JP2006006313A - コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 - Google Patents
コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006006313A JP2006006313A JP2005060321A JP2005060321A JP2006006313A JP 2006006313 A JP2006006313 A JP 2006006313A JP 2005060321 A JP2005060321 A JP 2005060321A JP 2005060321 A JP2005060321 A JP 2005060321A JP 2006006313 A JP2006006313 A JP 2006006313A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- base sequence
- dna
- base
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
【解決手段】 コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子、及び、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子又はその部分断片であって、特定の塩基配列群に属するいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド等。
【選択図】 なし
Description
現在、アカゲザル、カニクイザル等の大型サルが当該目的のために利用されているが、コスト、操作性等の面から小型サルが実験動物として注目を集めている(例えば、非特許文献1参照)。
一方で、ラット、マウス等のげっ歯類を用いた研究では、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が盛んになってきている(例えば、非特許文献2参照)。
上記の研究動向において、実験動物として注目を集めている小型サルにおいても、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が一層重要になると考えられる。
1.コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子(以下、本発明遺伝子と記すこともある。);
2.コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド(以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。)
(1)配列番号1で示される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列
(3)配列番号3で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号1で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(5)配列番号2で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(6)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して、95%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(7)前項(1)乃至(6)記載のいずれかの塩基配列を有し、かつ、5’キャップからポリA配列までの領域を含む成熟mRNAに対して相補的なDNAの塩基配列
(8)ベータアクチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列
(9)前項(1)乃至(8)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
(10)前項(1)乃至(9)記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列;
3.下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
(1)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長20〜60を有する塩基配列
(3)前項(1)又は(2)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列;
4.DNA又はRNA検出のための組成物であって、前項2又は3記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物(以下、本発明組成物と記すこともある。);
5.前項2又は3記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする前項4記載の組成物;
6.2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての前項2又は3記載のポリヌクレオチドの使用(以下、本発明使用と記すこともある。);
7.前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項6記載のポリヌクレオチドの使用;
8.2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
(1)前項2又は3記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
(2)前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
(3)2種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
(4)第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、2種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法(以下、本発明測定方法と記すこともある。);
9.前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項7記載の測定方法;
10.第一工程及び/又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、DNAアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする前項9又は10記載の測定方法;
等を提供するものである。
本発明において利用される小型サルは、新世界サルの一種であるコモンマーモセット(Callithrix Jacchus)である。当該サルは、ヒトに近縁な真猿類に属する超小型サルであり、大型サルに比べて繁殖効率が良くしかも小型で取り扱いが容易である。
(1)配列番号1で示される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列
(3)配列番号3で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号1で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(5)配列番号2で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(6)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して、95%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(7)前項(1)乃至(6)記載のいずれかの塩基配列を有し、かつ、5’キャップからポリA配列までの領域を含む成熟mRNAに対して相補的なDNAの塩基配列
(8)ベータアクチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列
(9)前項(1)乃至(8)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
(10)前項(1)乃至(9)記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
例えば、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載される遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
具体的には例えば、コモンマーモセットの肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等のタンパク質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに当該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン/フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート/CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、Trizol試薬(インビトロジェン社)、Isogen(ニッポンジーン社製)等が挙げられる。
