 환경변화에 관한 정보뿐만 아니라, 이러한 환경변화가 생명현상에 미치는 영향 및 해당 생물의 건강진단에 관한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 기법은 미세한 환경변화도 감지 가능하고, 조기 진단적 가치를 갖으며, 유전자 기능에 대한 고찰을 통해 미래 예측 기능도 가질 수 있다.
빈산소 해역 형성에 의한 생태계의 교란 위험성이 제기되고 있는 현 상황에서, 생명현상의 기본인 유전자와 핵산 물질의 분석을 통하여 환경변화의 영향과 생태계 파급효과를 정확히 진단하는 첨단기술 개발의 필요성이 절실하다.
이에, 본 발명자들은 해양환경변화에 대응하는 생체지표를 발굴하던 중 우리나라 연안에 널리 분포하는 담치의 일종인 지중해담치(Mytilus galloprovincialis)에서 용존 산소량 감소에 의한 빈산소 상태에서의 특정 유전자의 발현량 변화를 규명하였고, 용존 산소량 감소에 대한 지중해담치의 분자생물학적 반응을 파악함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단할 수 있는 마이크로어레이 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다;
60S ribosomal protein L32 protein mRNA, 40S ribosomal protein S3, 60S ribosomal protein L3 and related proteins, Ribosomal protein L11 mRNA, Elongation factor 2 mRNA, 40S ribosomal protein S2 putative mRNA/30S ribosomal protein S5, 60S acidic ribosomal protein P2 (Genbank Accession No. FM165434.1), 40S ribosomal protein S4, Nucleolar complex associated 2 homolog, 40S ribosomal protein S28, 60S ribosomal protein L21, Elongation factor TU (tufA) gene, EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha (Genbank Accession No. EU684228.1), RecA gene, Zinc finger NFX1-type containing 1, tRNA-Leu (trnL) gene, Molecular chaperone (HSP90 family), Prefoldin subunit 1 putative mRNA, DnaJ domain containing protein mRNA, Hsp70-1 gene (Genbank Accession No. AJ585375.1), Aspartate beta-hydroxylase (ASPH), Matrix metallopeptidase 9, Heat shock protein 12B, C-type lectin mRNA, LIM protein (LIM) mRNA, Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains, Surfactant protein A, Calcium-dependent protein kinase, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha, GTPase-activating protein GYP 7, Ral-GDS related protein Rgr, CEGP1 protein, MEGF10 protein, 18S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. DQ640546.1), 16S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. AF023552.1), Fibrillar collagen, Phosphate regulatory protein genes phoB-phoR, Galactose-binding lectin, Lec4 lectin mRNA, Tubulin beta 2A, microtubule associated protein (RHAMM) mRNA, Chitinase mRNA, Sodium-dependent phosphate/anion cotransport, Endo-1,3-beta-glucanase Engl1, Organic anion transporter, Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein, Peptidoglycan glycosyltransferase, ABC transporter AbcG16, Extracellular Cu/Zn-superoxide dismutase mRNA (Genbank Accession No. FM177867.1), Immunoglobulin kappa chain complex (Igk), 6-deoxyerythronolyde B synthase II , Polyketide synthase gene cluster, Farnesyl diphosphate synthase, Gamma-glutamyltransferase 8 pseudogene, Cytochrome P-450 hydroxylase homolog (nidi) gene, Anthranilate N-methyltransferase mRNA, Mitochondrial ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit, Cytochrome oxidase subunit I gene (Genbank Accession No. GQ480294.1), NADH:ubiquinone oxidoreductase NDUFA2/B8 subunit, ATP synthase F0 subunit 6, Sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase, NADH dehydrogenase subunit 4 (Genbank Accession No. AF315186.1), Flavin containing monooxygenase 3 (FMO3) gene, Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein 1 (gnb1l) mRNA, Carcinolectin5b-5, Rhamnose-binding lectin, Ubiquitin-protein ligase E, Sialic acid binding lectin, Fertility restorer-like protein, Somatic embryogenesis receptor-like kinase 2, Transcriptional activator, TenA family, Transcription antiterminator, BglG family, Transcriptional regulator, LacI family, Leucine-rich repeat kinase 2, Transcriptional regulator, TetR family, SH2 domain containing 4B (SH2D4B), Ecotype Hr-5 disease resistance protein, Collagen protein, MHC class II antigen beta (Genbank Accession No. AJ249992.1), Interleukin 1 receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1), Mytilin C precursor, Endoproteinase Arg-C precursor, Apextrin, Neuromacin, Matrix protein (gag), Opticin (Optc) gene, Glycopeptide AFGP polyprotein precursor gene, Cadherin 11 (Cdh11) gene, Microsatellite Myco-14 sequence, Proteasome beta 9 subunit gene, Hemagglutinin/amebocyte aggregation factor precursor putative mRNA, Alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine receptor, MFN2 gene for mitofusin 2, Rendezvin (RDZ) mRNA, Calnexin (pp90) mRNA, Interleukin-20 receptor alpha, Interferon regulatory factor 7 (IRF7) mRNA, DAZ-associated protein 1 putative mRNA, Cytotactin 및 NADH -ubiquitin oxidoreductase chain 2.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 해양 생태계의 스트레스에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 해양 생태계의 스트레스에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로어레이 칩은 용존 산소량 감소에 대응하는 지중해담치의 유전자를 집적하기 때문에, 본 발명의 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 진단방법 및 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 아울러 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용한 진단 방법 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 키트도 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 빈산소 상태인 용존 산소량(Dissolved Oxygen, DO) 1 ㎎/L에서 24 시간 및 72 시간 동안 배양한 지중해담치의 유전자 발현 차이를 나타낸 그림이다. 특이적으로 나타나는 유전자 단편을 화살표로 표시하였다.
