JPH1189599A - 補正競合ｒｔ−ｐｃｒ法によるヒトｗｔ１発現定量法 - Google Patents
補正競合ｒｔ−ｐｃｒ法によるヒトｗｔ１発現定量法Info
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- JPH1189599A JPH1189599A JP27814297A JP27814297A JPH1189599A JP H1189599 A JPH1189599 A JP H1189599A JP 27814297 A JP27814297 A JP 27814297A JP 27814297 A JP27814297 A JP 27814297A JP H1189599 A JPH1189599 A JP H1189599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 補正された競合ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷ
Ｔ１・ｍＲＮＡ発現量定量法を提供。 【解決手段】 a)検体ＲＮＡにＷＴ１−ＲＮＡスタンダ
ード希釈系列下に逆転写酵素を競合反応させ、b)得られ
るｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、c)アガロースゲル電気泳
動によるＷＴ１・ｍＲＮＡ由来バンドとＷＴ１−スタン
ダードＲＮＡ由来バンドの発光強度比を測定し、d)検体
ＲＮＡにβ−アクチン−ＲＮＡスタンダード希釈系列下
に逆転写酵素を競合反応させ、e)得られるｃＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅させ、f)アガロースゲル電気泳動によるβ−ア
クチン・ｍＲＮＡ由来バンドとβ−アクチン−スタンダ
ードＲＮＡ由来バンドの発光強度比を測定し、g)上記c)
のＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を上記f)のβ−アクチン・ｍＲ
ＮＡ量値で除算し、これに健常人β−アクチン・ｍＲＮ
Ａ発現量平均値を乗算して補正する、補正競合ＲＴ−Ｐ
ＣＲ法によるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量の定量方法。
Ｔ１・ｍＲＮＡ発現量定量法を提供。 【解決手段】 a)検体ＲＮＡにＷＴ１−ＲＮＡスタンダ
ード希釈系列下に逆転写酵素を競合反応させ、b)得られ
るｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、c)アガロースゲル電気泳
動によるＷＴ１・ｍＲＮＡ由来バンドとＷＴ１−スタン
ダードＲＮＡ由来バンドの発光強度比を測定し、d)検体
ＲＮＡにβ−アクチン−ＲＮＡスタンダード希釈系列下
に逆転写酵素を競合反応させ、e)得られるｃＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅させ、f)アガロースゲル電気泳動によるβ−ア
クチン・ｍＲＮＡ由来バンドとβ−アクチン−スタンダ
ードＲＮＡ由来バンドの発光強度比を測定し、g)上記c)
のＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を上記f)のβ−アクチン・ｍＲ
ＮＡ量値で除算し、これに健常人β−アクチン・ｍＲＮ
Ａ発現量平均値を乗算して補正する、補正競合ＲＴ−Ｐ
ＣＲ法によるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量の定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血病、固型癌の
診断や骨髄移植時期の決定に利用できるヒトＷＴ１のｍ
ＲＮＡの発現量を定量する新しい方法に関する。
診断や骨髄移植時期の決定に利用できるヒトＷＴ１のｍ
ＲＮＡの発現量を定量する新しい方法に関する。
【０００２】また本発明は、上記定量法のためのＤＮＡ
断片、これを含むプラスミド、スタンダード及びプライ
マーに関する。
断片、これを含むプラスミド、スタンダード及びプライ
マーに関する。
【０００３】
【従来の技術】ＷＴ１遺伝子は、１９９０年にコールら
〔Call, K. M. et al., Isolation and characterizati
on of a zinc finger polypeptide gene at the human
chromosome 11 Wilms' tumor locus, Cell, 60, 509-52
0 (1990)〕により、ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として
単離された遺伝子である。該遺伝子は、腎及び生殖器の
形成に重要な働きをすることが明らかとなっている。
〔Call, K. M. et al., Isolation and characterizati
on of a zinc finger polypeptide gene at the human
chromosome 11 Wilms' tumor locus, Cell, 60, 509-52
0 (1990)〕により、ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として
単離された遺伝子である。該遺伝子は、腎及び生殖器の
形成に重要な働きをすることが明らかとなっている。
【０００４】１９９４年に井上らは、ＷＴ１遺伝子がほ
ぼ全例の白血病患者に発現していることを見い出した
〔Inoue, K. et al., WT1 as a new prognostic factor
and anew marker for the detection of minimal resi
dual disease in acute leukemia, Blood, 84, 3071-30
79 (1994)〕。ＷＴ１は、健常人の末梢血では見出され
ないことから、白血病における微小残存病変（ＭＲＤ）
の検出への応用が試みられている。その方法としては、
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法〔Park,
s., et al., Nature Genet, 4, 415 (1993); Miwa, H.,
et al., Leukemia, 6, 405 (1993); Miyagi, t., et a
l., Leukemia, 7, 979 (1993)〕やＲＴ−ＰＣＲ法〔Rev
erse transcriptase-polymerase chain reaction; Inou
e, K., etal., Blood, 84 (9) 3071-3079 (1994)〕が知
られている。
ぼ全例の白血病患者に発現していることを見い出した
〔Inoue, K. et al., WT1 as a new prognostic factor
and anew marker for the detection of minimal resi
dual disease in acute leukemia, Blood, 84, 3071-30
79 (1994)〕。ＷＴ１は、健常人の末梢血では見出され
ないことから、白血病における微小残存病変（ＭＲＤ）
の検出への応用が試みられている。その方法としては、
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法〔Park,
s., et al., Nature Genet, 4, 415 (1993); Miwa, H.,
et al., Leukemia, 6, 405 (1993); Miyagi, t., et a
l., Leukemia, 7, 979 (1993)〕やＲＴ−ＰＣＲ法〔Rev
erse transcriptase-polymerase chain reaction; Inou
e, K., etal., Blood, 84 (9) 3071-3079 (1994)〕が知
られている。
【０００５】一方、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）
は、ＤＮＡ結合蛋白質で、どのような細胞でもほぼ同様
に発現していると考えられている。従って、ある特定の
遺伝子のｍＲＮＡ発現を定量する際に、該β−ａｃｔｉ
ｎの発現量を同時に定量すれば、実際に測定にしようす
る特定遺伝子のＲＮＡ量を比較したいサンプル間で一定
になるように補正することができる。
は、ＤＮＡ結合蛋白質で、どのような細胞でもほぼ同様
に発現していると考えられている。従って、ある特定の
遺伝子のｍＲＮＡ発現を定量する際に、該β−ａｃｔｉ
ｎの発現量を同時に定量すれば、実際に測定にしようす
る特定遺伝子のＲＮＡ量を比較したいサンプル間で一定
になるように補正することができる。
【０００６】上記のようにＷＴ１・ｍＲＮＡやβ−ａｃ
ｔｉｎ・ｍＲＮＡの発現を測定する方法として知られて
いる、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法や
ＲＴ−ＰＣＲ法は、半定量法であり、いずれも再現性や
定量性に乏しい。事実、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法では、
電気泳動後、バンドの発色強度を目視判定するか又はデ
ンシトメトリー法により測定する方法が採用されてい
る。
ｔｉｎ・ｍＲＮＡの発現を測定する方法として知られて
いる、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法や
ＲＴ−ＰＣＲ法は、半定量法であり、いずれも再現性や
定量性に乏しい。事実、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法では、
電気泳動後、バンドの発色強度を目視判定するか又はデ
ンシトメトリー法により測定する方法が採用されてい
る。
【０００７】しかしながら、これらの方法ではエチジウ
ムブロマイド発色強度の直線領域が非常に狭く、またＰ
ＣＲの増幅産物量が必ずしももとの鋳型量を反映してお
らず、単純に増幅産物量から鋳型量を推定することはで
きず、更に検体を希釈したり、ＰＣＲのサイクル数を代
える操作も必要であり、煩雑で、定量性に乏しい不利が
あった。
ムブロマイド発色強度の直線領域が非常に狭く、またＰ
ＣＲの増幅産物量が必ずしももとの鋳型量を反映してお
らず、単純に増幅産物量から鋳型量を推定することはで
きず、更に検体を希釈したり、ＰＣＲのサイクル数を代
える操作も必要であり、煩雑で、定量性に乏しい不利が
あった。
【０００８】さらに、正確な定量を行なうためには、実
際に定量に用いるＲＮＡ量は、サンプル間で補正してお
く必要がある。しかるに、一般的に測定に用いられてい
る２６０ｎｍの吸光度からのｍＲＮＡの定量法では、Ｄ
ＮＡの混入や、ＲＮＡのデグラデーションの可能性が考
えられるため、確実にｍＲＮＡの一定量をサンプリング
することは不可能である。
際に定量に用いるＲＮＡ量は、サンプル間で補正してお
く必要がある。しかるに、一般的に測定に用いられてい
る２６０ｎｍの吸光度からのｍＲＮＡの定量法では、Ｄ
ＮＡの混入や、ＲＮＡのデグラデーションの可能性が考
えられるため、確実にｍＲＮＡの一定量をサンプリング
することは不可能である。
【０００９】最近、これらの方法に代わって、全ての細
胞において発現しているとされるβ−ａｃｔｉｎの発現
量を指標に、サンプル間のＲＮＡ量の補正を行うこと
で、正確な定量値を算出する、標準物質（スタンダー
ド）を用いた競合ＲＴ−ＰＣＲ法が報告されている〔Ko
take S, et al., J. Immunol. Methods, 199 (2), 193-
203(1996)〕。しかしながら、この方法がＷＴ１の定量
に応用された例はない。
胞において発現しているとされるβ−ａｃｔｉｎの発現
量を指標に、サンプル間のＲＮＡ量の補正を行うこと
で、正確な定量値を算出する、標準物質（スタンダー
ド）を用いた競合ＲＴ−ＰＣＲ法が報告されている〔Ko
take S, et al., J. Immunol. Methods, 199 (2), 193-
203(1996)〕。しかしながら、この方法がＷＴ１の定量
に応用された例はない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このような理由より、
従来のノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法や
ＲＴ−ＰＣＲ法に代わって、より正確にヒトＷＴ１遺伝
子の発現量を定量できる新しいアッセイ系の開発が望ま
れている。
従来のノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法や
ＲＴ−ＰＣＲ法に代わって、より正確にヒトＷＴ１遺伝
子の発現量を定量できる新しいアッセイ系の開発が望ま
れている。
【００１１】従って、本発明の目的は、ヒトＷＴ１・ｍ
ＲＮＡの発現量を定量可能であって、しかもより再現性
が高く、正確に定量できる新しいヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ
の競合定量法を提供することにある。
ＲＮＡの発現量を定量可能であって、しかもより再現性
が高く、正確に定量できる新しいヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ
の競合定量法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、上記目的の達成に有効な、ＷＴ１・ｍＲＮＡ競合
ＲＴ−ＰＣＲ定量法、そのための標準物質（スタンダー
ド）及びプライマーの合成、並びにβ−ａｃｔｉｎ・ｍ
ＲＮＡ競合ＲＴ−ＰＣＲ定量法、そのためのスタンダー
ド及びプライマーの合成に成功した。そして、これらの
利用によって、それぞれヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量及
びβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ発現量を測定し、これらの
測定値から補正されたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量を定
量する方法を確立し、ここに本発明を完成した。
結果、上記目的の達成に有効な、ＷＴ１・ｍＲＮＡ競合
ＲＴ−ＰＣＲ定量法、そのための標準物質（スタンダー
ド）及びプライマーの合成、並びにβ−ａｃｔｉｎ・ｍ
ＲＮＡ競合ＲＴ−ＰＣＲ定量法、そのためのスタンダー
ド及びプライマーの合成に成功した。そして、これらの
利用によって、それぞれヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量及
びβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ発現量を測定し、これらの
測定値から補正されたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量を定
量する方法を確立し、ここに本発明を完成した。
【００１３】即ち、本発明によれば、以下の工程ａ）〜
工程ｇ）を含むことを特徴とする補正競合ＲＴ−ＰＣＲ
法によりヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの発現量を定量する方法
が提供される。
工程ｇ）を含むことを特徴とする補正競合ＲＴ−ＰＣＲ
法によりヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの発現量を定量する方法
が提供される。
【００１４】ａ）検体ＲＮＡにＷＴ１−ＲＮＡスタンダ
ード希釈系列下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡ
を得る工程、 ｂ）該ｃＤＮＡをＷＴ１−センスプライマー及びＷＴ１
−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲで増幅させ、
アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｃ）該電気泳動により得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ由来の
バンド及びＷＴ１−スタンダードＲＮＡ由来のバンドの
発光強度比を測定して検体のＷＴ１・ｍＲＮＡ量を算出
する工程、 ｄ）検体ＲＮＡにβ−アクチン−ＲＮＡスタンダード希
釈系列下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡを得る
工程、 ｅ）該ｃＤＮＡをβ−アクチン−センスプライマー及び
β−アクチン−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ
で増幅させ、アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｆ）該電気泳動により得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ
由来のバンド及びβ−アクチン−スタンダードＲＮＡ由
来のバンドの発光強度比を測定して検体のβ−アクチン
・ｍＲＮＡ量を算出する工程、 ｇ）工程ｃ）で得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を工程
ｆ）で得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ量値で除算し、
これに健常人のβ−アクチン・ｍＲＮＡ発現量平均値を
乗算して補正する工程。
ード希釈系列下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡ
を得る工程、 ｂ）該ｃＤＮＡをＷＴ１−センスプライマー及びＷＴ１
−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲで増幅させ、
アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｃ）該電気泳動により得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ由来の
バンド及びＷＴ１−スタンダードＲＮＡ由来のバンドの
発光強度比を測定して検体のＷＴ１・ｍＲＮＡ量を算出
する工程、 ｄ）検体ＲＮＡにβ−アクチン−ＲＮＡスタンダード希
釈系列下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡを得る
工程、 ｅ）該ｃＤＮＡをβ−アクチン−センスプライマー及び
β−アクチン−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ
で増幅させ、アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｆ）該電気泳動により得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ
由来のバンド及びβ−アクチン−スタンダードＲＮＡ由
来のバンドの発光強度比を測定して検体のβ−アクチン
・ｍＲＮＡ量を算出する工程、 ｇ）工程ｃ）で得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を工程
ｆ）で得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ量値で除算し、
これに健常人のβ−アクチン・ｍＲＮＡ発現量平均値を
乗算して補正する工程。
【００１５】また、本発明によれば、上記定量法のため
のＷＴ１・ｍＲＮＡ及びβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡの定
量法、これらに利用するスタンダード、プライマー等も
それぞれ提供される。より詳しくは、本発明によれば、
まず （１）配列番号：１で示され、ヒトのＷＴ１遺伝子を増
幅する際のプライマーがアニーリングする配列を両端に
持つＤＮＡ断片、（２）該ＤＮＡ断片を含む組換えプラ
スミドｐＷＴ１、（３）該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡ
を用いるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダー
ド、（４）ヒトＷＴ１遺伝子を増幅する際のプライマー
配列とプライマー及び（５）上記競合定量用スタンダー
ドとプライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷ
Ｔ１・ｍＲＮＡを定量する方法が提供される。
のＷＴ１・ｍＲＮＡ及びβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡの定
量法、これらに利用するスタンダード、プライマー等も
それぞれ提供される。より詳しくは、本発明によれば、
まず （１）配列番号：１で示され、ヒトのＷＴ１遺伝子を増
幅する際のプライマーがアニーリングする配列を両端に
持つＤＮＡ断片、（２）該ＤＮＡ断片を含む組換えプラ
スミドｐＷＴ１、（３）該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡ
を用いるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダー
ド、（４）ヒトＷＴ１遺伝子を増幅する際のプライマー
配列とプライマー及び（５）上記競合定量用スタンダー
ドとプライマーとを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷ
Ｔ１・ｍＲＮＡを定量する方法が提供される。
【００１６】また、本発明によれば、（６）配列番号：
２で示され、ヒトのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する際
のプライマーがアニーリングする配列を両端に持つＤＮ
Ａ断片、（７）該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐ
ＡＣＴ、（８）該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いる
ヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダー
ド、（９）該ヒトβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する際の
プライマー配列とプライマー及び（１０）上記競合定量
用スタンダードとプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法に
よりヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを定量する方法も
提供される。
２で示され、ヒトのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する際
のプライマーがアニーリングする配列を両端に持つＤＮ
Ａ断片、（７）該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐ
ＡＣＴ、（８）該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いる
ヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダー
ド、（９）該ヒトβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅する際の
プライマー配列とプライマー及び（１０）上記競合定量
用スタンダードとプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法に
よりヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを定量する方法も
提供される。
【００１７】本発明の補正競合ＲＴ−ＰＣＲ測定法によ
るヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量は、上記工程ｃ）で得ら
れるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を、上記工程ｆ）で得ら
れるヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ量値で除算し、こ
の値に健常人から得られたヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲ
ＮＡ発現量の平均値を乗算して補正することにより得え
られる。
るヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量は、上記工程ｃ）で得ら
れるヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を、上記工程ｆ）で得ら
れるヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ量値で除算し、こ
の値に健常人から得られたヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲ
ＮＡ発現量の平均値を乗算して補正することにより得え
られる。
【００１８】かかる本発明方法によれば、ヒトＷＴ１・
ｍＲＮＡ量を、従来法では得られない正確な値として得
ることができる。しかも本発明に係わる競合ＲＴ−ＰＣ
Ｒ定量法は、基本的には一つのチューブでスタンダード
との競合反応を行なわせるものであるため、正確な鋳型
量を反映する定量値が得られ、また反応チューブも少な
くでき、測定に費やす労力等を軽減できる利点もある。
ｍＲＮＡ量を、従来法では得られない正確な値として得
ることができる。しかも本発明に係わる競合ＲＴ−ＰＣ
Ｒ定量法は、基本的には一つのチューブでスタンダード
との競合反応を行なわせるものであるため、正確な鋳型
量を反映する定量値が得られ、また反応チューブも少な
くでき、測定に費やす労力等を軽減できる利点もある。
【００１９】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
塩基配列、核酸、制限酵素、その他に関する略号による
表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名
法乃至規定及び「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細
書等の作成のためのガイドライン」（平成２年１１月、
特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。
塩基配列、核酸、制限酵素、その他に関する略号による
表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名
法乃至規定及び「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細
書等の作成のためのガイドライン」（平成２年１１月、
特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明方法について詳細に
開示する。
開示する。
【００２１】本発明によれば、まず配列番号：１で示さ
れるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミド
ｐＷＴ１、該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いるヒト
ＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード及び該スタン
ダードを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷＴ１・ｍＲ
ＮＡを定量する方法が提供される。
れるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミド
ｐＷＴ１、該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いるヒト
ＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード及び該スタン
ダードを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷＴ１・ｍＲ
ＮＡを定量する方法が提供される。
【００２２】ここで、上記配列番号：１で示されるＤＮ
Ａ断片は、ヒトＷＴ１・ｍＲＮＡを逆転写反応する際の
プライマー及びヒトＷＴ１・ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する
際のプライマーがアニーリングする配列を両端に持つ。
上記ＤＮＡ断片のＰＣＲ産物のサイズ及び内部配列はヒ
トＷＴ１とは異なる点に特徴がある。また該ＤＮＡ断片
（変異ＤＮＡ）に相補的なプラス鎖ＲＮＡは、ヒトＷＴ
１・ｍＲＮＡ競合定量用のＲＮＡスタンダードとして有
用である。
Ａ断片は、ヒトＷＴ１・ｍＲＮＡを逆転写反応する際の
プライマー及びヒトＷＴ１・ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する
際のプライマーがアニーリングする配列を両端に持つ。
上記ＤＮＡ断片のＰＣＲ産物のサイズ及び内部配列はヒ
