ES2653851T3 - Biomarcadores transcriptómicos para evaluación de riesgo individual en insuficiencia cardíaca de nueva aparición - Google Patents

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Joshua M. Hare
Bettina Heidecker
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Abstract

Uso de una firma molecular que consiste en secuencias génicas complementarias de las secuencias de ácido nucleico: 232669_at (factor inducible por Hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA0220 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura del cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC:FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869_at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_art (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (Neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila)), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia de receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición de WD 33), 213773_x_at (familia de dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE:4821815) y 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial) para predecir un pronóstico de insuficiencia cardiaca de nueva aparición, que comprende examinar la expresión de las secuencias génicas de la firma molecular en una muestra tisular o celular.

Description

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(perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
Preferentemente, la detección en una célula o un paciente de las secuencias génicas, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas, es predictiva de resultado de diagnóstico clínico y pronóstico de insuficiencia cardíaca, predictivo de resultado de pronóstico o diagnóstico de enfermedades y trastornos cardíacos y cardiovasculares, tales como, por ejemplo, miocarditis, Enfermedad Cardíaca Coronaria, angina, Síndrome Coronario Agudo, Aneurisma y Disección Aórtica, arritmias, Cardiomiopatía, Enfermedad Cardíaca Congénita, insuficiencia cardíaca congestiva o insuficiencia cardíaca crónica, pericarditis y similares.
Preferentemente, las secuencias génicas, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas se sobreexpresan a niveles en al menos 1 % a 100 %, 200 %, 300 % o más en una célula o un paciente en comparación con niveles en una célula normal o un sujeto normal.
En una realización alternativa, al menos nueve secuencias génicas son pronóstico en la evaluación de riesgos individual en un paciente, predictivas de resultado de diagnóstico clínico y pronóstico de insuficiencia cardíaca.
En otra realización preferida, una pluralidad de secuencias génicas son pronóstico en evaluación de riesgos individual en un paciente para aparición de insuficiencia cardíaca.
En otra realización preferida, un biomarcador (BBT) predictivo de resultado de diagnóstico clínico y pronóstico de insuficiencia cardíaca que comprende secuencias/biomoléculas de ácido nucleico comprende: 1558458_at (LOC401320 Hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las
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En una realización, la detección en una célula o un paciente de las secuencias génicas, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas es predictiva de resultado de diagnóstico clínico y pronóstico de insuficiencia cardíaca, y es predictiva de resultado de pronóstico o diagnóstico de enfermedades y trastornos cardíacos y cardiovasculares, tales como por ejemplo, miocarditis, Enfermedad Cardíaca Coronaria, angina, Síndrome Coronario Agudo, Aneurisma y Disección Aórtica, arritmias, Cardiomiopatía, Enfermedad Cardíaca Congénita, insuficiencia cardíaca congestiva o insuficiencia cardíaca crónica, pericarditis y similares.
En una realización preferida, las secuencias génicas, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas están sobreexpresados a niveles en al menos 1 % a 100 %, 200 %, 300 % o más en una célula o un paciente en comparación con niveles en una célula normal o un sujeto normal.
En otra, un biochip comprende las secuencias de ácido nucleico: 1558458_at (LOC401320 Hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En una realización, el biochip comprende al menos diez secuencias de ácido nucleico, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En otra realización preferida, un anticuerpo o aptámero es específico para cada una de: 1558458_at (LOC401320 Hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho
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a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (Neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila)), 244512_at (locus transcrito muy similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral 14), 22651_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición de WD 33), 213773_x_at (familia de dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En otra realización preferida, una célula expresa una cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico o productos de las mismas que comprenden: 1558458_at (LOC401320 Hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En otra realización preferida, un vector expresa una cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico que comprende: 1558458_at (LOC401320 Hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH66 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contienen dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (Polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968 at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208 at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho
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GTPasa 26, ARHGAP26), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
Breve descripción de los dibujos
La invención se señala particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas anteriores y adicionales de la invención puede entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es una exploración de una fotografía que muestra un análisis de ARN total extraído con Bioanalizador Agilent 2100: cada muestra se ensayó con respecto a su integridad y pureza antes de hibridación de micromatrices. La fotografía representa un gel de 12 muestras con bandas uniformes de ARN 18S y 28S. El carril izquierdo contiene el marcador de referencia. La Figura 2 es una representación esquemática de conjuntos de entrenamiento y ensayo como se usan para el desarrollo de un clasificador con Análisis de Predicción de Micromatrices (PAM). Todas las muestras obtenidas de pacientes con mal pronóstico (MP, n = 18) se seleccionaron de un depósito biológico (n = 180) y las que tenían un buen pronóstico (BP, n = 25) se seleccionaron de una manera con control de casos (véase el texto para las definiciones de MP y BP). El clasificador, un centroide reducido más próximo, se desarrolló en 2/3 de los datos (17 muestras con BP; 12 muestras con MP) con validación posterior en el 1/3 restante de los datos (8 muestras con BP, 6 muestras con MP). La precisión de ensayo global del BBT se calculó a partir de 50 particiones aleatorias en conjuntos de entrenamiento y ensayo. La Figura 3 es un mapa de calor de muestras de todos los pacientes con cardiomiopatía dilatada idiopática (n = 43). Cada columna corresponde a una muestra de paciente y cada fila representa un gen. Las muestras clasificadas como con MP forman un grupo definido y están destacadas en un cuadrado rojo. Los genes regulados negativamente se representan con rojo, mientras que los genes regulados positivamente se marcan en azul. Las flechas amarillas indican muestras clasificadas erróneamente. La Figura 4 es un diagrama circular que ilustra rutas implicadas dentro del biomarcador de pronóstico. Las rutas principales sobreexpresadas en pacientes con BP incluyeron transcripción (26 %), unión de proteínas (15 %), transporte de iones (13 %) y desarrollo neuromuscular (10 %). La Figura 5 muestra dos gráficos que ilustran la mejora funcional de la fracción de eyección (FE) desde la línea basal hasta el punto final: dentro de todos los casos admitidos de cardiomiopatía idiopática (n = 43), se analizaron adicionalmente aquellos de los que estuvieron disponibles medidas ecocardiográficas en línea basal y punto final (n = 17). Las muestras se clasifican en BP o MP basándose en la predicción de BBT. Los pacientes clasificados como BP (n = 11, promedio de seguimiento: 49,9±21 m) experimentaron mejora de FE (*P = 0,0009), mientras que los MP (n = 6, promedio de seguimiento: 6,2±2,9 m) no. La línea roja representa una muestra clasificada erróneamente. Las barras de error representan ETM. La Figura 6 es una gráfica que muestra la validación cruzada del conjunto de entrenamiento: partiendo de un conjunto de 9 genes, el aumento del umbral conduce a un aumento constante del error de clasificación errónea después de un límite de 2,1. La Figura 7 es una gráfica que muestra la validación cruzada del conjunto de entrenamiento: el aumento del umbral aumenta constantemente el error de clasificación errónea después de un límite de 2,1. La Figura 8 es un mapa de calor que usa una firma de 9 genes: este mapa de calor se creó por un enfoque de agrupamiento no supervisado usando normalización por niveles de expresión medios. Cada columna representa una muestra y cada línea corresponde a un gen, para el que se enumeran las ID de affymetrix en el lado derecho. Para más detalles acerca de las anotaciones de genes véase tabla 5. Un color rojo significa baja expresión del gen, mientras que un color azul demuestra altos niveles de expresión génica. Tres muestras de pacientes con mal pronóstico se agruparon erróneamente (rodeadas). La Figura 9 muestra un mapa de calor usando una firma de 43 genes: este mapa de calor se creó con el mismo algoritmo de agrupamiento jerárquico no supervisado que en la Figura 9. Solamente una muestra se clasificó erróneamente (BP-10). Resulta interesante que, realizando investigación adicional acerca del historial de este paciente, se descubrió que se le había diagnosticado en primer lugar insuficiencia cardíaca más de 5 años antes de morir, lo que sugiere que era de hecho un superviviente a largo plazo y fue reconocido correctamente por el algoritmo de los inventores. En el estudio de los inventores, se le clasificó como un paciente con mal pronóstico, porque la biopsia se obtuvo un año antes de morir. La Figura 10 es una gráfica que muestra el centroide reducido más próximo del “clasificador de 9 genes”: los centroides se calcularon en PAM a partir de la expresión promedio para cada gen en cada clase dividida por la desviación típica dentro de la clase para ese gen. La clasificación de centroide reducido más próximo “reduce” cada uno de los centroides de clase hacia el centroide general para todas las clases por el umbral. La clasificación del centroide más próximo toma el perfil de expresión génica de una nueva muestra, y lo compara con cada uno de estos centroides de clase. La clase de cuyo centroide está más cerca, en distancia al cuadrado, es la clase predicha para esa nueva muestra. Cada línea en la gráfica representa un gen. El centroide rojo caracteriza el grupo 1 (mal pronóstico), el centroide verde caracteriza el grupo 2 (buen pronóstico). Todos los genes, excepto uno, que se regularon positivamente en el grupo con buen pronóstico, estaban infraexpresados en el grupo con mal resultado clínico. La Figura 11 muestra el centroide reducido más próximo del “clasificador de 43 genes”: después de extender el clasificador de los inventores a 43 genes, apareció un segundo gen regulado positivamente en el grupo con mal
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pronóstico.
Descripción detallada
La invención se refiere a firmas moleculares que actúan como un biomarcador de pronóstico muy sensible para insuficiencia cardíaca, enfermedades cardíacas, miocarditis y otros trastornos cardíacos.
La predicción de pronóstico sigue siendo una necesidad no satisfecha importante en insuficiencia cardíaca (IC) de nueva aparición. Aunque se usan varios ensayos clínicos, ninguno distingue con precisión entre pacientes con mala supervivencia frente a supervivencia excelente. Una firma transcriptómica, generada a partir de una biopsia endomiocárdica (BEM), actúa como un biomarcador de pronóstico nuevo en IC.
Definiciones
De acuerdo con la presente invención y como se usa en el presente documento, los siguientes términos se definen con los siguientes significados, a no ser que se indique de forma explícita otra cosa.
Como se usa en el presente documento, “un” y “el” incluyen referencias plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa.
Como se usa en el presente documento, una “firma molecular” o “firma” o “biomarcador” o “biomarcador basado en transcriptoma” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a todas las biomoléculas identificadas en las Tablas 2 y 8. A medida que se descubren más biomoléculas, cada biomolécula de nueva identificación puede asignarse a uno o más biomarcadores o firmas moleculares. Cada biomolécula también puede retirarse, reasignarse
o redistribuirse a una firma molecular.
El término “biomolécula” se refiere a ADN, ARN (incluyendo ARNm, ARNr, ARNt y ARNtm), nucleótidos, nucleósidos, polinucleótidos, péptidos y cualquier combinación de los mismos.
Una “posición” base como se usa en el presente documento se refiere a la localización de una base o resto de nucleótido dado dentro de un ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, el término “matriz” se refiere a una disposición espacial ordenada, particularmente una disposición de biomoléculas inmovilizadas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “matriz direccionable” se refiere a una matriz en la que los elementos individuales tienen coordenadas x e y definidas con precisión, de modo que puede identificarse un elemento dado en una posición particular en la matriz.
