KR101379317B1 - 해수온 변화에 대응하는 감태 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 환경 변화 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 해수온 변화에 대응하는 감태(Ecklonia cava) 유래의 유전자 및 이를 이용한 고온 및 저온 노출 여부 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 감태로부터 유래한 특정 유전자군이 기후변화에 따른 해수온 변화에 의해 특이적인 발현 변화를 나타내어, 이들을 생체지표로 이용함으로써 해수온 증가에 따른 해양 생태계의 고온 및 저온 스트레스 노출 여부를 확인할 수 있는 마이크로어레이 및 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 해수온 변화에 대응하는 감태(Ecklonia cava)의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계의 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
감태(Ecklonia cava)는 갈조식물 문(Phaeophyta), 다시마 목(Laminariales), 다시마 과(Laminariaceae), 감태 속(Ecklonia)에 속하는 해조류로서, 한국 연안에서는 동해안 중남부, 남해안 전역, 서해안 남부 및 제주도 연안에 흔하게 분포하며, 중국의 중남부와 일본 중부 해안을 포함한 북태평양 서해안에 한정되어 분포한다. 감태는 암반 기질이 잘 발달된 조하대 수심 5 내지 20 m 범위에서 해중림을 형성하며, 특히, 다른 생물들의 서식처를 제공함으로써, 연안의 해양생물 다양성에 큰 공헌을 하고 있는 생물이다. 따라서 연안의 해양생물 다양성을 기후변화로부터 보존하기 위해서는 감태의 보호가 우선되어야한다.
감태의 엽상체는 갈색이고 가죽질이며 수지상의 부착기로부터 50 내지 100 cm 길이의 원주상 줄기를 낸다. 감태의 줄기는 어릴 때는 속이 차 있으나 성숙하면 중심부가 대롱처럼 비게 된다. 줄기의 중심부는 피층 아래에 위치한 점액강도로부터 분비된 점액질로 채워지며, 줄기의 끝은 점차 편편하고 얇게 펴져 길이 20 내지 30 cm, 폭 4 내지 5 cm의 중앙엽을 이룬 다음 양쪽으로 우상엽을 낸다. 우상엽은 양쪽 가장자리로부터 다시 폭이 좁은 소엽을 우상으로 어긋나게 낸다. 성숙하면 중앙엽은 5 mm까지 두꺼워진다. 중앙엽과 소엽은 주름이 없이 매끈하다. 감태의 엽상체는 포자체로서 성숙하면 중앙엽의 중심부에 짙은 갈색의 자낭군이 형성된다. 감수분열한 자낭군으로부터 유주자가 방출되어 현미경적 크기의 분지 사상체인 암수 배우체로 발달한다. 수배우체로부터 편모성 정자가 방출되어 암배우체 정단부에 위치한 난자로 이동하여 수정이 일어나고 이어서 대형 포자체로 발달하는 이형세대교번 생활사를 보인다. 초기 포자체로부터 성숙한 대형 포자체로 성숙하기까지는 2 내지 3년이 소요된다. 이와 같은 감태의 성숙한 엽상체는 피층조직에 함유된 알긴산염이 추출되어 식품 제조, 산업, 의약학적으로 다양하게 이용되고 있다.
기후변화는 다양한 시간과 공간 속에서 변화하고 있는 지구의 기후에 대하여 그 변화를 총칭하여 가리키는 것으로, 현재의 기후계가 자연적 요인 및 인위적 요인에 의하여 점차 변화하는 것을 말한다. 자연적 요인에는 대기, 해양, 육지, 설빙, 생물권 자신의 내적 요인 외에, 화산 분화에 의한 성층권의 에어로졸(부유 미립자) 증가, 태양 활동의 변화, 태양과 지구의 천문학적 상대위치 관계 등의 외적 요인이 있다. 인위적 요인에는 화석연료 과다 사용에 따른 이산화탄소 등 대기 조성의 변화, 토지 피복의 변화, 삼림파괴 등이 있다. 기후변화의 결과로 인하여, 이상 기상, 지구온난화 및 해수온 상승을 비롯한 각종 지구 환경의 악화 문제가 발생하고 있다.
특히, 최근에는 인간의 활동에 의한 온실 가스의 대기 중 농도 증가로 인하여 지구온난화가 가속화되고 있다. 온실효과로 인하여 지구온난화의 지표인 지구표면 온도는 지난 100년 동안(1906~2005) 0.74±0.18 ℃상승한 것으로 파악된다. 지구온난화에 의해 해수온이 상승하고 있으며, 극지방을 제외한 전 세계의 빙하가 감소하는 현상이 관측되고 있다. 이러한 급격한 수온 변화는 해양 생태계에 큰 영향을 준다. 즉, 해양 생물의 대사를 변화시켜, 결과적으로는 해양 어장 및 해양 동식물종을 교란시킨다.