次いで、得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。更に一本鎖cDNAを鋳型とし、かつ大腸菌RNAseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることにより得られるRNA断片をプライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼIを用いて二本鎖のcDNAを合成することもできる。得られたcDNAは、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、cDNA合成システムプラス(アマシャムバイオサイエンス社製)やSuperScript Choice System(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
次に、得られた二本鎖cDNAを、例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10等のベクターとリガーゼとを用いて連結することによりcDNAライブラリーを作製することができる。
また、コモンマーモセットの組織片又はそれらの動物由来培養細胞から、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”(丸善1998)等に記載される通常の方法に準じてゲノムDNAを調製する。
例えば、試料が肝臓の場合には、抽出緩衝液[10mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1 mM EDTA (pH8.0), 20μ g/ml, 0.5%SDS]を組織重量に対し10倍量(v/w)加え粉砕し、さらにProteinaseKを最終濃度100μl/ml になるように加え混合する。この混合物を50℃で3時間保温した後、フェノール/クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分にエタノールを添加しゲノムDNAを沈殿させ回収する。また、試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit(ストラータジーン社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムDNAを得ることができる。得られたゲノムDNAをλgt10等のベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムDNAライブラリーを得ることができる。
PCRに用いられるプライマーとしては、例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示される塩基配列の5’側の翻訳開始点から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号1で示される塩基配列の3’側の翻訳終了点から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。PCRの条件としては、例えば、反応液50μl中に、Ex-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液(タカラバイオ社製)5μl、2.5mM dNTP混合液(各2.5 mMのdATP, dGTP, dCTP及びdTTPを含む。)5μl(dATP, dGTP, dCTP及びdTTP各々の最終濃度が0.25 mM)、10μMプライマー 各0.5〜2.5μl(終濃度が0.1〜0.5μM)、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、Ex-Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)1.25ユニットを含む組成の反応液にて、以下の条件による3工程の増幅サイクルを繰り返して行う。まず変性工程として、例えば約90℃から約96℃、好ましくは約94℃から約95℃で、1分から15分間、好ましくは1分から2分間の保温を行う。次にプライマーのアニーリング工程として、例えば約30℃から約70℃、好ましくは約40℃から約60℃で、約3秒から約3分間、好ましくは約5秒間から約2分間の保温が行われる。さらにDNAポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約70℃から約75℃、好ましくは約72℃から約73℃で、約15秒間から約5分間、好ましくは約30秒間から約4分間の保温が行われる。この3工程からなる増幅サイクルを、約20回から約50回、好ましくは約25回から約40回行う。このようなPCRで増幅されたDNA断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿により回収することにより、或いは、例えば、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)のような市販のDNA断片精製用のカラムを用いて、精製及び回収することができる。回収の際にDNA断片を溶解させる溶媒として、水、生理食塩水、1 から100 mMトリス塩酸、TE緩衝液[10 mMトリス塩酸、1 mM EDTA、pH7.4から8.0]等の適当な溶液を用いることができる。
具体的には例えば、TAクローニングキット(Invitrogen社)やpBluescriptII(Stratagene社)等の市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法(例えば、Maxam, A. M. & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977等に記載される)やSanger法(例えば、Sanger, F. & A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F. & Nicklen & A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977等に記載される)に準じて確認することができる。ABI社製モデル377等の自動DNAシークエンサーを用いる場合には、対応するDNAシークエンスキット、例えば、ABI社製Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等を用いることができる。
例えば、コモンマーモセットの組織から、特開平9-24818号公報又は特開平10-12729号公報等に記載された完全長cDNAの取得方法に準じて取得する。
具体的には例えば、コモンマーモセットの肝臓から、上記の方法に基づいて、全RNAを抽出する。次いで、得られた全RNAを鋳型として5’キャップサイト(7MeGpppN)に特異的なジオール構造にタグになる分子を化学結合させ、このRNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成した後、タグ分子の機能を利用して完全長cDNAのみを分離する方法が挙げられる。得られた完全長cDNAは、プラスミドpUC118やファージλgt10等のベクターとリガーゼとを用いて連結することにより、cDNAライブラリーを作製する。
具体的には、例えば、5’端側のcDNA断片を取得するために、上記の方法によりコモンマーモセットの組織から一本鎖cDNAを合成する。合成したcDNAの第1鎖の3’端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを付加する。特異的な塩基配列は、不必要な二次構造を形成しにくく、本発明遺伝子の塩基配列に類似性がなく特異性が高いものであれば如何なる塩基配列でもかまわないが、例えば、18塩基〜24塩基からなるポリdAが挙げられる。5’端にオリゴヌクレオチドが付加されたcDNAを鋳型として用いるPCRを行う。PCRに用いられるプライマーのうち、フォワードプライマーとしてはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて3’端に付加された上記のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、またリバースプライマーとしては約15塩基〜約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示される塩基配列の5’側の翻訳開始点から数十から数千塩基離れた塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、18塩基〜24塩基を有するポリdTを挙げることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。PCRの条件としては、例えば、上記の条件が挙げられる。3’端のcDNA断片を取得するために、コモンマーモセットの組織から全RNAを抽出し、5’末端にアダプター配列が付加されたオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。アダプター配列が付加されたオリゴdTプライマーの塩基配列としては、不必要な二次構造を形成しにくく、本発明遺伝子の塩基配列に類似性がなく特異性が高いものであれば如何なる塩基配列でもかまわないが、例えば、配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。合成されたcDNAの第1鎖を鋳型として用いたPCRを行う。PCRに用いられるプライマーのうち、フォワードプライマーとしては、約15塩基〜約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示される塩基配列の3’側の翻訳終了点から数十から数千塩基離れた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。リバースプライマーとしては、アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号7で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。PCRの条件としては、例えば、上記の条件が挙げられる。このようにして得られた5’側cDNA断片、3’側cDNA断片及び本発明遺伝子を適当な制限酵素で切断した後、両者をリガーゼにより繋ぎ合わせることにより、本発明完全長cDNAを取得することができる。