Como se usan en el presente documento, las expresiones “sonda” y “sonda biomolecular” se refieren a una biomolécula usada para detectar una biomolécula complementaria. Los ejemplos incluyen antígenos que detectan anticuerpos, oligonucleótidos que detectan oligonucleótidos complementarios y ligandos que detectan receptores. Dichas sondas se inmovilizan preferentemente en un microelectrodo que comprende un sustrato.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “biomatriz”, “biochip” y “matriz de biochip” se refieren a una disposición espacial ordenada de biomoléculas inmovilizadas en un microelectrodo dispuesto sobre un sustrato de soporte sólido. Las moléculas sonda preferidas incluyen aptámeros, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, péptidos, ligandos, anticuerpos y antígenos; las especies de sonda más preferidas son péptidos y proteínas. Las microplacas biológicas, como se usan en la técnica, abarcan sustratos que contienen matrices o micromatrices, preferentemente matrices ordenadas y más preferentemente matrices ordenadas, direccionables, de moléculas biológicas que comprenden un miembro de un par de unión biológico. Típicamente, dichas matrices son matrices de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria de al menos una secuencia que puede estar o se espera que esté presente en una muestra biológica. Como alternativa, y preferentemente, las proteínas, los péptidos u otras moléculas pequeñas pueden disponerse en dichas microplacas biológicas para realizar, entre otros, análisis inmunológicos (en los que las moléculas dispuestas son antígenos) o ensayar receptores biológicos (en los que las moléculas dispuestas son ligandos, agonistas o antagonistas de dichos receptores).
La expresión/cantidad de un gen, una biomolécula o un biomarcador en una primera muestra está a un nivel “mayor que” el nivel en una segunda muestra si el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la primera muestra es al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,5 veces, 1,75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la segunda muestra o una muestra normal. Los niveles de expresión/cantidades pueden determinarse basándose en cualquier criterio adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, ARNm, ADNc, proteínas, fragmentos proteicos y/o copias génicas. Los niveles de expresión/cantidades pueden determinarse de forma cualitativa y/o cuantitativa.
Por el término “modular”, se entiende que cualquiera de las actividades mencionadas, por ejemplo, se aumentan, potencian, actúan como un agonista, promueven, reducen, disminuyen, suprimen, bloquean o antagonizan (actúan
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En otra realización preferida, un procedimiento para identificar y distinguir entre pacientes con un alto riesgo de enfermedad cardíaca y pacientes con un buen pronóstico para recuperación comprende: identificar en una muestra biológica de un paciente una firma molecular que comprende un biomarcador basado en transcriptoma (BBT): un biomarcador comprende las secuencias génicas: 1558458_at (LOC401320 hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH66 /// MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contiene dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (Lon peptidasa 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208_at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26) secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas; evaluar la probabilidad de identificación de cada gen componente en cada muestra; asignar cada uno a una clase; e identificar y distinguir entre pacientes con un alto riesgo de enfermedad cardíaca y pacientes con un buen pronóstico para recuperación.
En otra realización preferida, la predicción de pronóstico de insuficiencia cardíaca comprende detectar al menos diez moléculas que tienen secuencias génicas que comprenden: 232669_at (factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA0220 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura del cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869 _at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_at (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG), proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición WD 33), 213773_x_at (familia del dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En otra realización preferida, la predicción de pronóstico de insuficiencia cardíaca comprende detectar al menos nueve moléculas que tienen secuencias génicas que comprenden: 1558458_at (LOC401320 hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D
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paciente un biomarcador que comprende las secuencias génicas: un biomarcador que comprende las secuencias génicas: 232669_at (factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA0220 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura del cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869 _at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_at (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG), proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición WD 33), 213773_x_at (familia del dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas; y evaluar la probabilidad de identificación de cada gen componente en cada muestra; y asignar cada uno a una clase. Se detalla un ejemplo de un procedimiento preferido en los ejemplos a continuación.
En otra realización preferida, un procedimiento para identificar y distinguir entre pacientes con un alto riesgo de enfermedad cardíaca y en pacientes con un buen pronóstico para recuperación comprende: identificar un biomarcador que comprende secuencias génicas que comprenden: un biomarcador comprende las secuencias génicas: 232669_at (factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo de soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA0220 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura del cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869 _at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_at (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG), proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición WD 33), 213773_x_at (familia del dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas; y evaluar la probabilidad de identificación de cada gen componente en cada muestra; y asignar cada uno a una clase; identificar y distinguir entre pacientes con un alto riesgo de enfermedad cardíaca y pacientes con un buen pronóstico para recuperación.
En otra realización preferida, un procedimiento para identificar y distinguir entre pacientes con un alto riesgo de enfermedad cardíaca y pacientes con un buen pronóstico para recuperación comprende: identificar un biomarcador que comprende secuencias génicas que comprenden: un biomarcador comprende las secuencias génicas: 1558458_at (LOC401320 hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano de heparán sulfato 2 (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales,
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En dichos procedimientos alternativos, una muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador en condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-biomarcador, y después detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede detectarse de varias maneras, tales como por transferencia de Western y procedimientos de ELISA para ensayar una amplia diversidad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Está disponible una amplia serie de técnicas de inmunoensayo usando dicho formato de ensayo, véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Estas incluyen ensayos tanto en un único sitio como en dos sitios o “de tipo sándwich” de los tipos no competitivos, así como en los ensayos de unión competitiva tradicionales. Estos ensayos también incluyen unión directa de un anticuerpo marcado con un biomarcador diana.
