JP2003523195A - ジンクフィンガードメイン及びその同定方法 - Google Patents

ジンクフィンガードメイン及びその同定方法

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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Abstract

(57)【要約】 任意の与えられた標的部位を認識するジンクフィンガードメインを同定する生体内選別法を公開する。また、特定部位を認識するジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を公開する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 〔技術分野〕 本発明は、転写因子のようなＤＮＡ−結合タンパク質に関する。
【０００２】 〔従来の技術〕 大部分の遺伝子は、通常プロモーターまたはエンハンサー領域内にある、特定
のＤＮＡ部位に結合するポリペプチド転写因子により転写レベルが調節される。
これらのタンパク質は、プロモーター部位でＲＮＡポリメラーゼにより転写開始
を活性化または抑制し、それにより標的遺伝子の発現を調節する。活性化因子で
あれ抑制因子であれ、多くの転写因子は、構造的にモジュールである。そのよう
なモジュールは、構造的に別個のドメインとして組み合わせ可能であり、ＤＮＡ
結合、二量体化または転写機構（transcriptional machinary）との相互作用の
ような特異的な機能を有する。活性化ドメインまたは抑制ドメインのような効果
ドメインは、非相同のＤＮＡ結合ドメインに転移されても、その機能を維持する
〔Brent and Ptashne、(1985)Cell 43:729-36; Dawson et al.,(1995)Mol. Cell
Biol. 15:6923-31〕。ジンクフィンガードメイン（zinc finger domain）、ホ
メオドメイン（homeodomain）、及びヘリックス−ターン−ヘリックス（helix-t
urn-helix）ドメインを含む多くのＤＮＡ結合ドメインの３次構造がＮＭＲ及び
Ｘ線結晶構造解析データから決定されている。
【０００３】 〔要約〕 本発明は、キメラ転写因子を同定し、製造するための、迅速で大規模な細胞的
方法を提供する。そのような転写因子は、例えば、生物医学及び生物工学的応用
において内生遺伝子の発現を変化させるために使用され得る。転写因子は、生体
内、すなわち、無傷の生細胞内で検査される。また、本発明は、本発明の方法を
、例えばゲノム配列のスクリーニングに適用することにより発見され得る新規核
酸結合ドメインをも含む。
【０００４】 本発明は、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方法に
関する。このような同定方法は本願において「ドメイン選別法」または「生体内
スクリーニング法」ということもある。前記方法は（１）リポーター構築物（re
porter construct）を含有する細胞及び（２）複数のハイブリッド核酸を提供す
ることを含む。リポーター構築物は、プロモーターに作動可能に連結されたリポ
ーター遺伝子を有し、プロモーターは、招集部位（recruitment site）及び標的
部位（target site）を有する。リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーター
の招集部位及び標的部位を全て認識する場合（すなわち、基準を越える程度の結
合時）には所定のレベルを超過して発現するが、転写因子がプロモーターの招集
部位のみを認識する場合にはその限りでない。複数のハイブリッド核酸のそれぞ
れは、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイ
ン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインのような要素を含む非天然のタ
ンパク質をコードする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は、複数
のハイブリッド核酸のメンバー中で互いに異なる。前記選択方法は次を更に含む
：複数のハイブリッド核酸中の一つ以上が一つ以上の細胞に入るようにする条件
下で、複数の核酸を細胞と接触させること；細胞内でハイブリッド核酸が発現で
きるようにする条件で細胞を維持すること；細胞が、標的部位を認識する試験ジ
ンクフィンガードメインをコードするハイブリッド核酸を含むことの指示として
、所定レベル以上にリポーター遺伝子を発現する細胞を同定すること。
【０００５】 ＤＮＡ結合ドメイン、すなわち、招集部位を認識し、複数のハイブリッド構成
員の中で変化しないないドメインは、例えば、一つ、二つ、三つ、またはそれ以
上のジンクフィンガードメインを含むことができる。前記方法に利用される細胞
は原核生物細胞または真核生物細胞であっても良い。真核生物細胞の例には、サ
ッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセ
ス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、または、ピッチア パステウリス（
Pichia pasteuris）のような酵母細胞；Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；及び繊維
芽細胞またはリンパ球のような哺乳動物細胞を挙げることができる。
【０００６】 ここで、「所定レベル（given level）」は、転写因子が招集部位は認識する
が、標的部位は認識しない場合に観察される発現量である。ある場合には、「所
定レベル」は０であっても良い（少なくとも使用される検定法の検出限度内で）
。
【０００７】 前記方法は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ混合物、またはｃＤＮＡ混合物
のような核酸から試験ジンクフィンガードメインをコードする核酸源（source n
ucleic acid）を増幅し、増幅された断片を生産する付加的な工程を含むことが
できる。核酸源はオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができ
る。オリゴヌクレオチドプライマーは、ドメインの保存された境界をコードする
核酸にアニールされる縮重オリゴヌクレオチド（例えば、相異する核酸配列を有
する特定オリゴヌクレオチドのプール、またはイノシンのような非天然の塩基を
有する特定オリゴヌクレオチド）のセット中の一つであり得る。また代替的に、
前記プライマーは特定オリゴヌクレオチドであっても良い。増幅された断片は、
前記方法に使用された複数のハイブリッド核酸に含まれるハイブリッド核酸を生
産するために利用される。
【０００８】 前記方法は、次の工程を更に含むことができる：（ｉ）配列データベース中の
候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を同定すること；（ii）候補ジン
クフィンガードメインのアミノ酸配列をコードする候補核酸を提供すること；及
び（iii）候補核酸を利用し、前述の方法に使用された複数のハイブリッド核酸
に含まれるハイブリッド核酸を製作すること。前記データベースは、公知及び（
または）予測されるタンパク質のような複数のアミノ酸配列に関する記録のみな
らず、ｃＤＮＡ、ＥＳＴｓ、ゲノムＤＮＡ、または予測されるイントロンを除去
するためにコンピュータ処理されたゲノムＤＮＡのような複数の核酸配列に対す
る記録を含むことができる。
【０００９】 所望であれば、前記方法は第２標的部位（例えば、第１試験ジンクフィンガー
ドメインにより認識される配列と異なる配列）を認識する第２試験ジンクフィン
ガードメインを同定するために反復することができる。続いて、同定された第１
及び第２試験ジンクフィンガードメインの両方をコードする核酸を製作すること
ができる。生成されるハイブリッドタンパク質は、第１試験ジンクフィンガード
メインの標的部位及び第２ジンクフィンガードメインの標的部位の両方を含む標
的部位を特異的に認識できるはずである。
【００１０】 本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインがプロモーター内の標的部位を
認識するか否かを決定する方法に関する。本願では、この方法を「部位選別法」
とも称する。前記方法はリポーター構築物及びハイブリッド核酸を提供する工程
を含む。リポーター遺伝子は、招集部位及び標的部位を含むプロモーターに作動
可能に連結され、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識
する場合、所定レベルを超過するレベルにリポーター遺伝子を発現させるが、転
写因子がプロモーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない。ハイ
ブリッド核酸は、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ
結合ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインの要素を有する非天
然生成タンパク質をコードする。前記方法は次のような工程を更に含む：リポー
ター構築物が細胞内に入るようにする条件下でリポーター構築物を細胞と接触さ
せる工程；前記工程以前、以後、または前記工程と同時に、ハイブリッド核酸が
細胞内に入るようにする条件下でハイブリッド核酸を細胞と接触させる工程；前
記細胞をハイブリッド核酸が細胞内で発現できるようにする条件下で維持する工
程；及び細胞内リポーター遺伝子の発現を検出する工程。リポーター遺伝子の発
現が所定レベルより高いということは試験ジンクフィンガードメインが標的部位
を認識するという指標である。
【００１１】 前記リポーター構築物及びハイブリッド核酸は、別のプラスミドにそれぞれ含
まれてもよい。二つのプラスミドは細胞に同時にまたは連続的に導入することが
できる。一つのプラスミドまたは２つのプラスミドの両方は、選別可能マーカー
を含むことができる。また、リポーター構築物とハイブリッド核酸は、同一のプ
ラスミド中に含まれてもよく、この場合には、リポーター構築物とハイブリッド
核酸を細胞に導入するために単一回の接触工程のみが必要である。また他の実施
態様では、リポーター構築物及びハイブリッド核酸中の一つまたは両者が、細胞
のゲノムに安全に挿入される。前記方法の場合、本願に記述された任意の生体内
方法において、転写活性化ドメインは転写抑制ドメインで代替することができ、
この場合には、リポーター遺伝子の発現レベルが所定レベル未満に減少する細胞
を同定するようになる。
【００１２】 本発明の更なる他の方法は、２つの細胞の融合により、試験ジンクフィンガー
ドメインの結合優先性の迅速な決定を容易にする。この方法は、リポーター遺伝
子を含有する第１細胞を提供する工程；ハイブリッド核酸を含有する第２細胞を
提供する工程；第１細胞及び第２細胞を融合させて融合細胞を形成する工程；融
合細胞を融合細胞内でハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で維持する工
程；及び融合細胞内リポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、ここで、リ
ポーター遺伝子の発現レベルが所定レベルより高いということは試験ジンクフィ
ンガードメインが標的部位を認識することを表す指標である。例えば、第１細胞
及び第２細胞は組織培養細胞または真菌細胞であり得る。本方法の例示的な一実
施態様では、酵母（S. cerevisiae）細胞が利用される。第１細胞は第１交配型
（例えば、ＭＡＴａ）を有し、第２細胞は第１交配型と異なる交配型（例えば、
ＭＡＴα）を有する。２つの細胞を相互に接触させれば、酵母交配（yeast mati
ng）により第１細胞及び第２細胞の両方のゲノムを含有する核を有する単一細胞
（例えば、ＭＡＴａ/α）が作られる。本方法では、全て同一な第１交配型であ
り、それぞれの第１細胞が相異する標的部位を有するリポーター構築物を有する
、複数の第１細胞を提供することを含んでもよい。全て同一な第２交配型であり
、それぞれが相異する試験ジンクフィンガードメインを有する複数の第２細胞も
提供される。全ての可能な対交配（pair-wise mating）のような複数の対交配で
マトリックスを作る。この方法は、複数の結合部位（例えば、可能な標的部位の
全ての完全なセット）に対する複数の試験ジンクフィンガードメインの結合優先
性を決定するのに利用される。
【００１３】 本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインの結合優先性を検査する方法を
提供する。本方法は、（１）本質的に全ての細胞がハイブリッド核酸を含有する
細胞を提供する工程及び（２）複数のリポーター構築物を提供する工程を含む。
複数のリポーター構築物のそれぞれは招集部位及び標的部位を含むプロモーター
に作動可能に結合されたリポーター遺伝子を有する。リポーター遺伝子は転写因
子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識する場合には所定レベル
を超過して発現されるが、転写因子が単にプロモーターの招集部位のみに結合す
る場合はその限りでない。複数のリポーター構築物の成員において、第２の標的
部位は多様に変化する。ハイブリッド核酸は、以下の要素、すなわち、（ｉ）転
写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、及び（iii
）試験ジンクフィンガードメイン、を有するハイブリッドタンパク質をコードす
る。本方法は、次の工程：複数のリポーター構築物中の少なくとも一つが、少な
くとも一つの細胞に入るようにする条件下で、複数のリポーター構築物を細胞と
接触させる工程；細胞内の核酸発現が可能な条件で細胞を維持する工程；細胞内
にリポーター構築物を含有し、所定レベル以上にリポーター構築物を発現させる
細胞（リポーター構築物が所定レベル以上に発現されるということは、細胞内の
リポーター構築物がジンクフィンガードメインにより認識される標的部位を有す
るということを表す）を同定する工程、を更に含む。
【００１４】 試験ジンクフィンガードメインが１つより多い標的部位に対して結合優先性を
有する場合は、それぞれ異なる標的部位を有する複数の細胞を前記方法により同
定することができる。前記方法は、最高レベルのリポーター遺伝子発現を示す細
胞を同定することを更に含むことができる。別法として、リポーター遺伝子発現
の臨界レベル（例えば、リポーター遺伝子発現が２、４、８、２０、５０、１０
０、１０００倍またはそれ以上増加するレベル）を決定し、臨界レベルを超えて
リポーター遺伝子を発現させる全ての細胞を選択することもある。
【００１５】 標的結合部位は、例えば、２〜６ヌクレオチド長であり得る。複数のリポータ
ー構築物は標的結合部位の２、３、または４またはそれ以上の位置にＡ、Ｔ、Ｇ
及びＣヌクレオチドの全ての可能な組合を含むことができる。
【００１６】 また他の側面において、本発明は複数のジンクフィンガードメインを同定する
方法であることをその特徴とする。この方法は、第１試験ジンクフィンガードメ
インを同定するためにドメイン選別法を遂行し、また第１試験ジンクフィンガー
ドメインの標的部位とは異なる標的部位を認識する第２試験ジンクフィンガード
メインを同定するためにドメイン選別法を再遂行することを含む。更に他の特徴
は、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を生成する方法であり
、この方法は第１及び第２試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメ
イン選別法を２回遂行し、第１及び第２試験ジンクフィンガードメインを含むポ
リペプチドをコードする核酸を構築することを含む。その核酸は、二つの下位部
位（subsite）からなる部位を特異的に認識する二つのドメインを含むハイブリ
ッドタンパク質をコードすることができる。下位部位は、それぞれ第１試験ジン
クフィンガードメインの標的部位及び第２試験ジンクフィンガードメインの標的
部位である。
【００１７】 また他の側面において、本発明は、ジンクフィンガードメインにより認識され
るＤＮＡ配列を同定する方法に関する。本方法は、第１試験ジンクフィンガード
メインに対する第１結合優先配列を同定するための部位選別法の遂行、及び第２
試験ジンクフィンガードメインに対する第２結合優先配列を同定するための部位
選別法の再遂行を含む。同定された第１及び第２試験ジンクフィンガードメイン
を全てコードする核酸を構築することができる。その核酸は、第１試験ジンクフ
ィンガードメインの標的部位及び第２試験ジンクフィンガードメインの標的部位
を含む部位を特異的に認識する２つのドメインを含むハイブリッドタンパク質を
コードすることができる。
【００１８】 本発明はまた、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方
法を提供する。この方法は、（１）リポーター構築物を含有する細胞及び（２）
複数のハイブリッド核酸を提供することを含む。リポーター構築物は、プロモー
ターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子を有し、プロモーターは、招集部
位及び標的部位を有する。リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集
部位及び標的部位を全て認識する場合（すなわち、基準を越える程度の結合時）
には所定レベル未満で発現されるが、転写因子がプロモーターの招集部位のみを
認識する場合にはその限りでない。複数のハイブリッド核酸のそれぞれは、以下
の要素、（ｉ）転写抑制ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイ
ン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメイン、と一緒に非天然のタンパク質
をコードする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は、複数のハイブ
リッド核酸の成員中で変化がある。その方法は、次の工程：複数の核酸中の少な
くとも一つが、少なくとも一つの細胞に入るようにする条件下で、複数の核酸を
細胞と接触させる工程；細胞内でハイブリッド核酸が発現できるようにする条件
で細胞を維持する工程；細胞が標的部位を認識する試験ジンクフィンガードメイ
ンをコードするハイブリッド核酸を含む指標として、リポーター遺伝子を所定レ
ベル未満に発現させる細胞を同定する工程。本方法の追加実施態様も転写活性化
ドメインを利用する方法と類似している。同様に、本願に記述された他のいかな
る選別法も、転写活性化ドメインの代りに転写抑制ドメインを用いて遂行するこ
とができる。
【００１９】 また他の側面において、本発明の特徴は、特定の精製されたポリペプチド及び
単離された核酸である。本発明の精製されたポリペプチドは、下記のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む：
【００２０】 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６８）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６９） Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７０）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７１）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ −Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７２）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７３、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７４）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ −Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７５）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５０）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５１）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５２）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５３）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５４）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５５）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５６）、 Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−
Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５７）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５８）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５９）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６１）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６２）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６３）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６４）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６５）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６６）、 Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６７）、 （ここで、Ｘaはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは疎水性残基であ
り、Ｘｃはセリンまたはスレオニンである。）本発明の核酸は上記のポリペプチ
ドをコードする核酸を含む。
【００２１】 また、本発明の精製されたポリペプチドは、配列番号２３、２５、２７、２９
、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３
、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１
１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２
９、１３１、１３３、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４
９、または１５１と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９５％
、９６％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有することが
できる。前記ポリペプチドはポリペプチドの核酸接触残基に相応するアミノ酸位
置において、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９
、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３
、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１１、１１３、１１５、１１７、１
１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１
３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、または１５１と同一であり得
る。または、前記ポリペプチドは、ポリペプチドの核酸接触残基に相当する残基
中の少なくとも一つ以上の残基が、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３
３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５
７、５９、６１、６３、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１１、１１３
、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１
、１３３、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、または
１５１と異なることができる。精製されたポリペプチドはまた、非相同のＤＮＡ
結合ドメイン、核局在化シグナル、小分子結合ドメイン（例、ステロイド結合ド
メイン）、エピトープタグまたは精製のための配列（精製ハンドル）、触媒ドメ
イン（例、核酸改質ドメイン、核酸切断ドメイン、またはＤＮＡ修復触媒的ドメ
イン）及び／または転写機能的ドメイン（例、活性化ドメイン、抑制ドメインな
ど）中の一つ以上を含むことができる。本発明はまた、前記ポリペプチドをコー
ドする単離された核酸配列、及び配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２
、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６
、５８、６０、６２、６４、６６、１０２、１０４、１０６、１１０、１１２、
１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、
１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８または１５
０、またはこれらの相補体からなるプローブ配列の単一鎖のプローブに厳しい条
件下でハイブリダイズする単離された核酸配列を含む。本発明は、非相同の核酸
結合ドメインに融合された本発明のポリペプチドを細胞内で発現させる方法を、
更に含む。この方法は、前記融合タンパク質をコードする核酸を細胞に導入する
ことを含む。このような本発明の核酸は、誘導可能プロモーター（例、ステロイ
ドホルモン調節性プロモーター、小分子調節性プロモーター、またはテトラシク
リンTet-On及びTet-Offシステムのような操作された誘導性システム）のような
非相同の核酸配列により作動可能に調節され得る。
【００２２】 「塩基接触位置」という用語は、配列番号２１のアミノ酸、アルギニン７３、
アスパラギン酸７５、グルタミン酸７６、及びアルギニン７９に構造的に対応す
るジンクフィンガードメインの４つのアミノ酸の位置をいう。これらの位置はま
た−１、２、３、及び６位と称されることもある。問合せ配列において、塩基接
触位置に相応する位置を同定するためには、問合せ配列のシステイン及びヒスチ
ジン残基がＺｉｆ２６８のフィンガー３のシステイン及びヒスチジン残基と並ぶ
ように問合せ配列を問題のジンクフィンガードメインと整列させる。ヨーロッパ
生物情報研究所（European Bioinformatics Institute）のＣｌｕｓｔａｌＷ
ＷＷＷサービス （http://www2.ebi.ac.uk/clustalw；Thompson et al（1994）
）Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）は、配列整列の一つの簡単な方法を提供
する。
【００２３】 「非相同の（heterologous）」という用語は、人為的に構成に導入されたポリ
ペプチドであり、その構成に天然のには存在しないポリペプチドをいう。内生の
ものとの区別においては、非相同のポリペプチドは、いかなる天然に生じるポリ
ペプチド中の側面に位置しない少なくとも１つの側面に位置するポリペプチド配
列を有していてもよい。「ハイブリッド」という用語は、（ｉ）少なくとも２つ