DNA等検出用本発明ポリヌクレオチドは、以下のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。
(1)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長20〜60を有する塩基配列
(3)前項(1)又は(2)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
ここで、項目番号(2)としては、例えば、(2a)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の60塩基長を有する塩基配列、(2b)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の50塩基長を有する塩基配列、(2c)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の35塩基長を有する塩基配列配列、(2d)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の30塩基長を有する塩基配列配列、(2d)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の20塩基長を有する塩基配列配列等を挙げることができる。
また、項目番号(3)で示すように、DNAアレイやノーザン法の如く、ハイブリダイゼーション法を用いてDNA又はRNAを検出する場合には、上記項目番号(1)又は(2)のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。
上述した項目番号(1)から(3)のいずれかで示される塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドは、それぞれ単独で使用することもできるだけではなく、複数個の組み合わせで使用することもできる。後述するRT−PCR法におけるプライマー、又はプローブとしての使用においては、項目番号(2)又は(3)で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中から、PCR反応を実施するのに適切なポリヌクレオチド(塩基長20〜60、好ましくは塩基長20〜50)を選択することが好ましい。ポリヌクレオチドの選択には、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、DNASIS(日立ソフトウエア社製)等を用いて、上記に示したポリヌクレオチドから行うことができる。また、検出時の信頼性を高める目的で、複数個の異なった遺伝子の塩基配列領域を検出するポリヌクレオチドを用いることも行われているが、この場合には、項目番号(2)又は(3)で示される塩基配列を有し、それぞれ互いに重複しない塩基配列を有するポリヌクレオチドを、複数個使用するのが望ましい。
方法を用いて取得してもよい。
例えば、取得本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの項で具体的に示したように、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得することができる他、塩基配列の情報を基づき、市販のDNA合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。
本発明組成物は、DNA又はRNA検出のための組成物であって、本発明ポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。当該組成物は、本発明ポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなる形態であってもよい。当該形態のうち、本発明ポリヌクレオチドが固体基板の表面に固定されてなる代表的なものはDNAアレイである(以下、本発明DNAアレイと記すこともある。)。
遺伝子発現解析手法は、疾患の診断、分類若しくは発生予測、又は薬剤の効力若しくは毒性・副作用の機構解析等の、様々な局面で盛んに利用されている。遺伝子発現解析手法には、ノーザンブロッティング法が従来から利用されてきたが、定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法(以下、定量的RT−PCR法と記すこともある。)や、DNAアレイを用いた手法(以下、DNAアレイ法と記すこともある。)が開発され、現在ではこれら手法も活用されている。
前者の遺伝子発現解析手法(即ち、定量的RT−PCR法)では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるmRNA又は全RNA等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するcDNAをリバーストランスクリプターゼを用いて合成した後、合成されたcDNA量をPCR法を用いて定量し、定量されたcDNA量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
後者の遺伝子発現解析手法(即ち、DNAアレイ法)では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるmRNA又は全RNA等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するcDNA又はこれをin vitro転写反応することによって得られるcRNAが蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体を、DNAアレイに対してハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした標識体量を蛍光強度、放射線強度等に基づき定量し、定量されたcDNA量又はcRNA量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
本発明DNAアレイは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含むものであり、これ以外のプローブの数やその塩基配列については特に制限されない。例えば、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外の遺伝子に対応するプローブを含むDNAアレイが挙げられる。好ましくは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外のコモンマーモセット由来の遺伝子に対応するプローブを含むDNAアレイが挙げられる。
まず、DNAプローブを調製する。DNAプローブの調製方法として、例えば、上記(1)のノーザンハイブリダイゼーション法に記載された方法と同様な方法に準じてコモンマーモセットの組織から調製されたcDNAを鋳型としてPCR法等により調製することができる。当該cDNAを鋳型にして、Ex Taq(タカラバイオ)等のDNAホ゜リメラーセ゛を用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。このようにして増幅されたDNAをpUC118等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。尚、当該DNAの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
PCR反応後の増幅されたDNAを、当該DNAを含む溶液からエタノール沈殿によって回収することにより、又は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)等の市販のDNA断片精製用カラムを用いて精製することができる。精製において当該DNAを溶解させる溶媒として、ジメチルスルホキシド、水、生理食塩水、1〜100 mMトリス塩酸等の適当な緩衝液又は3xSSC等の溶液を用いることができる。好ましくは、3XSSCを用いればよい。溶解の際のDNAの濃度は、約1〜約100μMに調整する。ベクターにクローニングされたDNAを用いる場合には、適当な制限酵素で目的とするDNA断片を切り出し、必要に応じてアガロースゲルで精製を行う。得られたDNA断片は、例えば、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)のような市販のDNA断片精製用カラムを用いて、ゲルを分離することができる。ゲルから分離されたDNA断片を上記の溶媒に溶解させる。また、クローニングベクターのクローニング領域の両端に通常設定されているようなT7、T3、SP6等の塩基配列をプライマーとして再度PCRを行うことにより、DNAプローブのためのDNAを取得してもよい。
DNAアレイに配置されるDNA断片の長さが約20塩基〜約100塩基の場合には、塩基配列の情報を基づき、市販のDNA合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。化学合成後のDNA断片を、上記のDNA断片精製用カラム、高速液体クロマトグラフィー等により精製し、これを上記の溶媒に溶解させる。
本発明使用は、2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての本発明ポリヌクレオチドの使用である。本発明使用では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