Los ensayos de tipo sándwich están entre los ensayos más útiles y más habitualmente usados. Existen varias variaciones de la técnica de ensayo de tipo sándwich. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo no marcado se inmoviliza en un sustrato sólido y la muestra a ensayar se pone en contacto con la molécula unida. Después de un periodo adecuado de incubación, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, se añade después un segundo anticuerpo específico del antígeno, marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable y se incuba, permitiendo un tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado. Cualquier material que no haya reaccionado se retira por lavado, y se determina la presencia del antígeno mediante observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, mediante observación sencilla de la señal visible, o pueden cuantificarse comparando con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador.
Las variaciones del ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en el que tanto la muestra como el anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Los expertos en la materia conocen bien estas técnicas, incluyendo cualquier variación menor que sea fácilmente evidente. En un ensayo de tipo sándwich directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad por el biomarcador se une de forma covalente o pasiva a una superficie sólida. La superficie sólida es típicamente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más habitualmente usados celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. Los procesos de unión se conocen bien en la técnica y consisten en general en reticulación, unión covalente o adsorción física. El complejo de polímero-anticuerpo que se lava para preparar la muestra de ensayo. Se añade después una alícuota de la muestra para ensayar al complejo de fase sólida y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo 2-40 minutos o durante una noche si es más conveniente) y en condiciones adecuadas (por ejemplo de temperatura ambiente a 40 ºC, tal como entre 25 ºC y 32 ºC, inclusive) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Después del periodo de incubación, la fase sólida de subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una parte del biomarcador. El segundo anticuerpo se une con una molécula indicadora que se usa para indicar la unión del segundo anticuerpo con el marcador molecular.
Un procedimiento alternativo implica inmovilizar los biomarcadores diana en la muestra y disponer después la diana inmovilizada a anticuerpo específico que puede estar o no marcado con una molécula indicadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la fuerza de la señal de molécula indicadora, una diana unida puede ser detectable por marcaje directo con el anticuerpo. Como alternativa, un segundo anticuerpo marcado, específico del primer anticuerpo se expone al complejo de diana-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de diana-primer anticuerposegundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula indicadora. Por “molécula indicadora”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable de forma analítica que permite la detección de anticuerpo unido a antígeno. Las moléculas indicadoras más habitualmente usadas en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.
En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, existe una amplia diversidad de diferentes técnicas de conjugación, que están fácilmente disponibles para los expertos en la materia. Las enzimas habitualmente usadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, glucosa oxidasa, galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos para usar con las enzimas específicas se eligen en general para la producción, tras hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular, se permite que se una y después se retira por lavado el reactivo en exceso. Después se añade una solución que contiene el sustrato apropiado al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima unida al segundo anticuerpo, proporcionando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, habitualmente de forma espectrofotométrica, para proporcionar un indicio de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. Como alternativa, pueden acoplarse químicamente compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, con anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un
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microscopio óptico. Como en el EIA, se permite que el anticuerpo marcado con fluorescencia se una con el complejo del primer anticuerpo-marcador molecular. Después de retirar por lavado el reactivo no unido, el complejo terciario restante se expone después a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas muy bien establecidas en este campo. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras, tales como radioisótopo, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
Los procedimientos de la invención incluyen además protocolos que examinan la presencia y/o expresión de ARNm, en una muestra tisular o celular. Se conocen bien procedimientos para la evaluación de ARNm en células e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas marcadas, transferencia de Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR y otros procedimientos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).
En una realización, el nivel de ARNm correspondiente al marcador puede determinarse por formatos tanto in situ como in vitro en una muestra biológica usando procedimientos conocidos en la técnica. Muchos procedimientos de detección de expresión usan ARN aislado. Para procedimientos in vitro, puede utilizarse cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de ARN de células. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, NY (1987-1999). Adicionalmente, pueden procesarse fácilmente grandes números de muestras tisulares usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de una única etapa de la Patente de Estados Unidos n.º 4.843.155. El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero sin limitación, análisis de Southern o Northern, análisis de PCR y matrices de sondas. Un procedimiento de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen que se detecta. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficientes para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con un ARN o ADN genómico que codifica un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en el presente documento. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el marcador en cuestión se está expresando.
En un formato, el ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, procesando el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, la sonda o las sondas se inmovilizan en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la sonda o las sondas, por ejemplo, en una matriz de microplacas de genes Affymetrix. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente procedimientos de detección de ARNm conocidos para su uso en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención.
Aunque la amplificación de moléculas no se requiere en la presente invención como se analiza en la sección de ejemplos, un experto en la materia podría usar procedimientos de amplificación. Un procedimiento alternativo para determinar el nivel de ARNm correspondiente a un marcador de la presente invención en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, mediante RT-PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, Patente de Estados Unidos n.º 4.683.202 (1987), reacción en cadena de la ligasa, replicación de secuencia autosostenida, Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, págs. 1874-1878 (1990), sistema de amplificación transcripcional, Kwoh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 1173-1177 (1989); Q-Beta Replicasa, Lizardi y col., Biol. Technology, Vol. 6, página 1197 (1988); replicación por círculo rodante, Patente de Estados Unidos n.º
5.854.033 (1988); o cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de las moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en números muy bajos. Como se usa en el presente documento, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar con regiones 5’ o 3’ de un gen (cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entre medias. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10-30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50-200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.
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Para procedimientos in situ, no es necesario que el ARNm se aísle de las células antes de su detección. En dichos procedimientos una muestra celular o tisular se prepara/procesa usando procedimientos histológicos conocidos. La muestra se inmoviliza después en un soporte, típicamente un portaobjetos de vidrio, y después se pone en contacto con una sonda que puede hibridar con ARNm que codifica el marcador.