1: 대조군, 정상 상소조건에서 72 시간 배양한 지중해담치
2: 실험군, 빈산소에 24 시간 노출한 지중해 담치
3: 실험군, 빈산소에 72 시간 노출한 지중해담치
ACPX: 적용한 프라이머의 종류
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다:
60S ribosomal protein L32 protein mRNA, 40S ribosomal protein S3, 60S ribosomal protein L3 and related proteins, Ribosomal protein L11 mRNA, Elongation factor 2 mRNA, 40S ribosomal protein S2 putative mRNA/30S ribosomal protein S5, 60S acidic ribosomal protein P2, 40S ribosomal protein S4, Nucleolar complex associated 2 homolog, 40S ribosomal protein S28, 60S ribosomal protein L21, Elongation factor TU (tufA) gene, EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha, RecA gene, Zinc finger NFX1-type containing 1, tRNA-Leu (trnL) gene, Molecular chaperone (HSP90 family), Prefoldin subunit 1 putative mRNA, DnaJ domain containing protein mRNA, Hsp70-1 gene, Aspartate beta-hydroxylase (ASPH), Matrix metallopeptidase 9, Heat shock protein 12B, C-type lectin mRNA, LIM protein (LIM) mRNA, Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains, Surfactant protein A, Calcium-dependent protein kinase, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha, GTPase-activating protein GYP 7, Ral-GDS related protein Rgr, CEGP1 protein, MEGF10 protein, 18S ribosomal RNA gene, 16S ribosomal RNA gene, Fibrillar collagen, Phosphate regulatory protein genes phoB-phoR, Galactose-binding lectin, Lec4 lectin mRNA, Tubulin beta 2A, microtubule associated protein (RHAMM) mRNA, Chitinase mRNA, Sodium-dependent phosphate/anion cotransport, Endo-1,3-beta-glucanase Engl1, Organic anion transporter, Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein, Peptidoglycan glycosyltransferase, ABC transporter AbcG16, Extracellular Cu/Zn-superoxide dismutase mRNA, Immunoglobulin kappa chain complex (Igk), 6-deoxyerythronolyde B synthase II , Polyketide synthase gene cluster, Farnesyl diphosphate synthase, Gamma-glutamyltransferase 8 pseudogene, Cytochrome P-450 hydroxylase homolog (nidi) gene, Anthranilate N-methyltransferase mRNA, Mitochondrial ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit, Cytochrome oxidase subunit I gene, NADH:ubiquinone oxidoreductase NDUFA2/B8 subunit, ATP synthase F0 subunit 6, Sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase, NADH dehydrogenase subunit 4, Flavin containing monooxygenase 3 (FMO3) gene, Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein 1 (gnb1l) mRNA, Carcinolectin5b-5, Rhamnose-binding lectin, Ubiquitin-protein ligase E, Sialic acid binding lectin, Fertility restorer-like protein, Somatic embryogenesis receptor-like kinase 2, Transcriptional activator, TenA family, Transcription antiterminator, BglG family, Transcriptional regulator, LacI family, Leucine-rich repeat kinase 2, Transcriptional regulator, TetR family, SH2 domain containing 4B (SH2D4B), Ecotype Hr-5 disease resistance protein, Collagen protein, MHC class II antigen beta, Interleukin 1 receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1), Mytilin C precursor, Endoproteinase Arg-C precursor, Apextrin, Neuromacin, Matrix protein (gag), Opticin (Optc) gene, Glycopeptide AFGP polyprotein precursor gene, Cadherin 11 (Cdh11) gene, Microsatellite Myco-14 sequence, Proteasome beta 9 subunit gene, Hemagglutinin/amebocyte aggregation factor precursor putative mRNA, Alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine receptor, MFN2 gene for mitofusin 2, Rendezvin (RDZ) mRNA, Calnexin (pp90) mRNA, Interleukin-20 receptor alpha, Interferon regulatory factor 7 (IRF7) mRNA, DAZ-associated protein 1 putative mRNA, Cytotactin 및 NADH -ubiquitin oxidoreductase chain 2.