トＷＴ１とは異なる点に特徴がある。また該ＤＮＡ断片
（変異ＤＮＡ）に相補的なプラス鎖ＲＮＡは、ヒトＷＴ
１・ｍＲＮＡ競合定量用のＲＮＡスタンダードとして有
用である。
【００２３】上記ＤＮＡ断片及びこれを保有する組換え
体プラスミドは、一般的な遺伝子組換え技術に従い製造
できる。得られる組換え体プラスミドを細菌、ウイルス
等の微生物に組み込んで形質転換させ、該形質転換体よ
り、上記変異ＤＮＡに対応する相補的プラス鎖ＲＮＡを
得ることができる。
体プラスミドは、一般的な遺伝子組換え技術に従い製造
できる。得られる組換え体プラスミドを細菌、ウイルス
等の微生物に組み込んで形質転換させ、該形質転換体よ
り、上記変異ＤＮＡに対応する相補的プラス鎖ＲＮＡを
得ることができる。
【００２４】上記プラスミドの製法につき詳述すれば、
これは好ましくはＰＣＲ法を利用した変異導入法等によ
り製造できる。該方法において用いられるＤＮＡ断片調
製のための鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ法を行い得るものなら
何でもよく、特定のものに限定されない。該鋳型ＤＮＡ
の抽出は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホル
ム法（Sambrook J., et al., Molecular Cloning. In a
laboratory manual cold spring harbor laboratory p
ress, New York, 1990）等により実施できる。
これは好ましくはＰＣＲ法を利用した変異導入法等によ
り製造できる。該方法において用いられるＤＮＡ断片調
製のための鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ法を行い得るものなら
何でもよく、特定のものに限定されない。該鋳型ＤＮＡ
の抽出は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホル
ム法（Sambrook J., et al., Molecular Cloning. In a
laboratory manual cold spring harbor laboratory p
ress, New York, 1990）等により実施できる。
【００２５】また、上記ＤＮＡ断片の調製は、例えば、
鋳型ＤＮＡの標的領域を、ＤＮＡ断片調製用のセンスプ
ライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ法
にて増幅させる。
鋳型ＤＮＡの標的領域を、ＤＮＡ断片調製用のセンスプ
ライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ法
にて増幅させる。
【００２６】上記で得られるＤＮＡ断片は、例えばこれ
を３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切り出して
精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+等の発現ベ
クターに直接挿入するか又はｐＵＣ１９やｐＣＲII等の
クローニングベクターに挿入した後、発現ベクターにサ
ブクローニングして、微生物、例えば大腸菌を形質転換
させることができる。かくして得られる形質転換大腸菌
を常法に従い培養し、プラスミドを精製して、所望のｐ
ＷＴ１を収得できる。このプラスミドｐＷＴ１は、これ
を用いて大腸菌（E.coli)ＪＭ１０９コンピテント細胞
を形質転換させることができる。かくして得られる形質
転換大腸菌の一具体例は、本発明者によりＯＡＬ７７７
７と命名されている。
を３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切り出して
精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+等の発現ベ
クターに直接挿入するか又はｐＵＣ１９やｐＣＲII等の
クローニングベクターに挿入した後、発現ベクターにサ
ブクローニングして、微生物、例えば大腸菌を形質転換
させることができる。かくして得られる形質転換大腸菌
を常法に従い培養し、プラスミドを精製して、所望のｐ
ＷＴ１を収得できる。このプラスミドｐＷＴ１は、これ
を用いて大腸菌（E.coli)ＪＭ１０９コンピテント細胞
を形質転換させることができる。かくして得られる形質
転換大腸菌の一具体例は、本発明者によりＯＡＬ７７７
７と命名されている。
【００２７】以下、ＷＴ１−ＲＮＡスタンダード及びこ
れを用いたＷＴ１・ｍＲＮＡの定量法につき詳述する。
れを用いたＷＴ１・ｍＲＮＡの定量法につき詳述する。
【００２８】ＷＴ１−ＲＮＡスタンダードの調製は、例
えば大腸菌のバクテリオファージＴ７由来のＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼを用いて、次のようにして調製でき
る。即ち、前記のごとくして得られる本発明ｐＷＴ１の
Ｔ７プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡ断片を鋳型
として、まずＲＮＡを合成し、その後混在するＤＮＡを
ＤＮａｓｅを用いて分解し、フェノール抽出により精製
する。かくして、所望のＲＮＡスタンダード液を調製で
きる。
えば大腸菌のバクテリオファージＴ７由来のＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼを用いて、次のようにして調製でき
る。即ち、前記のごとくして得られる本発明ｐＷＴ１の
Ｔ７プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡ断片を鋳型
として、まずＲＮＡを合成し、その後混在するＤＮＡを
ＤＮａｓｅを用いて分解し、フェノール抽出により精製
する。かくして、所望のＲＮＡスタンダード液を調製で
きる。
【００２９】得られるＲＮＡスタンダード溶液は、濃度
コピー数で表され、引き続くヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの定
量の際には、例えば０．２ｍｇ／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ
溶液で希釈して１０1コピー／μｌ、１０2コピー／μ
ｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コピー／μｌ、１０5コ
ピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、１０7コピー／μｌ、
１０8コピー／μｌ、１０9コピー／μｌ及び１０10コピ
ー／μｌの溶液のＲＮＡスタンダード希釈系列として利
用できる。
コピー数で表され、引き続くヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの定
量の際には、例えば０．２ｍｇ／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ
溶液で希釈して１０1コピー／μｌ、１０2コピー／μ
ｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コピー／μｌ、１０5コ
ピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、１０7コピー／μｌ、
１０8コピー／μｌ、１０9コピー／μｌ及び１０10コピ
ー／μｌの溶液のＲＮＡスタンダード希釈系列として利
用できる。
【００３０】ＲＮＡスタンダードによるＷＴ１ｍＲＮＡ
の定量は、上記のようにして調製されたＲＮＡスタンダ
ード希釈系列を利用して、例えば次の競合定量測定法に
より実施できる。
の定量は、上記のようにして調製されたＲＮＡスタンダ
ード希釈系列を利用して、例えば次の競合定量測定法に
より実施できる。
【００３１】即ち、この方法では、例えば、まず培養細
胞Ｋ５６２からＡＧＰＣ法〔Chomczynski, P. and Sacc
i, N., Single step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extract
ion, Anal. Biochem., 162,156-159 (1987)〕により抽
出したトータルＲＮＡに、各種濃度に希釈したＲＮＡス
タンダード溶液及び逆転写用プライマーを加え、次いで
この溶液を８０℃程度で５分間程度加温し、直ちに氷中
で冷却し、逆転写酵素を添加して３７℃程度で６０分間
程度反応させ、その後、９５℃程度で５分間程度加温し
て逆転写酵素を失活させて、ｃＤＮＡ溶液を調製する。
胞Ｋ５６２からＡＧＰＣ法〔Chomczynski, P. and Sacc
i, N., Single step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extract
ion, Anal. Biochem., 162,156-159 (1987)〕により抽
出したトータルＲＮＡに、各種濃度に希釈したＲＮＡス
タンダード溶液及び逆転写用プライマーを加え、次いで
この溶液を８０℃程度で５分間程度加温し、直ちに氷中
で冷却し、逆転写酵素を添加して３７℃程度で６０分間
程度反応させ、その後、９５℃程度で５分間程度加温し
て逆転写酵素を失活させて、ｃＤＮＡ溶液を調製する。
【００３２】次に、得られたｃＤＮＡ溶液にセンスプラ
イマー及びアンチセンスプライマーを加えてＰＣＲ法を
実施し、増幅されたＤＮＡを３％アガロースゲル電気泳
動して、Ｋ５６２ＷＴ１・ｍＲＮＡ由来のバンドと、ス
タンダードＲＮＡ由来のバンドの比をデンシトメトリー
法により解析し、２本のバンドの発光強度の比を求め
る。かくして、Ｋ５６２のＷＴ１・ｍＲＮＡ量を定量で
きる。
イマー及びアンチセンスプライマーを加えてＰＣＲ法を
実施し、増幅されたＤＮＡを３％アガロースゲル電気泳
動して、Ｋ５６２ＷＴ１・ｍＲＮＡ由来のバンドと、ス
タンダードＲＮＡ由来のバンドの比をデンシトメトリー
法により解析し、２本のバンドの発光強度の比を求め
る。かくして、Ｋ５６２のＷＴ１・ｍＲＮＡ量を定量で
きる。
【００３３】本発明によれば、また配列番号：２で示さ
れるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミド
ｐＡＣＴ、該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いたヒト
β−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード及び
該スタンダードを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトβ−
ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを定量する方法が提供される。
以下この方法につき詳述する。
れるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミド
ｐＡＣＴ、該ＤＮＡ断片に対応するＲＮＡを用いたヒト
β−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード及び
該スタンダードを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトβ−
ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを定量する方法が提供される。
以下この方法につき詳述する。
【００３４】配列番号：２で示されるＤＮＡ断片は、ヒ
トβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを逆転写反応する際のプ
ライマー及びヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｃＤＮＡをＰＣＲ
増幅する際のプライマーがアニーリングする配列を両端
に持つことを特徴とする。該ＤＮＡ断片はまた、そのＰ
ＣＲ産物のサイズ及び内部配列においてヒトβ−ａｃｔ
ｉｎとは異なることをも特徴とする。該ＤＮＡ断片に相
補的なプラス鎖ＲＮＡは、ヒトβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮ
Ａ競合定量用ＲＮＡスタンダードとして有用である。
トβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを逆転写反応する際のプ
ライマー及びヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｃＤＮＡをＰＣＲ
増幅する際のプライマーがアニーリングする配列を両端
に持つことを特徴とする。該ＤＮＡ断片はまた、そのＰ
ＣＲ産物のサイズ及び内部配列においてヒトβ−ａｃｔ
ｉｎとは異なることをも特徴とする。該ＤＮＡ断片に相
補的なプラス鎖ＲＮＡは、ヒトβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮ
Ａ競合定量用ＲＮＡスタンダードとして有用である。
【００３５】上記ＤＮＡ断片（変異ＤＮＡ断片）及びこ
れを保有する組換え体プラスミドは、一般的な遺伝子組
換え技術に従い製造できる。該組換え体プラスミドを細
菌、ウイルス等の微生物に組み込んで形質転換させた形
質転換体より、上記変異ＤＮＡに対応する相補的プラス
鎖ＲＮＡを得ることができる。
れを保有する組換え体プラスミドは、一般的な遺伝子組
換え技術に従い製造できる。該組換え体プラスミドを細
菌、ウイルス等の微生物に組み込んで形質転換させた形
質転換体より、上記変異ＤＮＡに対応する相補的プラス
鎖ＲＮＡを得ることができる。
【００３６】該方法につき詳述すれば、所望のプラスミ
ドは、ＨＢＶ・ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を利用し
た変異導入法等により製造できる。ＤＮＡ断片調製のた
めの鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ法を行い得るものなら何でも
よく、特定のものに限定されない。該鋳型ＤＮＡの抽出
は例えば前述したフェノール／クロロホルム法等により
実施できる。
ドは、ＨＢＶ・ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を利用し
た変異導入法等により製造できる。ＤＮＡ断片調製のた
めの鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ法を行い得るものなら何でも
よく、特定のものに限定されない。該鋳型ＤＮＡの抽出
は例えば前述したフェノール／クロロホルム法等により