Como alternativa para realizar determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador por comparación de su expresión con la expresión de un gen que no es un marcador, por ejemplo, un gen constitutivo que se expresa de forma constitutiva. Los genes adecuados para normalización incluyen genes constitutivos, tales como el gen de actina o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de paciente, con otra muestra o entre muestras de diferentes fuentes.
Como alternativa, el nivel de expresión puede proporcionarse como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, el nivel de expresión del marcador se determina para 10 o más muestras de muestras biológicas normales frente a enfermedades, preferentemente 50 o más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los genes ensayados en el número de muestras mayor y esto se usa como un nivel de expresión de línea basal para el marcador. El nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de ensayo (nivel absoluto de expresión) se divide después por el valor de expresión medio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
Preferentemente, las muestras usadas en la determinación de línea basal serán de pacientes que no tienen el polimorfismo. La elección de fuente de celular depende del uso del nivel de expresión relativo. El uso de expresión hallada en tejidos normales como una puntuación de expresión media ayuda a validar si el marcador ensayado es específico (frente a células normales). Además, a medida que se acumulan más datos, el valor de expresión medio puede revisarse, proporcionando valores de expresión relativos mejorados basándose en datos acumulados.
Anticuerpos y aptámeros
En una realización preferida, los anticuerpos y aptámeros se unen específicamente con cada componente de los biomarcadores descritos en el presente documento. Los componentes incluyen las secuencias de ácido nucleico, secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas de cada componente en cada biomarcador.
Los polinucleótidos aptámeros son típicamente ADN fosfodiéster convencional monocatenario (ADNmc). También pueden incorporarse análogos de ADN cercanos al aptámero como se describe posteriormente.
Un procedimiento de descubrimiento de aptámero típico se describe a continuación:
se sintetiza un polinucleótido que comprende una secuencia aleatoria entre “ramas” que tienen secuencia constante. Las ramas pueden incluir sitios de restricción para clonación conveniente y también pueden actuar como sitios de cebado para cebadores de PCR. La síntesis puede realizarse fácilmente en instrumentos comerciales.
Las proteínas diana se tratan con el polinucleótido aleatorio. La proteína diana puede estar en solución y después los complejos pueden inmovilizarse y separarse de ácidos nucleicos no unidos mediante el uso de una columna de afinidad de anticuerpos. Como alternativa, la proteína diana podría inmovilizarse antes del tratamiento con el polinucleótido aleatorio.
Los complejos de proteína diana-polinucleótido se separan del material que no está en complejo y después se separan los polinucleótidos unidos de la proteína diana. El ácido nucleico unido puede después caracterizarse, pero más habitualmente se amplifica, por ejemplo mediante PCR y se repiten las etapas de unión, separación y amplificación. En muchos casos, el uso de condiciones que promueven cada vez más la separación del ácido nucleico de la proteína diana, por ejemplo mayor concentración salina, en el tampón de unión usado en la etapa 2) en iteraciones posteriores, da como resultado la identificación de polinucleótidos que tienen afinidad crecientemente alta por la proteína diana.
Los ácidos nucleicos que muestran alta afinidad por las proteínas diana se aíslan y caracterizan. Esto se consigue típicamente clonando los ácidos nucleicos usando sitios de restricción incorporados en las ramas, y después secuenciando el ácido nucleico clonado.
La afinidad de los aptámeros por sus proteínas diana está típicamente en el intervalo nanomolar, pero puede ser tan baja como el intervalo picomolar. Es decir KD es típicamente 1 pM a 500 nM, más típicamente de 1 pM a 100 nM. Los aptámeros que tienen una afinidad de KD en el intervalo de 1 pM a 10 nM también son útiles.
Pueden sintetizarse polinucleótidos de aptámeros en un sintetizador de ácidos nucleicos disponible en el mercado por procedimientos conocidos en la técnica. El producto puede purificarse por procedimientos de selección de
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tamaño o cromatográficos.
Los polinucleótidos de aptámeros son típicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de longitud, más típicamente de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de longitud, aún más típicamente de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos de longitud y aún más típicamente de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos de longitud. Un intervalo de longitud preferido es de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos.
Las secuencias de aptámeros pueden seleccionarse como una secuencia deseada, o poblaciones aleatorias o parcialmente aleatorias de secuencias pueden prepararse y después seleccionarse con respecto a unión específica con una proteína diana deseada mediante ensayo in vitro. Puede usarse cualquiera de los ensayos de unión de ácido nucleico-proteína típicos conocidos en la técnica, por ejemplo, transferencia de “Southwestern” usando oligonucleótido marcado o proteína marcada como la sonda. Véase también Patente de Estados Unidos n.º
5.445.935 para un ensayo de polarización de fluorescencia de interacción de proteína-ácido nucleico.
Se consideran conocidos en la técnica nucleótidos apropiados para síntesis de aptámeros y su uso, y reactivos para enlace covalente de proteínas con ácidos nucleicos y su uso.
Un complejo de aptámero-proteína deseado, por ejemplo, complejo de aptámero-trombina puede marcarse y usarse como un agente de diagnóstico in vitro de una manera muy similar a cualquier agente de unión a proteína específico, por ejemplo un anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, un complejo de aptámero-proteína puede usarse para detectar y cuantificar la cantidad de su proteína diana en una muestra, por ejemplo una muestra de sangre, para proporcionar un diagnóstico de una patología correlacionado con la cantidad de la proteína en la muestra.
Un complejo molecular de aptámero-diana/cebo deseado también puede usarse para captura de imágenes de diagnóstico. En usos de captura de imágenes, los complejos se marcan de modo que puedan detectarse fuera del cuerpo. Son marcadores típicos radioisótopos, habitualmente radioisótopos con semividas cortas. Pueden usarse los radioisótopos de captura de imágenes habituales, tales como 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTC, 186Re, 188Re, 64Cu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 67Ga, 90Y, 111In, 18F, 3H, 14C, 35S o 32P. También pueden usarse potenciadores de captura de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN), tales como gadolinio-153, para marcar el complejo para detección por RMN. Se consideran conocidos en la técnica procedimientos y reactivos para realizar el marcaje, bien en el polinucleótido
o bien en el resto proteico.