本発明測定方法は、2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、(1)前項2記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、(2)前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、(3)2種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、(4)第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、2種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、を有することを特徴とする。本発明測定方法では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
まず、解析対象である所望の遺伝子の塩基配列に相当するDNAを調製し、次いで、その全部若しくは一部からなるDNAを標識して標識化プローブを調製する。ここで「標識化DNAプローブ」とは、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられる蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体であるDNA断片である。また、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドについても同様に、そのDNAを標識して標識化プローブを調製する。尚、所望の遺伝子は、コモンマーモセットの組織から上記の方法により調製されたcDNAを鋳型として用いたPCR法等によって調製することができる。当該cDNAを鋳型にして、Ex Taq(タカラバイオ)等のDNAホ゜リメラーセ゛を用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、所望の遺伝子の種類、使用するプライマーの塩基配列等により異なるが、例えば、前述のような反応条件等を挙げることができる。このようにして増幅されたDNAはpUC118等をベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該DNAの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert 法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
別途、同一の被験試料から調製された全RNA又はmRNAを上記の方法でアガロースゲルを用いて分離し、ナイロンメンブレンに移す。上記方法で得られた、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブを加え、上記の条件に従ってハイブリダイゼーションを行い、メンブレン上の標識量を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、全RNA又はmRNAを移したナイロンメンブレンを別途用意する他に、所望の遺伝子の転写産物量を測定したナイロンメンブレンから、標識化プローブを除去して、本発明遺伝子の転写産物量を測定することもできる。この場合には、例えば、メンブレンを0.1〜 1 % のSDSを含む溶液中で 5 〜30 分間加温又は煮沸することにより、ハイブリダイズした標識化プローブを除去する。ナイロンメンブレンを室温に戻した後、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブと前述の条件でハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとするコモンマーモセット由来の2種以上の被検試料から上記(1)ノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法によりmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、MMLV(東洋紡)等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液[50 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、3 mM MgCl2、75 mM KCl、10 mM DTT]中、0.5 mM dNTP及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜1時間反応させることにより、前記mRNAに対応するcDNAを調製する。尚、cDNA合成キット(タカラバイオ)を用いて対応するcDNAを調製してもよい。
調製されたcDNAを鋳型にして、所望の遺伝子の塩基配列の一部分からなるDNAをプライマーとしたPCRを行う。PCRに用いられるプライマーは、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、DNASIS(日立ソフトウエア社製)等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。PCRの条件としては、例えば、Ex taq(タカラバイオ)を使用し、反応緩衝液[10 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、50 mM KCl,1.5 mM MgCl2]中、2.5 mM dNTP及び[α32P]-dCTP存在下で、例えば、94℃,30秒間次いで40℃〜60℃,2分間さらに72℃,2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射線強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、例えば、Ex taq(タカラバイオ)を使用し、反応緩衝液[10 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、50 mM KCl,1.5 mM MgCl2]中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃,2分間次いで95℃,10分間の保温の後、95℃,15秒間次いで60℃,1分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、当該cDNAを鋳型にして、本発明ポリヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行う。当該PCRは所望の遺伝子の転写産物量を測定する目的のためのPCRと同時点又は別時点のいずれの時期でもかまわないが、同時点が望ましい。
PCRに用いられるプライマーとしては、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、DNASIS(日立ソフトウエア社製)等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基〜約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。PCRの条件としては、所望の遺伝子の転写産物量を測定するために用いられた条件と同一な条件であることが好ましい。例えば、Ex taq(タカラバイオ)を使用し、反応緩衝液[10 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、50 mM KCl,1.5 mM MgCl2]中、2.5 mM dNTP及び[α32P]-dCTP存在下で、例えば、94℃,30秒間次いで40℃〜60℃,2分間さらに72℃,2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射線強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。また、例えば、Ex taq(タカラバイオ)を使用し、反応緩衝液[10 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、50 mM KCl,1.5 mM MgCl2]中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃,2分間次いで95℃,10分間の保温の後、95℃,15秒間次いで60℃,1分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
被検試料における、解析対象である所望の遺伝子の転写産物量及び本発明遺伝子の転写産物量を測定するには、通常の技術に基づいたDNAアレイを用いて行えばよい。このようなDNAアレイは、メンブレンフィルター、スライドガラス等の固体基板の表面に数十個から数万個のDNAプローブがアレイ状に配置されたものである。これを用いることにより、被検試料における所望の遺伝子の発現の有無及びその発現量を一度に調べることができる。ここで用いられるDNAプローブとしては、上記(1)のノーザンハイブリダイゼーション法に使用されるものと同様、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられるDNA断片である。DNAアレイは、固体基板の表面に配置されたDNAプローブの数により、おおよそ数個から数百個までのDNAプローブが配置されたDNAアレイ及びそれ以上の数のDNAプローブが配置されたDNAアレイの2種類に大別されるが、ここでは両者を含むものである。
本発明で用いられるDNAアレイは、例えば、ゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊(羊土社刊)等に記載された方法に準じて製造することができる。また、DNAプローブが有する塩基配列の情報を基にづき、Fodor, S. P.A. et al., Science, 251, 767 (1991) に記載されたように、固体基板の上に塩基を順次添加して化学合成させてゆくことにより、DNAアレイを直接的に製造することも可能である。DNAアレイの製造法の詳細については、例えば、上記の通りである。
(3−1) DNAマクロアレイによる定量(その1)