実施できる。
【００３７】ＤＮＡ断片の調製は、ＰＣＲ法により、即
ち、鋳型ＤＮＡの標的領域を、ＤＮＡ断片調製用のセン
スプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法にて増幅させることにより実施できる。プラスミ
ドｐＡＣＴは、上記で得られるＤＮＡ断片を、例えば３
％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切り出して精製
し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+等の発現ベクタ
ーに直接挿入するか又はｐＵＣ１９やｐＣＲII等のクロ
ーニングベクターに挿入した後、発現ベクターにサブク
ローニングして、微生物、例えば大腸菌を形質転換さ
せ、かくして得られる形質転換体を常法に従い培養する
ことにより調製できる。このプラスミドｐＡＣＴは、こ
れを用いて大腸菌（E.coli)ＪＭ１０９コンピテント細
胞を形質転換させ得る。かくして得られる形質転換大腸
菌の一具体例は、本発明者によりＯＡＬ８８８８と命名
されている。
ち、鋳型ＤＮＡの標的領域を、ＤＮＡ断片調製用のセン
スプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法にて増幅させることにより実施できる。プラスミ
ドｐＡＣＴは、上記で得られるＤＮＡ断片を、例えば３
％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切り出して精製
し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+等の発現ベクタ
ーに直接挿入するか又はｐＵＣ１９やｐＣＲII等のクロ
ーニングベクターに挿入した後、発現ベクターにサブク
ローニングして、微生物、例えば大腸菌を形質転換さ
せ、かくして得られる形質転換体を常法に従い培養する
ことにより調製できる。このプラスミドｐＡＣＴは、こ
れを用いて大腸菌（E.coli)ＪＭ１０９コンピテント細
胞を形質転換させ得る。かくして得られる形質転換大腸
菌の一具体例は、本発明者によりＯＡＬ８８８８と命名
されている。
【００３８】上記β−アクチン−ＲＮＡスタンダード及
びこれを用いたβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡの定量法につ
き詳述すると、該ＲＮＡスタンダードの調製は、例えば
大腸菌のバクテリオファージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて調製できる。即ち、上記ｐＡＣ
ＴのＴ７プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡ断片を
鋳型として、まずＲＮＡを合成し、その後混在するＤＮ
ＡをＤＮａｓｅを用いて分解し、フェノール抽出により
精製することによりＲＮＡスタンダードを調製できる。
びこれを用いたβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡの定量法につ
き詳述すると、該ＲＮＡスタンダードの調製は、例えば
大腸菌のバクテリオファージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて調製できる。即ち、上記ｐＡＣ
ＴのＴ７プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡ断片を
鋳型として、まずＲＮＡを合成し、その後混在するＤＮ
ＡをＤＮａｓｅを用いて分解し、フェノール抽出により
精製することによりＲＮＡスタンダードを調製できる。
【００３９】かくして得られるＲＮＡスタンダード液
は、濃度コピー数で表され、引き続くヒトβ−ａｃｔｉ
ｎ ・ｍＲＮＡの定量の際には、例えば０．２ｍｇ／ｍ
ｌウシ胸腺ｔＲＮＡ溶液で希釈して１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの希釈系列として利用で
きる。
は、濃度コピー数で表され、引き続くヒトβ−ａｃｔｉ
ｎ ・ｍＲＮＡの定量の際には、例えば０．２ｍｇ／ｍ
ｌウシ胸腺ｔＲＮＡ溶液で希釈して１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの希釈系列として利用で
きる。
【００４０】ＲＮＡスタンダードによるβ−ａｃｔｉｎ
・ｍＲＮＡの定量は、上記のようにして調製されたＲ
ＮＡスタンダード希釈系列を利用して、競合定量測定法
により実施できる。
・ｍＲＮＡの定量は、上記のようにして調製されたＲ
ＮＡスタンダード希釈系列を利用して、競合定量測定法
により実施できる。
【００４１】この方法では、例えば、まず培養細胞Ｋ５
６２からＡＧＰＣ法により抽出したトータルＲＮＡに、
各種濃度に希釈したＲＮＡスタンダード溶液及び逆転写
用プライマーを加え、次いでこの溶液を８０℃程度で５
分間程度加温し、直ちに氷中で冷却し、逆転写酵素を添
加して３７℃程度で６０分間程度反応させ、その後、９
５℃程度で５分間程度加温して逆転写酵素を失活させる
ことにより、ｃＤＮＡ溶液を調製する。
６２からＡＧＰＣ法により抽出したトータルＲＮＡに、
各種濃度に希釈したＲＮＡスタンダード溶液及び逆転写
用プライマーを加え、次いでこの溶液を８０℃程度で５
分間程度加温し、直ちに氷中で冷却し、逆転写酵素を添
加して３７℃程度で６０分間程度反応させ、その後、９
５℃程度で５分間程度加温して逆転写酵素を失活させる
ことにより、ｃＤＮＡ溶液を調製する。
【００４２】次に、得られたｃＤＮＡ溶液にセンスプラ
イマー及びアンチセンスプライマーを加えてＰＣＲ法に
より増幅し、３％アガロースゲル電気泳動して、Ｋ５６
２β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ由来のバンドと、スタン
ダードＲＮＡ由来のバンドの比をデンシトメトリー法に
より解析し、２本のバンドの発光強度の比を求める。か
くして、Ｋ５６２のβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ量を定量
できる。
イマー及びアンチセンスプライマーを加えてＰＣＲ法に
より増幅し、３％アガロースゲル電気泳動して、Ｋ５６
２β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ由来のバンドと、スタン
ダードＲＮＡ由来のバンドの比をデンシトメトリー法に
より解析し、２本のバンドの発光強度の比を求める。か
くして、Ｋ５６２のβ−ａｃｔｉｎ・ｍＲＮＡ量を定量
できる。
【００４３】本発明に係わる、補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法
により補正されたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量を測定す
る方法は、次の通り実施される。即ち、まず、前記競合
ＲＴ−ＰＣＲ法で得られたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの値
を、同競合ＲＴ−ＰＣＲ法で得られたヒトβ−ａｃｔｉ
ｎ・ｍＲＮＡの値で除算して、ＷＴ１・ｍＲＮＡの発現
量比を得る。次いで、健常人から末梢血を採取し、単核
球を分取し、ＲＮＡを抽出後、トータルＲＮＡ１μｇを
用いてβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現量を測定し、健
常人からの単核球におけるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ
発現平均値を算出する。この平均値を、前記で得られた
ＷＴ１・ｍＲＮＡの発現量比に乗算して、ＷＴ１・ｍＲ
ＮＡ発現量補正値を得る。かくして得られる補正値が、
本発明補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法により得られる所望のヒ
トＷＴ１・ｍＲＮＡ発現の発現量である。
により補正されたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量を測定す
る方法は、次の通り実施される。即ち、まず、前記競合
ＲＴ−ＰＣＲ法で得られたヒトＷＴ１・ｍＲＮＡの値
を、同競合ＲＴ−ＰＣＲ法で得られたヒトβ−ａｃｔｉ
ｎ・ｍＲＮＡの値で除算して、ＷＴ１・ｍＲＮＡの発現
量比を得る。次いで、健常人から末梢血を採取し、単核
球を分取し、ＲＮＡを抽出後、トータルＲＮＡ１μｇを
用いてβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現量を測定し、健
常人からの単核球におけるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ
発現平均値を算出する。この平均値を、前記で得られた
ＷＴ１・ｍＲＮＡの発現量比に乗算して、ＷＴ１・ｍＲ
ＮＡ発現量補正値を得る。かくして得られる補正値が、
本発明補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法により得られる所望のヒ
トＷＴ１・ｍＲＮＡ発現の発現量である。
【００４４】かかる本発明方法に従えば、従来法では得
られなかった正確なヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量が得ら
れる。即ち、従来法に従えば、発現量比（ＷＴ１／β−
アクチン）が得られるのみであり、これによるサンプル
間の相対的比較しか行ない得なかったのに対し、本発明
方法によれば、検体中の絶対的ＷＴ１・ｍＲＮＡ値が正
確に定量できるのである。
られなかった正確なヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量が得ら
れる。即ち、従来法に従えば、発現量比（ＷＴ１／β−
アクチン）が得られるのみであり、これによるサンプル
間の相対的比較しか行ない得なかったのに対し、本発明
方法によれば、検体中の絶対的ＷＴ１・ｍＲＮＡ値が正
確に定量できるのである。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、白血病、固型癌の診断
及び骨髄移植の時期の決定等に有効な、ヒトＷＴ１・ｍ
ＲＮＡ発現の定量測定法が提供される。また本発明によ
れば、ヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード、
該スタンダードのためのＲＮＡに対応するＤＮＡ断片、
これを保有するプラスミド、之等を用いるヒトＷＴ１・
ｍＲＮＡの定量法、並びにヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲ
ＮＡ競合定量用スタンダード、該スタンダードのための
ＲＮＡに対応するＤＮＡ断片、これを保有するプラスミ
ド、之等を用いるヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定
量法も提供される。
及び骨髄移植の時期の決定等に有効な、ヒトＷＴ１・ｍ
ＲＮＡ発現の定量測定法が提供される。また本発明によ
れば、ヒトＷＴ１・ｍＲＮＡ競合定量用スタンダード、
該スタンダードのためのＲＮＡに対応するＤＮＡ断片、
これを保有するプラスミド、之等を用いるヒトＷＴ１・
ｍＲＮＡの定量法、並びにヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲ
ＮＡ競合定量用スタンダード、該スタンダードのための
ＲＮＡに対応するＤＮＡ断片、これを保有するプラスミ
ド、之等を用いるヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定
量法も提供される。
【００４６】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例をあげる。
例をあげる。
【００４７】
【実施例１】ＷＴ１スタンダードによるＷＴ１・ｍＲＮ
Ａの定量 １−１．プライマーの調製 本例において用いたプライマーＦＷＴ１ＳＴＤ、ＲＷＴ
１ＳＴＤ、ＷＴ１−ＲＴ、ＷＴ１−Ｆ及びＷＴ１−Ｒの
塩基配列をそれぞれ配列番号：３、４、５、６及び７に
示す。
Ａの定量 １−１．プライマーの調製 本例において用いたプライマーＦＷＴ１ＳＴＤ、ＲＷＴ
１ＳＴＤ、ＷＴ１−ＲＴ、ＷＴ１−Ｆ及びＷＴ１−Ｒの
塩基配列をそれぞれ配列番号：３、４、５、６及び７に
示す。
【００４８】配列番号：５に示す配列のＷＴ１−ＲＴ
は、逆転写反応用のプライマーであり、ヒトＷＴ１・ｍ
ＲＮＡ〔Gessler, M., et al., Homozygous deletion i
n Wilms tumors of a zinc-finger gene identified by
chromosome jumping, Nature., 343 (6260), 774-778
(1990)〕の１８０１−１７８０の配列に相当する。
は、逆転写反応用のプライマーであり、ヒトＷＴ１・ｍ
ＲＮＡ〔Gessler, M., et al., Homozygous deletion i
n Wilms tumors of a zinc-finger gene identified by
chromosome jumping, Nature., 343 (6260), 774-778
(1990)〕の１８０１−１７８０の配列に相当する。
【００４９】配列番号：６及び７に示す配列のＷＴ１−
Ｆ及びＷＴ１−Ｒは、ＰＣＲ用のプライマーであり、そ
れぞれ同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１３１９−１３３９及び１
７１０−１７３０の配列に相当する。
Ｆ及びＷＴ１−Ｒは、ＰＣＲ用のプライマーであり、そ
れぞれ同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１３１９−１３３９及び１
７１０−１７３０の配列に相当する。
【００５０】また配列番号：３及び４に示す配列のＦＷ
Ｔ１ＳＴＤ及びＲＷＴ１ＳＴＤは、共にＤＮＡ断片作成
用のプライマーである。ＦＷＴ１ＳＴＤ（配列番号：
３）の５’末端の１番目から２１番目は、同ＷＴ１・ｍ
ＲＮＡの１３１９−１３３９に相当し、２２番目から４
２番目は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１３８８−１４０８に
相当し、４３番目から６９番目は、ＨＢＶ・ＤＮＡ〔Ko
bayashi, M., et al., Complete nucleotide sequence
of hepatitis B virus DNA of subtype adr andits con
served gene organization, Gene., 30, 227-232 (198
4)〕の１９０３−１９２９の配列に相当する。