En una realización preferida, un anticuerpo o aptámero es específico para cada secuencia génica del biomarcador que comprende un biomarcador que comprende las secuencias génicas: 232669_at (factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA020 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura de cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869_at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_at (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila)), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a XP_0010813421), 233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición de WD 33), 213773_x_at (familia de dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_art (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas.
En una realización preferida, un anticuerpo o aptámero es específico para cada secuencia génica del biomarcador que comprende un biomarcador que comprende las secuencias génicas: 1558458_at (LOC401320 hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano 2 de heparán sulfato (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP,
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del biomarcador o los biomarcadores en la alícuota de la muestra biológica en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión del biomarcador o los biomarcadores correspondientes en la alícuota de la muestra biológica que no está en contacto con el agente candidato; y (d) identificar dicho agente a partir de dicho efecto observado, en el que una diferencia de al menos 10 % entre el nivel de expresión del gen biomarcador o combinación de genes biomarcadores en la alícuota de la muestra biológica en contacto con el agente candidato y el nivel de expresión del gen biomarcador correspondiente o combinación de genes biomarcadores en la alícuota de la muestra biológica que no está en contacto con el agente candidato es un indicio de un efecto del agente candidato.
En realizaciones preferidas, los efectos del fármaco se correlacionan con la expresión de las firmas moleculares asociadas con un buen pronóstico como se describe en detalle en los ejemplos a continuación.
En otra realización, se proporciona un agente candidato derivado por el procedimiento.
En otra realización, se proporciona una preparación farmacéutica que comprende un agente.
En otra realización preferida, un procedimiento para producir un fármaco comprende las etapas del procedimiento (i) sintetizar el agente candidato identificado en la etapa (c) anterior o un análogo o derivado del mismo en una cantidad suficiente para proporcionar dicho fármaco en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto; y/o (ii) combinar el candidato farmacológico, el agente candidato identificado en la etapa (c) anterior o un análogo o derivado del mismo con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Vectores, células: en algunas realizaciones es deseable expresar las biomoléculas que comprenden un biomarcador, en un vector y en células. Las aplicaciones de dichas combinaciones son ilimitadas. Los vectores y células que expresan la o las biomoléculas pueden usarse en ensayos, kits, descubrimiento de fármacos, diagnóstico, pronóstico y similares. Las células pueden ser células madre aisladas de la médula ósea como una célula progenitora, o células obtenidas de cualquier otra fuente, tal como por ejemplo ATCC.
“Célula progenitora derivada de médula ósea” (BMDC) o “célula madre derivada de médula ósea” se refiere a una célula madre primitiva con la maquinaria para autorrenovación activa de forma constitutiva. Se incluyen en esta definición células madre que son totipotentes, pluripotentes y precursoras. Una “célula precursora” puede ser cualquier célula en una ruta de diferenciación celular que sea capaz de diferenciarse en una célula más madura. Como tal, la expresión “población de células precursoras” se refiere a un grupo de células capaz de desarrollarse a una célula más madura. Una población de células precursoras puede comprender células que son totipotentes, células que son pluripotentes y células que están restringidas a linaje de células madre (es decir células capaces de desarrollarse a menos linajes que todos los hematopoyéticos, o a, por ejemplo, solamente células de linaje eritroide). Como se usa en el presente documento, la expresión “célula totipotente” se refiere a una célula capaz de desarrollarse a todos los linajes de células. De forma similar, la expresión “población totipotente de células” se refiere a una composición de células capaz de desarrollarse a todos los linajes de células. También como se usa en el presente documento, la expresión “célula pluripotente” se refiere a una célula capaz de desarrollarse a una diversidad (aunque no todos) de linajes y son al menos capaces de desarrollarse a todos los linajes hematopoyéticos (por ejemplo, linajes linfoide, eritroide y trombocítico). Las células madre derivadas de médula ósea contienen dos tipos bien caracterizados de células madre. Las células madre mesenquimatosas (MSC) normalmente forman condrocitos y osteoblastos. Las células madre hematopoyéticas (HSC) son de origen mesodérmico lo que normalmente da lugar a células de la sangre y el sistema inmunitario (por ejemplo, linajes eritroide, de granulocitos/macrófagos, megacariocitos y linfoide). Además, también se ha mostrado que las células madre hematopoyéticas tienen el potencial de diferenciarse en las células del hígado (incluyendo hepatocitos, células del conducto biliar), pulmón, riñón (por ejemplo, células epiteliales tubulares renales y parénquima renal), tracto gastrointestinal, fibras del músculo esquelético, astrocitos del SNC, neuronas de Purkinje, músculo cardíaco (por ejemplo, cardiomiocitos), endotelio y piel.