상기 마이크로어레이 칩에 있어서 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 마이크로어레이 칩인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
18S ribosomal RNA(Genbank Accession No. DQ640546.1), ALPHA 10 nAChR gene for alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine, EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha(Genbank Accession No. EU684228.1), chitinase mRNA, cytochrome oxidase subunit 1 (cox1)(Genbank Accession No. GQ480294.1), NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 2 putative mRNA, calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha, GTPase-activating protein GYP 7, phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein, hsp90, ATP synthase F0 subunit 6.
상기 마이크로어레이 칩에 있어서 상기 유전자는 지중해담치(Mytilus galloprovincialis)로부터 유래되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 마이크로어레이 칩에 있어서 상기 유전자는 용존 산소량 변화에 의하여 발현이 증가 또는 감소하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 마이크로어레이 칩에 있어서 상기 스트레스는 해수의 용존 산소량의 변화인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량이 3 ㎎/L 이하인 것이 바람직하고, 1 ㎎/L 이하인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 마이크로어레이 칩에 있어서 용존 산소량 변화에 따른 해양 생태계 반응을 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대조군에 비해 용존 산소량 감소에 의하여 발현이 증가 또는 감소하는 유전자 100 개를 확인하였으며, 서열 분석을 통해 서열번호 1 내지 100으로 기재되는 핵산 서열을 확인하였다(도 1).
또한 본 발명은
1) 실험군인 해양 생태계의 스트레스에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서 상기 스트레스는 해수의 용존 산소량의 변화인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량이 3 ㎎/L 이하인 것이 바람직하고, 1 ㎎/L 이하인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서 용존 산소량 변화에 따른 해양 생태계 반응을 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은
1) 실험군인 해양 생태계의 스트레스에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서 상기 스트레스는 해수의 용존 산소량의 변화인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량이 3 ㎎/L 이하인 것이 바람직하고, 1 ㎎/L 이하인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서 용존 산소량 변화에 따른 해양 생태계 반응을 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서 상기 스트레스는 해수의 용존 산소량의 변화인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량이 3 ㎎/L 이하인 것이 바람직하고, 1 ㎎/L 이하인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 있어서 용존 산소량 변화에 따른 해양 생태계 반응을 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 있어서 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 있어서 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서 상기 스트레스는 해수의 용존 산소량의 변화인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량이 3 ㎎/L 이하인 것이 바람직하고, 1 ㎎/L 이하인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 해수의 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 있어서 용존 산소량 변화에 따른 해양 생태계 반응을 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
지중해담치 배양 및 빈산소 조건 노출
<1-1> 지중해담치의 배양
경남 거제시 장목만에서 채취된 지중해담치를 10 내지 15 개체씩 망에 넣고, 수조에 설치한 횟대에 걸어 배양하였다. 해수는 세 종류의 필터(100, 10 및 1 ㎛)를 거친 자연해수를 이용하였다. 수중 히터를 이용하여 수온은 20-21 ℃로 고정하였으며, 1주 이상 순치시켰다. 순치기간 중 공기 공급기를 이용하여 충분한 양의 공기를 공급하였다. 배양은 빛을 공급하지 않는 암 조건에서 수행하였다.
<1-2> 지중해담치의 빈산소 조건 노출
상기 실시예 <1-1>의 지중해담치를 질소 가스와 공기 공급기를 이용하여 용존 산소량을 1 ㎎/L로 고정하여 3 일간 배양하였으며, 시료의 채취는 24 시간과 72 시간에 실시하였다. 수온은 20-21℃로 유지하였다. 용존 산소량은 AquaController(Neptune Systems, San Jose, CA, USA)를 이용하여 조절하였다.