이러한 환경의 변화에 대응하기 위해, 해양 생물은 자신의 특정 유전자의 발현량을 조절하여 생리 또는 대사를 변화시킴으로써 능동적으로 환경변화에 대처한다. 그러므로 기후변화와 같은 외부 환경변화에 발현량이 변화되는 유전자들을 발굴하여 생체지표로 이용함으로써, 환경변화에 반응하는 생물체의 유전자 발현 변화를 이용한다면 특정지역의 환경변화에 관한 정보뿐만 아니라, 이러한 환경변화가 생명현상에 미치는 영향 및 해당 생물의 건강진단에 관한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 기법은 미세한 환경변화도 감지 가능하고, 조기 진단적 가치를 갖으며, 유전자 기능에 대한 고찰을 통해 미래 예측적 기능도 갖을 수 있다. 기후변화에 의한 생태계의 교란에 대한 위험성이 제기되고 있는 현 상황에서, 생명현상의 기본인 유전자와 핵산 물질의 분석을 통하여 환경변화의 영향과 생태계 파급효과를 정확히 진단하는 첨단기술 개발의 필요성이 절실하다.
이에, 본 발명자들은 해수온 변화에 대응하는 생체지표를 발굴하던 중, 해양 생물다양성 유지에 큰 역할을 하고 있는 대형 갈조류의 일종인 감태(Ecklonia cava)에서 온도변화에 의한 특정 유전자의 발현량 변화를 규명하였고, 온도변화 특이 유전자 후보군은 해수온 변화 정도 및 이에 따른 해양 생태계의 환경 변화를 파악할 수 있는 바이오센서로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기후 변화에 따른 해수온 변화에 대응하는 감태(Ecklonia cava) 유래의 유전자, 및 이를 이용한 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인 방법 또는 해양 생태계의 환경 변화 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해수온 변화에 대응하여 발현이 증가 또는 감소하는 하기 유전자 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이를 제공한다:
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또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자들를 이용한 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 마이크로어레이를 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자들에 대해서 각 유전자에 상보적이고 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍을 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 해수온 변화에 대응하는 감태(Ecklonia cava) 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법은 기후변화에 따른 해수온 변화에 대응하는 감태 유래 특정 유전자의 발현량 변화를 측정함으로써, 해수온 변화에 의한 고온 및 저온 스트레스 노출 여부를 확인할 수 있는 바이오 센서 및 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 해수온에 대응하여 발현이 변화하는 감태(Ecklonia cava) 유래의 유전자를 발굴하였으며, 그 중에서, 고온 및 저온 스트레스에 대한 자기 방어 기작과 깊이 관련되어 있는 유전자를 발굴하였다. 따라서, 상기 고온 및 저온 노출에 대하여 발현량이 변화하는 감태 유래 유전자를 집적한 마이크로어레이를 해수 시료의 고온 및 저온 스트레스 노출 여부 검출 및 수 생태계의 건강 상태를 진단하는데 이용할 수 있다.
본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이를 제공한다:
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상기 유전자는 감태(Ecklonia cava)로부터 유래되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 마이크로어레이는 기후변화에 의한 해수온 변화에 대응하는 해양 생태계 반응을 확인하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 감태와 대조군인 감태에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 실험군인 감태와 대조군인 감태에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 하기 각각의 유전자에 상보적이며 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
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3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트는 기후변화에 의한 해수온 변화에 대응하는 해양 생태계 반응을 확인하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 당업자에게 알려진 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:
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상기 키트는 기후변화에 의한 해수온 변화에 대응하는 해양 생태계 반응을 확인하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 해수온 변화에 대응하는 감태(Ecklonia cava) 유래의 유전자를 발굴하기 위하여, 감태를 여러 온도의 해수에서 배양한 후 감태 유래 cDNA를 합성하여 발현량이 변화하는 유전자들을 조사하였다. 구체적으로, 16 ℃, 20 ℃ 및 24 ℃에서 배양한 감태의 조직에서 mRNA를 각각 분리한 후, 이를 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA를 Cy3-CTP 및 Cy5-CTP로 형광 표지한 뒤 이를 이용하여 마이크로어레이를 제작하였다. 상기 제작한 마이크로어레이를 Axon GenePix 4000B scanner(Axon Instrument, USA)를 이용하여 스캔한 뒤 이를 분석하였다. 그 결과, 20 ℃ 배양군을 기준으로 16 ℃에서 배양한 실험군에서 발현량이 증가하는 유전자 9종, 감소하는 유전자 14종(표 1 참조) 및 24 ℃에서 배양한 실험군에서 발현량이 증가하는 유전자 84종, 감소하는 유전자 89종(표 2 참조)을 확인하였고, 16 ℃ 배양군을 기준으로 24 ℃에서 배양한 실험군에서 발현량이 증가하는 유전자 28종 및 감소하는 유전자 20종(표 3 참조)을 확인하였다. 기후 변화는 해수온 변화를 유발하고 이러한 환경의 변화에 따라 해양 생물은 생리 및 대사의 변화를 일으킨다. 그러므로 해양 생물인 감태 유래 유전자 발현량의 변화를 확인함으로써 외부 환경 변화에 따른 스트레스 및 건강 상태를 확인할 수 있는 생체지표로 이용 가능하다.