En una realización preferida, un procedimiento para identificar compuestos terapéuticos candidatos comprende cultivar células que expresan al menos una biomolécula seleccionada de: 232669_at (factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa), 214951_at (familia de vehículo soluto 26, miembro 10), 243482_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 226210_s_at (expresado por vía materna 3), 232159_at (tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), 233026_s_at (que contiene dominio PDZ), 211996_s_at (gen hipotético de proteína de tipo KIAA020 LOC 283846), 243774_at (mucina 20, asociado a superficie celular), 242551_at (fase abierta de lectura de cromosoma 18), 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26), 244208_at (supresor de punto de control 1), 239984_at (canal de sodio, abierto por tensión, tipo VII, alfa), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 214869_at (apolipoproteína L, 6), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE)), 235887_at (homólogo de Smg-6, factor de degradación de ARNm mediada por mutación terminadora (C. elegans)), 229957_at (proteína transmembrana 91), 223546_x_at (tipo LUC7L (S. cerevisiae)), 239567_at (proteína activadora de Rho GTPasa 10), 242194_at (Culina 4A), 1558525_at (proteína hipotética LOC283901), 227178_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales), 224260_at (clon de ADNC), 238643_at (neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1), 232253_at (homólogo de RAD50 (S. cerevisiae)), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1), 233197_at (tipo kelch 9 (Drosophila)), 244512_at (locus transcrito fuertemente similar a Up_0010813421),
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233443_at (proteína hipotética LOC389362), 231275_at (proteína FLJ42875), 226419_s_at (proteína hipotética LOC64546), 201221_s_at (polipéptido de 70 kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña), 209354_at (miembro de la familia del receptor de factor de necrosis tumoral 14), 226571_s_at (tipo receptor de proteína tirosina fosfatasa, S), 220728_at (EST), 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto), 213946_s_at (tipo obscurina 1, similar a isoforma de titina N2-B), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1), 223147_s_at (dominio de repetición de WD 33), 213773_x_at (familia de dominio NOL/NOP2/Sun, miembro 5), 1560049_art (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2), 243974_at (clon de ADNC IMAGE: 4821815), 201510_at factor de tipo E74 3 (factor de transcripción de dominio ets, específico epitelial), secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas, con un agente terapéutico candidato; identificar agentes terapéuticos candidatos que modulan la expresión de las biomoléculas e identificar un agente terapéutico candidato. Preferentemente, un agente terapéutico candidato comprende moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, vacunas, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, proteínas, péptidos y vectores que expresan moléculas de ácido nucleico.
En una realización preferida, un procedimiento para identificar compuestos terapéuticos candidatos comprende cultivar células que expresan al menos una biomolécula seleccionada de: 1558458_at (LOC401320 hipotética), 1560049_at (repetición de triplete CUG, proteína de unión a ARN 2, CUGBP2), 201394_s_at (proteína de motivo de unión a ARN 5, RBM5), 201655_s_at (proteoglucano 2 de heparán sulfato (perlecano), HSPG2), 202379_s_at (secuencia de reconocimiento de tumor por linfocitos citolíticos naturales, NKTR), 202808_at, 203071_at (dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3B, SEMA3B), 203748_x_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 203981_s_at (casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 4, ABCD4), 204737_s_at (miosina, cadena pesada 6, miosina, cadena pesada 7, MYH6 // MYH7), 204978_at (factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 16, SFRS16), 206209_s_at (anhidrasa carbónica IV, CA4), 207541_s_at (componente de exosoma 10, EXOSC10), 207798_s_at (tipo ataxina 2, ATXN2L), 208978_at (proteína rica en cisteína 2, CRIP2), 209354_at (superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 14 TNFRSF14), 210628_x_at (proteína de unión a factor de crecimiento transformante beta latente 4, LTBP4), 211909_x_at (receptor de prostaglandina E 3 (subtipo EP3), PTGER3), 211996_at (proteína de tipo KIAA020, complejo de poro nuclear (LOC23117)), 212487_at (que contiene dominio de parche G 8, GPATCH8), 213946_s_at (tipo obscurina 1, OBSL1), 214951_at (familia de vehículo de solutos 26, miembro 10, SLC26A10), 220219_s_at (que contiene repetición rica en leucina 37A, LRRC37A), 221071_at, 221780_s_at (polipéptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 27DDX27), 221806_s_at (que contiene dominio SET 5, SETD5), 221833_at (peptidasa Lon 2, peroxisómica, LONP2), 223546_x_at (tipo LUC7 (S. cerevisiae), LUC7L), 224260_at (clon de ADNC IMAGE: 4478733), 225562_at (activador de proteína AS p21 3, RASA3), 226040_at (ARNM; ADNc DKFZp762N156 (del clon DKFZp762N156), 227968_at (que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1, PDDC1), 228198_s_at (proteína ribosómica mitocondrial S9, MRPS9), 229830_at (locus transcrito), 230683_at (ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430), 238185_at (motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1, RBMS1), 241597_at (repeticiones de dipéptido de arginina-ácido glutámico (RE), RERE), 242551_at (fase abierta de lectura 1 del cromosoma 18, C18orf1), 244208_at (supresor de punto de control 1, CHES1), 244494_at (dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1, ZDHHC1) y 244548_at (proteína activadora de Rho GTPasa 26, ARHGAP26) secuencias complementarias, fragmentos, alelos, variantes y productos génicos de las mismas, con un agente terapéutico candidato; identificar agentes terapéuticos candidatos que modulan la expresión de las biomoléculas e identificar un agente terapéutico candidato. Preferentemente, un agente terapéutico candidato comprende moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, vacunas, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, proteínas, péptidos y vectores que expresan moléculas de ácido nucleico.