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記(1)のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、mRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、MMTV(東洋紡)等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液[例えば、50 mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、3 mM MgCl2、75 mM KCl及び10 mM DTTを含む液]中、0.5 mM dNT[α32P]-dCTP、P及び25μg/mlオリゴdT存在下で、42℃、15分間〜1時間反応させることにより、標識cDNAを調製する。このとき、cDNA合成キット(タカラバイオ)等を用いてもよい。解析対象である所望の遺伝子、本発明遺伝子又は本発明完全長cDNAの塩基配列の全て又は一部に一致する塩基配列を有するDNAプローブをメンブレンフィルター上にスポットして作製されたDNAアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC(0.9M NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム)、5×デンハルト溶液[0.1%(w/v)フィコール400、0.1%(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1%BSA]、0.1%(w/v)SDS,100μg/ml変性サケ精子DNA、50%ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに2 ml〜6 mlのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に、これに上記のDNAプローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb (ロシュダイアグノースティク社)等を用いることもできる。ハイブリダイゼーション後、DNAアレイを取り出して、これを50 ml〜100 mlの2×SSC、0.1%SDSに浸した後、室温で15分間程度インキュベートする。さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50 ml〜100 mlの0.1×SSC、0.1%SDS中、68℃、30分間インキュベートする。次いで、DNAアレイ上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記(1)のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、mRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、MMTV(東洋紡)等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液[例えば、50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、3mM MgCl2、75mM KCl及び10mM DTTを含む液]中、0.5mM dNTP、Cy3-dUTP(又はCy5-dUTP)及び25μg/mlオリゴdT存在下で、42℃、15分間〜1時間反応させる。これにアルカリバッファー(例えば、1N NaOH、20mM EDTAを含む液)を加え、65℃10分間保温した後、Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン社)等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより、蛍光標識DNAを調製する。調製された蛍光標識DNAを、DNAアレイに対して、上記(3−1)のDNAアレイによる定量(その1)に記載された方法と同様な方法により、ハイブリダイゼーションを行う。DNAアレイ上の標識量をスキャナー等で測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
基本的には、(a)組織の固定、包埋及び切片の作製、(b)プローブの調製、(c)ハイブリダイゼーションによる検出からなり、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたRNA又はDNAをプローブとすること以外は、例えば、Heiles, H. et al., Biotechniques, 6, 978, 1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック、羊土社, 214, 1992、細胞工学ハンドブック、羊土社, 222, 1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
RNAプローブを調製する場合には、まず、例えば、上記(1)のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子又は完全長cDNAを取得し、当該DNAをSP6、T7、T3RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクター(例えば、Stratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等)に組み込んで大腸菌に導入することにより、プラスミドDNAを調製する。次いで、センス(ネガティブコントロール用)、アンチセンス(ハイブリダイゼーション用)RNAができるようにプラスミドDNAを制限酵素で切断する。両プラスミドDNAを鋳型とし、放射性標識の場合にはα-35S-UTP等、非放射性標識の場合にはディゴキシゲニンUTP若しくはフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3RNAポリメラーゼを用いてRNAを合成しながら標識した後、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたRNAを調製する。尚、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはRNAラベリングキット(アマシャムバイオサイエンス社)が市販され、また非放射性標識用にはDIG RNAラベリングキット(ロシュダイアグノースティック社)、RNAカラーキット(アマシャムバイオサイエンス社)等が市販されている。また、DNAプローブを調製する場合には、例えば、32P等で標識された放射性ヌクレオチド若しくはビオチン、ディゴキシゲニン或いはフルオレセインで標識されたヌクレオチドを、ニックトランスレーション法[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]又はランダムプライム法[Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 132, 6 (1083), Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 137, 266 (1984)]によって取り込ませることにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたDNAを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット(アマシャムバイオサイエンス社)、Random Prime Labeling Kit(ロシュダイアグノースティック社)が市販され、また非放射性標識用にはDIG DNA標識キット(ロシュダイアグノースティック社)、DNAカラーキット(アマシャムバイオサイエンス社)等が市販されている。
具体的には、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。また、当該被検試料を液体窒素中にて凍結させ、その微小薄層切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。このようにしてスライドグラス切片を得る。
次に、当該被検試料の中に存在しかつ使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼKで処理し、アセチル化する。次いで、当該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを90℃、3分間加熱した後、これをハイブリダイゼーション溶液で希釈して得られる溶液を前記のスライドグラス切片の上に滴下する。滴下後、当該スライドグラス切片をフィルムで覆い、モイスチャーチャンバー中で、45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着又は未反応のプローブを洗浄すること等(RNAプローブを用いた場合には、RNase処理も加える。)により除去する。スライドグラス切片の上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料におけるコモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量をSxとし、i番目(i≦n)の被検試料におけるコモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量をSiとし、当該Siを基準として算出する場合には、その相対比Cxは下記の式で表される。
Cx=Si/Sx