따라서, 상기 유전자들은 해수온 증가에 따른 고온 및 저온 스트레스에 대한 노출 여부의 확인을 위한 마이크로어레이 및 키트로 유용하게 사용할 수 있다.
이하 실시예 및 실험예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
감태(
Ecklonia cava
)의
배양 및 온도변화 노출
<1-1>
감태의
배양
본 발명자들은 수심 5 내지 15 m의 서귀포 연안에서 감태(Ecklonia cava) 시료를 채취하여 연구소에서 배양하였다.
구체적으로, 수심 5 내지 15 m의 서귀포 연안에서 스쿠버 다이빙하여 채취한 감태를 젖은 수건 및 종이를 이용하여 습기를 유지하면서 연구실로 운반하였다. 연구실로 운반한 감태의 엽체를 천공하여 직경 1 내지 2 cm의 디스크를 얻었다. 상기 디스크를 pH 7.8로 맞춰진 ES-enriched seawater medium(NaNO3, Na2glycerophosphate5H2O, Fe-solution, PII metals, Vitamin B12, Thiamine, Biotin, Tris buffer)(Sigma Co.)에서 배양하였다.
<1-2>
감태의
온도변화 노출
본 발명자들은 상기 <실시예 1-1>의 감태를 16 ℃, 20 ℃ 및 24 ℃의 세 온도 조건에서 각각 48시간 동안 노출하였다.
구체적으로, 노출 온도는 20 ℃를 기준으로 하여 저온 노출 실험군은 20 ℃보다 4 ℃ 낮은 16 ℃에서, 고온 노출 실험군으로 20 ℃보다 4 ℃ 높은 24 ℃에서 48시간 동안 배양하였다.
<
실시예
2>
온도 상승에 의한
감태(
Ecklonia cava
)의
유전자 변화 측정
<2-1>
RNA
의 분리
본 발명자들은 온도 상승에 의한 감태 유래 유전자 변화를 측정하기 위하여 고온 및 저온에 노출한 감태의 RNA를 분리하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 수득한 세 온도(16 ℃, 20 ℃ 및 24 ℃)에 배양한 감태의 엽체 디스크를 막자사발에서 액체질소를 이용하여 분말로 만들고, 조직 분말에 CTAB buffer(3% CTAB, 1.0 M NaCL, 0.7 % PVP, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, pH 9.0)를 넣어 잘 섞은 후, 65 ℃에서 5분 동안 배양하였다. 배양한 감태를 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분)하여 층을 분리하여 상등액을 취하였다. 분리한 상등액의 1/2 volume의 클로로폼을 넣어 잘 섞은 후 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분간)하여 상등액을 취하였다. Equilibrated Phenol A(pH 4.3)를 1/4 volume 및 클로로폼(chloroform)을 1/4 volume 첨가하여 잘 섞은 후 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분)하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액에 페놀/클로로폼 용액(5:1)을 넣어 잘 섞고, 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분)하여 상등액을 취하였다. LiCl 용액(8M)을 앞서 취한 용액 부피의 1/2 첨가하여 조심스럽게 섞은 후, 4 ℃에서 최소 2시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 30분)하여 용액을 제거하고 침전물을 얻었다. 에탄올(70% DEPC-처리수)을 상기 침전물에 넣고 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분)하여, 침전물을 수세하고, 에탄올을 제거하였다. 그 후 침전물을 건조시켜 약 100 ㎕의 DEPC-처리수에 녹였다. 추출한 RNA 용액은 변성된 아가로즈 젤을 이용한 전기영동법으로 분리하였고 RNA의 순도는 UV spectrometer를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 260 nm/280 nm의 값이 1.6 내지 1.8 사이에 있음을 확인하고, 두 ribosomal RNA subunit(large/small)의 비가 1.5 내지 2.0이 되는 것을 확인함으로써 RNA가 변성되지 않음을 판단하였다.
<2-2>
cDNA
합성 및 형광표지
본 발명자들은 감태의 정제된 실험군 및 대조군의 전체 RNA를 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus(Agilent Technologies, USA)를 사용하여 Cy3 및 Cy5로 표지하였다.
구체적으로, 감태 시료 각각의 RNA 1 ㎍을 dT-프로모터 프라이머(dT-promoter primer)및 MMLV-역전사효소(MMLV-Reverse transcriptase)와 혼합하여 40 ℃에서 2시간 동안 역전사반응을 수행하였다. 그 후, T7 중합효소(T7 polymerase)를 첨가하여 40 ℃에서 2시간 동안 선형 증폭(linear amplification)을 수행하였다. 이와 같은 증폭과정을 통해 실험군 및 대조군의 시료를 각각 Cy3-CTP와 Cy5-CTP로 표지하였다.
<2-3>
혼성화
(
Hybridization
) 및 스캐닝(
scanning
)
본 발명자들은 감태 cDNA 마이크로 어레이를 제조하고 이를 혼성화시켜 스캐닝하였다.