빈산소 조건 노출에 의한 유전자 변화 측정
<2-1> RNA 의 분리
상기 실시예 <1-2>에서 수득한 빈산소 조건에 노출한 시험군 및 노출하지 않은 대조군의 지중해담치 아가미 조직 50-100 ㎎에 TRI Reagent 용액(Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) 1 ㎖를 넣고, glass homogenizer를 이용하여 균질화하고, 실온에 5 분간 방치하였다. 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞고, 실온에서 10 분간 방치하고, 15 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)하였다. 상층액을 취하여, 아이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕를 넣고, 상온에 5 분간 방치하였다. 약 20 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 후, 용액을 제거하여 침전물만을 취했다. 상기 침전물에 70 % 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5 분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켰다. 건조 후, 적당량의 DEPC-처리수에 용해하였다.
<2-2> cDNA 합성
용존 산소량 변화에 대응하는 특이적인 유전자의 분리에 GeneFishingTMDEG kits(Seegene, 한국)를 사용하였다. GeneFishingTMDEG kit은 PCR-기반의 차등발현 유전자의 분리를 위해 개발된 것으로, Liang과 Pardee(Science 1992, 257: 967-971)에 의해 고안된 Differential display(DD)-PCR 법을 모태로 한다. 이 DD-PCR기법은 작은 양의 RNA만으로도 여러 실험군에서 차등발현하는 유전자들을 분리할 수 있다는 장점이 있는 반면, 비교적 높은 빈도로 거짓-양성(false-positive) 결과가 검출된다는 단점을 안고 있었다. 이러한 단점을 개선하고자 여러 가지 시도가 있었고, 최근 특수하게 디자인된 어닐링 컨트롤 프라이머 시스템(annealing control primer system)을 이용하여 특이성을 높인 것이 GeneFishingTMDEG kit이다. 추출된 전체 RNA로부터 정제한 mRNA(3.0 ㎍)를 주형으로 dT-ACP1을 프라이머로, MMLV RT-ase를 반응 효소로 사용하여 대조군과 실험군의 cDNA를 합성하였다.
<2-3> 특이 유전자 단편의 분리 및 염기서열 분석
합성된 첫번째 가닥 cDNA를 주형으로 dT-ACP2 및 임의의 ACP(annealing control primers) 120종을 프라이머로 이용하여 PCR을 실시하였다. 상기 PCR 조건은 94 ℃에서 1 분; 50 ℃에서 3 분; 72 ℃에서 1 분을 실시하고, 94 ℃에서 40 초; 65 ℃에서 40 초; 72 ℃에서 40 초를 40 회 실시한 후, 72 ℃에서 5 분간 실시하였다. PCR 산물은 2 % 아가로스 젤을 이용하여 분리하였고, 이를 통해 확인된 특이적으로 증폭된 PCR 산물은 정제 후, T-벡터 시스템을 이용하여 클로닝(cloning)하고, 프라스미드(plasmid)를 추출하여 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 대조군에 비해 용존 산소량 감소에 의하여 발현이 증가 또는 감소하는 유전자 100 개를 확인하였으며, 서열 분석을 통해 서열번호 1 내지 100으로 기재되는 핵산 서열을 확인하였다.
60S ribosomal protein L32 protein mRNA(서열번호: 1), 40S ribosomal protein S3(서열번호: 2), 60S ribosomal protein L3 and related proteins(서열번호: 3), Ribosomal protein L11 mRNA(서열번호: 4), Elongation factor 2 mRNA(서열번호: 5), 40S ribosomal protein S2 putative mRNA/30S ribosomal protein S5(서열번호: 6), 60S acidic ribosomal protein P2 (Genbank Accession No. FM165434.1)(서열번호: 7), 40S ribosomal protein S4(서열번호: 8), Nucleolar complex associated 2 homolog(서열번호: 9), 40S ribosomal protein S28(서열번호: 10), 60S ribosomal protein L21(서열번호: 11), Elongation factor TU (tufA) gene(서열번호: 12), EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha (Genbank Accession No. EU684228.1)(서열번호: 13), RecA gene(서열번호: 14), Zinc finger NFX1-type containing 1(서열번호: 15), tRNA-Leu (trnL) gene(서열번호: 16), Molecular chaperone (HSP90 family)(서열번호: 17), Prefoldin subunit 1 putative mRNA(서열번호: 18), DnaJ domain containing protein mRNA(서열번호: 19), Hsp70-1 gene (Genbank Accession No. AJ585375.1)(서열번호: 20), Aspartate beta-hydroxylase (ASPH)(서열번호: 21), Matrix metallopeptidase 9(서열번호: 22), Heat shock protein 12B(서열번호: 23), C-type lectin mRNA(서열번호: 24), LIM protein (LIM) mRNA(서열번호: 25), Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains(서열번호: 26), Surfactant protein A(서열번호: 27), Calcium-dependent protein kinase(서열번호: 28), Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha(서열번호: 29), GTPase-activating protein GYP 7(서열번호: 30), Ral-GDS related protein Rgr(서열번호: 31), CEGP1 protein(서열번호: 32), MEGF10 