Ｔ１ＳＴＤ及びＲＷＴ１ＳＴＤは、共にＤＮＡ断片作成
用のプライマーである。ＦＷＴ１ＳＴＤ（配列番号：
３）の５’末端の１番目から２１番目は、同ＷＴ１・ｍ
ＲＮＡの１３１９−１３３９に相当し、２２番目から４
２番目は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１３８８−１４０８に
相当し、４３番目から６９番目は、ＨＢＶ・ＤＮＡ〔Ko
bayashi, M., et al., Complete nucleotide sequence
of hepatitis B virus DNA of subtype adr andits con
served gene organization, Gene., 30, 227-232 (198
4)〕の１９０３−１９２９の配列に相当する。
【００５１】また、ＲＷＴ１ＳＴＤ（配列番号：４）の
５’末端の１番目から２２番目は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡ
の１７８０−１８０１に相当し、２３番目から４３番目
は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１７１０−１７３０に相当
し、４４番目から７０番目は、同ＨＢＶ・ＤＮＡの１８
３１−１８５７の配列に相当する。
５’末端の１番目から２２番目は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡ
の１７８０−１８０１に相当し、２３番目から４３番目
は、同ＷＴ１・ｍＲＮＡの１７１０−１７３０に相当
し、４４番目から７０番目は、同ＨＢＶ・ＤＮＡの１８
３１−１８５７の配列に相当する。
【００５２】１−２．ＤＮＡ断片の調製 ＤＮＡ断片の調製のための鋳型となるＨＢＶ・ＤＮＡを
Ｂ型肝炎患者の血清から抽出した。即ち、血清１０μｌ
に０．２Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ加え、３７℃で１５分
間インキュベートした後、０．２Ｍ ＨＣｌを１０μｌ
加えたものをＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液とした。
Ｂ型肝炎患者の血清から抽出した。即ち、血清１０μｌ
に０．２Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ加え、３７℃で１５分
間インキュベートした後、０．２Ｍ ＨＣｌを１０μｌ
加えたものをＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液とした。
【００５３】上記ＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液５μｌを鋳型と
し、ＦＷＴ１ＳＴＤとＲＷＴ１ＳＴＤをプライマーとし
て、ＡｍｐＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用
い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分
間、５８℃で１分間及び７２℃で２分間のサイクルを３
５回行った。
し、ＦＷＴ１ＳＴＤとＲＷＴ１ＳＴＤをプライマーとし
て、ＡｍｐＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用
い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分
間、５８℃で１分間及び７２℃で２分間のサイクルを３
５回行った。
【００５４】上記で増幅された１８４ｂｐのＷＴ１ＨＢ
Ｖ断片を、３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切
り出して精製し、クローニングベクターｐＣＲII（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした後、ＥｃｏＲ
Ｉでインサートを切り出し、クローニングベクターｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして、所望
の組換えプラスミドｐＷＴ１を得た。
Ｖ断片を、３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切
り出して精製し、クローニングベクターｐＣＲII（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした後、ＥｃｏＲ
Ｉでインサートを切り出し、クローニングベクターｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして、所望
の組換えプラスミドｐＷＴ１を得た。
【００５５】かくして得られたプラスミドｐＷＴ１を用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒
造社）を形質転換して、ＯＡＬ７７７７細胞を得た。
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒
造社）を形質転換して、ＯＡＬ７７７７細胞を得た。
【００５６】この細胞を５０μｇ／ｍｌとなるようにア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、ＯＡＬ７７７
７細胞を単離し、大量培養によって２．５ｍｇのｐＷＴ
１を回収した。
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、ＯＡＬ７７７
７細胞を単離し、大量培養によって２．５ｍｇのｐＷＴ
１を回収した。
【００５７】上記で得られたｐＷＴ１の制限酵素地図を
図１に示す。
図１に示す。
【００５８】図中、枠で囲んだ部分（カラム）がＲＮＡ
スタンダードとして転写される部分であり、白カラムは
挿入されたＤＮＡ断片部分を、黒カラムはクローニング
ベクターｐＣＲIIのマルチクローニングサイトの一部分
を、斜線を付したカラムはＴ７プロモーター領域と発現
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+のマルチクロ
ーニングサイトの一部分を、実線はベクター ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+部分をそれぞれ示す。
スタンダードとして転写される部分であり、白カラムは
挿入されたＤＮＡ断片部分を、黒カラムはクローニング
ベクターｐＣＲIIのマルチクローニングサイトの一部分
を、斜線を付したカラムはＴ７プロモーター領域と発現
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+のマルチクロ
ーニングサイトの一部分を、実線はベクター ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+部分をそれぞれ示す。
【００５９】１−３．ＲＮＡスタンダードの調製 ＲＮＡスタンダードの調製は、大腸菌のバクテリオファ
ージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い、
ｐＷＴ１のＴ７プロモーターの下流に挿入したＤＮＡ断
片を鋳型として、次の通り行われた。
ージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い、
ｐＷＴ１のＴ７プロモーターの下流に挿入したＤＮＡ断
片を鋳型として、次の通り行われた。
【００６０】即ち、５０μｇのｐＷＴ１に挿入した競合
ＤＮＡ断片の下流にあるＢａｍＨＩサイトを、５０ユニ
ットのＢａｍＨＩで一夜消化させてｐＷＴ１を直鎖ＤＮ
Ａとし、フェノール・クロロホルム抽出により精製し
た。この操作により、７５０．５μｇ／ｍｌの直鎖ｐＷ
Ｔ１を１００μｌ回収した。
ＤＮＡ断片の下流にあるＢａｍＨＩサイトを、５０ユニ
ットのＢａｍＨＩで一夜消化させてｐＷＴ１を直鎖ＤＮ
Ａとし、フェノール・クロロホルム抽出により精製し
た。この操作により、７５０．５μｇ／ｍｌの直鎖ｐＷ
Ｔ１を１００μｌ回収した。
【００６１】上記で得られた溶液１μｌ（７５０．５ｎ
ｇ）に、２μｌの１０×ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（４
００ｍＭトリス、６０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウム及び２０ｍＭ塩酸スペルミジン、ｐＨ
７．５）、９μｌの滅菌蒸留水、それぞれ１μｌの２０
０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、１
０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＧＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＵＴＰ及び４０ユニット／μｌ ＲＮａ
ｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を順次加え、３
７℃で６０分間反応させた。次に、この溶液に５ｍｇ／
ｍｌ ＤＮａｓｅＩを１μｌ加え、３７℃で１５分間反
応させ、フェノール抽出により精製して、最終的に１９
５．３ｍｇ／ｍｌのスタンダードＲＮＡ溶液を調製し
た。
ｇ）に、２μｌの１０×ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（４
００ｍＭトリス、６０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウム及び２０ｍＭ塩酸スペルミジン、ｐＨ
７．５）、９μｌの滅菌蒸留水、それぞれ１μｌの２０
０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、１
０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＧＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＵＴＰ及び４０ユニット／μｌ ＲＮａ
ｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を順次加え、３
７℃で６０分間反応させた。次に、この溶液に５ｍｇ／
ｍｌ ＤＮａｓｅＩを１μｌ加え、３７℃で１５分間反
応させ、フェノール抽出により精製して、最終的に１９
５．３ｍｇ／ｍｌのスタンダードＲＮＡ溶液を調製し
た。
【００６２】このスタンダード溶液は、３００ｎｔのＲ
ＮＡからなることから、１．１×１０15コピー／μｌに
相当する。
ＮＡからなることから、１．１×１０15コピー／μｌに
相当する。
【００６３】上記ＲＮＡスタンダード溶液を０．２ｍｇ
／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社）溶液で希釈して、１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの各溶液を調製して、Ｒ
ＮＡスタンダード系列を得た。
／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社）溶液で希釈して、１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの各溶液を調製して、Ｒ
ＮＡスタンダード系列を得た。
【００６４】１−４．ＲＮＡスタンダードによるＷＴ１
・ｍＲＮＡの定量 １−３で調製したＲＮＡスタンダード系列を用いて、培
養細胞Ｋ５６２におけるＷＴ１・ｍＲＮＡを以下の通り
競合定量した。
・ｍＲＮＡの定量 １−３で調製したＲＮＡスタンダード系列を用いて、培
養細胞Ｋ５６２におけるＷＴ１・ｍＲＮＡを以下の通り
競合定量した。
【００６５】即ち、Ｋ５６２細胞よりＡＧＰＣ法によっ
てＲＮＡを抽出した。即ち、Ｋ５６２細胞にＤ液（４Ｍ
グアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７．０）５００μｌを加え、酢酸ナトリウ
ム５０μｌ、水飽和フェノール４５０μｌ及びクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）１００μｌを
順次添加し、１０分間激しく混和した。速やかに１５分
間氷冷し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上層を新しいチューブにとり、イソプロパノール５
００μｌをこれに加えた。転倒混和後、−８０℃で１０
分間冷却し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上清を取り除き、真空デシケーターにて吸引乾燥
し、これに滅菌蒸留水を適量加え、沈殿を溶解してトー
タルＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０での吸光度を測定し、
トータルＲＮＡ濃度を定量した。
てＲＮＡを抽出した。即ち、Ｋ５６２細胞にＤ液（４Ｍ
グアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７．０）５００μｌを加え、酢酸ナトリウ
ム５０μｌ、水飽和フェノール４５０μｌ及びクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）１００μｌを
順次添加し、１０分間激しく混和した。速やかに１５分
間氷冷し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上層を新しいチューブにとり、イソプロパノール５
００μｌをこれに加えた。転倒混和後、−８０℃で１０
分間冷却し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上清を取り除き、真空デシケーターにて吸引乾燥
し、これに滅菌蒸留水を適量加え、沈殿を溶解してトー
タルＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０での吸光度を測定し、
トータルＲＮＡ濃度を定量した。
【００６６】次いで、トータルＲＮＡを４本のチューブ
にそれぞれ０．２５μｇずつサンプリングし、それぞれ
に１０1コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０5コピ
ー／μｌ及び１０7コピー／μｌのＲＮＡスタンダード
系列を１μｌずつ及び１０ｐｍｏｌ／μｌのＷＴ１−Ｒ
Ｔプライマー１μｌずつを添加した後、全量が７μｌに
なるように滅菌蒸留水を加えた。８０℃で５分間加温し
て直ちに氷中で冷却し、逆転写酵素溶液８μｌを添加し
て３７℃で６０分間反応させた。反応後、９５℃にて５
分間加温して逆転写酵素を失活させてｃＤＮＡ溶液とし
た。