ここで「任意の被検試料」とは、測定を行った被検試料のうちのどの被験試料であってもかまわないが、対照となるような被検試料を測定に用いた場合にはそれを用いることが好ましい。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料における解析対象である所望の遺伝子の転写産物量をTxとし、上記の第三工程により算出されたi番目(i≦n)の被検試料に対するx番目の被検試料におけるコモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量の相対比をCxとし、i番目の被検試料ベータアクチン遺伝子の転写産物量を基準として算出する場合には、当該工程により補正された解析対象である所望の遺伝子の転写産物量ATxは下記の式で表される。
ATx=Tx・Cx
(1)全RNAの調製
コモンマーモセット(日本クレア社より入手)の肝臓から全RNAの抽出を行った。
47ヶ月齢の雄コモンマーモセットを解剖し、肝臓を摘出した後、摘出された肝臓をピンセットとハサミとを用いて細分化した後、これを直ちにRNAlater(アンビオン社)に浸漬し、一晩室温で静置した後、使用直前まで−20℃にて保存した。保存された肝臓組織の湿重量1gに対して10mlのTRIZOL試薬(インビトロジェン社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、5分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離(4℃、9,000rpm、10分間)した後、水層を50ml遠心チューブ(旭テクノグラス社製)に回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/5容量のクロロホルム(関東化学製)を添加した後、得られた混合物を15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離(4℃、9,000rpm、10分間)した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/2容量の2-プロパノール(関東化学製)を添加した。得られた混合物を転倒混和した後、室温で10分間静置した。静置後、これを遠心分離(4℃、9,000rpm、10分間)した後、上清を除去することにより、RNAのペレットを得た。得られたペレットを、1 mlのDEPC処理滅菌蒸留水(ナカライテスク製)で溶解した。このようにして得られたRNA溶液1 mlにRNeasy Midi Kit(キアゲン社製)添付のRLT buffer (10μl β−メルカプトエタノール/mL RLT buffer) 3.8 mlを添加し、混合した。更に、当該混合物に2.8 ml エタノール(関東化学製)を添加し、混合した。当該混合液を等量に分割した後、これをRNeasy Midi Kit添付のRNeasy Spin Column 2本にアプライし、遠心分離(室温、10,000rpm、15秒間)した。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、遠心分離(室温、10,000rpm、15秒間)した。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈されたRNeasy Midi Kit添付のRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離(室温、10,000rpm、15秒間)した。遠心分離後、再び溶出液を捨て、エタノールで希釈されたRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離(室温、14,000rpm、2分間)した。遠心分離後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Midi Kit添付の蒸留水をそれぞれ0.25 ml添加し、1分間室温で静置した。静置後、これを遠心分離(室温、10,000rpm、1分間)することにより、その溶出物として全RNAを得た。
上記(1)で調製された全RNA 7μg及びオリゴdTプライマー(アマシャムバイオサイエンス社製) 7μg を含む84μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 56μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 28μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 14μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 14μlを添加した後、42℃、1時間加熱し、さらに75℃、15分間加熱した後、当該混合物を氷上で冷却することにより、cDNAを得た。このようにして得られたcDNAは、冷却後使用時まで−20℃で保存された。
上記で得られたcDNAを鋳型に用いて、配列番号4で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号5で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ製)を用いてPCRを行うことにより、増幅DNAを得た。尚、PCRの反応液組成は、上記のcDNA 1μl、Ex taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)に添付された10xPCR緩衝液 5μl、Ex taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)に添付された2.5 mM dNTP 4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ1μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水37.5μlとした。PCR反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で1分間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された5μlを、アガロースゲル電気泳動に供し、当該増幅DNAが単一であることを確認した後、当該増幅DNAのうち25μlをQiaquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製し、30μlの滅菌精製水に回収した。回収された増幅DNAを含む溶液について、分光光度計を用いてOD260値を測定することにより、当該増幅DNAの量を定量したところ、25μg/mlであった。
上記(3)で得られた増幅DNAをTAベクターを用いてクローン化した。
当該増幅DNAを含む溶液1μlと50mg/mlのpGEM-Tベクター(プロメガ社製)1μlとを混合し、両者をDNAライゲーションキットVer.2(タカラバイオ製)を用いて反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性、IPTG及びX-galを用いたベータガラクトシダーゼに対する染色性の欠如を指標にコロニーを採取した後、採取されたコロニーからプラスミドDNAを調製した。調製されたプラスミドDNAの塩基配列をABIモデル3700オートシークエンサー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてダイターミネーター法で決定した。シークエンシング用プライマーとしては、DNA合成装置にて化学合成された配列番号8及び9で示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。得られた塩基配列に係るデータをDNA配列解析ソフトウエアDNASIS(日立ソフト社製)を用いて編集、整列化することにより、配列番号1で示された塩基配列を得た。このようにして得られた塩基配列を、BLAST法を用いて公的データベースであるNCBIの遺伝子配列に対して相同性検索を行ったところ、登録番号NM_001101であるヒトベータアクチンmRNAが有する塩基配列に相同性が高いことを見出し、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子であることを確認した。
上記で得られた本発明遺伝子の3’-非翻訳領域を含むポリヌクレオチドを取得するために、当該領域を含む本発明遺伝子クローンを、RT−PCR法を用いて取得した。
上記(1)で調製された全RNA 6μg及び配列番号6で示される塩基配列を有するプライマー1μg を含む20μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 8μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 4μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 2μl、DEPC処理水4μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μlを添加した後、37℃、2時間加熱し、さらに75℃、5分間加熱した後、当該混合物を氷上で冷却することにより、cDNAを得た。このようにして得られたcDNAを鋳型に用いて、配列番号4で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号7で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ製)を用いて、上記(3)と同様の条件下でPCRを行うことにより、増幅DNAを得た。上記(4)と同様にして、得られた増幅DNAをTAベクターを用いてクローン化後、塩基配列をABIモデル3700オートシークエンサー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いてダイターミネーター法で決定した。シークエンシング用プライマーとしては、DNA合成装置にて化学合成された配列番号8及び9で示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。得られた塩基配列を、BLAST法を用いて、配列番号1で示される上記(4)で取得した本発明遺伝子クローンの塩基配列に対して相同性検索を行ったところ、5‘−側の塩基配列が、配列番号1で示される上記(4)で取得した本発明遺伝子クローンの塩基配列と同等であったことから、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子であることを確認した。DNA配列解析ソフトウエアDNASIS(日立ソフト社製)を用いて、得られた塩基配列を、配列番号1で示される塩基配列と結合、整列化することにより、配列番号2で示された塩基配列を得た。このようにして得られた塩基配列を、BLAST法を用いて公的データベースであるNCBIの遺伝子配列に対して相同性検索を行ったところ、全長に亘って登録番号NM_0011101であるヒトベータアクチンmRNAが有する塩基配列に相同性が高いことを見出した。更に、3‘−端の塩基配列にpolyA配列を有していることから、配列番号2で示される塩基配列は、3’-非翻訳領域を含むコモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の塩基配列であることを確認した。