の天然に存在する異なった配列；（ii）少なくとも一つの人工配列（すなわち、
天然に存在しない配列）及び一つの天然に存在する配列；または（iii）少なく
とも二つの人工配列中のいずれか一つから由来するアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドを指す。人工配列の例には、天然のに存在する配列の突然変異及び新た
に設計された配列がある。
【００２４】 本願で使用された「厳しい条件下でハイブリダイズする」という用語は、４５
℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（６×ＳＳＣ）中でハイブリダイ
ズさせ、次いで、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄する条件
を指す。
【００２５】 「結合優先性（binding preference）」という用語は、ポリペプチドが、他の
結合部位に比べて一つの核酸結合部位を選別的に選択する識別力を指す。例えば
、核酸結合部位に比較してポリペプチドが量的に制限されている場合、本願に記
述された生体内または生体外の検査法で選好されない部位より選好される部位に
更に多量のポリペプチドが結合するはずである。
【００２６】 本願で使用される「認識（する）」という用語は、一つの核酸結合部位と第２
の競合部位とを識別するポリペプチドの能力を指し、したがって、例えば、本願
に記述された検査では第２の部位の過剰存在下において、ポリペプチドが、第１
の結合部位に結合したままで残るようになる。このポリペプチドは、単独で第１
の結合部位に対して十分な親和性を有しなくてもよいが、本発明のハイブリッド
ポリペプチドとして、隣接する招集部位に結合する他の核酸結合ドメインと融合
された場合には、検査され得る。
【００２７】 本願において用いられる「縮重オリゴヌクレオチド」とは、（ａ）相異するオ
リゴヌクレオチドの集団、及び（ｂ）一つ以上の配列にアニーリングできる単一
種のオリゴヌクレオチド（例えば、イノシンのような非自然的ヌクレオチドを有
するオリゴヌクレオチド）の両方を意味する。
【００２８】 本発明は、多様な利点を提供する。特定配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを
選別できる能力は、ＤＮＡの特定部位に結合する新規ポリペプチドの設計を可能
にする。したがって、本発明は選択された標的の発現を調節することができる（
例えば、病源体が必要とする遺伝子を抑制することができ、癌増殖が必要とする
遺伝子を抑制することができ、または発現が良くできない遺伝子または突然変異
タンパク質をコードする遺伝子を活性化または過剰発現することができる）新規
ポリペプチドの必要に応じた生産を容易にする。
【００２９】 ジンクフィンガードメインの使用は特に有利である。第一に、ジンクフィンガ
ーモチーフは、非常に多様なＤＮＡ配列を認識する。第二に、自然発生的ジンク
フィンガータンパク質の構造は、単位モジュール性である。例えば、「Ｅｇｒ−
１」とも呼ばれるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質は三つのジンクフィ
ンガードメインが直列で構成されている。図１は、ＤＮＡと複合体をなした三つ
のフィンガーからなるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質のＸ線決定構造
である〔Pavletich and Pabo, (1991)Science 252:809-817〕。各フィンガーは
ＤＮＡ認識部位の３−４塩基対と独立に接触する。したがって、それぞれのフィ
ンガーと接触した下位部位（subsite）は、独立的な分子的認識と見なされ得る
。同一なポリペプチド鎖において複数のジンクフィンガー単位モジュールが協同
効果を発揮することにより高親和度結合が達成される。
【００３０】 生体内選別工程の使用は、細胞内環境でＤＮＡの特定部位に結合するポリペプ
チドの直接的同定を可能にする。細胞、特に真核細胞において、認識に関連した
因子らは、試験官内の選別シナリオ中に存在する因子らとは大いに異なる。例え
ば、真核細胞核において、ポリペプチドは特定核酸結合部位に対して無数に多く
の異なる核タンパク質と競争しなければならない。ヌクレオソーム（nucleosome
）またはその他のクロマチンタンパク質が結合部位を占めたり閉鎖したり、また
はこの結合部位に競争的に作用できる。たとえ結合されていないとしても、細胞
内の核酸構造は、折りたたみ、スーパーコイリング、捩れ、及び解捩に付される
。反面、ポリペプチド自体は、その他の因子の中で、プロテアーゼ及びシャペロ
ンに、露出されている。その上、ポリペプチドは、全体遺伝子の結合可能な部位
と直面するようになり、そのようにして選別工程で選別されるためには所望の部
位への高い特異性がなければならない。生体内の選別とは対照的に、生体外の選
別は最高の特異性を有する結合物よりも、最高の親和性を有する結合物を選択す
ることができる。
【００３１】 発現されたポリペプチドキメラの結合能力を示すためにリポーター遺伝子を使
用することは効果的で簡単であるのみならず、タンパク質−核酸接触面のエネル
ギー学、結合接触面に影響を与える周辺残基及びヌクレオチドのような数多くの
周辺因子を計算に入れた複雑な相互作用コードを開発する必要がないため有利で
ある〔Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763〕。
【００３２】 本発明は、それ自体でヒトゲノム、または他のいかなるゲノムに存在する全て
のジンクフィンガードメインを有用にする。この、ジンクフィンガードメインの
構造的フォルディングが占有する配列空間の多様なサンプリングは、自然選択の
永年に本来備わった更なる利点を有することができる。その上、宿主種からのド
メインを利用することにより、本願に記述された方法による遺伝子治療適用のた
めに設計されたＤＮＡ結合タンパク質は宿主免疫応答によって非自己と取扱われ
る可能性が減少する。
【００３３】 一つ以上の本発明の詳細な実施態様を添付図面及び下記説明により提示する。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、この説明及び図面、及び請求項から明白
になるであろう。
【００３４】
【詳細な説明】
本発明は、試験ジンクフィンガードメインの核酸結合優先性を決定するための
新たなスクリーニング法に関する。この方法は、多様なＤＮＡ結合ドメイン、こ
れらドメインの多様な源泉及び数多くのライブラリー設計、数多くのリポーター
遺伝子、及び数多くの選別及びスクリーニングシステムに適用することができる
。このスクリーニング方法は高効率の基盤として遂行できる。このスクリーニン
グ方法から得た情報は人工核酸結合タンパク質を設計する方法に直ちに利用され
得る。この設計方法は、試験ジンクフィンガードメインの結合優先性を利用して
キメラ核酸結合タンパク質のモジュラー組立に導く。設計されたタンパク質は、
前記スクリーニング方法で更に最適化されたり、または変形され得る。
【００３５】ＤＮＡ結合ドメイン 本発明は、相異する結合特異性を有する核酸結合ドメインの集合体を利用する
。高い親和性及び高い特異性で、核酸に結合する多様なタンパク質構造が知られ
ている。これらの構造は、核酸の機能を特異的に制御するために、無数の異なる
タンパク質において繰り返し用いられる（二重螺旋ＤＮＡを認識する構造的モチ
ーフ検討のために、例えば文献〔Pabo and Sauer (1992) Annu. Rev. Biochem.
61:1053-95; Patikoglou and Burley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Str
uct. 26: 289-325;及びNelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-9〕参照）
。核酸結合ドメインに対する幾つかの非制限的な例は次の通りである。
【００３６】 ジンクフィンガー。ジンクフィンガーは、約３０個のアミノ酸残基からなる小
さいポリペプチドドメインであり、その中には、システインまたはヒスチジンで
ある４個のアミノ酸が、亜鉛イオンと配位結合をすることができるように、適切
に間隔を置いて配置されている（図１参照；検討のために例えば文献〔Klug and
Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollen
berg (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-2
50; Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 85:99-102;及びRosenfeld and Margalit (1993) J. Biomol. S
truct. Dyn. 11: 557-570〕参照）。したがって、ジンクフィンガードメインは
、亜鉛イオンと配位結合をする残基の種類により、例えば、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2類
、Ｃｙｓ2−Ｃｙｓ2類、Ｃｙｓ2−ＣｙｓＨｉｓ類などに分類できる。Ｃｙｓ2−
Ｈｉｓ2ジンクフィンガーで亜鉛と配位結合する残基は典型的に Ｘa−Ｘ−Ｃ−
Ｘ2-5−Ｃ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ5−Ψ−Ｘ2−Ｈ−Ｘ3-5−Ｈ（ここで、ψ（プサイ）は
疎水性残基である）のように配置されており〔Wolfe et al., (1999) Annu. Rev
. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212〕（配列番号７６）、ここで「Ｘ」は任
意のアミノ酸を表し、Ｘaはフェニルアラニンまたはチロシンであり、下付き添
字はアミノ酸の個数を指し、二つの下付き添字は介入するアミノ酸の典型的な範
囲を指す。逆平行（anti-parallel）βシートが短いか、非理想的であるか、又
は存在しなくてもよいが、典型的に、介入するアミノ酸は折りたたまれ、αヘリ
ックスに対して充填される逆平行βシートを形成する。この折りたたみは、亜鉛
と配位結合する側鎖が、亜鉛イオンと配位結合するのに適合した四面体構造中に
あるように配置される。塩基接触残基はフィンガーのＮ−末端にあり、かつ、先
行するループ領域にある（図２）。ジンクフィンガーＤＮＡ−結合タンパク質は
、通常、三つ以上のジンクフィンガードメインの直列配置で構成される。
【００３７】 ジンクフィンガードメイン（「ＺＦＤ」）は、最もありふれた真核生物ＤＮＡ
−結合モチーフ中の一つであり、酵母から高等植物及びヒトに至る多様な種で発
見される。ヒトゲノムのみにも少なくとも数千種のジンクフィンガードメインが
存在することと推測される。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガータ
ンパク質から単離することができる。ジンクフィンガータンパク質の非制限的な
例には、ＣＦ２−II、クルペル（Kruppel）、ＷＴ１、バソヌクリン（basonucli
n）、ＢＣＬ−６／ＬＡＺ−３、赤芽球クルペル−様転写因子、転写因子Ｓｐ１
、Ｓｐ２、Ｓｐ３及びＳｐ４、転写抑制剤ＹＹ１、ＥＧＲ１／Ｋｒｏｘ２４、Ｅ
ＧＲ２／Ｋｒｏｘ２０、ＥＧＲ３／Ｐｉｌｏｔ、ＥＧＲ４／ＡＴ１３３、Ｅｖｉ
−１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＨＩＶ−ＥＰ１／ＺＮＦ４０、ＨＩＶ−
ＥＰ２、ＫＲ１、ＺｆＸ、ＺｆＹ及びＺＮＦ７などがある。
【００３８】 下記電算的方法は、配列決定されたゲノム中の、または核酸データベース中の
、全てのジンクフィンガードメインを同定するために用いられ得る。任意のジン
クフィンガードメインを利用することができる。また、人工ジンクフィンガード
メインが、例えば、電算的方法により設計された〔例えば、Dahiyat and Mayo(1
997) Science 278:82-7〕。Dahiyat and Mayoのジンクフィンガーは、ジンクフ
ィンガーの折りたたみは採択するが、その核に亜鉛イオンを含有しない。したが
って、これは亜鉛イオンと配位結合するという機能的能力というよりは、そのポ
リペプチド骨格の、天然ジンクフィンガーの折りたたみとの構造的な類似性によ
るジンクフィンガーである。
【００３９】 ホメオドメイン。ホメオドメインは、ＤＮＡの小さい溝（minor groove）と接
触するＮ−末端腕及び続いて大きい溝（major groove）と接触する３個のαヘリ
ックスで構成される単純な真核生物ドメインである〔例えば、Laughon、(1991)
Biochemistry 30:11357-67参考〕。第三のαヘリックスは大きい溝中に位置し、
決定的なＤＮＡ−接触側鎖を含有する。ホメオドメインは第三のαヘリックスに
引導するターンに存在する高度に保存された特徴的なモチーフを有する。このモ
チーフはドメインの疎水性コア内に存在する不変トリプトファンを含む。このモ
チーフはプロサイト（Prosite）データベース（http://www.expasy.ch/参考）に
ＰＤＯＣ０００２７として公知となっている（〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｇ〕
−〔Ａ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｒ〕−Ｘ（２）−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｃ／Ｎ
〕−Ｘ−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ〕−Ｘ（４）−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ〕−〔Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／
Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｉ／Ｙ〕−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｋ／Ｈ〕−Ｗ−〔
Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｃ〕−Ｘ−〔Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｈ〕−Ｘ（５）−〔Ｒ／Ｋ／Ｎ
／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｗ〕；配列番号７７）。ホメオドメインは、細胞同一性を決定し
、有機体の発生過程で位置的な情報を提供する転写因子でしばしば発見される。
そのような古典的なホメオドメインは、ゲノム中にクラスターで発見することが
でき、クラスター中のホメオドメインの順番は、ボディー軸（body axis）に沿
ったホメオドメインの発現パターンに大体相当している。ホメオドメインは、例
えば、Ｈｏｘ−１のようなホメオドメインとのアラインメントにより、またはホ
メオドメインプロファイルまたはホメオドメイン隠れマルコフモデル（hidden M
arkov Model；ＨＭＭ；下記参照）、例えば、PfarmデータベースのＰＦ０００４
６またはＳＭＡＲＴデータベースの「ＨＯＸ」との整列により（http://smart.e
mbl-heidelberg.de/）、または前記のプロサイトモチーフＰＤＯＣ０００２７に
より同定可能である。
【００４０】 ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質。このＤＮＡ結合モチーフは、多
くの原核生物転写因子中でしばしば発見される。例えば、ＬａｃＩ族、ＡｒａＣ
族など、多くの亜族がある。名称において二つのヘリックスはＤＮＡの大きい溝
に対して位置し、第二のαヘリックスをＤＮＡの大きい溝内に配置する第一のα
ヘリックス及びこのようにＤＮＡの大きい溝に位置する第二のαヘリックスであ
る。これらドメインはＨＭＭ、例えば、ＳＭＡＲＴデータベースから得られるＨ
ＴＨ＿ＡＲＡＣ、ＨＴＨ＿ＡＲＳＲ、ＨＴＨ＿ＡＳＮＣ、ＨＴＨ＿ＣＲＰ、ＨＴ
Ｈ＿ＤＥＯＲ、ＨＴＨ＿ＤＴＸＲ、ＨＴＨ＿ＧＮＴＲ、ＨＴＨ＿ＩＣＬＲ、ＨＴ
Ｈ＿ＬＡＣＩ、ＨＴＨ＿ＬＵＸＲ、ＨＴＨ＿ＭＡＲＲ、ＨＴＨ＿ＭＥＲＲ及びＨ
ＴＨ＿ＸＲＥプロファイルとのアラインメントにより同定される（http://smart
.embl-heidelberg.de/）。
【００４１】 ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質。このＤＮＡ結合ドメインは、例
えば、ＭｙｏＤ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｅ１１及びミオゼニンのようなホモ−及びヘ
テロ−二量体転写因子間に共通的に発見される。このドメインは、二量体及びそ
の間のループからなり、各単量体は二つのαヘリックスにかけて結合する。この
ドメインは、例えば、ＳＭＡＲＴデータベース（http://smart.embl-heidelberg
.de/）で利用可能な「ＨＬＨ」プロファイルのようなＨＭＭとのアラインメント
により同定できる。たとえヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、典型
的に二量体性であるが、ポリペプチドリンカーを二つのサブユニット間に設計し
て単一オープンリーディングフレーム（open reading frame）が二つのサブユニ
ット及びリンカーをコードさせることにより単量体性バージョンを構築すること
ができる。
【００４２】ＤＮＡ−結合ドメインの同定 多様な方法を使用して構造ドメインを同定することができる。 電算的方法（Computational Method）。本明細書に記述された方法により単離
されたＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を公知配列のデータベース、例えば、
タンパク質配列の注釈をつけたデータベースまたは核酸結合ドメインに対する記
入を含む注釈をつけたデータベースと比較できる。また他の実施面では、非特性
化された配列、例えば、注釈を付けていないゲノム配列、ＥＳＴまたは全長ｃＤ
ＮＡ配列；特性化された配列、例えば、SwissProtまたはＰＤＢ；及びドメイン
、例えば、Pfarm、ProDom（http://www.tooulouse.inra.fr/）、及びＳＭＡＲＴ
（Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelber
g.de/）のデータベースが核酸結合ドメイン配列の源泉を提供できる。問合せア
ミノ酸配列と比較するために核酸配列データベースを全ての６個の読み枠（read
ing frame）に翻訳することができる。候補核酸結合ドメインをコードするとい
う標識をされた核酸配列は、適当な核酸源、例えば、ゲノムＤＮＡまたは細胞Ｒ
ＮＡから増幅できる。そのような核酸配列は、発現ベクタにクローニングできる
。コンピュータに基づいたドメイン同定の前記手順は、オリゴヌクレオチド合成
器及びロボットシステムと連係させて高い効率でドメインをコードする核酸を生
産することができる。候補ドメインをコードするクローン化された核酸は、宿主
発現ベクタに貯蔵し、制限酵素媒介サブクローニングまたは部位−特異的組換え
酵素媒介サブクローニング（米国特許第５,８８８,７３２号参照）によりＺｉｆ
２６８フィンガー１及び２と共に発現ベクタ、例えば、翻訳融合ベクタ内に導入
させることができる。高い作業処理量のため、相異する候補核酸結合ドメインを
コードする核酸を含有する複数のマイクロタイタープレートを生成するため、高
効率の基盤（platform）を用いることができる。
【００４３】 出発配列またはプロファイルからドメインを同定する細詳な方法は、当業界に
周知である。例えば、プロサイト（〔Hofmann et al.,(1999) Nucleic Acids Re
s. 27:215-219〕参照）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ（〔Altschul et al.,(1990)
J.Mol.Biol. 215:403-10〕参照）などが参照できる。簡単なストリング検索を遂
行して問合せ配列または問合せプロファイルに対する同一性を有するアミノ酸配
列を見出すことができ、例えば、Perl（http://bio.perl.org/）を使用してテキ
ストファイルをスキャニングすることができる。このように同定された配列は、
初期入力配列に対して約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％またはそれ以上の同一性を表すことができる。
【００４４】 問合せドメインと類似したドメインを公共データベース、例えば、文献〔Alts
chul et al.,(1990)J.Mol.Biol. 215:403-10〕のＸＢＬＡＳＴプログラム（バー
ジョン２．０）を使用して同定することができる。例えば、スコア＝５０、単語
長＝３のＸＢＬＡＳＴ変数を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を遂行すること
ができる。文献〔Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res.25(17): 3389-34
02〕に記述されているように、問合せ配列または検索された配列に間隔を導入す
ることができる。ＸＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムに対す
るディフォルト変数はhttp://www.ncbi.nlm.nih.govサイトで求めることができ
る。
【００４５】 プロサイトプロファイルＰＳ０００２８及びＰＳ５０１５７を使用してジンク
フィンガードメインを同定することができる。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ公表の８０,
０００個のタンパク質配列において、これらプロファイルはそれぞれ３１８９及
び２３１６個のジンクフィンガードメインを見出した。多様な相異する技法を使
用して関連したタンパク質の多重配列アラインメントからプロファイルが構築で
きる。グリブスコフ（Gribskov）及びその同僚ら〔Gribskov et al.,(1990)Meth
.Enzymol.183:146-159〕は記号比較表を利用し、残基頻度分布が提供された多重
配列アラインメントを各位置に対する重さに転換した。例えば、プロサイトデー
タベース及び文献〔Luethy et al.,(1994) Protein Sci.3:139-1465〕の作業が
参照できる。
【００４６】 関心のあるＤＮＡ結合ドメインを代表する隠れマルコフモデル（Hidden Marko
v Models；HMM's）は、例えば、パーム（Pfarm）データベース、リリース２．１
のようなそのようなモデルのデータベースから生成され又は得ることができる。
追加的なドメインを見出すために、例えば、前記ディフォルト変数を使用してＨ
ＭＭでデータベースを検索することができる（例えば、ディフォルト変数のため
にhttp://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search参照）。または、使用者
は前記変数を最適化させることができる。境界スコアを選択して配列データベー
スを濾過することにより、境界以上のスコアを有する配列が候補ドメインとして
表示されるようにすることができる。Pfarmデータベースの説明は、文献〔Sonha
mmer et al.,(1997) Proteins 28(3):405-420〕で見出すことができ、ＨＭＭに
関する詳細な説明は、例えば、文献〔Gribskov et al.,(1990) Meth.Enzymol.18
3:146-159; Gribskovetal., (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4355-4358; Kr
ogh et al.,(1994) J.Mol.Biol.235:1501-1531;及びStultz et al.,(1993) Prot
ein Sci.2:305-314〕で見出すことができる。
【００４７】 ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Simple Modular Architecture Research T
ool, http://smart.embl-heidelberg.de/;文献〔Schultz et al.,(1998) Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 95:5857;及びSchultz et al.,(2000) Nucl.Acids Res 28:
231〕）は、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（文献〔Durbin et al.,(1998) Biolog
ical sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic aci
ds. Cambridge University Press.〕;http://hmmer.wustl.edu/）のヒドン・マ
ルコフモデルでプロファイルすることにより同定されたジンクフィンガードメイ
ンのカタログ（ＺｎＦ＿Ｃ２Ｈ２；ＺｎＦ＿Ｃ２Ｃ２；ＺｎＦ＿Ｃ２ＨＣ；Ｚｎ
Ｆ＿Ｃ３Ｈ１；ＺｎＦ＿Ｃ４；ＺｎＦ＿ＣＨＣＣ；ＺｎＦ＿ＧＡＴＡ；及びＺｎ
Ｆ＿ＮＦＸ）を提供する。
【００４８】 ハイブリダイゼーションに基づいた方法。多様な形態のＤＮＡ結合ドメインを
コードする核酸集合体を分析してアミノ末端及びカルボキシ末端の保存された境
界配列をコードする配列プロファイルを得ることができる。そのような保存され
た境界配列をコードする核酸配列に混成化できる縮重オリゴヌクレオチドが設計
できる。また、そのような縮重オリゴヌクレオチドの有効性はそれらの組成と公
知となったゲノム配列上の可能なアニーリング部位の頻度を比較することにより
評価され得る。複数反復された設計により縮重オリゴヌクレオチドを最適化する
ことができる。例えば、公知のＣｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンクフィンガーを比較するこ
とにより、天然配列中の隣接フィンガー間のリンカー地域の共通配列が明らかに
なった（文献〔Agata et al.,(1998) Gene 213:55-64〕参照）。そのような縮重
オリゴヌクレオチドは、複数のＤＮＡ結合ドメインを増幅させるのに使用される
。増幅されたドメインを試験ジンクフィンガードメインとしてハイブリッド核酸
に挿入し、後続的に、本明細書に記述された方法により標的部位への結合を分析
する。
【００４９】ライブラリー設計 この方法は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸の集合体（例えば、プラス
ミド、ファージミドまたはフアージライブラリーの形態）において機能的核酸結
合特性のスクリーニングを可能にする。前記集合体は、多様な群のＤＮＡ結合ド
メインがコードでき、更には相異する構造的折りたたみを有するドメインもコー
ドできる。一例として、前記集合体はジンクフィンガードメインのような単一の
構造的折りたたみのドメインをコードする。下記方法が、ジンクフィンガードメ
インに関して記述されたが、当業者であれば、これを他の類型の核酸結合ドメイ
ンに応用できるはずである。
【００５０】 ドメイン突然変異。さらに一例において、前記核酸集合体は、縮重パターンラ
イブラリーから組立てられる構造ドメインをコードする核酸で構成される。例え
ば、ジンクフィンガーの場合、公知ジンクフィンガーのアラインメントを、各位
置における最も適合したアミノ酸を同定するために用いることができる。別法と
して、構造的研究及び突然変異誘発（mutagenesis）実験を、各位置のアミノ酸
の望ましい特性を決定するために用いることができる。任意の核酸結合ドメイン
を、突然変異を導入するための構造的基盤として用いることができる。特に、核
酸と結合する部位に非常に近接した位置またはそのような位置に隣接した位置を
突然変異誘発のための標的にすることができる。パターン化された縮重ライブラ
リーを使用することにより、突然変異した試験ジンクフィンガードメインを、突
然変異位置における可能なアミノ酸の小集団に限定することができる。各位置に
前記プロファイルをコードするために縮重コドンセットを使用することができる