구체적으로, 형광물질이 라벨링된 감태의 cDNA 시료를 PCR purification kit(Qiagen, Germany)을 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다. 정제된 형광표지-cDNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)(3x SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 ㎍ Cot-1 DNA, 20 ㎍ yeast tRNA)에 첨가한 후, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물을 만들었다. 상기 혼성화 혼합물을 95 ℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고, 12,000 g에서 30초간 원심분리하여 가열된 혼성화 화합물의 온도를 떨어뜨렸다. 제조된 감태 cDNA 마이크로어레이(microarray)에 커버슬립(coverslip)을 덮고, 변성시킨 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)하였다. 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(Chamber)에 넣고 65 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 혼성화가 끝난 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 세척과정을 수행하고, 마이크로어레이를 회전하여 건조한 후 스캐닝(scanning)할 때까지 암실에서 보관하였다. 실험이 완료된 감태 마이크로어레이를 Axon GenePix 4000B scanner(Axon Instrument, USA)를 사용하여 스캔하였다. GenePix Pro 6.0 program에서, 스캔 이미지로부터 각 점을 그리딩 파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율 등의 분석값이 포함된 GPR 파일(GPR file)을 얻었다.
<2-4>
마이크로어레이
자료 분석
GenePix Pro Program에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 GeneSpring 7.3.1(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다. 표준화(Normalization): LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였다. 신뢰할 수 있는 유전자(Reliable gene): 중앙값의 합이 배경(background) 보다 낮거나 각 화소(pixel) 값의 표준편차가 유의하지 않은 점을 플래그 아웃(flag-out)함으로써 유의한 유전자를 얻었다. 유의한 유전자(Significant genes) : 평준화된 비율(normalized ratio) 값이 2 배 이상 차이를 보이는 점을 선별하였다.
그 결과, 20 ℃에서 배양한 배양군을 기준으로 16 ℃에서 배양한 실험군에서 발현량이 변화되는 유전자 23종(증가 9, 감소 14)(표 1), 24 ℃에 배양한 실험군에서 발현량이 변화되는 유전자 173종(증가 84, 감소 89)(표 2), 16 ℃ 배양군을 기준으로 24 ℃에서 배양한 실험군에서 발현량이 변화되는 유전자 48종(증가 28, 감소 20)(표 3)을 확인하였으며, 중복된 유전자를 제외한 총 210종의 유전자를 서열번호 1 내지 210으로 기재하였다.
| 서열번호 | 발현량 변화 | |
| 상향 조절 |
1 | 2.97 |
| 2 | 2.89 | |
| 3 | 2.78 | |
| 4 | 2.31 | |
| 5 | 2.30 | |
| 6 | 2.20 | |
| 7 | 2.18 | |
| 8 | 2.06 | |
| 9 | 2.04 | |
| 하향 조절 |
10 | -2.01 |
| 11 | -2.11 | |
| 12 | -2.12 | |
| 13 | -2.15 | |
| 14 | -2.16 | |
| 15 | -2.33 | |
| 16 | -2.50 | |
| 17 | -2.59 | |
| 18 | -2.81 | |
| 19 | -3.02 | |
| 20 | -3.64 | |
| 21 | -5.60 | |
| 22 | -6.36 | |
| 23 | -8.33 |
발현량 변화: -, 하향조절(발현량 감소); +, 상향조절(발현량 증가)
발현량 변화: -, 하향조절(발현량 감소); +, 상향조절(발현량 증가)
발현량 변화: -, 하향조절(발현량 감소); +, 상향조절(발현량 증가)