上記(4)および(5)で取得した、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の各組織における転写産物量を確認するために、種々の異なる個体や異なる種類の組織からRNAを抽出し、RT−PCR法を用いてmRNAの発現を調べた。
47〜132ヶ月齢の4匹のコモンマーモセット(日本クレア社より入手)より組織を摘出し、上記(1)に記載した方法を用いて全RNAを抽出した。抽出した組織は、肝臓、肺、心臓、骨格筋、脳及び腎臓(以上、個体番号1)、肝臓、心臓及び骨格筋(以上、個体番号2)、肝臓及び肺(以上、個体番号3)、脳(以上、個体番号4)の12種類である。次に、前記全RNAそれぞれ1μg及びd(T)12-18プライマー(アマシャムバイオサイエンス製)1μg を含む12μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 1μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 1μlを添加した後、42℃、60分加熱し、さらに75℃、15分間加熱した後、当該混合物を4℃で冷却することにより、cDNAを得た。
このようにして得られたcDNAに精製水80μlを添加し希釈した後、使用時まで−20℃で保存した。このようにして得られたcDNAを鋳型に用いて、配列番号10で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号11で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ製)を用いてRT−PCRを行った。尚、RT−PCRの反応液組成は、上記希釈後のcDNA溶液を3μl、Ex taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)に添付された10xPCR緩衝液 3μl、Ex taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)に添付された2.5 mM dNTP 2.4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ0.6μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水22.6μlとした。PCR反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で30秒間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された3μlを、エチジウムブロミドを含んだアガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、図1に示すように、電気泳動に供した12種類のサンプルに均等の蛍光を発するバンドが検出された。この結果から、電気泳動に供した12種類のすべての組織において、個体や組織の種類に関わらずほぼ同量のベータアクチン遺伝子のmRNAが含まれていることが確認された。
コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子
配列番号2
ポリA領域を含むコモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子
配列番号3
コモンマーモセット由来のベータアクチン
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
cDNA合成のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
DNA塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
DNA塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
RT−PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号11
RT−PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Claims (10)
- コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子。
- コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
(1)配列番号1で示される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列
(3)配列番号3で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列
(4)配列番号1で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(5)配列番号2で示される塩基配列に対して、95%以上の塩基同一性を有する塩基配列
(6)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して、95%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
(7)前項(1)乃至(6)記載のいずれかの塩基配列を有し、かつ、5’キャップからポリA配列までの領域を含む成熟mRNAに対して相補的なDNAの塩基配列
(8)ベータアクチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列
(9)前項(1)乃至(8)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
(10)前項(1)乃至(9)記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列 - 下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
(1)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列
(2)配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1126から1725で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長20〜60を有する塩基配列
(3)前項(1)又は(2)記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列 - DNA又はRNAを検出のための組成物であって、請求項2又は3記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物。
- 請求項2又は3記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての請求項2又は3記載のポリヌクレオチドの使用。
- 前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項6記載のポリヌクレオチドの使用。
- 2種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
(1)請求項2又は3記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
(2)前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
(3)2種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定されたベータアクチン遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
(4)第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、2種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法。 - 前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項8記載の測定方法。
- 第一工程及び/又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、DNAアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする請求項8又は9記載の測定方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005060321A JP2006006313A (ja) | 2004-05-27 | 2005-03-04 | コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 |
