ES2551584T3 - Métodos para seleccionar ovocitos competentes y embriones competentes con alto potencial para un resultado de embarazo - Google Patents

Métodos para seleccionar ovocitos competentes y embriones competentes con alto potencial para un resultado de embarazo Download PDF

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Abstract

Un método para seleccionar un ovocito que producirá, tras fertilización, un embrión viable con una alta tasa de implante que conduce a embarazo, que comprende la etapa de medir el nivel de expresión de 10 genes en una célula del cumulus que rodea dicho ovocito; en el que dichos genes son ATF3, SIAT6, PRKACA, PLA2G5, GPC6, G0S2, RBMS1, NFIC, SLC40A1 y WNT6 y - en el que el ovocito se selecciona si dicha célula del cumulus no sobre-expresa ninguno de dichos 10 genes.

Description

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complejos entre ácidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias de sonda unidas a la superficie de microserie. Los complejos hibridados marcados entonces se detectan y pueden cuantificarse o semicuantificarse. El marcaje puede conseguirse por diversos métodos, por ejemplo, usando marcaje radiactivo o fluorescente. Están disponibles muchas variantes de la tecnología de hibridación en microserie para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, la revisión de Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210).
En este contexto, la invención comprende adicionalmente un chip de ADN que comprende un soporte sólido que porta ácidos nucleicos que son específicos para los genes enumerados en la Tabla A.
Otros métodos para determinar el nivel de expresión de dichos genes incluyen la determinación de la cantidad de proteínas codificadas por dichos genes.
Dichos métodos comprenden poner en contacto la muestra con un compañero de unión capaz de interaccionar de forma selectiva con una proteína marcadora presente en la muestra. El compañero de unión es generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal.
La presencia de la proteína puede detectarse usando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico convencionales, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos de competición, reacción directa, o tipo sándwich. Dichos ensayos incluyen, aunque sin limitación, transferencias de Western; ensayos de aglutinación; inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tales como ELISA; ensayos tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcadores reveladores tales como marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos o moléculas colorantes, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o anticuerpos que han reaccionado con el mismo.
Los ensayos mencionados anteriormente generalmente implican la separación de proteína no unida en una fase líquida de un soporte en fase sólida al cual están unidos los complejos antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microtitulación), cloruro de polivinilo (por ejemplo, láminas o pocillos de microtitulación); látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microtitulación); fluoruro de polivinilideno; papel diazotizado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas magnéticamente sensibles, y similares.
Más particularmente, puede usarse un método ELISA, donde los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con un anticuerpo contra la proteína a ensayar. Una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene la proteína marcadora se añade después a los pocillos recubiertos. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno, la placa o placas pueden lavarse para retirar los restos no unidos y se añade una molécula de unión secundaria marcada de forma detectable. La molécula de unión secundaria se deja reaccionar con cualquier proteína marcadora de muestra capturada, la placa se lava y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria usando métodos bien conocidos en la técnica.
Como alternativa puede preferirse un método de inmunohistoquímica (IHC). IHC proporciona específicamente un método para detectar dianas en una muestra o espécimen tisular in situ. La integridad celular global de la muestra se mantiene en IHC, permitiendo por tanto la detección tanto de la presencia como de la localización de las dianas de interés. Típicamente se fija una muestra con formalina, se incluye en parafina y se corta en secciones para tinción y posterior inspección por microscopia óptica. Los métodos actuales de IHC usan marcaje directo o marcaje basado en anticuerpo secundario o basado en hapteno. Los ejemplos de sistemas IHC conocidos incluyen, por ejemplo, EnVision(TM) (DakoCytomation), Powervision(R) (Immunovision, Springdale, AZ), el kit NBA(TM) (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA), HistoFine(R) (Nichirei Corp, Tokio, Japón).
En una realización particular, puede montarse una sección tisular (por ejemplo, una muestra que comprende células del cumulus) en un portaobjetos u otro soporte después de incubación con anticuerpos dirigidos contra las proteínas codificadas por los genes de interés. Después, pueden realizarse inspecciones microscópicas en la muestra montada en un soporte sólido adecuado. Para la producción de fotomicrografías, pueden montarse secciones que comprendan muestras en un portaobjetos de vidrio u otro soporte plano, para resaltar por tinción selectiva la presencia de las proteínas de interés.