protein(서열번호: 33), 18S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. DQ640546.1)(서열번호: 34), 16S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. AF023552.1)(서열번호: 35), Fibrillar collagen(서열번호: 36), Phosphate regulatory protein genes phoB-phoR(서열번호: 37), Galactose-binding lectin(서열번호: 38), Lec4 lectin mRNA(서열번호: 39), Tubulin beta 2A(서열번호: 40), microtubule associated protein (RHAMM) mRNA(서열번호: 41), Chitinase mRNA(서열번호: 42), Sodium-dependent phosphate/anion cotransport(서열번호: 43), Endo-1,3-beta-glucanase Engl1(서열번호: 44), Organic anion transporter(서열번호: 45), Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein(서열번호: 46), Peptidoglycan glycosyltransferase(서열번호: 47), ABC transporter AbcG16(서열번호: 48), Extracellular Cu/Zn-superoxide dismutase mRNA (Genbank Accession No. FM177867.1)(서열번호: 49), Immunoglobulin kappa chain complex (Igk)(서열번호: 50), 6-deoxyerythronolyde B synthase II(서열번호: 51), Polyketide synthase gene cluster(서열번호: 52), Farnesyl diphosphate synthase(서열번호: 53), Gamma-glutamyltransferase 8 pseudogene(서열번호: 54), Cytochrome P-450 hydroxylase homolog (nidi) gene(서열번호: 55), Anthranilate N-methyltransferase mRNA(서열번호: 56), Mitochondrial ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit(서열번호: 57), Cytochrome oxidase subunit I gene (Genbank Accession No. GQ480294.1)(서열번호: 58), NADH:ubiquinone oxidoreductase NDUFA2/B8 subunit(서열번호: 59), ATP synthase F0 subunit 6(서열번호: 60), Sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase(서열번호: 61), NADH dehydrogenase subunit 4 (Genbank Accession No. AF315186.1)(서열번호: 62), Flavin containing monooxygenase 3 (FMO3) gene(서열번호: 63), Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein 1 (gnb1l) mRNA(서열번호: 64), Carcinolectin5b-5(서열번호: 65), Rhamnose-binding lectin(서열번호: 66), Ubiquitin-protein ligase E(서열번호: 67), Sialic acid binding lectin(서열번호: 68), Fertility restorer-like protein(서열번호: 69), Somatic embryogenesis receptor-like kinase 2(서열번호: 70), Transcriptional activator TenA family(서열번호: 71), Transcription antiterminator BglG family(서열번호: 72), Transcriptional regulator LacI family(서열번호: 73), Leucine-rich repeat kinase 2(서열번호: 74), Transcriptional regulator TetR family(서열번호: 75), SH2 domain containing 4B (SH2D4B)(서열번호: 76), Ecotype Hr-5 disease resistance protein(서열번호: 77), Collagen protein(서열번호: 78), MHC class II antigen beta (Genbank Accession No. AJ249992.1)(서열번호: 79), Interleukin 1 receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1)(서열번호: 80), Mytilin C precursor(서열번호: 81), Endoproteinase Arg-C precursor(서열번호: 82), Apextrin(서열번호: 83), Neuromacin(서열번호: 84), Matrix protein (gag)(서열번호: 85), Opticin (Optc) gene(서열번호: 86), Glycopeptide AFGP polyprotein precursor gene(서열번호: 87), Cadherin 11 (Cdh11) gene(서열번호: 88), Microsatellite Myco-14 sequence(서열번호: 89), Proteasome beta 9 subunit gene(서열번호: 90), Hemagglutinin/amebocyte aggregation factor precursor putative mRNA(서열번호: 91), Alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine receptor(서열번호: 92), MFN2 gene for mitofusin 2(서열번호: 93), Rendezvin (RDZ) mRNA(서열번호: 94), Calnexin (pp90) mRNA(서열번호: 95), Interleukin-20 receptor alpha(서열번호: 96), Interferon regulatory factor 7 (IRF7) mRNA(서열번호: 97), DAZ-associated protein 1 putative mRNA(서열번호: 98), Cytotactin(서열번호: 99) 및 NADH -ubiquitin oxidoreductase chain 2(서열번호: 100).
