JPWO2007086515A1

JPWO2007086515A1 - 遺伝子発現解析ツール

Info

Publication number: JPWO2007086515A1
Application number: JP2007556020A
Authority: JP
Inventors: 宮嶋　伸行; 伸行宮嶋; 彰堀ノ内; 健治 ▲たか▼見; 良太伊勢
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-26
Publication date: 2009-06-25
Also published as: EP1978085A1; EP1978085A4; JP2013176383A; US20090048116A1; US8138123B2; WO2007086515A1

Abstract

カニクイザル遺伝子の発現解析用ツールの提供。配列番号１〜１４に示される塩基配列からなる群より選択される２以上の塩基配列の各々と、それぞれ同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸のセットを含む、カニクイザル遺伝子発現解析ツール。該ツールを用いて、カニクイザル由来試料中の遺伝子転写産物を測定することを含む、カニクイザル遺伝子発現解析方法。

Description

本発明は、カニクイザルの遺伝子発現を解析するための新規リサーチツールおよびその用途に関する。より詳細には、本発明は、カニクイザル由来遺伝子転写産物のサブセットを含むカニクイザル遺伝子発現解析ツール、およびそれを用いたカニクイザルの遺伝子発現の解析方法等に関する。

発明の背景

カニクイザルは医薬品開発のための前臨床試験で主に使用されており、毒性試験、生化学および病理学検査等のデータが蓄積している。特に毒性試験において、霊長類であるサルはラットやマウスなどの齧歯動物よりも、ヒトへの外挿という点でデータの有用性が期待される。しかし、既存の毒性マーカーの変化のみでは、多岐にわたる副作用の影響を観察することが困難である。そのため、特に医薬品開発の初期段階においては、毒性反応を遺伝子発現レベルで解析する手法が注目されている。

とりわけ、数千〜数万種のmRNAの発現を同時にモニタリングするマイクロアレイ技術（DNAマイクロアレイについては、特許文献１〜４、非特許文献１および２等を参照）が、毒性発現メカニズムの解明や毒性予測の研究に活用され始めており、トキシコゲノミクス（toxicogenomics）と呼ばれる新たな研究分野として期待されている。毒性現象には、１ないし数個の遺伝子の独立した変化だけでなく、遺伝子間の相互作用やカスケード等のように多数の遺伝子が互いに関連し合った一体的な変動が伴うものと考えられる。そのため、マイクロアレイというトランスクリプトームレベルでの解析が可能な技術を用いることで、毒性発現に関わる分子の挙動を包括的に捉えることが可能になると期待される。

非ヒト霊長類の遺伝子発現解析用DNAマイクロアレイとしては、Affymetrix社製のアカゲザルESTを搭載したGeneChip（登録商標）が知られているが、わが国では実験動物としてカニクイザルが主流である。しかしながら、公開されているデータベースには、カニクイザルのアノテーション情報はほとんどないのが現状である。

例えば、薬物毒性のマーカーとなり得る遺伝子を探索する際などに、薬物投与による遺伝子の発現変動を検定するのにレファレンス（内部標準）となるべき遺伝子が必要である。通常、このような遺伝子としては、組織および時期に非特異的に、且つ比較的高レベルで発現している遺伝子、すなわちハウスキーピング遺伝子が用いられる（例えば、ヒトハウスキーピング遺伝子については、特許文献５等を参照）。しかしながら、上記のように、カニクイザルの遺伝子情報はきわめて限定的であり、ハウスキーピング遺伝子についても不明な点が多い。
米国特許第5,474,796号明細書国際出願公開第95/251116号パンフレット国際出願公開第95/35505号パンフレット米国特許第5,605,662号明細書特開2004-135552公報シェナ（Schena M.）ら、「プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、米国、第93巻、pp. 10614-10619（1996年）ヘラー（Heller R.A.）ら、「プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、米国、第94巻、pp. 2150-2155（1997年）