にそれぞれ０．２５μｇずつサンプリングし、それぞれ
に１０1コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０5コピ
ー／μｌ及び１０7コピー／μｌのＲＮＡスタンダード
系列を１μｌずつ及び１０ｐｍｏｌ／μｌのＷＴ１−Ｒ
Ｔプライマー１μｌずつを添加した後、全量が７μｌに
なるように滅菌蒸留水を加えた。８０℃で５分間加温し
て直ちに氷中で冷却し、逆転写酵素溶液８μｌを添加し
て３７℃で６０分間反応させた。反応後、９５℃にて５
分間加温して逆転写酵素を失活させてｃＤＮＡ溶液とし
た。
【００６７】得られた各ｃＤＮＡ溶液から３μｌを別の
チューブにとり、２０ｐｍｏｌ／μｌのＷＴ１−Ｆプラ
イマーとＷＴ１−Ｒプライマーをそれぞれ１μｌずつ用
い、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ社）を用い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は、
９４℃で１２分間加温した後、９４℃で１分間、６５℃
で２分間のサイクルを４０回行った。
チューブにとり、２０ｐｍｏｌ／μｌのＷＴ１−Ｆプラ
イマーとＷＴ１−Ｒプライマーをそれぞれ１μｌずつ用
い、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ社）を用い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は、
９４℃で１２分間加温した後、９４℃で１分間、６５℃
で２分間のサイクルを４０回行った。
【００６８】得られた各反応液１０μｌにつき３％アガ
ロースゲル電気泳動を行った。その結果を図２に示す。
ロースゲル電気泳動を行った。その結果を図２に示す。
【００６９】該図２に示される４１２ｂｐのバンドはＫ
５６２のＷＴ１・ｍＲＮＡ由来のものであり、１６２ｂ
ｐのバンドは、添加したスタンダードＲＮＡ由来のもの
である。
５６２のＷＴ１・ｍＲＮＡ由来のものであり、１６２ｂ
ｐのバンドは、添加したスタンダードＲＮＡ由来のもの
である。
【００７０】之等４１２ｂｐと１６２ｂｐのバンドが明
瞭に認められるＲＮＡスタンダード系列の１０7コピー
／μｌを添加したレーンを、ビデオデンシトメータＴＩ
ＡＳ−２３００Ｓ（ＡＣＩジャパン社）を用いて、デン
シトメトリー法〔真鍋敬、生物物理化学、26(4), 321(1
982)〕により解析して、２本のバンドの発光強度の比を
求めた。これは映像をビデオカメラを用いて５１２Ｘ５
１２画素、２５６階調の濃度データとして、画像処理装
置ＴＩＡＳ−２３００Ｓにて取り込み、パソコンＰＣ９
８００で演算処理して画像上のスポットの定量を行った
ものである。
瞭に認められるＲＮＡスタンダード系列の１０7コピー
／μｌを添加したレーンを、ビデオデンシトメータＴＩ
ＡＳ−２３００Ｓ（ＡＣＩジャパン社）を用いて、デン
シトメトリー法〔真鍋敬、生物物理化学、26(4), 321(1
982)〕により解析して、２本のバンドの発光強度の比を
求めた。これは映像をビデオカメラを用いて５１２Ｘ５
１２画素、２５６階調の濃度データとして、画像処理装
置ＴＩＡＳ−２３００Ｓにて取り込み、パソコンＰＣ９
８００で演算処理して画像上のスポットの定量を行った
ものである。
【００７１】上記より、Ｋ５６２のＷＴ１・ｍＲＮＡ量
は、７．７７Ｘ１０6コピー／ｍｌと計算された。この
結果より、ＷＴ１・ｍＲＮＡの定量が可能となった。
は、７．７７Ｘ１０6コピー／ｍｌと計算された。この
結果より、ＷＴ１・ｍＲＮＡの定量が可能となった。
【００７２】
【実施例２】β−ａｃｔｉｎスタンダードによるＷＴ１
・ｍＲＮＡの定量 ２−１．プライマーの調製 本例において用いたプライマーＦＡＣＴＳＴＤ、ＲＡＣ
ＴＳＴＤ、ＡＣＴ−ＲＴ、ＡＣＴ−Ｆ及びＡＣＴ−Ｒの
塩基配列を配列番号：８、９、１０、１１及び１２に示
す。
・ｍＲＮＡの定量 ２−１．プライマーの調製 本例において用いたプライマーＦＡＣＴＳＴＤ、ＲＡＣ
ＴＳＴＤ、ＡＣＴ−ＲＴ、ＡＣＴ−Ｆ及びＡＣＴ−Ｒの
塩基配列を配列番号：８、９、１０、１１及び１２に示
す。
【００７３】配列番号：１０に示す配列のＡＣＴ−ＲＴ
は、逆転写反応用のプライマーであり、ヒトβ−ａｃｔ
ｉｎ・ｍＲＮＡ〔Ponte, P., et al., Evolutionary co
nservation in the untranslated regions of actin mR
NAs: DNA sequence of a human beta-actin cDNA, Nucl
eic Acid Res., 12(3), 1687-1696 (1984)〕の６８３−
６５９の配列に相当する。
は、逆転写反応用のプライマーであり、ヒトβ−ａｃｔ
ｉｎ・ｍＲＮＡ〔Ponte, P., et al., Evolutionary co
nservation in the untranslated regions of actin mR
NAs: DNA sequence of a human beta-actin cDNA, Nucl
eic Acid Res., 12(3), 1687-1696 (1984)〕の６８３−
６５９の配列に相当する。
【００７４】配列番号：１１及び１２に示す配列のＡＣ
Ｔ−Ｆ及びＡＣＴ−Ｒは、ＰＣＲ用のプライマーであ
り、それぞれ同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの１４４−
１６３及び６１６−６３６の配列に相当する。
Ｔ−Ｆ及びＡＣＴ−Ｒは、ＰＣＲ用のプライマーであ
り、それぞれ同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの１４４−
１６３及び６１６−６３６の配列に相当する。
【００７５】また、配列番号：８及び９に示す配列のＦ
ＡＣＴＳＴＤ及びＲＡＣＴＳＴＤは、共にＤＮＡ断片作
成用のプライマーであり、ＦＡＣＴＳＴＤ（配列番号：
８）の５’末端の１番目から２０番目は、同β−ａｃｔ
ｉｎ ・ｍＲＮＡの１４４−１６３に相当し、２１番目
から４０番目は、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの３８
２−４０１に相当し、４１番目から６４番目は、ＨＢＶ
・ＤＮＡの１７４２−１７６５の配列に相当する。ま
た、ＲＡＣＴＳＴＤ（配列番号：９）の５’末端の１番
目から２５番目は、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの６
５９−６８３に相当し、２６番目から４６番目は、同β
−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの６１６−６３６に相当し、
４７番目から６７番目は、同ＨＢＶ・ＤＮＡの１８３２
−１８５２の配列に相当する。
ＡＣＴＳＴＤ及びＲＡＣＴＳＴＤは、共にＤＮＡ断片作
成用のプライマーであり、ＦＡＣＴＳＴＤ（配列番号：
８）の５’末端の１番目から２０番目は、同β−ａｃｔ
ｉｎ ・ｍＲＮＡの１４４−１６３に相当し、２１番目
から４０番目は、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの３８
２−４０１に相当し、４１番目から６４番目は、ＨＢＶ
・ＤＮＡの１７４２−１７６５の配列に相当する。ま
た、ＲＡＣＴＳＴＤ（配列番号：９）の５’末端の１番
目から２５番目は、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの６
５９−６８３に相当し、２６番目から４６番目は、同β
−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの６１６−６３６に相当し、
４７番目から６７番目は、同ＨＢＶ・ＤＮＡの１８３２
−１８５２の配列に相当する。
【００７６】２−２．ＤＮＡ断片の調製 ＤＮＡ断片の調製のための鋳型となるＨＢＶ・ＤＮＡを
Ｂ型肝炎患者の血清から抽出した。即ち、血清１０μｌ
に０．２Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ加え、３７℃で１５分
間インキュベートした後、０．２Ｍ ＨＣｌを１０μｌ
加えたものをＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液とした。
Ｂ型肝炎患者の血清から抽出した。即ち、血清１０μｌ
に０．２Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ加え、３７℃で１５分
間インキュベートした後、０．２Ｍ ＨＣｌを１０μｌ
加えたものをＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液とした。
【００７７】上記ＨＢＶ・ＤＮＡ抽出液５μｌを鋳型と
し、ＦＡＣＴＳＴＤとＲＡＣＴＳＴＤをプライマーとし
て、ＡｍｐＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用
い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃で１分間、
５８℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３５回行
った。
し、ＦＡＣＴＳＴＤとＲＡＣＴＳＴＤをプライマーとし
て、ＡｍｐＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用
い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃で１分間、
５８℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３５回行
った。
【００７８】上記で増幅された１９７ｂｐのＡＣＴＨＢ
Ｖ断片を、３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切
り出して精製し、クローニングベクター ｐＣＲII（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした後、Ｅｃｏ
ＲＩでインサートを切り出し、クローニングベクターｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして、所望
の組換えプラスミドｐＡＣＴを得た。
Ｖ断片を、３％アガロースゲル電気泳動後、ゲルより切
り出して精製し、クローニングベクター ｐＣＲII（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした後、Ｅｃｏ
ＲＩでインサートを切り出し、クローニングベクターｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングして、所望
の組換えプラスミドｐＡＣＴを得た。
【００７９】かくして得られたプラスミドｐＡＣＴを用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒
造社）を形質転換し、ＯＡＬ８８８８細胞を得た。
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒
造社）を形質転換し、ＯＡＬ８８８８細胞を得た。
【００８０】この細胞を５０μｇ／ｍｌとなるようにア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、ＯＡＬ８８８
８細胞を単離し、大量培養によって１．６ｍｇのｐＡＣ
Ｔを回収した。
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、ＯＡＬ８８８
８細胞を単離し、大量培養によって１．６ｍｇのｐＡＣ
Ｔを回収した。
【００８１】上記で得られたｐＡＣＴの制限酵素地図を
図３に示す。
図３に示す。
【００８２】図中、枠で囲んだ部分（カラム）がＲＮＡ
スタンダードとして転写される部分であり、白カラムは
挿入されたＤＮＡ断片部分を、黒カラムはクローニング
ベクターｐＣＲIIのマルチクローニングサイトの一部分
を、斜線を付したカラムはＴ７プロモーター領域と発現
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+のマルチクロ
ーニングサイトの一部分を、実線はベクター ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+部分をそれぞれ示す。
スタンダードとして転写される部分であり、白カラムは
挿入されたＤＮＡ断片部分を、黒カラムはクローニング
ベクターｐＣＲIIのマルチクローニングサイトの一部分
を、斜線を付したカラムはＴ７プロモーター領域と発現
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+のマルチクロ
ーニングサイトの一部分を、実線はベクター ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ+部分をそれぞれ示す。
【００８３】２−３．ＲＮＡスタンダードの調製 ＲＮＡスタンダードの調製は、大腸菌のバクテリオファ
ージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、ｐＡＣＴのＴ７プロモーターの下流に挿入したＤＮ
Ａ断片を鋳型として次の通り行われた。
ージＴ７由来のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、ｐＡＣＴのＴ７プロモーターの下流に挿入したＤＮ
Ａ断片を鋳型として次の通り行われた。
【００８４】即ち、５０μｇのｐＡＣＴに挿入したＤＮ
Ａ断片の下流にあるＢａｍＨＩサイトを、５０ユニット
のＢａｍＨＩで一夜消化させてｐＡＣＴを直鎖ＤＮＡと
し、フェノール・クロロホルム抽出により精製した。こ
の操作により、４６７．４μｇ／ｍｌの直鎖ｐＡＣＴを
１００μｌ回収した。
Ａ断片の下流にあるＢａｍＨＩサイトを、５０ユニット
のＢａｍＨＩで一夜消化させてｐＡＣＴを直鎖ＤＮＡと
し、フェノール・クロロホルム抽出により精製した。こ
の操作により、４６７．４μｇ／ｍｌの直鎖ｐＡＣＴを
１００μｌ回収した。
【００８５】上記で得られた溶液１μｌ（４６７．４ｎ
ｇ）に、２μｌの１０×ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（４
００ｍＭトリス、６０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウム及び２０ｍＭ塩酸スペルミジン、ｐＨ
７．５）、９μｌの滅菌蒸留水、それぞれ１μｌの２０
０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、１