Por lo tanto, las muestras IHC pueden incluir, por ejemplo: (a) preparaciones que comprenden células del cumulus,
(b) fijar e incluir dichas células y (c) detectar las proteínas de interés en dichas muestras celulares. En algunas realizaciones, un procedimiento de tinción IHC puede comprender etapas tales como: corte y recorte de tejido, fijación, deshidratación, infiltración de parafina, corte en secciones delgadas, montaje en portaobjetos de vidrio, cocción, desparafinado , rehidratación, recuperación del antígeno, etapas de bloqueo, aplicación de anticuerpos primarios, lavado, aplicación de anticuerpos secundarios (opcionalmente acoplados a un marcador detectable adecuado), lavado, tinción de contraste, y examen microscópico.
La invención también se refiere al uso de un kit para realizar los métodos descritos anteriormente, donde dicho kit comprende medios para medir el nivel o niveles de expresión de los genes de la Tabla A que es indicativa de si el
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de la granulosa (8 muestras). Inmediatamente después de la recuperación de los ovocitos, se combinaron los fluidos foliculares de folículos maduros (>17 mm) del mismo paciente, después de la retirada del complejo cumulus ovocito y se diluyeron en un volumen 1/3 de solución HBSS (BioWhittaker) en lotes de 50 ml, que representa una muestra. La purificación de células de la granulosa se adaptó a partir del protocolo de (Kolena et al., 1983). Después de centrifugación de 20 minutos a 500 g en cubetas oscilantes, se recogieron las células de la granulosa en un cojín de Ficoll (12 ml de medio de separación de Linfocitos, BioWhittaker). Se lavaron sucesivamente en HBSS y PBS, se incubaron 5 minutos en tampón de lisis sanguínea (KHCO3 10 mM, NH4Cl 150 mM, EDTA 0,1 mM) para retirar los glóbulos rojos, se contaron y se sedimentaron en PBS antes de lisis en tampón RLT (Quiagen) y almacenamiento a 80ºC. La cantidad de punción folicular y la cantidad de células de la granulosa purificadas varió de 6 a 12 de 2 106 a 9 106 respectivamente.
Preparación de ARN complementario (ARNc) e hibridación de microserie: Se extrajo el ARN de CC y de células de la granulosa usando el micro kit RNeasy (Qiagen). Se midió la cantidad de ARN total con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies Inc., DE, EE.UU.) y se evaluó la integridad del ARN con un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.). El ARNc se preparó con dos rondas de amplificación de acuerdo con el protocolo del fabricante de "doble amplificación" (kit de síntesis de ADNc de dos ciclos, Invitrogen) partiendo del ARN total (que varía de 70 ng a 100 ng). El ARNc obtenido después de la primera amplificación varió de 0,1 µg/ml a 1,9 g/ml y después de la segunda amplificación varió de 1,6 µg/ml a 4,5 g/ml.
El ARNc fragmentado marcado (12 µg) se hibridó a sondas oligonucleotídicas en una serie Affymetrix HG-U133 Plus
2.0 que contenía 54.675 conjuntos de sondas oligonucleotídicas ("conjunto de sondas") que corresponden a 
30.000 genes humanos únicos o genes predichos. Cada muestra de cumulus y granulosa se puso individualmente en un chip de microserie.
Procesamiento de datos: Se procesaron imágenes de GeneChip escaneadas usando el software Affymetrix GCOS
1.4 para obtener un valor de intensidad y una calificación de detección (presente, marginal o ausente) para cada conjunto de sondas usando los ajustes de análisis por defecto y escala global como primer método de normalización, con un valor de intensidad de diana medio recortado (TGT) de cada serie establecida arbitrariamente a 100. Las intensidades de sonda se derivaron usando el algoritmo MAS5.0. Este algoritmo también determina si un gen se expresa con un nivel de confianza definido o no ("calificación de detección"). Esta "calificación" puede ser "presente" (cuando las sondas de apareamiento perfecto están significativamente más hibridadas que las sondas de desapareamiento, valor-p <0,04), "marginal" (para valores-p >0,04 y <0,06) o "ausentes" (valor-p >0,06). Los datos de microseries se obtuvieron en nuestro laboratorio de acuerdo con las recomendaciones de Información Mínima acerca de un Experimento de Microserie MIAME (Brazma et al. 2001).