。例えば、疎水性残基のみを、脂肪族残基のみをまたは親水性残基のみをコード
するコドンセットが利用可能である。折りたたまれたポリペプチドをコードする
全長クローンについて、前記ライブラリーを選別することができる。文献〔Cho
et al.,(2000) J.Mol.Biol. 297(2):309-19〕では、縮重オリゴヌクレオチドを
使用してそのような縮重ライブラリーを製造する方法を提供し、また全長ポリペ
プチドをコードするライブラリー核酸を選別する方法を提供する。このような核
酸は本明細書に記載された選別法のために、便利な制限酵素切断部位または転位
酵素（transposase）または組換え酵素（recombinase）認識部位を使用して発現
プラスミドに容易に挿入することができる。
【００５１】 適当なコドン及び所定の位置における各ヌクレオチドの相対比率の選択は、遺
伝子コードを表す表を簡単に調査したり、または電算的アルゴリズムにより決定
できる。例えば、前記チョー（Cho）らの文献には、要望される縮重タンパク質
配列を受け付け、その配列をコードする望ましいオリゴヌクレオチド設計を出力
する電算プログラムが記載されている。
【００５２】 天然の種類のドメインの単離。ドメインライブラリーをヒトのような真核生物
のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから構築することができる。このために複数の方
法が可能である。例えば、前記したように、利用可能なアミノ酸配列のコンピュ
ーター検索によりドメインが同定できる。各ドメインをコードする核酸を単離し
、例えば、プロモーター、活性化ドメイン及び選別マーカーを含有するベクター
のような、細胞内での発現に適当なベクターに挿入することができる。また他の
例において、保存されたモチーフにハイブリダイズする縮重オリゴヌクレオチド
を、例えば、ＰＣＲによりこのモチーフを含有する複数の関連ドメインを増幅す
るために用いることができる。例えば、クルペル様Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2ジンクフィン
ガーを、文献〔Agata et al.,(1998) Gene 213:55-64〕の方法により増幅するこ
とができる。この方法はまた、例えば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）−
（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（配列番号７８）のようなパ
ターンを有する配列である、ジンクフィンガードメインの自然発生的リンカーペ
プチド配列を保持する。さらに、この方法は関心のあるドメインに限定された集
合体のスクリーニングであるゆえに、選択されていないゲノムライブラリーまた
はｃＤＮＡ配列のライブラリーのスクリーニングとは異なり、ライブラリーの複
雑性が非常に減少され、大規模ライブラリーを完全にスクリーニングすることの
様的な困難のために望ましい配列を逃す可能性を減少させる。
【００５３】 ヒトゲノムは、多様なジンクフィンガードメインを含有し、このうちの多くは
特徴づけされず、かつ同定されていない。ジンクフィンガードメインを有するタ
ンパク質をコードする数千個の遺伝子があると推定される〔Pellegrino and Ber
g,(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:671-675〕。これらヒトジンクフィンガ
ードメインは、新規のＤＮＡ−結合タンパク質が構築され得る多様なドメインの
広範囲な集合体である。各ジンクフィンガードメインが独特の３−乃至４−ｂｐ
配列を認識する場合、全ての可能な３−乃至４−ｂｐ配列に結合するのに必要な
ドメインの総数は単に６４乃至２５６（４3乃至４4）個である。ヒトゲノムの天
然レパートリーが、全ての可能な認識部位に及ぶために、充分な数の独特のジン
クフィンガードメインを含有している可能性がある。これらジンクフィンガード
メインは人工キメラＤＮＡ結合タンパク質を構築するための価値あるソースであ
る。自然発生のジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムに由来する人工的突然
変異とは異なり、自然選択圧下で進化したものであり、したがって、特定のＤＮ
Ａ配列への結合及び生体内機能のために自然的に最適化されたものであり得る。
【００５４】 ヒトジンクフィンガードメインは、例えば、遺伝子治療の応用において、人体
に導入された場合に免疫応答を誘導する可能性が遥かに少ない。
【００５５】特定ＤＮＡ結合特性を有するジンクフィンガードメインの生体内選別 所望のＤＮＡ認識特性を有するジンクフィンガードメインを次のような生体内
スクリーニングシステムを使用して同定することができる。問題の複合結合部位
をリポーター遺伝子の上流に挿入し、複合結合部位に転写活性化ドメインを誘引
・招集することにより、リポーター遺伝子の転写が所定レベル以上に増加するよ
うにした。固定されたＤＮＡ結合ドメインに融合された試験ジンクフィンガード
メイン及び転写活性化ドメインで構成されたハイブリッドタンパク質をコードす
る発現プラスミドを構築した。
【００５６】 複合結合部位は、少なくとも二つの要素、すなわち、招集部位及び標的部位か
らなる。このシステムで固定されたＤＮＡ結合ドメインが招集部位を認識するよ
うに設計される。しかし、招集部位に対する固定されたＤＮＡ結合ドメインの結
合親和度は、生体内で単独にはリポーター遺伝子を転写活性化させるのに不充分
な程度である。これは、対照群の実験により確認することができる。
【００５７】 例えば、細胞内で発現された場合、固定されたＤＮＡ結合ドメインは（試験ジ
ンクフィンガードメインの不在、または非機能的であると知られたり、または公
知となったＤＮＡ接触残基がアラニンのような代替アミノ酸で置換された試験ジ
ンクフィンガードメインの存在下では）リポーター遺伝子の転写を通常のレベル
以上に活性化させられてはならない。他の手段により（例えば、リポーターに対
する競争的抑制剤の使用により）システムの敏感度を増加させることができるた
め、若干の漏出または低いレベルの活性化は許容される。固定されたＤＮＡ結合
ドメインは、招集部位に安定的に結合しないことと予想される。例えば、固定さ
れたＤＮＡ結合ドメインは約０．１nM、１nM、１μM、１０μM、１００μMまた
はそれ以上の解離定数（Ｋd）で招集部位に結合することができる。標的部位に
対するＤＮＡ結合ドメインのＫdは、試験ジンクフィンガードメインの不在下で
または第２標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインの不
在下で、電気泳動移動検定（electrophoretic mobility shift assay；ＥＭＳＡ
）により試験管内で測定可能である。
【００５８】 したがって、ハイブリッドタンパク質が細胞内複合結合部位に安定的に結合し
、これによりリポーター遺伝子を活性化させるためには、例えば、複合結合部位
の多様な部位等の標的部位を認識する機能的（functional）試験ジンクフィンガ
ードメインの付着が必要である。標的部位に対する試験ジンクフィンガードメイ
ンの結合優先度により所定レベルに比べて増加したリポーター遺伝子発現をもた
らす。例えば、観察された発現レベルを所定レベルで割って得られるリポーター
遺伝子発現の増加倍数は約２、４、８、２０、５０、１００、１０００倍または
それ以上であり得る。試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識する場合
、ＤＮＡ結合ドメイン及び試験ジンクフィンガードメインを含む転写因子のＫd
は、例えば、標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインを
欠如した転写因子に比べて増加する。例えば、特異性を有する標的部位と複合体
を成した転写因子の解離定数（Ｋd）は約５０nM、１０nM、１nM、０．１nM、０
．０１nMまたはそれ未満であり得る。Ｋdは試験管内ＥＭＳＡにより決定され得
る。
【００５９】 試験ジンクフィンガードメインが固定ＤＮＡ結合ドメインの生体内結合親和性
を増大させる能力を測定することにより、敏感で正確にＤＮＡ結合特異性が検査
できるこのような発見は、ヒトゲノムから新規ジンクフィンガードメインの迅速
な単離及び特性化を可能にする。
【００６０】 固定されたＤＮＡ結合ドメインは、すなわち、例えば、複数のドメインを有す
るか、またはオリゴマーである自然発生的ＤＮＡ−結合タンパク質等の自然発生
のＤＮＡ−結合タンパク質から単離された単位的ドメインを含む。例えば、Ｚｉ
ｆ２６８のフィンガー１及び２のような二つの公知のジンクフィンガーの両方を
、固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる。当業者であれば
、数多くの核酸結合ドメイン（例えば、ホメオドメイン、ヘリックス−ターン−
ヘリックスドメインまたはヘリックス−ループ−ヘリックスドメインのような本
明細書に記載されたドメインファミリー、または当業界で特性が知られた核酸結
合ドメイン）からシステムに好適な固定ＤＮＡ結合ドメインを同定することがで
きるはずである。固定されたＤＮＡ結合ドメインにより認識される招集部位の適
切な選択が更に要求される。招集部位は、固定されたＤＮＡ結合ドメインが得ら
れた自然発生のＤＮＡ結合タンパク質に対する天然の結合部位内の下位部位（su
bsite）であり得る。必要に応じて、固定ドメインまたは招集部位に突然変異を
導入してシステムの敏感性を増加させることができる。
【００６１】 生体内のスクリーニングシステムに適合した細胞には真核細胞及び原核細胞全
てが含まれる。例示的な真核細胞には、例えば、サッカロマイセス・セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポムベ（Saccharomyces po
mbe）及びピッチア・パストリス（Pichia pastoris）細胞のような酵母細胞など
がある。
【００６２】 前記スクリーニングシステムを使用してジンクフィンガードメインを選択する
ために、サッカロマイセス・セレビジエを使用する酵母ワン−ハイブリッドシス
テムを変形させた。まず、ＨＩＳ３リポーター遺伝子をコードするリポータープ
ラスミドを調製した。予め決定された４−ｂｐ標的ＤＮＡ配列を、切断された結
合配列に連結させてＤＮＡ−結合ドメインについての複合結合配列を提供し、そ
れぞれの複合結合配列を別個のプラスミド上のリポーター遺伝子に作動可能に連
結させた。
【００６３】 ハイブリッド核酸配列は、切断されたＤＮＡ結合ドメイン及びジンクフィンガ
ードメインを含むＤＮＡ結合ドメインに連結された転写活性化ドメインをコード
する。
【００６４】 本願で使用された結合部位は、隣接した（連続的な）部位が頻繁に使用される
が、必ずしも隣接する必要はない。隣接していない部位を認識するタンパク質を
調製するためには、核酸結合ドメイン間に伸縮性があるか、及び／又は、伸張性
があるリンカーを使用し得る。
【００６５】 本発明の一態様によれば、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２で構
成され、フィンガー３が欠如されたポリペプチドを固定されたＤＮＡ結合ドメイ
ンとして使用することができる（Ｚｉｆ２６８の３個のジンクフィンガー中、フ
ィンガー１はＮ−末端、フィンガー２は中間、フィンガー３はＣ−末端に位置す
るジンクフィンガードメインを指す）。また、結合部位が特徴づけられた如何な
る２個のジンクフィンガードメインでも固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使
用することができる。
【００６６】 他の有用な固定されたＤＮＡ結合ドメインは他のジンクフィンガータンパク質
、例えば、Ｓｐ１、ＣＦ２−II、ＹＹ１、クルペル（Kruppel）、ＷＴ１、Ｅｇ
ｒ２、またはＰＯＵ−ドメインタンパク質、例えば、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２、及び
Ｐｉｔ１から由来し得る。しかし、これらは例として提供されたものであり、本
発明はこれらに限定されない。
【００６７】 本発明の一具体的な実施例によれば、最適のＺｉｆ２６８認識配列（５′−Ｇ
ＣＧ ＴＧＧ ＧＣＧ−３′）の５′末端から４−ｂｐを欠損させて生成された
５′−ＧＧＧＣＧ−３′塩基配列が招集部位として使用され得る。３乃至４ｂｐ
のいかなる標的配列でも、これら招集部位に連結されて複合結合配列が生成でき
る。
【００６８】 活性化ドメイン。本発明で使用することができる転写活性化ドメインは、酵母
のＧａｌ４活性化ドメイン及びヘルペスシンプルレックスウイルスのＶＰ１６ド
メインを含むが、これに限定されない。バクテリアにおいて活性化ドメインの機
能は、野生型ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットＣ−末端ドメインまたは突然変
異体αサブユニットＣ−末端ドメインを招集できる融合ドメイン（例えば、タン
パク質相互作用ドメインに融合されたＣ−末端ドメイン）により摸倣できる。
【００６９】 抑制ドメイン。所望であれば、活性化ドメインの代りに抑制ドメインがＤＮＡ
結合ドメインに融合され得る。真核細胞抑制ドメインの例には、オレンジ（ORAN
GE）、グローチョー（groucho）、及びＷＲＰＷ〔Dawson et al (1995) Mol.Cel
l Biol. 15:6923-31〕が含まれる。抑制ドメインを使用する時は、毒性リポータ
ー遺伝子及び（または）非選択性マーカーを使用して減少した発現を示す個体を
スクリーニングすることができる。
【００７０】 リポーター遺伝子。リポーター遺伝子は、例えば、薬物耐性を付与する遺伝子
、または栄養要求性マーカーのような選択性マーカーであり得る。薬物耐性遺伝
子の例には、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）シクロヘキサミ
ド耐性遺伝子（ＣＹＨ）、サッカロマイセス・セレビシエカナバニン耐性遺伝子
（ＣＡＮ１）、及びハイグロマイシン耐性遺伝子などがある。サッカロマイセス
・セレビシエ栄養要求性マーカーには、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ
２及びＴＲＰ１遺伝子などがある。栄養要求性マーカーがリポーター遺伝子であ
る時は、栄養要求性遺伝子の機能的コピーが欠けているため、特定代謝物質が生
産できる能力が欠如された細胞が使用される。代謝物質が欠如した培地で細胞を
維持することにより、標的部位に結合する試験ジンクフィンガードメインをコー
ドする構築物の選択が可能である。例えば、ＨＩＳ３遺伝子はｈｉｓ３−酵母菌
株と共に選択性マーカーとして使用され得る。ハイブリッド転写因子をコードす
る構築物の導入後に、細胞をヒスチジン欠乏培地上で成長させる。哺乳類細胞の
選択可能マーカーには、例えば、チミジンキナーゼ、ネオマイシン耐性、及びHP
RTが当業者によく知られている。
【００７１】 別法として、リポーター遺伝子がコードするタンパク質の存在を容易に確認し
、及び／又は定量化することができる。そのようなリポーター遺伝子の例には、
ｌａｃＺ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシ
ファラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、青色蛍光タンパク質（BFP）及び例えば、変更されたり向上した蛍光特性を有
するＧＦＰ誘導体〔Clontech Laboratories,Inc., CA〕などがある。lａｃＺを
発現する細胞のコロニーは比色基質Ｘ−ｇａｌを含むプレートでコロニーを成長
させることにより検出することができる。ＧＦＰ発現は、励起の上、蛍光放出を
測定して検出することができる。個々のＧＦＰ発現細胞は蛍光活性化細胞分類機
（ＦＡＣＳ）を使用して同定され、分離され得る。
【００７２】 このシステムは、２種類のリポーター遺伝子（例えば、選択可能リポーター遺
伝子及び選択不可能リポーター遺伝子）を利用して構築され得る。選択可能マー
カーは、適当な成長条件下で所望のドメインを有する細胞のみが成長するように
するので、所望のドメインの迅速な同定を容易にする。選択不可能リポーターは
、例えば、偽陽性を区別するための確認手段、及び結合程度を定量化する手段を
提供する。前記二つのリポーターは、ゲノムの互いに異なる位置に挿入されるこ
とができ、ゲノムに直列に挿入されることができ、同一の染色体外の要素（例え
ば、プラスミド）に含まれたり、または互いに異なる染色体外要素に含まれるこ
とができる。
【００７３】 図５は、所望のジンクフィンガードメインを選別するために使用された変形し
たワン−ハイブリッドシステムの原理を示す。ハイブリッド転写因子のＤＮＡ結
合部位は（ａ）Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２からなる切断され
たＤＮＡ結合部位と（ｂ）ジンクフィンガードメインＡまたはＢで構成される。
リポーター遺伝子のプロモーター領域に位置した結合部位の塩基配列は、４ｂｐ
の標的配列（ヌクレオチド１−４，５′−ＸＸＸＸ−３′）及び切断された結合
配列（ヌクレオチド５−９，５′−ＧＧＧＣＧ−３′）からなる複合結合配列（
５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３′）である。
【００７４】 ハイブリッド転写因子内の試験ジンクフィンガードメイン（図５のＡ）が標的
配列を認識するならば、ハイブリッド転写因子は複合結合配列に安定に結合でき
る。このような安定した結合はハイブリッド転写因子の活性化ドメインの作用（
図５のＡＤ）を通じてリポーター遺伝子の発現をもたらす。その結果、ＨＩＳ３
がリポーター遺伝子として使用された時、形質転換酵母はヒスチジンが欠如され
た培地で成長する。または、lａｃＺがリポーター遺伝子として使用された時に
は、形質転換酵母はlａｃＺタンパク質の基質であるＸ−gａlを含む培地で青色
コロニーとして育つ。しかし、ハイブリッド転写因子のジンクフィンガードメイ
ン（図５のＢ）が標的配列を認識するのに失敗すれば、リポーター遺伝子の発現
は誘導されない。その結果、形質転換酵母はヒスチジンを欠如した培地で成長で
きないか（ＨＩＳ３がリポーター遺伝子として使用された時）、またはＸ−gａl
を含む培地で白色コロニーとして成長するようになる（lａｃＺがリポーター遺
伝子として使用された時）。
【００７５】 この改変されたワン−ハイブリッドシステムを利用する選別法は、この過程を
通じて選別されたジンクフィンガードメインが細胞内環境で機能的であると立証
されたため、有利である。したがって、このドメインは恐らく折りたたまれ、核
に入ることができ、細胞内プロテアーゼ及び損傷が与えられる他の可能な細胞内
物質に対して耐えられると推測される。その上、本願で開示された改変されたワ
ン−ハイブリッドシステムは、所望のジンクフィンガードメインの簡単で迅速な
単離を可能にする。本願の改変されたワン−ハイブリッドシステムでは、所望の
ジンクフィンガードメインを単離するために単１回の酵母形質転換のみを必要と
する。
【００７６】 本願で記述された選別法は、例えば、植物または動物（例えば、哺乳類、例え
ば、ヒト）種のゲノム等のゲノムからジンクフィンガードメインを同定するのに
使用することができる。また、本方法は、例えば、無作為突然変異法により調製
された突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリーからジンクフィンガー
ドメインを同定するのに使用することができる。また、前記２つの方法は一緒に
使用され得る。例えば、特定３−ｂｐまたは４−ｂｐＤＮＡ配列に対するジンク
フィンガードメインがヒトゲノムから単離されなかった場合に、無作為または部
位指示的突然変異誘導により調製されたジンクフィンガードメインのライブラリ
ーを前記ドメインについてスクリーニングすることができる。
【００７７】 酵母における改変されたワン−ハイブリッドシステムが与えられた標的配列を
認識し、結合するジンクフィンガードメインを選別するために望ましい方法であ
るが、当業者ならば酵母ワン−ハイブリッド選別法以外に他のシステムが使用さ
れ得ることが明らかなはずである。例えば、真核生物体のゲノムから由来した自
然的に発見されるジンクフィンガードメインのライブラリーをスクリーニングす
るのにファージディスプレイ選別法が使用されることもある。
【００７８】 本発明は、多様な培養細胞にワン−ハイブリッド法を使用することを含む。例
えば、標的配列に作動可能に連結されたリポーター遺伝子を培養中の原核細胞ま
たは動物または植物細胞に導入でき、そして、培養細胞をジンクフィンガードメ
インのライブラリーをコードするプラスミド、ファージ、またはウイルスで形質
移入することができる。その後、リポーター遺伝子が活性化された単離された細
胞から、標的配列を認識する所望のジンクフィンガードメインを得ることができ
る。
【００７９】 下記に示された実施例は、前記方法が関心のある結合部位を認識するジンクフ
ィンガードメインが同定できることを証明する。フィンガー３に位置した多様な
ジンクフィンガードメインを有するハイブリッド転写因子のライブラリーを調製
した。前記ライブラリーから選別された新規なジンクフィンガードメイン（例え
ば、ＨＳＮＫ、ＱＳＴＶ、及びＶＳＴＲジンクフィンガー；後述する）中、いず
れのものも相当する親フィンガータンパク質ではＣ−末端に天然には位置しなか
った。これは、ジンクフィンガードメインは単位的（モジュール性）ということ
と、ジンクフィンガードメインを適切に混合し、配列して新規なＤＮＡ結合ドメ
インが構成できるということを明確に証明する。
【００８０】 本発明の方法により選別されたジンクフィンガードメインは、適切な再配列及
び組換えにより新規なＤＮＡ結合タンパク質を作るための組立単位として使用さ
れ得る。例えば、ＨＩＶ−１の共受容体であるヒトＣＣＲ５のプロモーター領域
を認識する新規なＤＮＡ結合タンパク質を次のように構築することができる。ヒ
トＣＣＲ５のプロモーター領域は、５′−ＡＧＧ ＧＴＧ ＧＡＧ Ｔ−３′（
配列番号４）（図６）の１０−ｂｐ配列を含む。本願で開示された改変されたワ
ン−ハイブリッドシステムを使用し、特異的にそれぞれ５′−ＡＧＧＧ−３′、
５′−ＧＴＧＧ−３′、及び５′−ＧＡＧＴ−３′の４−ｂｐ標的配列中の一つ
を認識する３個のジンクフィンガードメインが単離できる。これら標的配列はＣ
ＣＲ５標的配列中、オーバーラップする４−ｂｐ断片である。これら３個のジン
クフィンガードメインを適切なリンカーで連結し、調節ドメイン（例えば、ＶＰ
１６ドメイン及びＧＡＬ４）または抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に付着さ
せ、ＣＣＲ５プロモーターに特異的に結合する新規の転写因子が生成できる。こ
れらジンクフィンガータンパク質はＨＩＶ−１増殖の防止を助けるために遺伝子
治療に使用されることができる。
【００８１】高効率スクリーニング 下記方法は、複数の可能性のあるＤＮＡ結合部位や、更には全ての可能なＤＮ
Ａ結合部位に対する集合体内の各ドメインの相対的生体内結合親和性の迅速な測
定を可能にする。核酸結合ドメインをコードする核酸の大規模集合体を製造した
。各核酸結合ドメインはハイブリッド核酸構築物で試験ジンクフィンガードメイ
ンとしてコードされ、一つの交配型の酵母菌株で発現される。これにより、全て
の可能なまたは所望のドメインを発現する第１セットの酵母菌株が製造される。
リポーター構築物内に前記ドメインの推定標的部位についてのリポーター構築物
を含有する酵母菌株の第２セットを反対の交配型で製造する。それぞれ異なる試
験ジンクフィンガードメインと異なる標的部位リポーター構築物を有する、融合
された細胞のマトリックスを生成するために、本方法は、複数のまたは全ての可
能性のある対交配の遂行を要求する。それぞれの融合された細胞について、リポ
ーター遺伝子の発現が測定される。これにより本方法は迅速で難しくなく試験さ
れるドメインらの結合優先性を決定する。
【００８２】 例えば、与えられたプロファイルに一致する推定ドメインをゲノムデータベー
スを調査することにより、ドメインの集合体が同定された。前記集合体は、例え
ば、１０〜２０個のドメイン、または全ての同定されたドメイン、可能には、数
千個またはそれ以上を含む。データベースで同定された、ドメインをコードする
核酸は、合成オリゴヌクレオチドを使用して増幅する。前記合成オリゴヌクレオ
チドを設計する手作業のまたは自動化された方法は、本技術分野で通常のことで
ある。追加的なドメインをコードする核酸は縮重プライマーで増幅され得る。前
記集合体のドメインをコードする核酸を前記記述された酵母発現プラスミドにク
ローニングして、このドメインとＺｉｆ２６８の初めの二つのフィンガー及び転
写活性ドメインとの融合タンパク質が生成できる。複数のドメインをコードする
核酸をクローニングするために増幅及びクローニング工程をマイクロタイタープ
レート形式で行う。
【００８３】 または、酵母発現ベクタに前記ドメインをコードする複数の増幅された核酸を
速かに挿入するために組換えクローニング方法を使用することができる。この方
法は、米国特許第５，８８８，７３２及び「ゲートウェイ」マニュアル（Life T
echnologies-Invitrogen、CA、USA）に記述されており、増幅プライマー端に位
置−特異的組換え酵素（recombinase）のための必要に応じた部位を含めること
を必要とする。発現ベクターは、ドメインをコードする増幅された核酸が挿入さ
れる位置に追加的な部位を含む。これらの部位は終結コドンが欠如されるように
設計された。増幅産物、発現ベクター、及び部位特異的な組換え酵素の添加は、
組換え反応による増幅された配列のベクターへの挿入をもたらす。例えば、首尾
のよい挿入で毒性遺伝子が置換される等の追加的な特徴は、この方法を効率の高
いものとし、高効率の生体内スクリーニングに好適なものとする。
【００８４】 制限酵素媒介の及び／又は組換えのクローニングは、それぞれの確認されたド
メインをコードする核酸を発現ベクターに挿入するのに使用され得る。このベク
ターはバクテリア中で増殖でき、索引されたマイクロタイタープレートで凍結で
きるため、それぞれのウェルが互いに異なる、唯一無二なＤＮＡ結合ドメイン中
の一つをコードする一つの核酸を有している一つの細胞を含めることができる。
【００８５】 それぞれのドメインについて単離されたプラスミドＤＮＡを得て、一つの酵母
細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＡＴａ細胞に形質転換させる。
発現ベクタが選択可能マーカーを有しているため、形質転換された細胞はマーカ
ーが選別できる栄養条件の最小培地で育つことができる。前記細胞を後日の使用
のために、例えば、マイクロタイタープレートで凍結貯蔵することができる。
【００８６】 酵母菌株の第２セットを、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＡＴα細
胞に構築する。この酵母菌株セットは多様な相異するリポーターベクターを含む
。その後、唯一なＤＮＡ結合ドメインを有する発現ベクタを含有するそれぞれの
酵母菌株を前記リポーター遺伝子セットのそれぞれの酵母菌株と交配させる。こ
れら２菌株は互いに反対の交配型であり、互いに異なる栄養要求性を有するよう
に遺伝子操作されたため、二倍体が容易に選別できる。このような二倍体はリポ
ーター及び発現ベクターの両方を有する。この細胞はまた、リポーター及び発現
プラスミドの両方共が選別できる栄養条件下で維持される。ユエツら（2000, Na
ture 403:623-7）は、このような酵母交配のマトリックスを作製し、全ての酵母
タンパク質の完壁なツー−ハイブリッド地図を記述している。
【００８７】 リポーター遺伝子発現は、高容量の形式（例えば、マイクロタイタープレート
）でも感知できる。例えば、ＧＦＰをリポーターとして使用する時、交配された
細胞のマトリックスを含むプレートを蛍光についてスキャンできる。
【００８８】新規なＤＮＡ結合タンパク質の単位体の組立 適切なジンクフィンガードメインを混合し、配合して目的の９−ｂｐまたはそ
れ以上のＤＮＡ配列を認識する新たなＤＮＡ結合タンパク質を合理的に構築する
ことができる。ジンクフィンガードメインの単位体的構造は、新たなＤＮＡ結合
タンパク質を構築するためのそれらの再配列を容易にする。図１に示されている
ように、天然に生成されるＺｉｆ２６８タンパク質におけるジンクフィンガード
メインはＤＮＡ二重螺旋に沿って一列で位置する。それぞれのドメインは相異す
る３−４ｂｐＤＮＡセグメントを独立に認識する。
【００８９】 ジンクフィンガードメインのデータベース。前述のワン−ハイブリッド選別シ