Dichos compuestos son útiles, por ejemplo, como compuestos terapéuticos candidatos para el tratamiento de enfermedad cardíaca, trastornos cardíacos y afecciones de los mismos. Por lo tanto, se incluyen en el presente documento procedimientos para explorar con respecto a compuestos terapéuticos candidatos para el tratamiento de, por ejemplo, miocarditis, Enfermedad Cardíaca Coronaria, angina, Síndrome Coronario Agudo, Aneurisma y Disección Aórtica, arritmias, Cardiomiopatía, Enfermedad Cardíaca Congénita, insuficiencia cardíaca congestiva o insuficiencia cardíaca crónica, pericarditis y similares. Los procedimientos incluyen administrar el compuesto a un modelo de la afección, por ejemplo, poner en contacto un modelo celular (in vitro) con el compuesto, o administrar el compuesto a un modelo animal de la afección, por ejemplo, un modelo animal de una afección asociada con enfermedad cardíaca. El modelo se evalúa después con respecto a un efecto del compuesto candidato en el resultado clínico en el modelo y puede considerarse un compuesto terapéutico candidato para el tratamiento de la afección. Dichos efectos pueden incluir efectos clínicamente relevantes, dolor reducido; aumento de la esperanza de vida; y así sucesivamente. Dichos efectos pueden determinarse en una escala macroscópica o microscópica. Los compuestos terapéuticos candidatos identificados por estos procedimientos pueden verificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante administración a sujetos humanos en un ensayo clínico.
Las biomoléculas pueden expresarse a partir de uno o más vectores. Un “vector” (denominado en ocasiones “vehículo” de suministro génico o transferencia génica) se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprende un polinucleótido para suministrar a una célula hospedadora, bien in vitro o bien in vivo. El polinucleótido para suministrar puede comprender una secuencia codificante de interés en la terapia génica. Los vectores incluyen, por ejemplo, vectores víricos (tales como adenovirus (“Ad”), virus adenoasociados (VAA) y retrovirus), liposomas y otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares capaces de mediar en el suministro de
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(continuación)
Buen pronóstico (n=25)
Mal pronóstico (n=18)
NYHA, n (%)
I
1(4 %) 1(5 %)
II
13(52 %) 6(33 %)
III
10(40 %) 8(44 %)
IV
1(4 %) 4(22 %)
FE VI, %
24±13 23±13
DDIVI, cm PAP, kPa
6,4±1 6,3±2
Sistólica
4,79±1,73 5,45±1,73
Diastólica
2,13±0,80 2,66±1,46
Presión de enclavamiento capilar pulmonar, kPa Medicaciones, n (%)
1,73±0,93 2,39±1,33
β-Antagonista
17(68 %) 13(72 %)
Inhibidor de ACE
17(68 %) 12(67 %)
Antagonista de aldosterona
4(16 %) 4(22 %)
Diurético
17(68 %) 15(83 %)
Terapia inotrópica intravenosa
0 0
Análisis de micromatrices: se aisló un promedio de 568 ± 92 ng de ARN total de todas las BEM y se ensayaron con el Bioanalizador Agilent 2100, revelando alta integridad y pureza de ARN de todas las muestras con bandas 5 uniformes de ARN 18S y 28S (Figura 1). Hubo 46 genes sobreexpresados de forma significativa en pacientes que se recuperaron de insuficiencia cardíaca (q <5 %, FC> 1,2, Tabla 1) como se determinó con SAM. Se usó PAM para evaluar el valor predictivo de este conjunto de genes. Para conseguir esto y ensayar con respecto a validez, los pacientes se asignaron a conjuntos de entrenamiento que consistían en 2/3 de las muestras (n = 29) y conjuntos de ensayo que contenían 1/3 de las muestras (n = 14; Figura 2). Este enfoque dio como resultado un “centroide
10 reducido más próximo” de 45 genes, que distinguió con alta precisión entre pacientes de alto riesgo y los que tenían un excelente pronóstico.
Tabla 2: 46 genes sobreexpresados de forma significativa en pacientes con insuficiencia cardíaca con buen resultado de pronóstico (q<5 %, FC>1,2).
ID de affy Título del gen Factor de Cambio
232669_at
Factor inducible por hipoxia 3, subunidad alfa 1,8
214451_at
familia de vehículo de soluto 26, miembro 10 1,8
243482_at
Tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento 1,8
epidérmico 1
226210_s_at
expresado por vía materna 3 1,7
232159_at
Tipo sustrato 15 de ruta del receptor de factor de crecimiento 1,7
epidérmico 1
233026_s_at Que contiene dominio PDZ 2 1,6
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(continuación)
Sonda
Título del Gen Símbolo del Gen Descripción de Proceso Biológico de GO
225562 226040 227968 228198 229830 230683 230185 241597 242551 244208 244494 244548
activador de proteína RAS p21 3 RASA3 ADNc de ARNm DKFZp762N156 (de clon) --que contiene dominio 7 de enfermedad de Parkinson 1 PDDC1 proteína ribosómica mitocondrial S9 MRPS9 Locus trascrito ---ADNC: FLJ20892 fis, clon ADKA03430 --motivo de unión a ARN, proteína de interacción monocatenaria 1 RBMS1 repeticiones de dipéptido de argininaácido glutámico (RE) RERE fase abierta de lectura 1 del Cromosoma 18 C18orf1 supresor de punto de control 1 CHES1 dedo de cinc, que contiene tipo DHHC 1 ZDHHC1 proteína activadora de Rho GTPasa 26 ARHGAP26 cascada de señalización intracelular, mediada por regulación de GTPasa pequeña ----biosíntesis de proteínas, respuesta al daño de ADN, detección de ADN ----replicación de ADN, procesamiento de ARN /// regulación de la traducción remodelación de la cromatina, transcripción, importación de sustrato portador de NLS proceso biológico punto de control de daño de ADN, fase G2 del ciclo celular mitótico proceso biológico, palmitoilación de proteínas transducción de señal, desarrollo del sistema nervioso, citoesqueleto de actina
Tabla 8: 41 genes regulados positivamente en pacientes con buen pronóstico: 41 transcritos del biomarcador de 43 genes se sobreexpresaron en el grupo con buen resultado clínico. Solamente 2 genes se regularon negativamente, de nuevo el receptor muscarínico de acetilcolina M3, como en la firma molecular de 9 genes, y un transcrito con función desconocida.

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