본 발명에서 제시한 고온 및 저온 노출에 대응하는 감태 유래 유전자는 해양 생태계의 해수온 변화 정도 및 이에 따른 해양 생태계의 상태를 모니터링하고 진단하기 위한 바이오센서의 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, 제시된 유전자들의 기능에 의거하여 해양 생태계의 스트레스 검출 또는 건강 진단 방법에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (12)
- 하기 모든 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 마이크로어레이(microarray):
서열번호 1로 기재되는 유전자, 서열번호 2로 기재되는 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 유전자, 서열번호 4로 기재되는 유전자, 서열번호 5로 기재되는 유전자, 서열번호 6으로 기재되는 유전자, 서열번호 7로 기재되는 유전자, 서열번호 8로 기재되는 유전자, 서열번호 9로 기재되는 유전자, 서열번호 10으로 기재되는 유전자, 서열번호 11로 기재되는 유전자, 서열번호 12로 기재되는 유전자, 서열번호 13으로 기재되는 유전자, 서열번호 14로 기재되는 유전자, 서열번호 15로 기재되는 유전자, 서열번호 16으로 기재되는 유전자, 서열번호 17로 기재되는 유전자, 서열번호 18로 기재되는 유전자, 서열번호 19로 기재되는 유전자, 서열번호 20으로 기재되는 유전자, 서열번호 21로 기재되는 유전자, 서열번호 22로 기재되는 유전자, 서열번호 23으로 기재되는 유전자, 서열번호 24로 기재되는 유전자, 서열번호 25로 기재되는 유전자, 서열번호 26으로 기재되는 유전자, 서열번호 27로 기재되는 유전자, 서열번호 28로 기재되는 유전자, 서열번호 29로 기재되는 유전자, 서열번호 30으로 기재되는 유전자, 서열번호 31로 기재되는 유전자, 서열번호 32로 기재되는 유전자, 서열번호 33으로 기재되는 유전자, 서열번호 34로 기재되는 유전자, 서열번호 35로 기재되는 유전자, 서열번호 36으로 기재되는 유전자, 서열번호 37로 기재되는 유전자, 서열번호 38로 기재되는 유전자, 서열번호 39로 기재되는 유전자, 서열번호 40으로 기재되는 유전자, 서열번호 41로 기재되는 유전자, 서열번호 42로 기재되는 유전자, 서열번호 43으로 기재되는 유전자, 서열번호 44로 기재되는 유전자, 서열번호 45로 기재되는 유전자, 서열번호 46으로 기재되는 유전자, 서열번호 47로 기재되는 유전자, 서열번호 48로 기재되는 유전자, 서열번호 49로 기재되는 유전자, 서열번호 50으로 기재되는 유전자, 서열번호 51로 기재되는 유전자, 서열번호 52로 기재되는 유전자, 서열번호 53으로 기재되는 유전자, 서열번호 54로 기재되는 유전자, 서열번호 55로 기재되는 유전자, 서열번호 56으로 기재되는 유전자, 서열번호 57로 기재되는 유전자, 서열번호 58로 기재되는 유전자, 서열번호 59로 기재되는 유전자, 서열번호 60으로 기재되는 유전자, 서열번호 61로 기재되는 유전자, 서열번호 62로 기재되는 유전자, 서열번호 63으로 기재되는 유전자, 서열번호 64로 기재되는 유전자, 서열번호 65로 기재되는 유전자, 서열번호 66으로 기재되는 유전자, 서열번호 67로 기재되는 유전자, 서열번호 68로 기재되는 유전자, 서열번호 69로 기재되는 유전자, 서열번호 70으로 기재되는 유전자, 서열번호 71로 기재되는 유전자, 서열번호 72로 기재되는 유전자, 서열번호 73으로 기재되는 유전자, 서열번호 74로 기재되는 유전자, 서열번호 75로 기재되는 유전자, 서열번호 76으로 기재되는 유전자, 서열번호 77로 기재되는 유전자, 서열번호 78로 기재되는 유전자, 서열번호 79로 기재되는 유전자, 서열번호 80으로 기재되는 유전자, 서열번호 81로 기재되는 유전자, 서열번호 82로 기재되는 유전자, 서열번호 83으로 기재되는 유전자, 서열번호 84로 기재되는 유전자, 서열번호 85로 기재되는 유전자, 서열번호 86으로 기재되는 유전자, 서열번호 87로 기재되는 유전자, 서열번호 88로 기재되는 유전자, 서열번호 89로 기재되는 유전자, 서열번호 90으로 기재되는 유전자, 서열번호 91로 기재되는 유전자, 서열번호 92로 기재되는 유전자, 서열번호 93으로 기재되는 유전자, 서열번호 94로 기재되는 유전자, 서열번호 95로 기재되는 유전자, 서열번호 96으로 기재되는 유전자, 서열번호 97로 기재되는 유전자, 서열번호 98로 기재되는 유전자, 서열번호 99로 기재되는 유전자, 서열번호 100으로 기재되는 유전자, 서열번호 101로 기재되는 유전자, 서열번호 102로 기재되는 유전자, 서열번호 103으로 기재되는 유전자, 서열번호 104로 기재되는 유전자, 서열번호 105로 기재되는 유전자, 서열번호 106으로 기재되는 유전자, 서열번호 107로 기재되는 유전자, 서열번호 108로 기재되는 유전자, 서열번호 109로 기재되는 유전자, 