선별된 유전자들의 발현량 변화 정량분석
<3-1> 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 관련된 유전자들의 선별
상기 실시예 <2-3>에서 분리된 100 종의 유전자 중, 외부 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 깊이 관련되어 있는, 하기 11 종의 유전자를 선별하였다.
18S ribosomal RNA gene, ALPHA 10 nAChR gene for alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine, EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha, chitinase mRNA, cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) gene, NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 2 putative mRNA, calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha, GTPase-activating protein GYP 7, phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein, hsp90, ATP synthase F0 subunit 6.
이들에 대해서 실시간 정략적 PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)을 위한 프라이머를 다자인하고 합성하였다(표 1).
실시간 정략적 PCR을 위한 대상 유전자들의 프라이머 염기서열
유전자 프라이머의 염기서열
18S ribosomal RNA gene F: 5'-GGTCGGTGAAACATCAATC-3' (서열번호:101)
R: 5'-AGAATACAAGTACCGAAAGG-3' (서열번호:102)
ALPHA 10 nAChR gene F: 5'-GGTACTAGCGTTGGTATCATC-3'(서열번호:103)
R: 5'-GTCCGCTTTTACTGTTTTTC-3' (서열번호:104)
EF1-alpha mRNA F: 5'-GTGGGATGATGTTGATATAG-3' (서열번호:105)
R: 5'-CCATTGCCTATAGCATTTAC-3' (서열번호:106)
Chitinase mRNA F: 5'-CAGGGAAGTTGTAATATCTG-3' (서열번호:107)
R: 5'-TACTCTGAAAACACAGGTGAC-3'(서열번호:108)
Cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) gene F: 5'-GTGTCTTCTTATGGGTCTG-3' (서열번호:109)
R: 5'-GCTATAAACATGCTTTCTCC-3' (서열번호:110)
NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 2 putative mRNA F: 5'-TGGACAGAGTTTAAAGGAG-3' (서열번호:111)
R: 5'-CTAGCATAGACTTTTGGTTG-3' (서열번호:112)
Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha F: 5'-ACAGTCGGCACAGGTACAC-3' (서열번호:113)
R: 5'-GCATACTACGCTCTACACTTC-3'(서열번호:114)
GTPase-activating protein GYP 7 F: 5'-CAGGTTTTACTGCTACAGG-3' (서열번호:115)
R: 5'-GTTAATCACGATCCCTTGTG-3' (서열번호:116)
Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein F: 5'-GGTGACTGTTTTTATGGTC-3' (서열번호:117)
R: 5'-CGAAGAGAATGAAATGTCC-3' (서열번호:118)
Hsp90 F: 5'-GGTTGCTGATAAAGTAGTTG-3' (서열번호:119)
R: 5'-ATTCAGTCTGGTCTTCTTTC-3' (서열번호:120)
ATP synthase F0 subunit 6 F: 5'-ATATGTAGAAGGGAGTTGG-3' (서열번호:121)
R: 5'-ATCTAACTCCTATGGTCCTC-3' (서열번호:122)
<3-2> cDNA 합성
실시예 <2-1>의 방법으로 추출된 RNA를 주형으로 AB High Capacity RAN-to-cDNA Kit(Applide Biosystems, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA 1 ㎍에 해당되는 양을 분주하고, 증류수를 첨가하여 9 가 되도록 적정하였다. 2×RT 버퍼 10 ㎕, 20×Enzyme Mix 1 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, spin down하고 37 ℃에서 60 분 동안 반응시킨다. 반응 후, 95 ℃로 5 분 동안 가열하여 반응을 종료시겼다. 합성된 cDNA는 -20 ℃에 보관하였다.
<3-3> 실시간 정량적 PCR ( Real - time quantitative PCR ) 분석
상기 합성된 cDNA 0.5 ㎕(약 10 ng/㎕에 해당)에 해당 유전자의 프라이머쌍을 0.8 ㎕(10 pmol/㎕), 2× SYBR1 mixture를 10 ㎕ 넣었다. 증류수를 이용하여 최종 양을 20 ㎕로 적정하였다. PCR의 온도조건은 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 조건으로 40 사이클을 수행하였다.
각 시료에 대한 대조유전자(a-tubulin)와 관심유전자의 CT 값을 비교하고, 상대 표준 곡선(relative Standard Curve) 방법으로 관심유전자의 발현 변화를 상대적인 값으로 정량하였다(표 2).