Análisis de datos y visualización: Se usó análisis significativo de microseries (SAM) (Tusher et al., 2001) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) para identificar genes cuya expresión variaba significativamente entre grupos de muestras. SAM proporciona valores de media o mediana del cambio factorial (FC) y una porcentaje de confianza de la tasa de descubrimiento falso (FDR) en base a permutación de datos (cambio factorial medio > 2 y FDR < 5%). El análisis de series que permite la comparación del perfil de expresión génica entre muestras de células del cumulus y muestras de células de la granulosa se basa en primer lugar en la detección de ARN significativo (calificación de detección "presente" o "ausente") y después, se somete a un SAM (análisis significativo de microseries) para identificar genes cuya expresión varió significativamente entre grupos de muestras. Para realizar la comparación de perfil de expresión génica entre muestras de células del cumulus de acuerdo con la calidad embrionaria y/o el resultado de embarazo, se realizó una selección no supervisada de conjuntos de sondas usando un coeficiente de variación (CV ≥40%) y un filtro de "calificación de detección" ausente/presente antes de SAM. Para comparar los perfiles de expresión de células del cumulus de desarrollo embrionario alterado (grado 3-4) y bueno (grado 1-2), o de embriones que conducen, o no, a un embrazo, realizamos una clasificación no supervisada con análisis de componentes principales (PCA) y también agrupamiento jerárquico (de Hoon et al., 2004; Eisen et al., 1998). El PCA implicó guiones originales basados en el software de estadística R a través de la interfaz web RAGE (http://rage.montp.inserm.fr) (Reme et al., 2008). El análisis de agrupamiento jerárquico basado en los niveles de expresión de sondas variables se realizó con los paquetes de software CLUSTER y TREEVIEW. Para descubrir las redes biológicas funcionales y las vías canónicas superiores, importamos las firmas de expresión génica en el Software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EEUU).
Análisis de RT-PCR cuantitativa: Para análisis de qRT-PCR, se seleccionaron 10 muestras CC usadas en los experimentos de microserie de acuerdo con su resultado de embarazo (5 muestras CC asociadas a un resultado negativo y 5 a un resultado positivo correspondientes a 10 pacientes). Se usó ARNc marcado (1 g) del paciente para generar ADNc de primera hebra. Estos ADNc (5 l de una dilución 1/10) para reacciones de PCR cuantitativa a tiempo real de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Applied Biosytems). Los 20 l de mezcla de reacción consistían en ADNc (5 l), 1 M de cebadores y 10 l de mezcla maestra de PCR universal Taqman (Applied Biosystem). La amplificación se midió durante 40 ciclos con una temperatura de hibridación a 60ºC. La cantidad de producto de PCR producida en cada etapa de ciclo de la reacción de PCR se controla por sonda TaqMan. Se establece un umbral en la fase exponencial de la curva de amplificación, de la cual se lee el número de ciclo ("Ct" para "umbral de ciclo"). El valor Ct se usa en el cálculo de los niveles relativos de transcrito de ARNm. Se
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Tabla B: conjunto de genes predictivo.
Símbolo del gen
Nombre del gen ID del gen
WNT6
familia del sitio de integración de MMTV tipo wingless, miembro 6 7475
LRCH4
dominio que contiene repeticiones ricas en leucina y homología a calponina (CH) 4034
PAX8
caja 8 apareada 7849
CABP4
proteína 4 de unión a calcio 57010
PDE5A
fosfodiesterasa 5A, específica de GMPc 8654
BCL2L11
BCL2-tipo 11 (facilitador de apoptosis) 10018
PCK1
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (soluble) 5105
TCF20
factor 20 de transcripción (AR1) 6942
SLAMF6
miembro 6 de la familia SLAM 114836
EPOR
receptor de eritropoyetina 2057
CACNG6
canal de calcio, dependiente de voltaje, subunidad gamma 6 59285
NLRP1
familia NLR, que contiene dominio pirina 1 22861
PECAM1
molécula de adhesión de plaquetas/células endoteliales 5175
NOS1
óxido nítrico sintasa 1 (neuronal) 4842
ATF3
factor 3 de transcripción activador 467
KRTAP8
proteína 8-1 asociada a queratina 337879
GRIK5
receptor de glutamato, ionotrópico, kainato 5 2901
SLC24A3
familia de transportadores de solutos 24 (intercambiador de sodio/potasio/calcio), miembro 3 57419
SLC5A12
familia de transportadores de solutos 5 (cotransportador de sodio/glucosa), miembro 12 159963
SLCA10A2
familia de transportadores de solutos 10 (familia de contransportadores de sodio/ácido biliar), miembro 2 6555
SLCO1A2
familia de transportadores de solutos, de transporte de aniones orgánicos, miembro 1A2 6579
SLC25A5
familia de transportadores de solutos 25 (transportador mitocondrial; traslocador de nucleótidos de adenina), miembro 5 292
MG29 o SYPL2
sinaptofisina-tipo 2 284612
NLGN2
neuroligina 2 57555
PRKACA
proteína quinasa, dependiente de AMPc, catalítica, alfa 5566
FOSB
homólogo B de oncogén viral de osteosarcoma murino FBJ 2354
SIAT6
ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 3 6487
LOXL2
lisil oxidasa-tipo 2 4017
PRF1
perforina 1 (proteína de formación de poros) 5551
ADPRH
ADP-ribosilarginina hidrolasa 141
APBB3
unión a proteína precursores de amiloide beta (A4), familia B, miembro 3 10307
EGR3
respuesta de crecimiento prematuro 3 1960
CNR2
receptor 2 de cannabinoides (macrófagos) 1269
IFITM1
proteína transmembrana 1 inducida por interferón (9-27) 8519
PLA2G5
fosfolipasa A2, grupo V 5322
CAMTA1
activador 1 de transcripción de unión a calmodulina 23261
SOX4
SRY (región determinante del sexo Y)-caja 4 6659
NFIB
factor nuclear I/B 4781
NFIC
factor nuclear I/C (factor de transcripción de unión a CCAAT) 4782
RBMS1
motivo de unión a ARN, proteína 1 de interacción monocatenaria 5937
G0S2
conmutador 2 G0/G1 50486
FAT3
homólogo 3 de supresor tumoral FAT (Drosophila) 120114
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