서열번호 110으로 기재되는 유전자, 서열번호 111로 기재되는 유전자, 서열번호 112로 기재되는 유전자, 서열번호 113으로 기재되는 유전자, 서열번호 114로 기재되는 유전자, 서열번호 115로 기재되는 유전자, 서열번호 116으로 기재되는 유전자, 서열번호 117로 기재되는 유전자, 서열번호 118로 기재되는 유전자, 서열번호 119로 기재되는 유전자, 서열번호 120으로 기재되는 유전자, 서열번호 121로 기재되는 유전자, 서열번호 122로 기재되는 유전자, 서열번호 123으로 기재되는 유전자, 서열번호 124로 기재되는 유전자, 서열번호 125로 기재되는 유전자, 서열번호 126으로 기재되는 유전자, 서열번호 127로 기재되는 유전자, 서열번호 128로 기재되는 유전자, 서열번호 129로 기재되는 유전자, 서열번호 130으로 기재되는 유전자, 서열번호 131로 기재되는 유전자, 서열번호 132로 기재되는 유전자, 서열번호 133으로 기재되는 유전자, 서열번호 134로 기재되는 유전자, 서열번호 135로 기재되는 유전자, 서열번호 136으로 기재되는 유전자, 서열번호 137로 기재되는 유전자, 서열번호 138로 기재되는 유전자, 서열번호 139로 기재되는 유전자, 서열번호 140으로 기재되는 유전자, 서열번호 141로 기재되는 유전자, 서열번호 142로 기재되는 유전자, 서열번호 143으로 기재되는 유전자, 서열번호 144로 기재되는 유전자, 서열번호 145로 기재되는 유전자, 서열번호 146으로 기재되는 유전자, 서열번호 147로 기재되는 유전자, 서열번호 148로 기재되는 유전자, 서열번호 149로 기재되는 유전자, 서열번호 150으로 기재되는 유전자, 서열번호 151로 기재되는 유전자, 서열번호 152로 기재되는 유전자, 서열번호 153으로 기재되는 유전자, 서열번호 154로 기재되는 유전자, 서열번호 155로 기재되는 유전자, 서열번호 156으로 기재되는 유전자, 서열번호 157로 기재되는 유전자, 서열번호 158로 기재되는 유전자, 서열번호 159로 기재되는 유전자, 서열번호 160으로 기재되는 유전자, 서열번호 161로 기재되는 유전자, 서열번호 162로 기재되는 유전자, 서열번호 163으로 기재되는 유전자, 서열번호 164로 기재되는 유전자, 서열번호 165로 기재되는 유전자, 서열번호 166으로 기재되는 유전자, 서열번호 167로 기재되는 유전자, 서열번호 168로 기재되는 유전자, 서열번호 169로 기재되는 유전자, 서열번호 170으로 기재되는 유전자, 서열번호 171로 기재되는 유전자, 서열번호 172로 기재되는 유전자, 서열번호 173으로 기재되는 유전자, 서열번호 174로 기재되는 유전자, 서열번호 175로 기재되는 유전자, 서열번호 176으로 기재되는 유전자, 서열번호 177로 기재되는 유전자, 서열번호 178로 기재되는 유전자, 서열번호 179로 기재되는 유전자, 서열번호 180으로 기재되는 유전자, 서열번호 181로 기재되는 유전자, 서열번호 182로 기재되는 유전자, 서열번호 183으로 기재되는 유전자, 서열번호 184로 기재되는 유전자, 서열번호 185로 기재되는 유전자, 서열번호 186으로 기재되는 유전자, 서열번호 187로 기재되는 유전자, 서열번호 188로 기재되는 유전자, 서열번호 189로 기재되는 유전자, 서열번호 190으로 기재되는 유전자, 서열번호 191로 기재되는 유전자, 서열번호 192로 기재되는 유전자, 서열번호 193으로 기재되는 유전자, 서열번호 194로 기재되는 유전자, 서열번호 195로 기재되는 유전자, 서열번호 196으로 기재되는 유전자, 서열번호 197로 기재되는 유전자, 서열번호 198로 기재되는 유전자, 서열번호 199로 기재되는 유전자, 서열번호 200으로 기재되는 유전자, 서열번호 201로 기재되는 유전자, 서열번호 202로 기재되는 유전자, 서열번호 203으로 기재되는 유전자, 서열번호 204로 기재되는 유전자, 서열번호 205로 기재되는 유전자, 서열번호 206으로 기재되는 유전자, 서열번호 207로 기재되는 유전자, 서열번호 208로 기재되는 유전자, 서열번호 209로 기재되는 유전자 및 서열번호 210으로 기재되는 유전자.
- 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 감태(Ecklonia cava)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 마이크로어레이.
- 삭제
- 1) 실험군인 감태와 대조군인 감태에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 모든 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인 방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인 방법.