실시간 정량적 PCR 분석에 의한 빈산소 조건 노출에 의한 대상 유전자의 발현량 변화
유전자 노출시간
24 시간 72 시간
18S ribosomal RNA gene 22.02 감소 5.94 증가
ALPHA 10 nAChR gene 13.68 감소 1.50 증가
EF1-alpha mRNA 10.66 감소 4.44 감소
Chitinase mRNA 10.71 감소 2.91 감소
Cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) gene 8.20 감소 1.18 증가
NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 2 putative mRNA 29.23 감소 검출되지 않음
Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha 52.6 감소 1.55 감소
GTPase-activating protein GYP 7 2.01 감소 3.05 감소
Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein 344.83 감소 3.09 감소
Hsp90 18.18 감소 1.89 감소
ATP synthase F0 subunit 6 107.45 증가 6.82 감소
본 발명의 용존 산소량 감소에 대응하는 지중해담치의 유전자는 빈산소 조건 특이적 유전자로써 용존 산소량 감소 및 이에 따른 해양 생태계 상태를 모니터하고 진단하기 위한 바이오센서로 유용하게 사용될 수 있고, 본 생물의 대사/생리변화를 구체화하여 앞으로 일어날 수도 있는 병리적 현상을 예측할 수 있는 생체지표 및 센서로 이용할 수 있을 것이며, 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. 하기 모든 유전자 각각의 핵산 서열 올리고뉴클레오티드 전부 또는 그의 상보가닥 분자가 직접된 빈산소(hypoxia, 저산소) 상태의 해수 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    60S ribosomal protein L32 protein mRNA(서열번호: 1), 40S ribosomal protein S3(서열번호: 2), 60S ribosomal protein L3 and related proteins(서열번호: 3), Ribosomal protein L11 mRNA(서열번호: 4), Elongation factor 2 mRNA(서열번호: 5), 40S ribosomal protein S2 putative mRNA/30S ribosomal protein S5(서열번호: 6), 60S acidic ribosomal protein P2 (Genbank Accession No. FM165434.1)(서열번호: 7), 40S ribosomal protein S4(서열번호: 8), Nucleolar complex associated 2 homolog(서열번호: 9), 40S ribosomal protein S28(서열번호: 10), 60S ribosomal protein L21(서열번호: 11), Elongation factor TU (tufA) gene(서열번호: 12), EF1-alpha mRNA for elongation factor 1 alpha (Genbank Accession No. EU684228.1)(서열번호: 13), RecA gene(서열번호: 14), Zinc finger NFX1-type containing 1(서열번호: 15), tRNA-Leu (trnL) gene(서열번호: 16), Molecular chaperone (HSP90 family)(서열번호: 17), Prefoldin subunit 1 putative mRNA(서열번호: 18), DnaJ domain containing protein mRNA(서열번호: 19), Hsp70-1 gene (Genbank Accession No. AJ585375.1)(서열번호: 20), Aspartate beta-hydroxylase (ASPH)(서열번호: 21), Matrix metallopeptidase 9(서열번호: 22), Heat shock protein 12B(서열번호: 23), C-type lectin mRNA(서열번호: 24), LIM protein (LIM) mRNA(서열번호: 25), Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains(서열번호: 26), Surfactant protein A(서열번호: 27), Calcium-dependent protein kinase(서열번호: 28), Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha(서열번호: 29), GTPase-activating protein GYP 7(서열번호: 30), Ral-GDS related protein Rgr(서열번호: 31), CEGP1 protein(서열번호: 32), MEGF10 protein(서열번호: 33), 18S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. DQ640546.1)(서열번호: 34), 16S ribosomal RNA gene (Genbank Accession No. AF023552.1)(서열번호: 35), Fibrillar collagen(서열번호: 36), Phosphate regulatory protein genes phoB-phoR(서열번호: 37), Galactose-binding lectin(서열번호: 38), Lec4 lectin mRNA(서열번호: 39), Tubulin beta 2A(서열번호: 40), microtubule associated protein (RHAMM) mRNA(서열번호: 41), Chitinase mRNA(서열번호: 42), Sodium-dependent phosphate/anion cotransport(서열번호: 43), Endo-1,3-beta-glucanase Engl1(서열번호: 44), Organic anion transporter(서열번호: 45), Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mutase family protein(서열번호: 46), Peptidoglycan glycosyltransferase(서열번호: 47), ABC transporter AbcG16(서열번호: 48), Extracellular Cu/Zn-superoxide dismutase mRNA (Genbank Accession No. FM177867.1)(서열번호: 49), Immunoglobulin kappa chain complex (Igk)(서열번호: 50), 6-deoxyerythronolyde B synthase II(서열번호: 51), Polyketide synthase gene cluster(서열번호: 52), Farnesyl diphosphate synthase(서열번호: 53), Gamma-glutamyltransferase 