０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＧＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＵＴＰ、４０ユニット／μｌ ＲＮａｓ
ｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を順次加え、３７
℃で６０分間反応させた。次に、この溶液に５ｍｇ／ｍ
ｌ ＤＮａｓｅＩを１μｌ加え、３７℃で１５分間反応
させ、フェノール抽出により精製して、最終的に８９．
９ｍｇ／ｍｌのスタンダードＲＮＡ溶液を調製した。
ｇ）に、２μｌの１０×ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（４
００ｍＭトリス、６０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
塩化ナトリウム及び２０ｍＭ塩酸スペルミジン、ｐＨ
７．５）、９μｌの滅菌蒸留水、それぞれ１μｌの２０
０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、１
０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＧＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＵＴＰ、４０ユニット／μｌ ＲＮａｓ
ｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を順次加え、３７
℃で６０分間反応させた。次に、この溶液に５ｍｇ／ｍ
ｌ ＤＮａｓｅＩを１μｌ加え、３７℃で１５分間反応
させ、フェノール抽出により精製して、最終的に８９．
９ｍｇ／ｍｌのスタンダードＲＮＡ溶液を調製した。
【００８６】このスタンダード溶液は、３１３ｎｔのＲ
ＮＡからなることから４．９×１０14コピー／μｌに相
当する。
ＮＡからなることから４．９×１０14コピー／μｌに相
当する。
【００８７】上記ＲＮＡスタンダード溶液を０．２ｍｇ
／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社）溶液で希釈して、１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの各溶液を調製して、Ｒ
ＮＡスタンダード系列を得た。
／ｍｌウシ胸腺ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社）溶液で希釈して、１０1コピー／μ
ｌ、１０2コピー／μｌ、１０3コピー／μｌ、１０4コ
ピー／μｌ、１０5コピー／μｌ、１０6コピー／μｌ、
１０7コピー／μｌ、１０8コピー／μｌ、１０9コピー
／μｌ及び１０10コピー／μｌの各溶液を調製して、Ｒ
ＮＡスタンダード系列を得た。
【００８８】２−４．ＲＮＡスタンダードによるβ−ａ
ｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定量 ２−３で調製したＲＮＡスタンダード系列を用いて、培
養細胞Ｋ５６２におけるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを
以下の通り競合定量した。
ｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定量 ２−３で調製したＲＮＡスタンダード系列を用いて、培
養細胞Ｋ５６２におけるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを
以下の通り競合定量した。
【００８９】即ち、Ｋ５６２細胞よりＡＧＰＣ法によっ
てＲＮＡを抽出した。即ち、Ｋ５６２細胞にＤ液（４Ｍ
グアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７．０）５００μｌを加え、酢酸ナトリウ
ム５０μｌ、水飽和フェノール４５０μｌ及びクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）１００μｌを
順次添加し、１０分間激しく混和した。速やかに１５分
間氷冷し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上層を新しいチューブにとり、イソプロパノール５
００μｌをこれに加えた。転倒混和後、−８０℃で１０
分間冷却し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上清を取り除き、真空デシケーターにて吸引乾燥
し、これに滅菌蒸留水を適量加え、沈殿を溶解しトータ
ルＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０での吸光度を測定して、
トータルＲＮＡ濃度を定量した。
てＲＮＡを抽出した。即ち、Ｋ５６２細胞にＤ液（４Ｍ
グアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．５％ザルコシル、０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７．０）５００μｌを加え、酢酸ナトリウ
ム５０μｌ、水飽和フェノール４５０μｌ及びクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（４９：１）１００μｌを
順次添加し、１０分間激しく混和した。速やかに１５分
間氷冷し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上層を新しいチューブにとり、イソプロパノール５
００μｌをこれに加えた。転倒混和後、−８０℃で１０
分間冷却し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）し
て、上清を取り除き、真空デシケーターにて吸引乾燥
し、これに滅菌蒸留水を適量加え、沈殿を溶解しトータ
ルＲＮＡ溶液とし、ＯＤ２６０での吸光度を測定して、
トータルＲＮＡ濃度を定量した。
【００９０】次いで、トータルＲＮＡを３本のチューブ
にそれぞれ０．２５μｇずつサンプリングし、それぞれ
に１０3コピー／μｌ、１０5コピー／μｌ及び１０7コ
ピー／μｌのＲＮＡスタンダード系列を１μｌずつと、
１０ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴ−ＲＴプライマーを１μｌ
添加した後、全量が７μｌになるように滅菌蒸留水を加
えた。８０℃で５分間加温して直ちに氷中で冷却し、逆
転写酵素溶液８μｌを添加して３７℃で６０分間反応さ
せた。反応後、９５℃にて５分間加温して逆転写酵素を
失活させてｃＤＮＡ溶液とした。
にそれぞれ０．２５μｇずつサンプリングし、それぞれ
に１０3コピー／μｌ、１０5コピー／μｌ及び１０7コ
ピー／μｌのＲＮＡスタンダード系列を１μｌずつと、
１０ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴ−ＲＴプライマーを１μｌ
添加した後、全量が７μｌになるように滅菌蒸留水を加
えた。８０℃で５分間加温して直ちに氷中で冷却し、逆
転写酵素溶液８μｌを添加して３７℃で６０分間反応さ
せた。反応後、９５℃にて５分間加温して逆転写酵素を
失活させてｃＤＮＡ溶液とした。
【００９１】得られた各ｃＤＮＡ溶液から３μｌを別の
チューブにとり、２０ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴ−Ｆプラ
イマーとＡＣＴ−Ｒプライマーをそれぞれ１μｌずつ用
い、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ社）を用い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は９
４℃で１２分間加温した後、９４℃で１分間、６５℃で
２分間のサイクルを３５回行った。
チューブにとり、２０ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴ−Ｆプラ
イマーとＡＣＴ−Ｒプライマーをそれぞれ１μｌずつ用
い、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ社）を用い、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応は９
４℃で１２分間加温した後、９４℃で１分間、６５℃で
２分間のサイクルを３５回行った。
【００９２】得られた各反応液１０μｌにつき３％アガ
ロースゲル電気泳動を行った。その結果を図４に示す。
ロースゲル電気泳動を行った。その結果を図４に示す。
【００９３】該図４に示される４９３ｂｐのバンドはＫ
５６２のβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ由来のものであ
り、１７６ｂｐのバンドは、添加したスタンダードＲＮ
Ａ由来のものである。
５６２のβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ由来のものであ
り、１７６ｂｐのバンドは、添加したスタンダードＲＮ
Ａ由来のものである。
【００９４】之等４９３ｂｐと１７６ｂｐのバンドが明
瞭に認められるＲＮＡスタンダード系列の１０7コピー
／μｌを添加したレーンを、ビデオデンシトメータＴＩ
ＡＳ−２３００Ｓ（ＡＣＩジャパン社）を用いて、デン
シトメトリー法により解析し、２本のバンドの発光強度
の比を求めた。これは映像をビデオカメラを用いて５１
２Ｘ５１２画素、２５６階調の濃度データとして、画像
処理装置ＴＩＡＳ−２３００Ｓにて取り込み、パソコン
ＰＣ９８００で演算処理して画像上のスポットの定量を
行うことにより求めた。
瞭に認められるＲＮＡスタンダード系列の１０7コピー
／μｌを添加したレーンを、ビデオデンシトメータＴＩ
ＡＳ−２３００Ｓ（ＡＣＩジャパン社）を用いて、デン
シトメトリー法により解析し、２本のバンドの発光強度
の比を求めた。これは映像をビデオカメラを用いて５１
２Ｘ５１２画素、２５６階調の濃度データとして、画像
処理装置ＴＩＡＳ−２３００Ｓにて取り込み、パソコン
ＰＣ９８００で演算処理して画像上のスポットの定量を
行うことにより求めた。
【００９５】上記より、Ｋ５６２のβ−ａｃｔｉｎ・ｍ
ＲＮＡ量は、３．５３×１０6コピー／ｍｌと計算され
た。この結果より、本発明の定量法によるβ−ａｃｔｉ
ｎ・ｍＲＮＡの定量が可能となった。
ＲＮＡ量は、３．５３×１０6コピー／ｍｌと計算され
た。この結果より、本発明の定量法によるβ−ａｃｔｉ
ｎ・ｍＲＮＡの定量が可能となった。
【００９６】
【実施例３】補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＷＴ１
・ｍＲＮＡの定量 ３−１．ＲＮＡスタンダード系列を用いて得たヒトＷＴ
１ｍＲＮＡの定量 実施例１の１−４．に示したＲＮＡスタンダード系列を
用いて、競合定量法によって培養細胞Ｋ５６２における
ＷＴ１・ｍＲＮＡ量を求めた結果は、７．７７×１０6
コピー／ｍｌと計算された。
・ｍＲＮＡの定量 ３−１．ＲＮＡスタンダード系列を用いて得たヒトＷＴ
１ｍＲＮＡの定量 実施例１の１−４．に示したＲＮＡスタンダード系列を
用いて、競合定量法によって培養細胞Ｋ５６２における
ＷＴ１・ｍＲＮＡ量を求めた結果は、７．７７×１０6
コピー／ｍｌと計算された。
【００９７】３−２．ＲＮＡスタンダード系列を用いて
得たヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定量 実施例２の２−４．に示したＲＮＡスタンダード系列を
用いて、競合定量法によって培養細胞Ｋ５６２における
β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを求めた結果は、３．５３
×１０6コピー／ｍｌと計算された。
得たヒトβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡの定量 実施例２の２−４．に示したＲＮＡスタンダード系列を
用いて、競合定量法によって培養細胞Ｋ５６２における
β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡを求めた結果は、３．５３
×１０6コピー／ｍｌと計算された。
【００９８】３−３．ＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量比の算出 上記ＷＴ１・ｍＲＮＡ定量値７．７７×１０6コピー／
ｍｌを、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ定量値３．５３
×１０6コピー／ｍｌで除算し、内部標準物質であるβ
−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現に対するＷＴ１・ｍＲＮ
Ａの発現量比２．２０を算出した。
ｍｌを、同β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ定量値３．５３
×１０6コピー／ｍｌで除算し、内部標準物質であるβ
−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現に対するＷＴ１・ｍＲＮ
Ａの発現量比２．２０を算出した。
【００９９】３−４．健常人単核球におけるβ−ａｃｔ
ｉｎ ・ｍＲＮＡ発現量の平均値の設定 ３９人の健常人から末梢血を採取した後、Ｆｉｃｏｌｌ
Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い単核球を
分取し、実施例１の１−１．と同様にしてＲＮＡを抽出
後、トータルＲＮＡ１μｇを用いて、β−ａｃｔｉｎ
・ｍＲＮＡ発現量を算出し、３９人の健常人単核球にお
けるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現平均値１０6.86コ
ピー／μｇ−トータルＲＮＡと変動係数１．７５％を得
た。
ｉｎ ・ｍＲＮＡ発現量の平均値の設定 ３９人の健常人から末梢血を採取した後、Ｆｉｃｏｌｌ
Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い単核球を
分取し、実施例１の１−１．と同様にしてＲＮＡを抽出
後、トータルＲＮＡ１μｇを用いて、β−ａｃｔｉｎ
・ｍＲＮＡ発現量を算出し、３９人の健常人単核球にお
けるβ−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現平均値１０6.86コ
ピー／μｇ−トータルＲＮＡと変動係数１．７５％を得
た。
【０１００】３−５． ＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量補正値