したがって、本発明の目的は、カニクイザル由来のハウスキーピング遺伝子を同定することであり、それらを含むカニクイザルの遺伝子発現解析ツール、例えばDNAマイクロアレイを提供することである。本発明のさらなる目的は、該遺伝子発現解析ツールを用いて、カニクイザルの遺伝子発現を解析する方法を提供することである。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、主要6臓器（肝臓・腎臓・心臓・肺・脾臓・精巣）からEST解析を行い、約16,000個のユニークな配列を同定し、その情報をもとに60merオリゴヌクレオチドプローブを設計してDNAマイクロアレイを作製した。各種臓器由来のmRNAを用いた発現解析の結果、すべての臓器において比較的高レベルで発現する14種の遺伝子をカニクイザルにおけるハウスキーピング遺伝子として同定した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
［１］配列番号１〜１４に示される塩基配列をそれぞれ含む１４種のカニクイザル遺伝子転写産物からなる群より選択される２種以上の核酸の各塩基配列と、それぞれ同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸のセットを含む、カニクイザル遺伝子発現解析ツール；
［２］前記１４種のカニクイザル遺伝子転写産物以外のカニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸を１種以上含んでなる、上記［１］記載のツール；
［３］肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓および精巣からなる群より選択される臓器で特異的に発現する、および／またはヒトにおける薬効ターゲットに対応する、カニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸を１種以上含んでなる、上記［１］記載のツール；
［４］核酸のセットが固相担体上に固定されたものである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のツール；
［５］上記［１］〜［４］に記載のツールの１種以上を用いて、カニクイザル由来試料中の遺伝子転写産物を測定することを含む、カニクイザル遺伝子発現解析方法；および
［６］カニクイザル由来試料が、疾患モデルであるかもしくは薬剤を投与されたカニクイザルから採取されたものである、あるいは薬剤に曝露された単離カニクイザル細胞もしくは組織である上記［５］記載の方法；
などを提供する。

本発明の遺伝子解析ツールは、カニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子を少なくとも2種以上含むので、カニクイザルの遺伝子発現を高精度に定量的に比較し得るという優れた効果を奏する。

本発明の遺伝子発現解析ツールは、カニクイザル由来の2種以上のハウスキーピング遺伝子転写産物を検出し得る核酸のセット（以下、「本発明の核酸セット」という場合がある）、即ち、カニクイザル由来の2種以上のハウスキーピング遺伝子転写産物の塩基配列と、それぞれ同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸のセットを少なくとも含むことを特徴とする。ここで「遺伝子発現解析ツール」とは、上記核酸のセットを含んでいる限り、その形態に特に制限はなく、例えば、各核酸を含む試薬を構成として含むキットや、あるいは各核酸が、例えばアレイやマイクロプレートなどの固相担体上に固定された装置・器具などがこれに包含されるが、それらに限定されるものではない。また、ここで「ハウスキーピング遺伝子」とは、カニクイザルの少なくとも肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓および精巣で共通に、且つ一定以上の高レベルで発現している遺伝子を意味する。

具体的には、カニクイザル由来のハウスキーピング遺伝子転写産物として、配列番号１〜１４に示される塩基配列［RNAの場合、「t」は「u」と読み替える。配列表にはセンス鎖配列のみを示すが、本明細書において「配列番号ｎに示される塩基配列」という場合には、特にことわらない限りアンチセンス鎖および二重鎖をも含む意味である］をそれぞれ含む14種の核酸が挙げられる。ここで「遺伝子転写産物」とは、mRNAの他、cDNA、cRNAなどの二本鎖核酸等も包含する概念として用いられる。配列番号１〜１４に示される塩基配列を含む各カニクイザル遺伝子は、遺伝子命名委員会（HUGO Nomenclature Comittee, HGNC）で以下のように命名されている。
配列番号１：GAPDH
配列番号２：ACTB
配列番号３：SDHA
配列番号４：RPL4
配列番号５：TBP
配列番号６：HPRT1
配列番号７：PPIA
配列番号８：EEF1G
配列番号９：PAPSS2
配列番号１０：PGK1
配列番号１１：TFRC
配列番号１２：GUSB
配列番号１３：B2M
配列番号１４：UBC
「実質的に同一の塩基配列」とは、該14種の核酸のいずれかと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、且つ他の哺乳動物由来の該核酸オルソログの対応する領域の塩基配列とは異なる塩基配列を意味する。ここで「高ストリンジェントな条件」とは、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄を意味する。例えば、該14種の核酸の各塩基配列と実質的に同一の塩基配列として、該14種の核酸の各塩基配列と95%以上、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。

本発明の核酸セットを構成する各核酸としては、検出対象であるカニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子転写産物と特異的にハイブリダイズし得る核酸（プローブ）や、該転写産物の一部もしくは全部を増幅するプライマーとして機能し得る一対のオリゴヌクレオチド（プライマー）などが挙げられる。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。

プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、供される試料に応じてセンス鎖（例：cDNA、cRNAの場合）またはアンチセンス鎖（例：mRNA、cDNAの場合）を選択して用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約30塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔³²P〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン-（ストレプト）アビジンを用いることもできる。一方、プローブとなる核酸を固相上に固定化する場合には、試料中の核酸を上記と同様の標識剤を用いて標識することができる。

プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、各配列番号に示される塩基配列を含むカニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子転写産物のセンス鎖およびアンチセンス鎖とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。

カニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子転写産物を検出し得るプローブとして機能する核酸は、該遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得る上記プライマーセットを用い、カニクイザルの任意の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など］由来のcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としてPCR法によって所望の長さの核酸を増幅するか、前記した細胞・組織由来のcDNAもしくはゲノムDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション等により上記ハウスキーピング遺伝子もしくはcDNAをクローニングし、必要に応じて制限酵素等を用いて適当な長さの断片とすることにより取得することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第2版に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。あるいは、該核酸は、カニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子産物の各塩基配列情報（例えば、配列番号１〜１４に示される塩基配列）に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによっても得ることができる。また、シリコンやガラス等の固相上で該核酸を直接in situ（on chip）合成することにより、該核酸が固相化されたチップ（アレイ）を作製することもできる。

本発明の遺伝子発現解析ツールは、カニクイザル由来の2種以上のハウスキーピング遺伝子転写産物を検出し得る核酸のセットに加えて、前記14種のカニクイザル遺伝子転写産物以外のカニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸を１種以上含んでいてもよい。そのような核酸は、本発明の遺伝子発現解析ツールの使用目的に応じて、任意の数または種類のものを適宜選択することができる。例えば、カニクイザル遺伝子の発現を網羅的に解析する場合には、任意の臓器、組織等において発現するすべての遺伝子産物、さらにはゲノム上の全ての遺伝子産物を検出するための核酸を含むこともできるし、特定の毒性マーカーもしくは疾患マーカー遺伝子の発現を検出する場合には、当該目的の遺伝子産物を検出するための核酸のみを、上記ハウスキーピング遺伝子検出用核酸以外に含んでもよい。

好ましい一実施態様においては、そのような核酸は、肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、精巣等の臓器で特異的に発現する、あるいはまた、ヒトにおける薬効ターゲットに対応する、カニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含むものである。臓器特異的に発現する遺伝子は、後記実施例で示される各種臓器での各遺伝子の発現を相互に比較し、特定の臓器において発現が検出されるものを選択することにより取得することができる。

これらの核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥ緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、ＳＨ基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸プローブが固相に固定化された状態で提供される好ましい一例として、DNAマイクロアレイが挙げられる。DNAマイクロアレイは、核酸プローブを基板（ガラス、シリコンなど）上で１ヌクレオチドづつ合成するAffymetrix方式、もしくは予め調製された核酸プローブを基板上にスポッティングするStanford方式のいずれかにより作製することができる。

微量ＲＮＡ試料を用いてカニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子の発現を定量的に解析するためには、競合ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いることが好ましい。競合ＲＴ−ＰＣＲとは、目的のＤＮＡを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をcompetitorとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。従って、競合ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合、本発明の試薬は、上記プライマーセットに加えて、該プライマーセットにより増幅され、目的ＤＮＡと区別することができる増幅産物（例えば、目的のＤＮＡとはサイズの異なる増幅産物、制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物など）を生じる核酸をさらに含有することができる。このcompetitor核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡの場合、ＲＮＡ試料から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後にcompetitorを添加してＰＣＲを行えばよく、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ試料に最初から添加してＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のｍＲＮＡの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にカニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子の発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、SYBR Green I、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）の他、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：FAM、HEX、TET、FITC等）および消光物質（例：TAMRA、DABCYL等）で修飾したもの等が含まれる。

本発明はまた、上記した本発明の遺伝子解析ツールの１種以上を用いて、カニクイザル由来試料中の遺伝子転写産物を測定することを含む、カニクイザル遺伝子発現解析方法を提供する。
例えば、本発明の遺伝子解析ツールは、疾患モデルであるカニクイザルや薬剤を投与されたカニクイザルから採取された細胞含有試料、あるいは薬剤に曝露された、単離カニクイザル細胞もしくは組織（それから誘導される培養物・株化細胞を含む）等を用いて、疾患マーカー遺伝子、薬理作用マーカー遺伝子あるいは薬剤毒性マーカー遺伝子を検出・同定する、さらには疾患メカニズム、薬理作用メカニズム、毒性作用メカニズムの解析に好ましく使用され得る。

カニクイザルから採取される細胞含有試料としては、あらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、眼球、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など］などが例示されるが、迅速且つ簡便に採取することができ、動物への侵襲が少ないなどの点から、血液（例：末梢血）、リンパ球等が好ましい。
薬剤に曝露される、単離されたカニクイザル細胞もしくは組織としては、上記と同様のものの他、その初代培養や継代培養、あるいは上記の細胞・組織から樹立される細胞株などが挙げられる。再現性のよさや入手の容易さ等から細胞株の使用が好ましい。

カニクイザルから採取した細胞含有試料または薬剤に曝露された単離カニクイザル細胞・組織試料における遺伝子の発現は、該試料からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の転写産物を検出することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン−ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit; QIAGEN製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中の遺伝子転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でＤＮＡチップ（マイクロアレイ）解析が好ましい。

ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、遺伝子発現の検出は、標識プローブとして用いられる核酸を含有する上記本発明の遺伝子解析ツールを用いて行うことができる。すなわち、ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、本発明の試薬または本発明のキット中に含まれる各試薬を含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記「高ストリンジェントな条件下で」ハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、各遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し（各遺伝子についてそれぞれ行う）、スポットの標識量を測定することにより、各遺伝子の発現量を測定することができる。

ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）解析による場合、例えば、上記のようにして調製したＲＮＡ画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたｃＲＮＡが得られる）。この標識ｃＲＮＡを上記固相化プローブと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、各遺伝子の発現量を測定することができる。当該方法は、検出する遺伝子（従って、固相化されるプローブ）の数が多くなるほど、迅速性および簡便性の面で有利である。

本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号１：カニクイザル由来GAPDH遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号２：カニクイザル由来ACTB遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号３：カニクイザル由来SDHA遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号４：カニクイザル由来RPL4遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号５：カニクイザル由来TBP遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号６：カニクイザル由来HPRT1遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号７：カニクイザル由来PPIA遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号８：カニクイザル由来EEF1G遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号９：カニクイザル由来PAPSS2遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号１０：カニクイザル由来PGK1遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号１１：カニクイザル由来TFRC遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号１２：カニクイザル由来GUSB遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号１３：カニクイザル由来B2M遺伝子産物フラグメントの塩基配列
配列番号１４：カニクイザル由来UBC遺伝子産物フラグメントの塩基配列

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。

カニクイザルの主要６臓器（肝臓・腎臓・心臓・肺・脾臓・精巣）から常法によりRNAを抽出・cDNAライブラリーを作製し、総数128,063個について配列決定した。200塩基以下を除き、有効なデータ数は81,743個（平均長635塩基）となった。これらを公共ヒト遺伝子データベースと比較した結果、ヒトと相同性のあるものとして8,316遺伝子が含まれることがわかった。また、遺伝子をファミリーに分類して調べた結果、偏りが少なく良質なESTデータであることが判明した。

実施例１におけるEST解析から約16000個のユニークな配列を同定し、その情報をもとに60merオリゴヌクレオチドのプローブを設計、常法に従って各プローブをon chip合成してDNAマイクロアレイを構築した。

正常カニクイザルの各器官・組織［計27部位；各部位につき5個体（一部欠損やまとめたものがあるので、全129解析）］における遺伝子発現状況を、実施例２で構築したDNAマイクロアレイを用いて確認した。その結果、表に示す14個のカニクイザル遺伝子はいずれの器官・組織においても発現しており、ハウスキーピング遺伝子であることが確認された。表中Cy5は各部位のサンプルRNAであり、Cy3は全129解析に共通のUniversal Control RNA［個体番号7-11の肝臓（外側左葉）、腎臓（皮質＋髄質）、心臓（左心室壁）、肺（左肺後葉）、脾臓および精巣の全RNAの等量混合物］である。RatioはCy3の数値に対するCy5の数値の比を示す。

典型的な肝毒性物質である四塩化炭素をカニクイザルに投与し、バイオプシーで6および24時間後の肝臓を採取し、遺伝子の発現変動を調べた。その結果、6時間後にHSP、プロテアソーム、転写因子およびシグナル伝達関連の遺伝子発現の変化が観察された。

本発明の遺伝子発現解析ツールは、少なくとも2種のカニクイザル由来ハウスキーピング遺伝子の発現を検出し得る核酸を含むので、カニクイザルの遺伝子発現を精度よく定量的に解析することができ、毒性・薬理作用・疾患に関わるマーカー遺伝子の探索並びにメカニズムの解析に利用され、医薬品候補化合物の研究開発等に有用である。
本出願は、日本特許出願、特願２００６−０１９８５８を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

配列番号１〜１４に示される塩基配列からなる群より選択される２以上の塩基配列の各々と、それぞれ同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸のセットを含む、カニクイザル遺伝子発現解析ツール。
配列番号１〜１４に示される塩基配列からなる核酸以外のカニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸を１種以上含んでなる、請求項１記載のツール。
肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓および精巣からなる群より選択される臓器で特異的に発現する、および／またはヒトにおける薬効ターゲットに対応する、カニクイザル遺伝子転写産物の塩基配列と、同一もしくは実質的に同一の塩基配列またはその部分配列を含む核酸を１種以上含んでなる、請求項１記載のツール。
核酸のセットが固相担体上に固定されたものである、請求項１〜３のいずれかに記載のツール。
請求項１〜４に記載のツールの１種以上を用いて、カニクイザル由来試料中の遺伝子転写産物を測定することを含む、カニクイザル遺伝子発現解析方法。
カニクイザル由来試料が、疾患モデルであるかもしくは薬剤を投与されたカニクイザルから採取されたものである、あるいは薬剤に曝露された単離カニクイザル細胞もしくは組織である、請求項５記載の方法。