- 1) 실험군인 감태와 대조군인 감태에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 하기 각각의 유전자에 상보적이며 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍 모두를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
서열번호 1로 기재되는 유전자, 서열번호 2로 기재되는 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 유전자, 서열번호 4로 기재되는 유전자, 서열번호 5로 기재되는 유전자, 서열번호 6으로 기재되는 유전자, 서열번호 7로 기재되는 유전자, 서열번호 8로 기재되는 유전자, 서열번호 9로 기재되는 유전자, 서열번호 10으로 기재되는 유전자, 서열번호 11로 기재되는 유전자, 서열번호 12로 기재되는 유전자, 서열번호 13으로 기재되는 유전자, 서열번호 14로 기재되는 유전자, 서열번호 15로 기재되는 유전자, 서열번호 16으로 기재되는 유전자, 서열번호 17로 기재되는 유전자, 서열번호 18로 기재되는 유전자, 서열번호 19로 기재되는 유전자, 서열번호 20으로 기재되는 유전자, 서열번호 21로 기재되는 유전자, 서열번호 22로 기재되는 유전자, 서열번호 23으로 기재되는 유전자, 서열번호 24로 기재되는 유전자, 서열번호 25로 기재되는 유전자, 서열번호 26으로 기재되는 유전자, 서열번호 27로 기재되는 유전자, 서열번호 28로 기재되는 유전자, 서열번호 29로 기재되는 유전자, 서열번호 30으로 기재되는 유전자, 서열번호 31로 기재되는 유전자, 서열번호 32로 기재되는 유전자, 서열번호 33으로 기재되는 유전자, 서열번호 34로 기재되는 유전자, 서열번호 35로 기재되는 유전자, 서열번호 36으로 기재되는 유전자, 서열번호 37로 기재되는 유전자, 서열번호 38로 기재되는 유전자, 서열번호 39로 기재되는 유전자, 서열번호 40으로 기재되는 유전자, 서열번호 41로 기재되는 유전자, 서열번호 42로 기재되는 유전자, 서열번호 43으로 기재되는 유전자, 서열번호 44로 기재되는 유전자, 서열번호 45로 기재되는 유전자, 서열번호 46으로 기재되는 유전자, 서열번호 47로 기재되는 유전자, 서열번호 48로 기재되는 유전자, 서열번호 49로 기재되는 유전자, 서열번호 50으로 기재되는 유전자, 서열번호 51로 기재되는 유전자, 서열번호 52로 기재되는 유전자, 서열번호 53으로 기재되는 유전자, 서열번호 54로 기재되는 유전자, 서열번호 55로 기재되는 유전자, 서열번호 56으로 기재되는 유전자, 서열번호 57로 기재되는 유전자, 서열번호 58로 기재되는 유전자, 서열번호 59로 기재되는 유전자, 서열번호 60으로 기재되는 유전자, 서열번호 61로 기재되는 유전자, 서열번호 62로 기재되는 유전자, 서열번호 63으로 기재되는 유전자, 서열번호 64로 기재되는 유전자, 서열번호 65로 기재되는 유전자, 서열번호 66으로 기재되는 유전자, 서열번호 67로 기재되는 유전자, 서열번호 68로 기재되는 유전자, 서열번호 69로 기재되는 유전자, 서열번호 70으로 기재되는 유전자, 서열번호 71로 기재되는 유전자, 서열번호 72로 기재되는 유전자, 서열번호 73으로 기재되는 유전자, 서열번호 74로 기재되는 유전자, 서열번호 75로 기재되는 유전자, 서열번호 76으로 기재되는 유전자, 서열번호 77로 기재되는 유전자, 서열번호 78로 기재되는 유전자, 서열번호 79로 기재되는 유전자, 서열번호 80으로 기재되는 유전자, 서열번호 81로 기재되는 유전자, 서열번호 82로 기재되는 유전자, 서열번호 83으로 기재되는 유전자, 서열번호 84로 기재되는 유전자, 서열번호 85로 기재되는 유전자, 서열번호 86으로 기재되는 유전자, 서열번호 87로 기재되는 유전자, 서열번호 88로 기재되는 유전자, 서열번호 89로 기재되는 유전자, 서열번호 90으로 기재되는 유전자, 서열번호 91로 기재되는 유전자, 서열번호 92로 기재되는 유전자, 서열번호 93으로 기재되는 유전자, 서열번호 94로 기재되는 유전자, 서열번호 95로 기재되는 유전자, 서열번호 96으로 기재되는 유전자, 서열번호 97로 기재되는 유전자, 서열번호 98로 기재되는 유전자, 서열번호 99로 기재되는 유전자, 서열번호 100으로 기재되는 유전자, 서열번호 101로 기재되는 유전자, 서열번호 102로 기재되는 유전자, 서열번호 103으로 기재되는 유전자, 서열번호 104로 기재되는 유전자, 서열번호 105로 기재되는 유전자, 서열번호 106으로 기재되는 유전자, 서열번호 107로 기재되는 유전자, 서열번호 108로 기재되는 유전자, 서열번호 109로 기재되는 유전자, 서열번호 110으로 기재되는 유전자, 서열번호 111로 기재되는 유전자, 서열번호 112로 기재되는 유전자, 서열번호 113으로 기재되는 유전자, 서열번호 114로 기재되는 유전자, 서열번호 115로 기재되는 유전자, 서열번호 116으로 기재되는 유전자, 서열번호 117로 기재되는 유전자, 서열번호 118로 기재되는 유전자, 서열번호 119로 기재되는 유전자, 서열번호 120으로 기재되는 유전자, 서열번호 121로 기재되는 유전자, 서열번호 122로 기재되는 유전자, 서열번호 123으로 기재되는 유전자, 서열번호 124로 기재되는 유전자, 서열번호 125로 기재되는 유전자, 서열번호 126으로 기재되는 유전자, 서열번호 127로 기재되는 유전자, 서열번호 128로 기재되는 유전자, 서열번호 129로 기재되는 유전자, 서열번호 130으로 기재되는 유전자, 서열번호 131로 기재되는 유전자, 서열번호 132로 기재되는 유전자, 서열번호 133으로 기재되는 유전자, 서열번호 134로 기재되는 유전자, 서열번호 135로 기재되는 유전자, 서열번호 136으로 기재되는 유전자, 서열번호 137로 기재되는 유전자, 서열번호 138로 기재되는 유전자, 서열번호 139로 기재되는 유전자, 서열번호 140으로 기재되는 유전자, 서열번호 141로 기재되는 유전자, 서열번호 142로 기재되는 유전자, 서열번호 