US11/139,406 US7192712B2 (en) | 2004-05-27 | 2005-05-27 | Common marmoset-derived beta-actin gene and use thereof |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004157238 | 2004-05-27 | ||
JP2005060321A JP2006006313A (ja) | 2004-05-27 | 2005-03-04 | コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006006313A true JP2006006313A (ja) | 2006-01-12 |
Family
ID=35425812
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005060321A Pending JP2006006313A (ja) | 2004-05-27 | 2005-03-04 | コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7192712B2 (ja) |
JP (1) | JP2006006313A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007086515A1 (ja) * | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 遺伝子発現解析ツール |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1189599A (ja) * | 1997-09-24 | 1999-04-06 | Haruo Sugiyama | 補正競合rt−pcr法によるヒトwt1発現定量法 |
JP2002503454A (ja) * | 1998-02-04 | 2002-02-05 | ダーム、ミヒャエル・ヴェー | 体液中の腫瘍細胞の定量方法とそれに適した検査キット |
WO2002057489A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-07-25 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ercc1 and ts expression |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3517031B2 (ja) * | 1995-06-09 | 2004-04-05 | 日清紡績株式会社 | 生物学的活性物質の分析法 |
US20050255114A1 (en) * | 2003-04-07 | 2005-11-17 | Nuvelo, Inc. | Methods and diagnosis for the treatment of preeclampsia |
-
2005
- 2005-03-04 JP JP2005060321A patent/JP2006006313A/ja active Pending
- 2005-05-27 US US11/139,406 patent/US7192712B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1189599A (ja) * | 1997-09-24 | 1999-04-06 | Haruo Sugiyama | 補正競合rt−pcr法によるヒトwt1発現定量法 |
JP2002503454A (ja) * | 1998-02-04 | 2002-02-05 | ダーム、ミヒャエル・ヴェー | 体液中の腫瘍細胞の定量方法とそれに適した検査キット |
WO2002057489A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-07-25 | Response Genetics, Inc. | Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ercc1 and ts expression |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007086515A1 (ja) * | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 遺伝子発現解析ツール |
US8138123B2 (en) | 2006-01-27 | 2012-03-20 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Gene expressing analysis tool |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7192712B2 (en) | 2007-03-20 |
US20050266471A1 (en) | 2005-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006014723A (ja) | コモンマーモセット由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその利用 | |
WO2006085616A1 (ja) | 核酸配列増幅方法 | |
US20030065157A1 (en) | Genes expressed in lung cancer | |
KR20190026769A (ko) | 유전자 발현 프로파일을 사용하여 폐암을 진단하기 위한 조성물 및 방법 | |
JP2009534036A (ja) | 細胞培養表現型の示差的発現プロファイリング分析およびその使用 | |
Dahiya et al. | A fasciclin-domain containing gene, ZeFLA11, is expressed exclusively in xylem elements that have reticulate wall thickenings in the stem vascular system of Zinnia elegans cv Envy | |
KR20150109427A (ko) | WT1 mRNA의 발현량 정량 방법 | |
KR20230075403A (ko) | 활성 및 열안정성이 증가된 역전사효소 돌연변이체 | |
KR20020034161A (ko) | 불충분한 핵산 서열의 증폭방법 및 그 방법의 수행장치 | |
JP2006006313A (ja) | コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 | |
JP2006042802A (ja) | コモンマーモセット由来のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子及びその利用 | |
JP2006042803A (ja) | コモンマーモセット由来のシクロフィリンa遺伝子及びその利用 | |
WO1999043844A1 (en) | Reciprocal subtraction differential display | |
US20030119009A1 (en) | Genes regulated by MYCN activation | |
JP2005333948A (ja) | コモンマーモセット由来のアルブミン遺伝子及びその利用 | |
JP2006042804A (ja) | コモンマーモセット由来の18sリボソームrna遺伝子及びその利用 | |
EP4150110A1 (en) | Selective capture of target dna sequences | |
US7091033B2 (en) | Array of toxicologically relevant canine genes and uses thereof | |
JP4129229B2 (ja) | 神経芽細胞腫において単離された核酸 | |
JP4129227B2 (ja) | 神経芽細胞腫において単離された核酸 | |
US6150096A (en) | Molecular markers for the diagnosis of human diseases including Crohn's disease | |
US6657053B1 (en) | Reciprocal subtraction differential display | |
Freeman | Differential Display of Gene Expression | |
JP2022091235A (ja) | アユ類の性識別マーカー | |
JP2006115797A (ja) | 哺乳動物における肝細胞癌の検定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20080131 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080207 |
|
RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20080514 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101102 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110208 |