の算出 上記３−３．で算出したＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量比２．
２０に、上記３−４．で算出した健常人単核球における
β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現平均値１０6.86コピー
／μｇ−トータルＲＮＡ を乗算することにより、Ｋ５
６２におけるＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量補正値は、９．４
４×１０6コピー／μｇ−トータルＲＮＡであると定量
することができた。
の算出 上記３−３．で算出したＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量比２．
２０に、上記３−４．で算出した健常人単核球における
β−ａｃｔｉｎ ・ｍＲＮＡ発現平均値１０6.86コピー
／μｇ−トータルＲＮＡ を乗算することにより、Ｋ５
６２におけるＷＴ１・ｍＲＮＡ発現量補正値は、９．４
４×１０6コピー／μｇ−トータルＲＮＡであると定量
することができた。
【０１０１】
【配列表】 (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Ostuka Pharmaceutical Co., Ltd. (ii) TITLE OF INVENTION: 補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＷＴ１発現 定量法 (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 12 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING REFERENCE: 2107JP (C) FILING DATE: 24-September-1997
【０１０２】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 184 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA to genomic RNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: GGCATCTGAG ACCAGTGAGA AGCTGTCCCA CTTACAGATG CATGGTGAGG TGAACAATGT 60 TCCGGAGACT CTAAGGCCTC CCGATACAGA GCAGAGGCGG TGTCGAGGAG ATCTCGAATA 120 GAAGGAAAGA AGTCAGAAGG CAAACTCCAG CTGGCGCTTT GATGACGAAA GTTCAGACTG 180 AGAG 184
【０１０３】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 197 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA to genomic RNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: GTGGGGCGCC CCAGGCACCA CCAACCGCGA GAAGATGACC GCCTCCAAGC TGTGCCTTGG 60 GTGGCTTTGG GGCATGGACA TTGACCCGTA TAAAGAATTT GGAGCTTCTG TGGAGTTACT 120 CTCTTTTTTG CCTTCTGACT TCTTTCCTTC TTCCTCACCG AGCGCGGCTA CAGGAAATCG 180 TGCGTGACAT TAAGGAC 197
【０１０４】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 69 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: GGCATCTGAG ACCAGTGAGA AGCTGTCCCA CTTACAGATG CATGGTGAGG TGAACAATGT 60 TCCGGAGAC 69
【０１０５】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 70 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: GAGAGTCAGA CTTGAAAGCA GTTCAAAGCG CCAGCTGGAG TTTGCCTTCT GACTTCTTTC 60 CTTCTATTCG 70
【０１０６】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: AGAGTCAGAC TTGAAAGCAG T 21
【０１０７】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: GGCATCTGAG ACCAGTGAGA A 21
【０１０８】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: TCAAAGCGCC AGCTGGAGTT T 21
【０１０９】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 64 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: GTGGGGCGCC CCAGGCACCA CCAACCGCGA GAAGATGACC GCCTCCAAGC TGTGCCTTGG 60 GTGG 64
【０１１０】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 67 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: CTCCTTAATG TCACGCACGA TTTCCTGTAG CCGCGCTCGG TGAGGAAGAA GGAAAGAAGT 60 CAGAAGG 67
【０１１１】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CTCCTTAATG TCACGCACGA TTTCC 25
【０１１２】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: GTGGGGCGCC CCAGGCACCA 20
【０１１３】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: TGTAGCCGCG CTCGGTGAGG A 21
【図１】プラスミドｐＷＴ１の制限酵素地図を示す。
【図２】実施例１の１−４に示す検体ＲＮＡとＷＴ１−
ＲＮＡスタンダードとを用いた競合定量法に従い得られ
る、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳
動結果を示す図面代用写真である。
ＲＮＡスタンダードとを用いた競合定量法に従い得られ
る、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳
動結果を示す図面代用写真である。
【図３】プラスミドｐＡＣＴの制限酵素地図を示す。
【図４】実施例２の２−４に示す検体ＲＮＡとβ−アク
チン−ＲＮＡスタンダードとを用いた競合定量法に従い
得られる、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡのアガロースゲル
電気泳動結果を示す図面代用写真である。
チン−ＲＮＡスタンダードとを用いた競合定量法に従い
得られる、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡのアガロースゲル
電気泳動結果を示す図面代用写真である。
Claims (1)
- 【請求項１】 以下の工程ａ）〜工程ｇ）を含むことを
特徴とする補正競合ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＷＴ１・
ｍＲＮＡの発現量を定量する方法。 ａ）検体ＲＮＡにＷＴ１−ＲＮＡスタンダード希釈系列
下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡを得る工程、 ｂ）該ｃＤＮＡをＷＴ１−センスプライマー及びＷＴ１
−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲで増幅させ、
アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｃ）該電気泳動により得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ由来の
バンド及びＷＴ１−スタンダードＲＮＡ由来のバンドの
発光強度比を測定して検体のＷＴ１・ｍＲＮＡ量を算出
する工程、 ｄ）検体ＲＮＡにβ−アクチン−ＲＮＡスタンダード希
釈系列下に逆転写酵素を競合反応させてｃＤＮＡを得る
工程、 ｅ）該ｃＤＮＡをβ−アクチン−センスプライマー及び
β−アクチン−アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ
で増幅させ、アガロースゲル電気泳動を行なう工程、 ｆ）該電気泳動により得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ
由来のバンド及びβ−アクチン−スタンダードＲＮＡ由
来のバンドの発光強度比を測定して検体のβ−アクチン
・ｍＲＮＡ量を算出する工程、 ｇ）工程ｃ）で得られるＷＴ１・ｍＲＮＡ量値を工程
ｆ）で得られるβ−アクチン・ｍＲＮＡ量値で除算し、
これに健常人のβ−アクチン・ｍＲＮＡ発現量平均値を
乗算して補正する工程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27814297A JPH1189599A (ja) | 1997-09-24 | 1997-09-24 | 補正競合ｒｔ−ｐｃｒ法によるヒトｗｔ１発現定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27814297A JPH1189599A (ja) | 1997-09-24 | 1997-09-24 | 補正競合ｒｔ−ｐｃｒ法によるヒトｗｔ１発現定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189599A true JPH1189599A (ja) | 1999-04-06 |
Family
ID=17593179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27814297A Pending JPH1189599A (ja) | 1997-09-24 | 1997-09-24 | 補正競合ｒｔ−ｐｃｒ法によるヒトｗｔ１発現定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1189599A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006006313A (ja) * | 2004-05-27 | 2006-01-12 | Sumitomo Chemical Co Ltd | コモンマーモセット由来のベータアクチン遺伝子及びその利用 |
| US7063854B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-06-20 | Corixa Corporation | Composition and methods for WTI specific immunotherapy |
| US7115272B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-10-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7144581B2 (en) | 2000-10-09 | 2006-12-05 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7323181B2 (en) | 1998-09-30 | 2008-01-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| US7329410B1 (en) | 1998-09-30 | 2008-02-12 | Corixa Corporation | Compositions and method for WT1 specific immunotherapy |
| US7553494B2 (en) | 2001-08-24 | 2009-06-30 | Corixa Corporation | WT1 fusion proteins |
| WO2014115779A1 (ja) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | 大塚製薬株式会社 | WT1 mRNAの発現量定量方法 |
-
1997
- 1997-09-24 JP JP27814297A patent/JPH1189599A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7662386B2 (en) | 1998-09-30 | 2010-02-16 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
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| US7115272B1 (en) | 1998-09-30 | 2006-10-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
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| WO2014115779A1 (ja) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | 大塚製薬株式会社 | WT1 mRNAの発現量定量方法 |
| US10280467B2 (en) | 2013-01-22 | 2019-05-07 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Quantification method for expression level of WT1 mRNA |
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