143으로 기재되는 유전자, 서열번호 144로 기재되는 유전자, 서열번호 145로 기재되는 유전자, 서열번호 146으로 기재되는 유전자, 서열번호 147로 기재되는 유전자, 서열번호 148로 기재되는 유전자, 서열번호 149로 기재되는 유전자, 서열번호 150으로 기재되는 유전자, 서열번호 151로 기재되는 유전자, 서열번호 152로 기재되는 유전자, 서열번호 153으로 기재되는 유전자, 서열번호 154로 기재되는 유전자, 서열번호 155로 기재되는 유전자, 서열번호 156으로 기재되는 유전자, 서열번호 157로 기재되는 유전자, 서열번호 158로 기재되는 유전자, 서열번호 159로 기재되는 유전자, 서열번호 160으로 기재되는 유전자, 서열번호 161로 기재되는 유전자, 서열번호 162로 기재되는 유전자, 서열번호 163으로 기재되는 유전자, 서열번호 164로 기재되는 유전자, 서열번호 165로 기재되는 유전자, 서열번호 166으로 기재되는 유전자, 서열번호 167로 기재되는 유전자, 서열번호 168로 기재되는 유전자, 서열번호 169로 기재되는 유전자, 서열번호 170으로 기재되는 유전자, 서열번호 171로 기재되는 유전자, 서열번호 172로 기재되는 유전자, 서열번호 173으로 기재되는 유전자, 서열번호 174로 기재되는 유전자, 서열번호 175로 기재되는 유전자, 서열번호 176으로 기재되는 유전자, 서열번호 177로 기재되는 유전자, 서열번호 178로 기재되는 유전자, 서열번호 179로 기재되는 유전자, 서열번호 180으로 기재되는 유전자, 서열번호 181로 기재되는 유전자, 서열번호 182로 기재되는 유전자, 서열번호 183으로 기재되는 유전자, 서열번호 184로 기재되는 유전자, 서열번호 185로 기재되는 유전자, 서열번호 186으로 기재되는 유전자, 서열번호 187로 기재되는 유전자, 서열번호 188로 기재되는 유전자, 서열번호 189로 기재되는 유전자, 서열번호 190으로 기재되는 유전자, 서열번호 191로 기재되는 유전자, 서열번호 192로 기재되는 유전자, 서열번호 193으로 기재되는 유전자, 서열번호 194로 기재되는 유전자, 서열번호 195로 기재되는 유전자, 서열번호 196으로 기재되는 유전자, 서열번호 197로 기재되는 유전자, 서열번호 198로 기재되는 유전자, 서열번호 199로 기재되는 유전자, 서열번호 200으로 기재되는 유전자, 서열번호 201로 기재되는 유전자, 서열번호 202로 기재되는 유전자, 서열번호 203으로 기재되는 유전자, 서열번호 204로 기재되는 유전자, 서열번호 205로 기재되는 유전자, 서열번호 206으로 기재되는 유전자, 서열번호 207로 기재되는 유전자, 서열번호 208로 기재되는 유전자, 서열번호 209로 기재되는 유전자 및 서열번호 210으로 기재되는 유전자; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인 방법.
- 제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 것을 특징으로 하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 키트.
- 삭제
- 제 7항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 키트.
- 제 7항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTP 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 키트.
- 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 모두를 포함하는 해수온 변화에 의한 스트레스 노출 여부 확인용 키트:
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| KR1020130133666A KR101379317B1 (ko) | 2013-11-05 | 2013-11-05 | 해수온 변화에 대응하는 감태 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 환경 변화 진단 방법 |
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| KR (1) | KR101379317B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102230833B1 (ko) * | 2020-04-10 | 2021-03-24 | 한국해양과학기술원 | 해수온 변화에 대응하는 감태 수배우체 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 환경 변화 진단 방법 |
| KR102323441B1 (ko) * | 2021-04-01 | 2021-11-05 | 한국해양과학기술원 | 해수온 변화에 대응하는 감태 암배우체 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 환경 변화 진단 방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110011016A (ko) * | 2009-07-27 | 2011-02-08 | 한국해양연구원 | 해수온 변화에 대응하는 분홍바다맨드라미의 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 방법 |
| KR20130107553A (ko) * | 2012-03-22 | 2013-10-02 | 한국해양과학기술원 | 해수온 변화에 대응하는 감태 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 환경 변화 진단 방법 |
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2013
- 2013-11-05 KR KR1020130133666A patent/KR101379317B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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