ステムは可能な３−４塩基対結合部位のそれぞれに対し、一つ以上のジンクフィ
ンガードメインを同定するのに使用され得る。その結果は、マトリックスまたは
データベース（例えば、相関的なデータベース）として貯蔵され得る。データベ
ースはそれぞれの部位に結合するジンクフィンガードメインの相対的な親和性に
ついての指示事項を含んでいてもよい。
【００９０】 また、前記ジンクフィンガードメインらの標的配列特異性を立証するために、
これらを複数の相異する融合タンパク質に融合された状況で検査できる。さらに
、少量のドメインのみが利用可能な特定の結合部位は、追加的な選別スクリーニ
ングの標的となり得る。このような選別のためのライブラリーは、類似している
が明確に区別される結合部位に結合するジンクフィンガードメインに突然変異を
誘導して調製できる。可能性のあるドメインを最大に活用するために、標的結合
部位に対してドメインを交叉させることができるため、それぞれの可能な結合部
位に対するジンクフィンガードメインの完全なマトリックスは必須なものではな
い。このような交叉は、最も有用な３−４塩基対結合部位における結合部位を分
析し、更にまたジンクフィンガードメイン間のリンカーの長さを変化させること
により達成できる。設計されたポリペプチドが部位選択性及び高い親和度を全て
有するようにするためには、所望の部位に対し、高い特異性を有するジンクフィ
ンガードメインの両側を、更に高い親和度を有するが、特異性が劣る他のドメイ
ンと接するように連結させることができる。本願で記述された生体内スクリーニ
ング方法は、人工的に組立てられたジンクフィンガータンパク質及びこれらの誘
導体の生体内機能、親和性、及び特異性を試験するのに利用できる。同様に、本
方法は、例えば、多様なリンカー組成のライブラリー、ジンクフィンガードメイ
ン単位体のライブラリー、ジンクフィンガードメイン組成のライブラリーなどの
ライブラリーを製造すること等により、組立されたタンパク質を最適化するのに
使用され得る。
【００９１】 標的部位の分解。標的９−ｂｐまたはそれ以上のＤＮＡ配列は、３−４ｂｐの
セグメントに分解される。それぞれの分解された３−４ｂｐセグメントを認識す
るジンクフィンガードメインを同定する（例えば、前記にて言及のデータベース
から）。例えば、２０ｂｐ乃至５００ｂｐ配列の、より長い標的配列も、その配
列内で９ｂｐ、１２ｂｐ、及び１５ｂｐ下位配列を同定することができるため、
標的配列として適している。特に、データベースによく現れている部位に分解で
きる下位配列は、最初の設計標的として機能できる。
【００９２】 組立された単位体の製造。隣接した３−４ｂｐ下位部位または近傍の下位部位
を認識する複数のジンクフィンガードメインを含むようにポリペプチドを設計す
る。設計されたポリペプチド配列をコードする核酸配列は、合成することができ
る。合成遺伝子を構築することは、この技術分野では日常的なことである。その
ような方法には、必要に応じて合成されたオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ媒介され
たクローニング、及びメガプライマーＰＣＲからの遺伝子構築などがある。例え
ば、ライブラリーを形成するため、複数の核酸配列を合成することができる。そ
の認識特異性が前記位置に適合する異なったジンクフィンガードメインをコード
するように任意の与えられた位置で変化するドメインをコード核酸ライブラリー
を設計できる。各位置でジンクフィンガードメインの同一性を変化させるために
、セクシュアル（Sexual）ＰＣＲ及び「ＤＮＡシャッフリングTM」（Maxygen, I
nc., CA）が使用され得る。
【００９３】 ペプチドリンカー。ＤＮＡ結合ドメインは、多様なリンカーにより連結され得
る。リンカーの有用性と設計はこの技術分野でよく知られている。特に有用なリ
ンカーは核酸によりコードされるペプチドリンカーである。したがって、第一の
ＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、及び第二のＤＮＡ結合ドメインをコー
ドする合成遺伝子を構築することができる。このような設計は大規模の人工の複
数−ドメインＤＮＡ結合タンパク質を構築するために反復できる。PCT WO 99/45
132及びキム及びパボ（1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7）は、ジ
ンクフィンガードメインらを連結するのに好適なペプチドリンカーの設計を記述
している。
【００９４】 ランダムコイル、α−ヘリックス、又はβ−プリーツの３次構造を形成する追
加的なペプチドリンカーが使用できる。好ましい柔軟性のあるリンカーを形成す
るポリペプチドは、この技術分野でよく知られている〔例えば、Robinson and S
auer(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34参照〕。柔軟性のあるリ
ンカーは、典型的にグリシンを含むが、これはグリシンアミノ酸が側鎖が欠如さ
れていて回転自由度のある唯一なアミノ酸であるためである。親水性を増加させ
るために、セリンまたはトレオニンをリンカーに挿入することができる。併せて
、結合親和性を増加させるためにＤＮＡのリン酸骨格と相互作用可能なアミノ酸
が使用され得る。前記アミノ酸の賢明な使用により、親和性を上げることと配列
特異性が減少することの間のバランスを取ることができる。仮りに、リンカーと
して、厳格な伸張性が望ましいのであれば、文献〔Pantoliano et al.(1991) Bi
ochem. 30:10117-10125〕に記述された螺旋リンカーのようなα−ヘリックスリ
ンカーを使用することができる。また、リンカーはコンピュータモデリングによ
り設計できる（米国特許第４,９４６,７７８参照）。分子モデリングのためのソ
フトウェアを購入して使用することができる〔例えば、Molecular Simulations,
Inc., San Diego, CAから〕。このようなリンカーは、標準的な突然変異誘導技
術及びタンパク質工学の技術分野で用いられる生物理学的テストを利用し、本願
に記述された機能的分析を使用し、任意に最適化、すなわち、例えば、抗原性を
減少させるか、及び／又は安定性を増加させることができる。
【００９５】 ジンクフィンガードメインを活用した実施のために、ジンクフィンガー間で天
然に生成されるタンパク質を、フィンガーを互いに連結するのに使用することが
できる。前記天然に生成されるリンカーとして典型的なものは、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）（配
列番号７８）である（agata et al. 前記参照）。
【００９６】 二量体化ドメイン。ＤＮＡ結合ドメインを連結する他の方法は、二量体化ドメ
イン、特に異種二量体化ドメイン〔Pomerantz et al.(1998) Biochemistry 37:9
65-970参照〕を使用することである。この実施態様では、ＤＮＡ結合ドメインが
別個のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、第一のポリペプチドは、ＤＮＡ結
合ドメインＡ、リンカー及びドメインＢをコードする反面、第二のポリペプチド
は、ドメインＣ、リンカー及びドメインＤをコードする。当業者は、特性が明ら
かになった多くの二量体化ドメインから一つの二量体化ドメインを選択すること
ができる。同種二量体が望ましくないとすれば、異種二量体化を好むドメインを
使用することができる。特に適用可能な二量体化ドメインは、コイル化されたコ
イルモチーフ（例えば、二量体平行または逆平行コイル化されたコイル）である
。優先的に異種二量体を形成するコイル化されたコイルをまた利用することがで
きる〔Lumb and Kim、(1995) Biochemistry 34:8642-8648〕。二量体化ドメイン
の他の種類であって二量体化が小分子により、または信号伝達経路を通じて誘発
されるものがある。例えば、ＦＫ５０６の二量化形態は、二つのＦＫ５０６結合
タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを二量体化するのに使用され得る。このような
二量体化ドメインは追加的な調節工程を提供するために利用され得る。
【００９７】機能性検査（Functional Assays）及び使用 生化学的検査に加えて、核酸結合ドメインまたは本願で記述された方法（例え
ば、単位体組立）により設計されたタンパク質の機能を生体内で検査できる。例
えば、標的部位（例えば、細胞増殖に必要な遺伝子のプロモーター部位）に結合
するドメインが選択され得る。単位体組立により、（１）標的プロモーター部位
にまたがる下位部位にそれぞれ結合するように選択されたドメイン及び（２）Ｄ
ＮＡ抑制ドメイン（例えば、ＷＲＰＷドメイン）を含むタンパク質が設計できる
。
【００９８】 設計されたタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、Kang及びKimの文献
〔2000, J. Biol. Chem. 275:8742〕により記述された誘導性発現ベクターなど
の発現ベクターにクローニングできる。このような構造体を組織培養細胞または
胚性幹細胞に形質感染させることにより、対象モデルとしてのトランスジェニッ
ク組織が生成できる。このようなトランスジェニック動物モデルでタンパク質の
発現を誘導し、組織培養細胞の細胞増殖を調査したり、または発生学的変化及び
（または）腫瘍成長を調査して、設計されたタンパク質の効率が決定できる。併
せて、標的にした遺伝子の発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザン
ブロットのようなｍＲＮＡを検出する一般的な方法により検査できる。更に完壁
な測定のためには設計されたタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞からｍ
ＲＮＡを精製する。このようなｍＲＮＡの二つのプールを利用して、大規模な遺
伝子集合物（例えば、関心のある条件（例えば、癌）に関係した遺伝子の集合物
または生物体のゲノムで同定された遺伝子の集合物）に対するプローブを含有す
るマイクロアレイを探知する。このような検査は、設計されたタンパク質の特異
性を決定するのに特に有用である。万が一、設計されたタンパク質が高い親和度
を有するものの、低い特異性を有すれば、予想される標的遺伝子以外に遺伝子の
発現にも影響を与えて多面的で望ましくない効果を持たらすことがある。このよ
うな効果は転写物の全体的な分析により明らかになる。
【００９９】 加えて、設計されたタンパク質は、内生の遺伝子を調節するために、対象細胞
又は対象組織中で産生することができる。設計されたタンパク質は、内生の遺伝
子の領域に結合させるため、及び転写活性化又は抑制機能を与えるために、上記
のように改変される。Kang及びKim（上記）に記載されているように、プロモー
ターの誘導物質の濃度を調整することにより、内生の遺伝子の発現を、濃度依存
的方法で調節することができる。
【０１００】結合部位優先性検査 各ドメインの結合部位優先性は、ＥＭＳＡ、ＤＮａｓｅフットプリント法（fo
otprinting）、表面プラスモン共鳴法、またはカラム結合のような生化学的検査
により確認することができる。結合に必要な基質には、標的部位を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを使用することができる。このような検査は、非特定ＤＮＡを競
合物として、または特定ＤＮＡ配列を競争体として含むことができる。特定競争
体ＤＮＡには、一つ、二つ、または三つの核酸突然変異を有する認識部位が使用
され得る。したがって、生化学的検査により所定部位に対するドメインの親和度
のみならず、他の部位に対する所定部位の相対的親和性も測定できる。レバー及
びパボ〔Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673〕は、ＥＭＳＡからジン
クフィンガードメインに対する絶対Ｋd常数を得る方法を記述している。
【０１０１】 本発明は、下記実際的な実施例を通じて更に具体的に記述されるはずである。
しかし、これら実施例は本発明の範囲を制限しようとする意図から提供されたも
のでないことに留意すべきである。
【０１０２】 実施例１：ハイブリッド転写因子発現のためのプラスミドの製造 ジンクフィンガー転写因子を発現する発現プラスミドを、ｐＰＣ８６〔Chevra
y & Nathans(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793〕を改変して調
製した。以下に記述されるＤＮＡ操作は文献〔Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel et al. (1998), John Wiley & Sons, Inc.〕に提示された一
般的な方法により遂行した。ｐＰＣ８６内のＳａlIとＥｃｏＲＩ認識場所間にＺ
ｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入してｐＰ
ＣＦＭ−Ｚｉｆを作った。このクローニング工程の結果は、酵母Ｇａｌ４転写活
性化ドメインにＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質が連結された翻訳融合
タンパク質をもたらす。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを酵母菌細胞に形質転換させれば、
Ｇａｌ４活性化ドメインとＺｉｆ２６８ジンクフィンガーを含むハイブリッド転
写因子が発現される。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆ内にクローニングされたＺｉｆ２６８
ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ配列を図９に表した。
【０１０３】 ジンクフィンガードメインのライブラリーを構築するためのベクターとして、
ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆプラスミドを利用した。ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆは、ｐＰＣ
ＦＭ−Ｚｉｆのフィンガー３コーディング部位前に終止コドンとＰｓｔＩ認識配
列を含むオリゴヌクレオチドカセットの挿入により構築される。前記オリゴヌク
レオチドカセットは、二つの合成オリゴヌクレオチド、すなわち、５′−ＴＧＣ
ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ−３′（配列番号７９
）及び５′−ＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧ
−３′（配列番号８０）をアニーリングして形成される。終止コドンの挿入は、
Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をコードするプラスミドライブラリーの生成を防止
する。
【０１０４】 下記「実施例２」に記載のとおり、プラスミドはジンクフィンガードメインラ
イブラリーの作成のためのべクターとして用いた。
【０１０５】 加えて、個別のジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡ配列のギャップ
修復クローニングを、ハドソンら（１９９７、Genome Research 7:1169-1173）
記載に細部の改変を施して行った。
【０１０６】 個別のジンクフィンガードメインをクローン化するため、オーバーラップした
２つのオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、第２
ラウンドのＰＣＲ（再ＰＣＲ）のための２１ヌクレオチド長の共通の尾部を５′
末端に含み、当該個別のジンクフィンガードメインをコードする核酸にアニーリ
ングする特異的配列を含む。順向き及び逆向きのプライマーは、それぞれ、５′
−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＮ48-51−３′（配列番号１０
８）及び、５′−ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＮ42-45−３′
（配列番号１０９）（ここで、Ｎ48-51及びＮ42-45は、ジンクフィンガードメイ
ンをコードする核酸にアニーリングさせるための必要に応じた配列に相当する）
である。二本鎖ＤＮＡは、テンプレートの核酸を、２つのオリゴヌクレオチドの
等モルの混合物と一緒に増幅することによって調製した。ＰＣＲ条件は、９４℃
３分での第１サイクルに続き、９４℃１分、５０℃１分及び７２℃３０秒での５
サイクルからなる。
【０１０７】 その後、それぞれのジンクフィンガードメインをコードする二本鎖ＤＮＡを、
第２ラウンドＰＣＲにおいてテンプレートとして用いた。再ＰＣＲプライマーは
２つの領域を有し、１つの領域は、酵母ベクターｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一であ
り、第二の領域は、上記２１ヌクレオチド長の共通の尾部配列と同じである。順
向きプライマーの配列は、 ５′−ＴＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＧＴＡＧＴ
ＧＡＣＣＡＣＣＴＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣ
ＣＡＧＡＡＡＣＣＣ−３′（配列番号１３８） 及び逆向きプライマーの配列は、 ５′−ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＴ
ＣＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴ−３′（配列番号１３９） である。反応混合液は、２５ul中に、それぞれのプライマーを２．５pmol、Ｍｇ
2+を１．５mM、Ｔａｑポリメラーゼ２unit及びＰｆｕポリメラーゼ０．０１unit
を含む。反応は、９４℃３分、その後９４℃１分、６５℃１分及び７２℃３０秒
で２０サイクルを回して行った。ギャップ修復クローニングは、再ＰＣＲ産物の
混合物及び、ＭｓｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化した直線化したｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆ
ベクターを酵母ＹＷ１細胞に形質移入することによって行った。酵母ベクターｐ
ＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一の領域は、細胞中のベクターでの相同的組換えを可能に
する。
【０１０８】 実施例２：ジンクフィンガードメインライブラリーの製造 天然に存在するジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーをヒトの
ゲノムからジンクフィンガードメインをクローニングすることにより製造した。
縮重プライマー及びＰＣＲを利用してヒトのゲノムＤＮＡ（Promega Corporatio
n；米国ウィスコンシン州マジソン）からジンクフィンガードメインをコードす
るＤＮＡ断片を増幅した。ヒトジンクフィンガードメインをクローニングするた
めに使用された縮重ＤＮＡプライマーのＤＮＡ配列は次の通りである。
【０１０９】 ５′−ＧＣＧＴＣＣＧＧＡＣＮＣＡＹＡＣＮＧＧＮＳＡＲＡ−３′（配列番号
８１）及び
【０１１０】 ５′−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＮＮＢＲＷＡＮＧＧＹＹＴＹＴＣ−３′（配列番号８
２）
【０１１１】 （ここで、ＲはＧ及びＡを表し、ＢはＧ、Ｃ及びＴを表し、ＳはＧ及びＣを表し
、ＷはＡ及びＴを表し、ＹはＣ及びＴを表し、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを表す）。
【０１１２】 前記塩基配列は、多くの天然に生成されるジンクフィンガータンパク質のジン
クフィンガードメイン間の接合点で発見されるアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ／Ｇｌｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ（配列番号
８３）をコードする核酸配列にアニーリングする〔Agata et al.(1998) Gene 21
3:55-64〕。
【０１１３】 ＰＣＲのバッファ組成は、ＫＣｌ ５０mM、ＭｇＣｌ2 ３mM、Ｔｒｉｓ（pH
８．３）１０mMである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した後、９４℃で３０
秒、４２℃で６０秒、７２℃で３０秒を３５回反復した後、７２℃で１０分間の
最終温置をした。
【０１１４】 前記ＰＣＲ産物を次の通りｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆにクローニングした。ＰＣＲ
産物を電気泳動して１２０ｂｐに相当するＤＮＡ断片を単離した。ＢｓｐＥＩと
ＥｃｏＲＩで消化した後、これをｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに連結した。結果的に、
このプラスミドライブラリーがコードするハイブリッド転写因子のＤＮＡ−結合
ドメインはＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２とヒトゲノムから由来
したジンクフィンガードメインで構成される。全１０6個の大腸菌形質転換体か
らプラスミドライブラリーを調製した。前記ライブラリー製造方法によれば、ジ
ンクフィンガードメイン間で発見される天然に存在するリンカー配列が維持され
る。
【０１１５】 実施例３：ジンクフィンガードメインライブラリーの製造 無作為突然変異生成により突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリー
を調製した。Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をポリペプチド骨格（framework）と
して使用した。無作為突然変異は、配列番号２１（Ｚｉｆ２６８のフィンガー３
）の７３位（アルギニン）、７５位（アスパラギン酸）、７６位（グルタミン酸
）、７７位（アルギニン）、７８位（ライシン）及び７９位（アルギニン）にそ
れぞれ該当する、αヘリックスに沿って−１、２、３、４、５、６位のアミノ酸
に無作為突然変異を導入した。
【０１１６】 これらアミノ酸をコードする核酸配列位置のそれぞれに無作為化コドン、すな
わち、５′−（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ａ／Ｃ／Ｔ）（Ｇ／Ｃ）−３′のコドンを導
入した。この無作為化コドンは２０個のアミノ酸のうち、トリプトファン、チロ
シン、システイン、フェニルアラニンを除いた１６個のアミノ酸中の一つをコー
ドする。前記無作為化コドンは、可能な終止コドン三種を除外させる。突然変異
が挿入された位置を除いた残りの部分はＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク
質のフィンガー３と同一である。前記無作為化コドンは、下記二つのオリゴヌク
レオチド ５′−ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣ−３′（配列番号８４） ５′−ＣＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴ
ＧＳＮＢＳＮＢＡＡＧＳＮＢＳＮＢＳＮＢＳＮＢ
【０１１７】 ＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧ−３′（配列番号８５）（ここで、
ＢはＧ、Ｔ及びＣを表し、ＳはＧ及びＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ及びＴを表す。
）から製造されたオリゴヌクレオチドカセットとして導入される。
【０１１８】 前記二つのオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、常温で３０分間クレノ
ウポリメラーゼを使用して二重鎖にした後、ＡｖａＩとＳａｃIIで処理し、これ
をＳｇｒＡＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃIIで処理したｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆ（実施例１
参照）に挿入した。総１０9個の形質転換された菌株からプラスミドを分離し、
ジンクフィンガー転写因子を指定するプラスミドのライブラリーを製造した。
【０１１９】 実施例４：リポータープラスミドの製造 酵母ＨＩＳ３遺伝子を含むリポータープラスミドを、ｐＲＳ３１５Ｈｉｓ（Wa
ng & Reed(1993), Nature 364, 121-126）を改変して調製した。前記リポーター
プラスミドはまた、このプラスミドを有する形質転換体の選別のための目的でＬ
ＥＵ２マーカーをその天然のプロモーター下に含む。まず、ｐＲＳ３１５Ｈｉｓ
内のSａlI認識配列を除去するためにｐＲＳ３１５ＨｉｓをSａlIとＢａｍＨＩで
処理した後得られた小さい断片と、同じプラスミドをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処
理した後得られた大きい断片を結合させてｐＲＳ３１５ＨｉｓΔＳａｌを作った
。その後、オリゴヌクレオチドデュプレックスをＢａｍＨＩとＸｍａＩ間のｐＲ
Ｓ３１５ＨｉｓΔＳａｌに挿入してＨＩＳ３遺伝子のプロモーター部位にＳａｌ
Ｉ認識配列を導入した。互いにアニーリングされて挿入されるデュプレックスを
形成する二つのオリゴヌクレオチド配列は ５′−ＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧ−３′（配列番号８６
） ５′−ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴ−３′（配列番号８７
） である。その結果生成されたプラスミドをｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳと命名した
。
【０１２０】 ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳに所望の複合配列を挿入して多様なリポータープラ
スミドを作った。前記複合配列は複合配列の４コピーを含む直列配列（tandem a
rray）として挿入される。前記標的配列はＨＩＶ−１のＬＴＲで発見される１０
−ｂｐＤＮＡ配列 ５′−ＧＡＣＡＴＣ ＧＡＧ Ｃ−３′（配列番号１）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−１
２４／−１１５） ５′−ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ Ｔ−３′（配列番号２）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−
２３／−１４） ５′−ＧＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣ Ｔ−３′（配列番号３）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−
９５／−８６） 及びヒト遺伝子ＣＣＲ５のプロモーターに存在する１０ｂｐ配列（図６参照） ５′−ＡＧＧ ＧＴＧ ＧＡＧ Ｔ−３′（配列番号４）ヒトＣＣＲ５（−７０
／−７９） ５′−ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＣＡＴ−３′（配列番号５）ヒトＣＣＲ５（＋７／＋
１６） から由来したものである。
【０１２１】 これらそれぞれの１０−ｂｐＤＮＡ配列のうち、４−ｂｐ標的部位成分を分析す
ることにより、この部位を認識するジンクフィンガードメインを同定した。モジ
ュール性組合せ方法を利用し、このようなジンクフィンガードメインをカップリ
ングすることにより、生体内で前記部位が認識できるＤＮＡ結合タンパク質を調
製することができる。
【０１２２】 図６において、下線部分は４−ｂｐの標的塩基配列の例を表す。これらそれぞ
れの４−ｂｐ標的配列はＺｉｆ２６８のフィンガー１及び２により認識される塩
基配列である５′−ＧＧＧＣＧ−３′の５−ｂｐ招集配列に連結される。このよ