8 pseudogene(서열번호: 54), Cytochrome P-450 hydroxylase homolog (nidi) gene(서열번호: 55), Anthranilate N-methyltransferase mRNA(서열번호: 56), Mitochondrial ubiquinol-cytochrome c reductase iron-sulfur subunit(서열번호: 57), Cytochrome oxidase subunit I gene (Genbank Accession No. GQ480294.1)(서열번호: 58), NADH:ubiquinone oxidoreductase NDUFA2/B8 subunit(서열번호: 59), ATP synthase F0 subunit 6(서열번호: 60), Sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase(서열번호: 61), NADH dehydrogenase subunit 4 (Genbank Accession No. AF315186.1)(서열번호: 62), Flavin containing monooxygenase 3 (FMO3) gene(서열번호: 63), Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein 1 (gnb1l) mRNA(서열번호: 64), Carcinolectin5b-5(서열번호: 65), Rhamnose-binding lectin(서열번호: 66), Ubiquitin-protein ligase E(서열번호: 67), Sialic acid binding lectin(서열번호: 68), Fertility restorer-like protein(서열번호: 69), Somatic embryogenesis receptor-like kinae 2(서열번호: 70), Transcriptional activator TenA family(서열번호: 71), Transcription antiterminator BglG family(서열번호: 72), Transcriptional regulator LacI family(서열번호: 73), Leucine-rich repeat kinase 2(서열번호: 74), Transcriptional regulator TetR family(서열번호: 75), SH2 domain containing 4B (SH2D4B)(서열번호: 76), Ecotype Hr-5 disease resistance protein(서열번호: 77), Collagen protein(서열번호: 78), MHC class II antigen beta (Genbank Accession No. AJ249992.1)(서열번호: 79), Interleukin 1 receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1)(서열번호: 80), Mytilin C precursor(서열번호: 81), Endoproteinase Arg-C precursor(서열번호: 82), Apextrin(서열번호: 83), Neuromacin(서열번호: 84), Matrix protein (gag)(서열번호: 85), Opticin (Optc) gene(서열번호: 86), Glycopeptide AFGP polyprotein precursor gene(서열번호: 87), Cadherin 11 (Cdh11) gene(서열번호: 88), Microsatellite Myco-14 sequence(서열번호: 89), Proteasome beta 9 subunit gene(서열번호: 90), Hemagglutinin/amebocyte aggregation factor precursor putative mRNA(서열번호: 91), Alpha 10 subunit of nicotinic acetylcholine receptor(서열번호: 92), MFN2 gene for mitofusin 2(서열번호: 93), Rendezvin (RDZ) mRNA(서열번호: 94), Calnexin (pp90) mRNA(서열번호: 95), Interleukin-20 receptor alpha(서열번호: 96), Interferon regulatory factor 7 (IRF7) mRNA(서열번호: 97), DAZ-associated protein 1 putative mRNA(서열번호: 98), Cytotactin(서열번호: 99) 및 NADH -ubiquitin oxidoreductase chain 2(서열번호: 100).
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 지중해담치(Mytilus galloprovincialis)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 빈산소 상태의 해수 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 용존 산소량 변화에 의하여 발현이 증가 또는 감소하는 것을 특징으로 하는 빈산소 상태의 해수 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 용존 산소량의 변화는 빈산소(hypoxia, 저산소) 수괴 형성에 의한 것을 특징으로 하는 빈산소 상태의 해수 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  7. 삭제
  8. 1) 실험군인 빈산소 상태의 해수에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 빈산소 상태의 해수 노출에 대한 유전자 발현 수준 확인방법.
  9. 제 8항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 빈산소 상태의 해수 노출에 대한 유전자 발현 수준 확인방법.
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  13. 1) 실험군인 빈산소 상태의 해수에 노출된 것으로 의심되는 지중해담치와 대조군인 정상 지중해담치에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를, 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 빈산소 상태의 해수 노출에 대한 유전자 발현 수준 확인방법.
  14. 제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 빈산소 상태의 해수 노출 여부 확인용 키트.
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  18. 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 각각 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 포함하는 빈산소 상태의 해수 노출 여부 확인용 키트.
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