うに生成された９−ｂｐ配列は複合結合配列を構成する。それぞれの複合結合配
列は５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３′の形式を有するが、ここで、ＸＸＸＸは４
−ｂｐ標的配列であり、隣接した５′−ＧＧＧＣＧ−３′は招集配列である。
【０１２３】 図７は、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ内のリポーター遺伝子に作動可能に連結さ
れた、複合結合部位の直列配列が挿入された塩基配列を示す。それぞれの直列配
列は複合結合部位の塩基配列の４コピーが配置されている。それぞれの結合部位
に対し、二つのオリゴヌクレオチドを合成してアニーリングした後、ｐＲＳ３１
５ＨｉｓＭＣＳのSａlIとＸｍａI場所に連結してリポータープラスミドを作った
。
【０１２４】 実施例５：具体的リポータープラスミドの製造 ３塩基対の微小部位に対し、それぞれ一対のリポーター（すなわち、一つはl
ａｃＺ、他の一つはＨＩＳ３）を含むリポータープラスミドのセットを次のよう
に構築した。リポータープラスミドは所望の標的配列をｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣ
Ｓ及びｐＬａｃＺｉに挿入して製造した。それぞれの３塩基対の標的部位に対し
て二つのオリゴヌクレオチドを合成し、互いにアニーリングさせた後、これをｐ
ＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ及びｐＬａｃＺｉのＳａｌＩ及びＸｍａＩ部位間に挿入
した。前記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は次の通りである：５′−ＣＣＧＧ
Ｔ ＮＮＮＴＧＧＧＣＧＴＡＣＮＮＮＴＧＧＧＣＧ ＴＣＡ ＮＮＮＴＧＧＧＣ
Ｇ−３′（配列番号８８）及び５′−ＴＣＧＡＣＧＣＣＣＡＮＮＮ ＴＧＡ Ｃ
ＧＣＣＣＡＮＮＮＧＴＡＣＧＣＣＣＡＮＮＮ Ａ３′（配列番号８９）。全６４
対のオリゴヌクレオチドを合成し、前記二つのリポータープラスミド内に挿入し
た。
【０１２５】 実施例６：所望のＤＮＡ−結合特異性を有するジンクフィンガードメインの選択 与えられた標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガードメインを選択
するために、酵母をリポータープラスミドとハイブリッド転写因子を発現するジ
ンクフィンガーライブラリープラスミドで形質転換させた。以下記述される酵母
の形質転換方法と生体内スクリーニング方法は文献〔Current Protocols in Mol
ecular Biology、Ausubel et al.(1998), John Wiley & Sons, Inc., 米国ニュ
ージャジー州イングルウッド〕に提示された一般的な方法により行われた。酵母
菌株には、ｙＷＡＭ２（ＭＡＴα Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ＵＲＡ３：：ＧＡ
Ｌ１−ｌａｃＺ ｌｙｓ２８０１ ｈｉｓ３−Δ２００ ｔｒｐ１−Δ６３ ｌ
ｅｕ２ ａｄｅ２−１０１ＣＹＨ２）を使用した。
【０１２６】 一例として、まずリポーター遺伝子に作動可能に連結された塩基配列５′−Ｇ ＡＧＣ ＧＧＧＣＧ−３′（４ｂｐの標的配列に下線を付す）の複合結合部位を含
むリポータープラスミドで酵母を形質転換させた。その後、無作為突然変異法で
製造された突然変異ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを前記
形質転換された酵母に導入した。約１０6個程度のコロニーをロイシン及びトリ
プトファンが全て欠如された培地で得た。リポータープラスミド及びジンクフィ
ンガードメイン発現プラスミドはマーカー（marker）としてそれぞれＬＥＵ２遺
伝子とＴＲＰ１遺伝子を有していて、２種類のプラスミドで全て形質転換された
酵母はロイシンとトリプトファンが欠如された培地で育つことができる。
【０１２７】 １つの実施態様において、ヒトゲノムから由来するジンクフィンガードメイン
のライブラリーをリポータープラスミドを含有する細胞に形質転換した。このよ
うな形質転換は、５種類の相異する宿主細胞菌株に対して行われ、それぞれの株
は、リポーター遺伝子に作動可能に連結された相異する５種類の標的配列中の一
つを含有する。ロイシン及びトリプトファンが全て欠如された培地で各形質転換
から約１０5個程度のコロニーを得た。
【０１２８】 形質転換体をロイシン及びトリプトファンが欠如された合成培地を含有するペ
ットリディッシュ上で成長させた。インキュベーション後、プレートに１０％グ
リセロール溶液を加えた後、細胞をかき集めてグリセロール溶液中に凍結保管し
た。単一のアリコートをロイシン、トリプトファン、及びヒスチジンが欠乏した
培地に撒いた。ジンクフィンガー転写因子の作用なしにも微細な量のＨＩＳ３が
発現できるため、これによる細胞成長を抑制するために一部の成長培地にはＨＩ
Ｓ３の抑制剤である３−アミノトリアゾール（ＡＴ）をそれぞれ０、０．０３mM
、０．１mM、０．３mM添加した。ＡＴは、Ｈｉｓ３の競合阻害剤であり、ＨＩＳ
３選択系の感度を滴定する。ＡＴは、Ｈｉｓ３の基礎的な活性を抑制した。その
ような基礎的な活性は、レポータープラスミド上のＨＩＳ３遺伝子の少量の発現
から生じ得る。培地上に展開した約１０7個の酵母細胞うち、ＡＴを欠く選択培
地では数百個のコロニーが育った。ＡＴの濃度の増加につれて、コロニーの数字
が減った。０．３mMのＡＴを含む選択培地では、１０のオーダーでコロニーが育
った。ＡＴを欠いた培地と０．３mMのＡＴを含む培地からそれぞれ数個ずつのコ
ロニーを無作為に選定してこれらを培養した。プラスミドを酵母から分離し、大
腸菌菌株ＫＣ８（pyrF leuB600 trpC hisB463）を形質転換した。これからジン
クフィンガー転写因子をコードするプラスミドを分離して選択されたジンクフィ
ンガードメインのＤＮＡ塩基配列を決定した。
【０１２９】 各選択されたジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を、前記決定されたＤ
ＮＡ塩基配列から演繹的に誘導した。各ジンクフィンガードメインは、塩基−接
触部位における４つのアミノ酸残基、すなわち、αヘリックスに沿って−１、２
、３、６位のアミノ酸残基の名を取って命名した。結果を表１に表した。同定さ
れたジンクフィンガードメインは塩基−接触部位で発見される４個のアミノ酸に
よって命名された。塩基配列を分析した結果、同じジンクフィンガードメインが
反復的に得られる場合があることが分かる。表１において括弧内の数字は、同一
のジンクフィンガードメインがどれだけ多く得られたかを表す。例えば、４塩基
接触部位にＣＳＮＲを有する二つのジンクフィンガーが、ＧＡＧＣ核酸部位に結
合することが同定された（カラム３の「ＧＡＧＣ／ヒトゲノム」参照）。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】 選択されたヒトジンクフィンガードメインをコードする全長ＤＮＡ配列と、こ
れを翻訳して得られたアミノ酸配列を図１１に表した。ヒトゲノムにおいてジン
クフィンガードメインをコードするＤＮＡセグメントを増幅させるために使用し
た縮重ＰＣＲプライマーに相補的な配列を下線で表示した。対立因子の相異又は
増幅における改変の導入のため、この部分の塩基配列は報告されたヒトゲノム配
列の元来塩基配列と異なり得る。
【０１３２】 本発明によるスクリーニングで同定されたほとんどのヒトジンクフィンガード
メインは、新規なポリペプチドであるか、又は不明のオープンリーディングフレ
ームに相当した。例えば、ＨＳＮＫ（GenBank accession numberＡＦ１５５１０
０で報告された配列に含まれる）、ＱＳＴＶ（GenBank accession numberＡＬ１
１０２１７）、ＶＳＴＲ（GenBank accession numberＡＦ０２５７７２で報告さ
れた配列に含まれる）として設計されたジンクフィンガードメインは、その機能
がまだ知られていないタンパク質中に発見された。ここに記載された結果は、こ
れらのジンクフィンガードメインが、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインとして機能
することができるということを示すだけでなく、キメラタンパク質の中で好まし
い、それらの好適な結合部位を立証するものである。
【０１３３】 また、本願発明では、ヒトゲノムから得た前記ジンクフィンガードメインが組
立式で作用して新規なＤＮＡ−結合タンパク質を構築するための構成ブロックと
して使用され得ることを明らかにした。本願発明のヒトジンクフィンガードメイ
ンは、これをＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２に次いでＣ末端に配
置した時、生体内でこれらが特定な標的配列を認識する能力に基づいて選択され
た。したがって、同定されたジンクフィンガードメインは人工的な文脈で特定配
列が認識でき、合成転写因子を設計するためのモジュール性構成ブロックとして
適している。
【０１３４】 実施例７：酵母の対交配（pairwise mating） ３塩基対の標的部位に結合するジンクフィンガードメインの同定を容易にする
ために、酵母細胞の反復的な形質転換を避け、一回の形質転換で６４個のリポー
ター構築物のそれぞれに対して結合する陽性結合形質転換体を探すために、酵母
の交配を利用した。ＹＷ１（ＭＡＴα交配型）及びＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ交配
型）の２種の酵母菌株を使用した。ＹＷ１はｙＷＡＭ２から由来したもので、５
−フルオロオロチックアクシド（ＦＯＡ）耐性であるクローンを選択することに
より、ｙＷＡＭ２のｕｒａ３−誘導体を生成した。
【０１３５】 ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを酵母形質転換によりＹ
Ｗ１に導入した。約１０6個の形質転換されたコロニーから１０％グリセロール
溶液でプレートをかき集めて細胞を収集し、小分画で冷凍させた。６４個のリポ
ータープラスミドの各対（ｐＬａｃＺｉまたはｐＲＳ３１５Ｈｉｓから由来）を
酵母菌株ＹＰＨ４９９に共同形質感染させた。それぞれのリポータープラスミド
対を含有する形質転換体を回収して冷凍させた。
【０１３６】 冷凍させた細胞を溶かした後、これら酵母細胞を最小培地で中間−ログ成長期
まで成長させた。次いで、この２つの細胞類型を混合し、ＹＰＤで５時間交配さ
れるようにした。Ｘ−gａl及びＡＴ（１mM）を含有し、トリプトファン、ロイシ
ン、ウラシル及びヒスチジンが欠如した最小培地で二倍体細胞を選択した。数日
後、選択用プレートで成長した青色コロニーを単離し、これからジンクフィンガ
ードメインをコードするプラスミドを単離し、選択されたジンクフィンガードメ
インのＤＮＡ配列を決定した。
【０１３７】 青色コロニーから単離された核酸をＹＷ１細胞に個別的に再形質転換させた。
それぞれの単離された核酸に対し、再形質転換されたＹＷ１細胞を６４ Ｌａｃ
Ｚリポータープラスミドをそれぞれ含有するＹＰＨ４９９細胞と９６ウェルプレ
ートで交配させ、Ｘ−gａlを含有してトリプトファン及びウラシルが欠けた最小
培地上にばら撒いた。６４個の標的配列に対するジンクフィンガードメインのＤ
ＮＡ結合の親和度及び特異性は青色相の強度により決定された。Ｚｉｆ２６８ジ
ンクフィンガードメインとの対照群実験結果、ジンクフィンガードメインと結合
部位間の陽性相互作用は、濃い青乃至薄い青のコロニーを作り（ここで、青色の
強度は結合親和性に比例する）、陰性相互作用は白色コロニーを作った。
【０１３８】 実施例８：同定されたジンクフィンガードメインと相互作用コードの比較 選択されたジンクフィンガードメインのアミノ酸配列から塩基と相互作用をす
ることと予想されるアミノ酸残基と、ジンクフィンガー−ＤＮＡ相互作用コード
表（図３）から予測したアミノ酸残基との同一性及び類似性を比較した。大部分
のジンクフィンガードメインは、期待されたパターン、すなわちコードから予測
したものとよく合致する決定的な部位のアミノ酸残基を示した。
【０１３９】 例えば、無作為突然変異を通じて製造されたライブラリーから選択されたジン
クフィンガードメイン内の共通的アミノ酸残基は、−１位ではＲ（アルギニン）
（１４個中、７個）またはＫ（ライシン）（１４個中、２個）、３位ではＮ（ア
スパラギン）（１４個中、６個）及び６位ではＲ（１４個中、９個）であった（
表１参照）。これらのジンクフィンガードメインは、ＧＡＧＣプラスミドで選択
された。（リポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５′−ＧＡＧ Ｃ ＧＧＧＣＧ−３’を有するリポータープラスミドをＧＡＧＣプラスミドと呼ぶ
ことにする。以下類似に、リポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配
列５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３’を含むリポータープラスミドをＸＸＸＸプラ
スミドと呼ぶ）。決定的な塩基−接触部位のこれらのアミノ酸残基は、コードか
ら予想されたものと正確に合致する。〔ヒトゲノム内の大部分のジンクフィンガ
ードメインらは、２位にＳ（セリン）を有しており、セリンは４個の塩基中、い
ずれのものとも水素結合が形成できる。したがって、２位における影響は以下で
考慮しないこととする。また、一般的に、２位の残基は塩基認識において、単に
補助的な役割しか果たさないことも知られている（Pavletich及びPabo(1991) Sc
ience 252, 809-817）。
【０１４０】 ヒトのゲノムから由来したジンクフィンガードメイン中のアミノ酸残基も、コ
ードから予想されるものと非常によく一致した。例えば、ＧＡＧＣプラスミドを
使用して得たジンクフィンガードメイン内−１、３、６位の共通アミノ酸残基ら
は、それぞれＲ、Ｎ、Ｒである（表１カラム３参照）。これらのアミノ酸は、コ
ードから予想できるアミノ酸と正確に一致した。ＧＣＴＴプラスミドを使用して
得たジンクフィンガードメイン中の−１、３、６位のアミノ酸残基は、それぞれ
Ｖ、Ｔ、Ｒであった（表１カラム４）。このうち、Ｔ及びＲ残基は、コードから
予想したものと一致する。３ｂｐの塩基配列において３′末端に位置するＴと相
互作用をすることと期待されるコードの−１位から予想されたのアミノ酸は、Ｌ
、Ｔ、又はＮである。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲジンクフィンガ
ードメインは、この位置にＬ（ロイシン）と類似した疎水性アミノ酸であるＶ（
バリン）を含んでいた。
【０１４１】 全体的に、選択されたジンクフィンガードメイン内のアミノ酸残基は、三つの
位置中、少なくとも二つの位置ではコードから予想されるアミノ酸と一致した。
表１において、コードから予想されるジンクフィンガードメイン中のアミノ酸を
下線で表示した。これらの結果は、ここに開示された生体内選択システムが予想
通り機能していることを強力に示唆している。
【０１４２】 実施例９：再形質転換（retransformation）及び相互形質転換（cross-transfor
mation） 上記のジンクフィンガータンパク質らが誤って得られた陽性結果である可能性
を排除し、また前記ジンクフィンガータンパク質らの配列特異性を調査するため
に、単離されたプラスミドを利用し、酵母の再形質転換（retransformation）及
び相互形質転換（cross-transformation）を遂行した。
【０１４３】 まず、リポータープラスミドとジンクフィンガードメインをコードするハイブ
リッド転写因子プラスミドを一対にして酵母を同時−形質転換した。酵母形質転
換体をロイシン及びトリプトファンが欠如された最小培地に接種して３６時間培
養した。成長培地中の細胞約１,０００個をロイシン、トリプトファン、ヒスチ
ジンが欠如された固体培地（図１０で−ヒスチジンと表記）とロイシン、トリプ
トファンが欠如された固体培地（図１０で＋ヒスチジンと表記）上にばら撒いた
後、５０時間３０℃で培養した。その結果を図１０に示した。
【０１４４】 ハイブリット転写因子のジンクフィンガー部分が、複合結合配列と結合し、ハ
イブリット転写因子がＨＩＳ３レポーター遺伝子を活性化させる場合は、ヒスチ
ジンを欠く培地中でコロニーが成長することができると予測される。ジンクフィ
ンガー部分がこの複合結合配列に結合できないならば、コロニーは、ヒスチジン
が欠如された培地では育長することができない。
【０１４５】 図１０に示したように、単離されたジンクフィンガードメインは、相当する標
的配列に結合する能力を有し、Ｚｉｆ２６８とは明らかに異なる配列特異性を示
した。Ｚｉｆ２６８は、ＧＣＧＴプラスミドとの場合に、他の５つのプラスミド
との場合よりも高い活性を示し、ＧＡＧＴプラスミドとの場合には比較的高い活
性を示した。他の結合部位を含むレポーターを有し、Ｚｉｆ２６８タンパク質を
発現する株によっては、コロニーは形成されなかった。
【０１４６】 無作為突然変異ライブラリーから単離されたジンクフィンガードメインＫＴＮ
Ｒは、ＧＡＧＣリポータープラスミドで元来選択されたものである。予想通り、
ＧＡＧＣプラスミドのみでコロニーが形成された。ヒトゲノム由来のライブラリ
ーから得られたジンクフィンガードメインも期待した通りの特異性を示した。例
えば、ＧＡＣＴプラスミドで選択されたＨＳＮＫジンクフィンガードメインは、
酵母細胞に形質転換した場合、ＧＡＣＴプラスミドの場合のみで細胞成長を可能
とした。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲは、予想した通りＧＣＴＴプ
ラスミドで最大の活性を示した。ＧＡＧＴプラスミドで選択されたＲＤＥＲは、
Ｚｉｆ２６８のフィンガー３と同一の４つの塩基−接触部位に同一のアミノ酸残
基配列を有する。予想通り、このジンクフィンガードメインは、Ｚｉｆ２６８の
フィンガー３と類似の配列特異性を示した。ＧＡＧＣとＧＡＧＴプラスミドで選
択されたＳＳＮＲは、ＧＡＧＣプラスミドとはヒスチジン欠乏培地で細胞成長を
可能としたが、ＧＡＧＴプラスミドとは細胞成長を可能としなかった。ＡＣＡＴ
プラスミドで得られたＱＳＴＶは、この検定で試験されたいかなるプラスミドと
も細胞成長を可能としなかった。しかし、後述の如く、試験管内実験ではこのジ
ンクフィンガードメインはＡＣＡＴ配列と強く結合することができた。
【０１４７】 実施例１０：ゲルシフト分析（gel shift assay） 改変ワンハイブリッドシステムを用いて選択されたジンクフィンガードメイン
を含むジンクフィンガータンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させ、精製し、ゲ
ルシフト分析で用いた。ハイブリッドプラスミド中のジンクフィンガータンパク
質をコードするＤＮＡセグメントを、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化して得、ｐＧ
ＥＸ−４Ｔ２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＳａｌＩ及びＮｏｔＩ
部位の間に挿入した。ジンクフィンガードメインをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１株中で
、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）に連結された融合タンパク
質として発現させた。発現されたタンパク質をグルタチオンに対する親和性（gl
utathione affinity）クロマトグラフィー（Pharmacia Biotech, Piscataway, N
J）を利用して精製した後、ＧＳＴとジンクフィンガータンパク質の連結部位を
切断するトロンビンで消化した。精製されたジンクフィンガータンパク質は、Ｚ
ｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２、およびＣ末端に選択されたジンク
フィンガードメインを含有する。
【０１４８】 下記配列のプローブＤＮＡを合成し、アニーリングさせ、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼで32Ｐ標識し、ゲル移動分析に使用した。 ＧＣＧＴ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＣ ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号９０） ３′−ＣＡＧＣＧ ＣＧＣＡＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号９１） ＧＡＧＣ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＣ ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号９２） ３′−ＣＡＧＣＧ ＣＴＣＧＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号９３） ＧＣＴＴ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＴ ＧＣＴＴＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号９４） ３′−ＣＡＧＣＡ ＣＧＡＡＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号９５） ＧＡＣＴ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ ＧＡＣＴＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号９６） ３′−ＣＡＧＣＣ ＣＴＧＡＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号９７） ＧＡＧＴ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ ＧＡＧＴＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号９８） ３′−ＣＡＧＣＣ ＣＴＣＡＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号９９） ＡＣＡＴ； ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ ＡＣＡＴＧＧＧＣＧ ＧＴＡＣＣＧ−
３′ （配列番号１００） ３′−ＣＡＧＣＣ ＴＧＴＡＣＣＣＧＣ ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−
５′ （配列番号１０１）
【０１４９】 多様な量のジンクフィンガータンパク質を、２０mM Ｔｒｉｓ（pH７．７）、
１２０mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2、２０μM ＺｎＳＯ4、１０％グリセロール
、０．１％ Nonidet Ｐ−４０、５mM ＤＴＴ、及び０．１０mg/ml ＢＳＡ（牛血
清アルブミン）中で標識されたプローブＤＮＡと室温で１時間培養させた後、こ
の反応混合物をゲル電気泳動させた。放射能シグナルをホスホイメージャー（Ph
osphor Imager TM）解析（Molecular Dynamics）、文献〔Rebar and Pabo(1994)
Science 263:671-673〕に記載されたことにより解離定数を計算した。その結果
を表２に示す。２回以上の別途の実験によりすべての常数を決定し、平均からの
標準誤差を表示した。表２にはヒスチジン欠乏培地における酵素形質転換体の細
胞成長（図１０）も表した。
【０１５０】
【表２】
【０１５１】 ヒスチジン欠乏培地において、細胞成長を可能にするジンクフィンガータンパ
ク質らは相当するプローブＤＮＡと強く結合した。例えば、対照群として使用し
たＺｉｆ２６８タンパク質の場合、これは、ＧＣＧＴ及びＧＡＧＴリポータープ
ラスミドと共に再形質転換させる場合に細胞成長を可能にしたが、これらリポー
タープラスミドに相応するＤＮＡプローブを利用して試験管内で測定した解離定
数はそれぞれ２４pM、１７０pMであった。対照的に、Ｚｉｆ２６８タンパク質は
、他のリポータープラスミドとは細胞成長を可能にせず、相応するＤＮＡプロー
ブで測定した解離定数も１nMよりも高かった。
【０１５２】 新規ジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質も類似した
結果を示した。例えば、ＫＴＮＲタンパク質はＧＡＧＣプローブＤＮＡに対して
１７０ｐＭの解離定数での高い親和性を示すが、ＧＣＧＴ又はＧＡＣＴプローブ
ＤＮＡに対しては、それぞれ５．５nM又は３０nMの解離定数を表した。このタン
パク質は、ＧＡＧＣプラスミドとのみ、細胞成長を可能にした。ＨＳＮＫタンパ
ク質は、ＧＡＣＴプローブＤＮＡと強く結合することができるが（Ｋd＝０．３
２ｎM）、ＧＣＧＴ又はＧＡＧＴプローブＤＮＡとは結合しない。すなわち、Ｑ
ＳＴＶは、ＧＣＴＴ又はＧＣＧＴプローブＤＮＡと結合するよりも、それぞれ１
３倍又は４．３倍強くＡＣＡＴプローブＤＮＡと結合する。
【０１５３】 一般的に、例えば３つのジンクフィンガードメインを有するもののように、１
nM未満の解離定数でＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガータンパク質である場
合、酵母の成長を可能にするが、ジンクフィンガータンパク質が、１nMより高い
解離定数でＤＮＡ配列に結合する場合、細胞成長を可能にしない。１nMより大き
く５nM未満の解離定数でＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガータンパク質も、
例えば、４個のジンクフィンガードメインを有するキメラジンクフィンガータン
パク質の文脈において、有用であり得る。
【０１５４】 実施例１１：ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内（in viv o ）スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＱＣＧＫ
ＡＦＧＣＰＳＮＬＲＲＨＧＲＴＨ（配列番号２３）である。それは下記ヒト核酸
配列
【０１５５】 ５′−ＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡ
ＴＧＴＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号２２） によりコードされる。
【０１５６】 ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２
との融合ポリペプチドとして、３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣ、及びＧＡＧを
特異的に認識する。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦ
Ｄ−００１「ＣＳＮＲ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＡ＞ＧＡＣ＞Ｇ
ＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ」と
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとの融合
は、ＧＡＣを含む部位に対しては０．１７nM、ＧＡＧを含む部位に対しては０．
４６nM、そしてＧＣＧを含む部位に対しては２．７nMの解離定数（Ｋd）を示す
。
【０１５７】 ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、例えば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡ
Ｇ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインを
含むキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１５８】 実施例１２：ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」 ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＥＣＧＫＡＦＮＨＳＳＮ
ＦＮＫＨＨＲＩＨ（配列番号２５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコ
ードされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣ
ＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号２４）。
【０１５９】 ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２と
の融合ポリペプチドとして、３−ｂｐ標的配列ＧＡＣを特異的に認識する。生体
内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」
の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＣ＞ＧＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡに
おいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドル
とＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＮＳＫ」融合は、ＧＡＣを含む位置に対しては０．
３２nM、ＧＡＧを含む位置に対しては３．５nM、そしてＧＣＧを含む位置に対し
ては４２nMの解離定数（Ｋd）を有する。
【０１６０】 ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、例えば、ＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を
認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タ
ンパク質を作るための単位として使用され得る。
【０１６１】 実施例１３：ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＫＥＣＧＫＡＦＳＳＧＳＮ
ＦＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号２７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコ
ードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＴ
ＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ
−３′（配列番号２６）。
【０１６２】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦ
Ｄ−００３「ＳＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を表す。
生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮ
Ｒ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＧ＞ＧＡＣ＞ＧＣＧである。ＥＭＳ
Ａにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハン
ドルとＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」との融合は、ＧＡＧを含む位置に対し
ては０．４５nM、ＧＡＣを含む位置に対しては０．６１nM、そしてＧＣＧを含む
位置に対しては３．８nMの解離定数Ｋdを示す。
【０１６３】 ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、例えば、ＧＡＧまたはＧＡＣ配列を含
むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメ
ラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１６４】 実施例１４：ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳ
ＤＥＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号２９）である。それは、次のヒト核酸配列によ
りコードされる。 ５′−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡ
ＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＧＧＣＡＣ−３′（配列番号２８）。
【０１６５】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２と融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ
−００４「ＲＤＥＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特異性を表す。生
体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ
」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＣＧ＞ＧＴＧ、ＧＡＧ＞ＧＡＣである。
ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精
製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」との融合は、ＧＣＧを含む位置
に対しては０．０２７nM、ＧＡＧを含む位置に対しては０．１８nM、そしてＧＡ
Ｃを含む位置に対しては２８nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１６６】 ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧまたはＧＡＧ
配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインから
なるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１６７】 実施例１５：ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」 ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＥＣＧＫＡＦＡＱＮＳＴ
ＬＲＶＨＱＲＩＨ（配列番号３１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコ
ードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣ
ＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ
−３′（配列番号３０）。
【０１６８】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、３−ｂｐ標的配列ＡＣＡに対する認識特
異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０
０５「ＱＳＴＶ」の結合部位配列に対する選好度はＡＣＡ＞ＧＣＧ＞ＧＣＴであ
る。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳ
Ｔ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」との融合は、ＡＣＡを含む
位置に対しては２．３nM、ＧＣＧを含む位置に対しては９．８nM、そしてＧＣＴ
を含む位置に対しては２９nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１６９】 ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、例えば、ＡＣＡ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７０】 実施例１６：ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＹＣＧＫＴＦＳＶＳＳＴ
ＬＩＲＨＱＲＩＨ（配列番号３３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコ
ードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＡＧＴ
ＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号３２）。
【０１７１】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、３−ｂｐ標的配列ＧＣＴに対する認識特
異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０
０６「ＶＳＴＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＴ＞ＧＣＧ＞ＧＡＧであ
る。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳ
Ｔ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」との融合は、ＧＣＴを含む
位置に対しては０．５３nM、ＧＣＧを含む位置に対しては０．７６nM、そしてＧ
ＡＧを含む位置に対しては１．４nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１７２】 ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、例えば、ＧＣＴまたはＧＣＧ配列を含
むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメ
ラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７３】 実施例１７：ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＱＣＮＩＣＧＫＣＦＳＣＮＳ
ＮＬＨＲＨＱＲＴＨ（配列番号３５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣ
ＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＧＣＡＣ
−３′（配列番号３４）。
【０１７４】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡ
Ｇに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦ
Ｄ−００７「ＣＳＮＲ２」の結合部位配列に対する選好度はＧＡＡ＞ＧＡＣ＞Ｇ
ＡＧである。
【０１７５】 ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、例えば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡ
Ｇ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインか
らなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７６】 実施例１８：ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＳＳ
ＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号３７）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴ
ＣＡＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号３６）。
【０１７７】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧ
Ａに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦ
Ｄ−００８「ＱＳＨＲ１」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＧＡ＞ＧＡＡ＞
ＡＧＡである。
【０１７８】 ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は、例えば、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＡＧ
Ａ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインか
らなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７９】 実施例１９：ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＧＱＣＧＫＦＹＳＱＶＳ
ＨＬＴＲＨＱＫＩＨ（配列番号３９）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧ
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号３８）。
【０１８０】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特
異性を表す。
【０１８１】 ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８２】 実施例２０：ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＣＳ
ＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号４１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴ
ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号４０）。
【０１８３】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１
０「ＱＳＨＲ３」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０１８４】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は、例えば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８５】 実施例２１：ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＡＫＡＦＩＱＣＳ
ＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号４３）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴ
ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号４２）。
【０１８６】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡに対
する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０
１１「ＱＳＨＲ４」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０１８７】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、例えば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８８】 実施例２２：ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＲＥＣＧＲＧＦＲＱＨＳ
ＨＬＶＲＨＫＲＴＨ（配列番号４５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣ
ＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴ
−３′（配列番号４４）。
【０１８９】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＡＧＡ、Ｇ
ＡＡ、及びＣＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれ
ば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」の結合部位配列に対する選好度はＧＧ
Ａ＞ＡＧＡ＞ＧＡＡ＞ＣＧＡである。
【０１９０】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、例えば、ＧＧＡ、ＡＧＡ、ＧＡＡま
たはＣＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガード
メインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得
る。
【０１９１】 実施例２３：ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＥＣＫＤＣＧＫＡＦＩＱＫＳ
ＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号４７）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴ
ＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号４６）。
【０１９２】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特
異性を表す。
【０１９３】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１９４】 実施例２４：ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＲＥＣＲＲＧＦＳＱＫＳ
ＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号４９）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣ
ＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣ
−３′（配列番号４８）。
【０１９５】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特
異性を表す。
【０１９６】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１９７】 実施例２５：ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＴＣＲＫＴＦＳＱＫＳ
ＮＬＩＶＨＱＲＴＨ（配列番号５１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴ
ＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣ
−３′（配列番号５０）。
【０１９８】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１
５「ＱＳＮＶ１」の結合部位配列に対する選好度はＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０１９９】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２００】 実施例２６：ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＳＫＣＧＫＡＦＴＱＳＳ
ＮＬＴＶＨＱＫＩＨ（配列番号５３）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴ
ＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号５２）。
【０２０１】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１
６「ＱＳＮＶ２」の結合部位配列に対する選好度はＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０２０２】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る
【０２０３】 実施例２７：ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＤＥＣＧＫＮＦＴＱＳＳ
ＮＬＩＶＨＫＲＩＨ（配列番号５５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣ
ＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴ
−３′（配列番号５４）。
【０２０４】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特
異性を表す。
【０２０５】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は、例えば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２０６】 実施例２８：ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＤＶＣＧＫＴＦＴＱＫＳ
ＮＬＧＶＨＱＲＴＨ（配列番号５７）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＧ
ＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴ
−３′（配列番号５６）。
【０２０７】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特
異性を表す。
【０２０８】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は、例えば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２０９】 実施例２９：ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＰＤＣＧＫＳＦＳＱＳＳ
ＳＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号５９）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＧＴ
ＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣ
−３′（配列番号５８）。
【０２１０】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１
９「ＱＳＳＲ１」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２１１】 ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１２】 実施例３０：ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＱＤＣＧＲＡＦＮＱＮＳ
ＳＬＧＲＨＫＲＴＨ（配列番号６１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣ
ＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ
−３′（配列番号６０）。
【０２１３】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡに対する認識特
異性を表す。
【０２１４】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は、例えば、ＧＴＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１５】 実施例３１：ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニン
グにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＮＱＳＳＴＬ
ＴＲＨＫＩＶＨ（配列番号６３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコー
ドされる。 ５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣ
ＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴ
−３′（配列番号６２）。
【０２１６】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対する
認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０２１
「ＱＳＴＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２１７】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含
むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメ
ラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１８】 実施例３２：ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニン
グにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＭＥＣＧＫＡＦＮＲＲＳＨＬ
ＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号６５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコー
ドされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＡＡＣ
ＣＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＡＣ
−３′（配列番号６４）。
【０２１９】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異
性を表す。
【０２２０】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は、例えば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２１】 実施例３３：ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳ
ＬＲＲＨＥＴＴＨ（配列番号６７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコ
ードされる。 ５′−ＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴ
ＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号６６）。
【０２２２】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＴ、ＧＣＧ、ＧＴＡ
に対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ
−０２３「ＶＳＳＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＴ＞ＧＴＧ＞ＧＴＡ
である。
【０２２３】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は、例えば、ＧＴＴ、ＧＣＧまたはＧＴＡ
配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインから
なるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２４】 実施例３４：ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＥＣＧＱＡＦＲＱＲＡＨ
ＬＩＲＨＨＫＬＨ（配列番号１０３）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＣＣＴＴＴＡＧＡ
ＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣ
−３′（配列番号１０２）。
【０２２５】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異
性を表す。
【０２２６】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２７】 実施例３５：ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＨＱＣＧＫＡＦＩＱＳＦＮ
ＬＲＲＨＥＲＴＨ（配列番号１０５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡ
ＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣ
ＡＣ−３′（配列番号１０４）。
【０２２８】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＣに対する認識特異
性を表す。
【０２２９】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は、例えば、ＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３０】 実施例３６：ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮ
ＬＬＲＨＩＫＬＨ（配列番号１０７）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴ
ＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣ
−３′（配列番号１０６）。
【０２３１】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異
性を表す。
【０２３２】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３３】 実施例３７：ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨ
ＬＴＴＨＫＩＩＨ（配列番号１１１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＧ
ＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴ
−３′（配列番号１１０）。
【０２３４】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡ
、ＧＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ
−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」の結合部位配列に対する選好度は（ＡＧＡ、ＣＧ
Ａ）＞ＴＧＡ＞ＧＧＡである。
【０２３５】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は、例えば、ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡまた
はＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメ
インからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る
。
【０２３６】 実施例３８：ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨ
ＬＮＶＨＫＲＴＨ（配列番号１１３）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣ
ＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号１１２）。
【０２３７】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は３−ｂｐ標的配列ＣＧＡ、ＡＧＡ、及びＴ
ＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−Ｚ
ＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」の結合部位配列に対する選好度はＣＧＡ＞ＡＧＡ＞Ｔ
ＧＡである。
【０２３８】 ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は、例えば、ＣＧＡ、ＡＧＡ、ＴＧＡ配列
を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなる
キメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３９】 実施例３９：ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＭＣＳＥＣＧＲＧＦＳＱＫＳＮ
ＬＩＩＨＱＲＴＨ（配列番号１１５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣ
ＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ
−３′（配列番号１１４）。
【０２４０】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対する
認識特異性を表す。
【０２４１】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含
むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメ
ラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４２】 実施例４０：ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＥＫＣＧＫＡＦＮＱＳＳ
ＮＬＴＲＨＫＫＳＨ（配列番号１１７）である。それは、次のヒト核酸配列によ
りコードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣ
ＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴ
−３′（配列番号１１６）。
【０２４３】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特
異性を表す。
【０２４４】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４５】 実施例４１：ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＥＣＧＫＦＦＳＱＳＳ
ＳＬＩＲＨＲＲＳＨ（配列番号１１９）である。それは、次のヒト核酸配列によ
りコードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣ
ＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣ
−３′（配列番号１１８）。
【０２４６】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３
２「ＱＳＳＲ３」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２４７】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を
含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキ
メラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４８】 実施例４２：ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨ
ＬＴＱＨＲＲＩＨ（配列番号１２１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧ
ＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号１２０）。
【０２４９】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ
に対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ
−０３３「ＱＴＨＱ」の結合部位配列に対する選好度はＡＧＡ＞（ＴＧＡ、ＣＧ
Ａ）である。
【０２５０】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は、例えば、ＡＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ配列
を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなる
キメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５１】 実施例４３：ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴ
ＨＬＴＲＨＲＲＩＨ（配列番号１２３）である。それは、次のヒト核酸配列によ
りコードされる。 ５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧ
ＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ
−３′（配列番号１２２）。
【０２５２】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧ
Ａに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦ
Ｄ−０３４「ＱＴＨＲ１」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞（ＧＡＡ、
ＡＧＡ）である。
【０２５３】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は、例えば、ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧＡ配
列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからな
るキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５４】 実施例４４：ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＨＫＣＬＥＣＧＫＣＦＳＱＮＴ
ＨＬＴＲＨＱＲＴ（配列番号１２５）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＣＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴ
ＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＣＡＣ
−３′（配列番号１２４）。
【０２５５】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特
異性を表す。
【０２５６】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５７】 実施例４５：ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＨＣＤＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲ
ＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号１２７）である。それは、次のヒト核酸配列
によりコードされる。 ５′−ＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡ
ＴＴＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＧＴ
ＡＡＡＣＡＣ−３′（配列番号１２６）。
【０２５８】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３
６「ＲＤＥＲ２」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０２５９】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含む
ＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラ
ＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６０】 実施例４６：ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＲＣＳＷＥＧＣＥＷＲＦＡＲ
ＳＤＥＬＴＲＨＦＲＫＨ（配列番号１２９）である。それは、次のヒト核酸配列
によりコードされる。 ５′−ＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＴ
ＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＡ
ＡＡＧＣＡＣ−３′（配列番号１２８）。
【０２６１】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対す
る認識特異性を表す。
【０２６２】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含む
ＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラ
ＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６３】 実施例４７：ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＳＣＳＷＫＧＣＥＲＲＦＡＲ
ＳＤＥＬＳＲＨＲＲＴＨ（配列番号１３１）である。それは、次のヒト核酸配列
によりコードされる。 ５′−ＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧ
ＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡ
ＡＣＣＣＡＣ−３′（配列番号１３０）。
【０２６４】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対す
る認識特異性を表す。
【０２６５】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含む
ＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラ
ＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６６】 実施例４８：ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」 ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＡＣＳＷＱＤＣＮＫＫＦＡＲ
ＳＤＥＬＡＲＨＹＲＴＨ（配列番号１３３）である。それは、次のヒト核酸配列
によりコードされる。 ５′−ＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧ
ＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣ
ＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号１３２）。
【０２６７】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特
異性を表す。
【０２６８】 ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は、例えば、ＧＣＧ配列を含むＤＮＡ部
位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結
合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６９】 実施例４９：ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＨＣＮＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲ
ＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号１３５）である。それは、次のヒト核酸配列
によりコードされる。 ５′−ＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧ
ＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＣＧＡ
ＡＡＧＣＡＣ−３′（配列番号１３４）。
【０２７０】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対す
る認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４
０「ＲＤＥＲ６」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０２７１】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含む
ＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラ
ＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７２】 実施例５０：ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリー
ニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＬＣＱＹＣＡＱＲＦＧＲＫＤ
ＨＬＴＲＨＭＫＫＳＨ（配列番号１３７）である。それは、次のヒト核酸配列に
よりコードされる。 ５′−ＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧ
ＣＧＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴ
ＣＡＣ−３′（配列番号１３６）。
【０２７３】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧ、ＧＧＧに対す
る認識特異性を表す。
【０２７４】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は、例えば、ＧＡＧ、ＧＧＧ配列を含む
ＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラ
ＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７５】 実施例５１：ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨ
ＬＫＴＨＴＲＴＨ（配列番号１４１）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣ
ＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ
−３′（配列番号１４０）。
【０２７６】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は３−ｂｐ標的配列ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧ
に対する認識特異性を表す。
【０２７７】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は、例えば、ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、Ｇ
ＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメイン
からなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７８】 実施例５２：ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＡＣＥＶＣＧＶＲＦＴＲＮＤＫ
ＬＫＩＨＭＲＫＨ（配列番号１４３）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＣＡＣＣ
ＡＧＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣ
−３′（配列番号１４２）。
【０２７９】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異
性を表す。
【０２８０】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は、例えば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８１】 実施例５３：ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳ
ＤＫＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号１４５）である。それは、次のヒト核酸配列に
よりコードされる。 ５′−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡ
ＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＧＧＣＡＣ−３′（配列番号１４４）。
【０２８２】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧ、ＡＧＧに対する
認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４５
「ＲＤＫＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＧ＞ＡＧＧである。
【０２８３】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は、例えば、ＧＧＧ、ＡＧＧ配列を含むＤ
ＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤ
ＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８４】 実施例５４：ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮ
ＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号１４７）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴ
ＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ
−３′（配列番号１４６）。
【０２８５】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧ、ＧＴＧに対する
認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４６
「ＲＳＮＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＡＧ＞ＧＴＧである。
【０２８６】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は、例えば、ＧＡＧ、ＧＴＧ配列を含むＤ
ＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤ
ＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８７】 実施例５５：ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」 ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニ
ングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＬＣＳＥＣＤＫＣＦＳＲＳＴＮ
ＬＩＲＨＲＲＴＨ（配列番号１４９）である。それは、次のヒト核酸配列により
コードされる。 ５′−ＴＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴ
ＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ
−３′（配列番号１４８）。
【０２８８】 Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異
性を表す。
【０２８９】 ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は、例えば、ＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位
を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合
タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２９０】 本発明に関する多くの実施態様を記述した。それにも拘わらず、本発明の精神
と範囲を逸脱しない多くの多様な変形が可能であることを理解するはずである。
したがって他の実施態様も後述する請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 三つのジンクフィンガードメインで構成され、ＤＮＡ配列５′−ＧＣＧ ＴＧ
Ｇ ＧＣＧ Ｔ−３′と結合しているＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質
の３次元構造を表す図面である。黒色円は亜鉛イオンの位置を表す。
【図２】 Ｚｉｆ２６８のアミノ酸残基とＤＮＡ塩基間の水素結合相互作用を表す。αヘ
リックスに沿った−１、２、３及び６位のアミノ酸残基らは、特定位置の塩基と
相互作用する。太線は理想的な水素結合を表し、点線は潜在的な水素結合を表す
。
【図３】 ジンクフィンガードメインのαヘリックスに沿った−１、２、３及び６位のア
ミノ酸残基とＤＮＡ塩基間の相互作用を要約した認識コード（recognition code
）表を表す。
【図４】 アミノ酸残基及びこれらの相当する３塩基トリプレットの位置を表す図面であ
る。太線は観察される主要相互作用を表し、点線は補助相互作用を表す。
【図５】 本明細書に開示された生体内（in vivo）選別システムの原理を説明する図面
である。多様なジンクフィンガー突然変異のうち、ジンクフィンガードメインＡ
は標的配列（ＸＸＸＸで表示）を認識し、ＨＩＳ３リポーター遺伝子の転写を活
性化する。結果的に、酵母コロニーはヒスチジンが欠乏した培地で育つ。これと
対照的に、ジンクフィンガードメインBは標的配列を認識せず、したがって、リ
ポーター遺伝子は抑圧されるようになる。その結果、ヒスチジンが欠乏した培地
でコロニーが育たない。ADは転写活性化ドメインを表す。
【図６】 ＨＩＶの末端反復配列（ＬＴＲ）で及びＨＩＶ−１の共受容体（coreceptor）
をコードするヒト遺伝子であるＣＣＲ５のプロモーター部位で発見される１０−
ｂｐ配列の目録である（それぞれ配列番号１−５）。下線部分は本発明の選別で
使用された４−ｂｐ標的配列を表す。
【図７】 リポーター遺伝子に連結された結合部位の塩基配列を表す（それぞれ配列番号
s：６−１７）。それぞれの結合部位は４つの複合結合配列の直列配置で構成さ
れている。それぞれの複合結合配列はＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガ
ー２により認識される切断された結合配列５′−ＧＧ ＧＣＧ−３’を４−ｂｐ
標的配列に連結させて構築された。
【図８】 ハイブリッドプラスミドのライブラリー構築に使用可能なプラスミドであるｐ
ＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆ（配列番号１８及び１９）の図面である。
【図９】 ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに挿入されたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質
をコードする遺伝子に対する塩基配列及び相応する翻訳されたアミノ酸配列を表
す（それぞれ配列番号２０及び２１）。制限酵素により認識される部位に下線を
引いた。
【図１０】 生体内選別システムにより選択されたジンクフィンガータンパク質を使用して
再形質転換（retransformation）及び交差形質転換（cross-transformation）か
ら得た酵母細胞を有する培養プレートの写真である。
【図１１】 ヒトゲノム由来のジンクフィンガーライブラリーから生体内システムにより選
択されたジンクフィンガードメインの特定ＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列により
コードされるアミノ酸配列の目録である（配列番号２２−３３）。ヒトゲノムか
らジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡセグメントを増幅させるのに使
用される縮重（degenerate）ＰＣＲプライマーに相応するＤＮＡ配列に下線を引
いた。４個の潜在的な塩基−接触位置を表示し、アミノ酸残基を太く表した。亜
鉛イオンと配位結合することと予想される二つのＣｙｓ残基及び二つのＨｉｓ残
基をイタリック体で表した。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年８月２２日（２００２．８．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項８３】 請求項８２に記載されたポリペプチドをコードする配列を
含有する核酸。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１０月３１日（２００２．１０．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】 本発明に関する多くの実施態様を記述した。それにも拘わらず、本発明の精神
と範囲を逸脱しない多くの多様な変形が可能であることを理解するはずである。
したがって他の実施態様も後述する請求項の範囲に含まれる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING<110> Kim, Jin-Soo Kwon
, Young Do Kim, Hyun-Won Ryu, Eun-Hyun Hwang, Moon-Sun<12
0> SELECTION OF TARGET-SPECIFIC ZINC FINGER DOMAINS <130> 12279-002001 <160> 167 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 1 gacatcgagc 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 2 gcagctgctt 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 3 gctggggact 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agggtggagt 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gctgagacat 10 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal binding site <400> 6 ccggcgtggg cggctgcgtg ggcgtgcgtg ggcggactgc gtgggcg 47 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal binding site <400> 7 tcgacgccca cgcagtccgc ccacgcacgc ccacgcagcc gcccacg 47 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 8 ccggcgagcg ggcggtcgag cgggcgtgag cgggcggatc gagcgggcg 49 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 9 tcgacgcccg ctcgatccgc ccgctcacgc ccgctcgacc gcccgctcg 49 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 10 ccggctgctt gggcggctgc ttgggcgtgc ttgggcgggc tgcttgggcg 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 11 tcgacgccca agcagcccgc ccaagcacgc ccaagcagcc gcccaagcag 50 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 12 ccggactggg cgggggactg ggcgtgactg ggcggaggga ctgggcg 47 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> HIV-1 <400> 13 tcgacgccca gtccctccgc ccagtcacgc ccagtccccc gcccagt 47 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ccggagtggg cggtggagtg ggcgtgagtg ggcggatgga gtgggcg 47 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcgacgccca ctccatccgc ccactcacgc ccactccacc gcccact 47 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ccggacatgg gcggagacat gggcgtacat gggcggaaga catgggcg 48 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tcgacgccca tgtcttccgc ccatgtacgc ccatgtctcc gcccatgt 48 <210> 18 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence <221> CDS <222> (1)...(81) <400> 18 aaa gag ggt ggg tcg acc ttc cgg act ggc cag gaa cgc cca gat ccg 48
Lys Glu Gly Gly Ser Thr Phe Arg Thr Gly Gln Glu Arg Pro Asp Pro 1 5 10 15 cgg gaa ttc aga tct act agt gcg gcc gct aag taagtaagac gtcgagctcg 101
Arg Glu Phe Arg Ser Thr Ser Ala Ala Ala Lys 20 25 ccatcgcggt ggaagcttt 120 <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence <400> 19 Lys Glu Gly Gly Ser Thr Phe Arg Thr Gly Gln Glu Arg Pro Asp Pro 1 5 10 15 Arg Glu Phe Arg Ser Thr Ser Ala Ala Ala Lys 20 25 <210> 20 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence <221> CDS <222> (25)...(291) <400> 20 gggtcgacct tccggactgg ccag gaa cgc cca tat gct tgc cct gtc gag 51 Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu 1 5 tcc tgc gat cgc cgc ttt tct cgc tcg gat gag ctt acc cgc cat atc 99
Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile 10 15 20 25 cgc atc cac act ggc cag aag ccc ttc cag tgt cga atc tgc atg cgt 147
Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg 30 35 40 aac ttc agt cgt agt gac cac ctt acc acc cac atc cgg acc cac acc 195
Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr 45 50 55 ggc gag aag cct ttt gcc tgt gac att tgt ggg agg aag ttt gcc agg 243
Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg 60 65 70 agt gat gaa cgc aag agg cat acc aaa atc cat tta aga cag aag gat 291
Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Thr Lys Ile His Leu Arg Gln Lys Asp 75 80 85 ccgcgggaat cc 303 <210> 21 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence <400> 21 Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys 20 25 30 Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His 35 40 45 Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys 50 55 60 Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His 65 70 75 80 Thr Lys Ile His Leu Arg Gln Lys Asp 85 <210> 22 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(102) <400> 22 acc ggg cag aaa ccg tac aaa tgt aag caa tgt ggg aaa gct ttt gga 48
Thr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Gly 1 5 10 15 tgt ccc tca aac ctt cga agg cat gga agg act cac acc ggc gag aaa 96
Cys Pro Ser Asn Leu Arg Arg His Gly Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 ccg cgg 102
Pro Arg <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Gly 1 5 10 15 Cys Pro Ser Asn Leu Arg Arg His Gly Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 Pro Arg <210> 24 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(102) <400> 24 acc ggg gag aag cca tac aag tgt aag gag tgt ggg aaa gcc ttc aac 48
Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn 1 5 10 15 cac agc tcc aac ttc aat aaa cac cac aga atc cac acc ggc gaa aag 96
His Ser Ser Asn Phe Asn Lys His His Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 ccg cgg 102
Pro Arg <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Phe Asn Lys His His Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 Pro Arg <210> 26 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(102) <400> 26 acc ggg gag agg cca tat gaa tgt aag gaa tgt ggg aaa gcc ttt agt 48
Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser 1 5 10 15 agt ggt tca aac ttc act cga cat cag aga att cac acc ggt gaa aag 96
Ser Gly Ser Asn Phe Thr Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 ccg cgg 102
Pro Arg <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ser Gly Ser Asn Phe Thr Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 Pro Arg <210> 28 <211> 108 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(108) <400> 28 acc ggg cag aag cca tac gta tgc gat gta gag gga tgt acg tgg aaa 48
Thr Gly Gln Lys Pro Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys 1 5 10 15 ttt gcc cgc tca gat gag ctc aac aga cac aag aaa agg cac acc ggc 96
Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His Thr Gly 20 25 30 gaa aga ccg cgg 108
Glu Arg Pro Arg 35 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Thr Gly Gln Lys Pro Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys 1 5 10 15 Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His Thr Gly 20 25 30 Glu Arg Pro Arg 35 <210> 30 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(102) <400> 30 acc ggg gag aga cct tac gag tgt aat gaa tgc ggg aaa gct ttt gcc 48
Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ala 1 5 10 15 caa aat tca act ctc aga gta cac cag aga att cac acc ggc gaa aag 96
Gln Asn Ser Thr Leu Arg Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 ccg cgg 102
Pro Arg <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ala 1 5 10 15 Gln Asn Ser Thr Leu Arg Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 20 25 30 Pro Arg <210> 32 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(102) <400> 32 acc ggg gag agg cct tat gag tgt aat tac tgt gga aaa acc ttt agt 48
Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser 1 5 10 15 gtg agc tca acc ctt att aga cat cag aga atc cac acc ggc gag aga 96
Val Ser Ser Thr Leu Ile Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Arg 20 25 30 ccg cgg 102
Pro Arg <210> 33 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser 1 5 10 15 Val Ser Ser Thr Leu Ile Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Arg 20 25 30 Pro Arg <210> 34 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 34 tat cag tgc aac att tgc gga aaa tgt ttc tcc tgc aac tcc aac ctc 48
Tyr Gln Cys Asn Ile Cys Gly Lys Cys Phe Ser Cys Asn Ser Asn Leu 1 5 10 15 cac agg cac cag aga acg cac 69
His Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Tyr Gln Cys Asn Ile Cys Gly Lys Cys Phe Ser Cys Asn Ser Asn Leu 1 5 10 15 His Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 36 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 36 tat gca tgt cat cta tgt gga aaa gcc ttc act cag agt tct cac ctt 48
Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 aga aga cat gag aaa act cac 69
Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 38 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 38 tat aaa tgc ggc cag tgt ggg aag ttc tac tcg cag gtc tcc cac ctc 48
Tyr Lys Cys Gly Gln Cys Gly Lys Phe Tyr Ser Gln Val Ser His Leu 1 5 10 15 acc cgc cac cag aaa atc cac 69
Thr Arg His Gln Lys Ile His 20 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Lys Cys Gly Gln Cys Gly Lys Phe Tyr Ser Gln Val Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Lys Ile His 20 <210> 40 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 40 tat gca tgt cat cta tgt gga aaa gcc ttc act cag tgt tct cac ctt 48
Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 aga aga cat gag aaa act cac 69
Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Tyr Ala Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 42 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 42 tat gca tgt cat cta tgt gca aaa gcc ttc att cag tgt tct cac ctt 48
Tyr Ala Cys His Leu Cys Ala Lys Ala Phe Ile Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 aga aga cat gag aaa act cac 69
Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Tyr Ala Cys His Leu Cys Ala Lys Ala Phe Ile Gln Cys Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Lys Thr His 20 <210> 44 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 44 tat gtt tgc agg gaa tgt ggg cgt ggc ttt cgc cag cat tca cac ctg 48
Tyr Val Cys Arg Glu Cys Gly Arg Gly Phe Arg Gln His Ser His Leu 1 5 10 15 gtc aga cac aag agg aca cat 69
Val Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Val Cys Arg Glu Cys Gly Arg Gly Phe Arg Gln His Ser His Leu 1 5 10 15 Val Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 46 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 46 ttt gag tgt aaa gat tgc ggg aaa gct ttc att cag aag tca aac ctc 48
Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc aga cac cag aga act cac 69
Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 48 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 48 tat gtc tgc agg gag tgt agg cga ggt ttt agc cag aag tca aat ctc 48
Tyr Val Cys Arg Glu Cys Arg Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc aga cac cag agg acg cac 69
Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Tyr Val Cys Arg Glu Cys Arg Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 50 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 50 tat gaa tgt aac aca tgc agg aaa acc ttc tct caa aag tca aat ctc 48
Tyr Glu Cys Asn Thr Cys Arg Lys Thr Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 att gta cat cag aga aca cac 69
Ile Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Tyr Glu Cys Asn Thr Cys Arg Lys Thr Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 52 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 52 tat gtt tgc tca aaa tgt ggg aaa gcc ttc act cag agt tca aat ctg 48
Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 act gta cat caa aaa atc cac 69
Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 54 tac aaa tgt gac gaa tgt gga aaa aac ttt acc cag tcc tcc aac ctt 48
Tyr Lys Cys Asp Glu Cys Gly Lys Asn Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 att gta cat aag aga att cat 69
Ile Val His Lys Arg Ile His 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Tyr Lys Cys Asp Glu Cys Gly Lys Asn Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Val His Lys Arg Ile His 20 <210> 56 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 56 tat gaa tgt gat gtg tgt gga aaa acc ttc acg caa aag tca aac ctt 48
Tyr Glu Cys Asp Val Cys Gly Lys Thr Phe Thr Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 ggt gta cat cag aga act cat 69
Gly Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 57 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Tyr Glu Cys Asp Val Cys Gly Lys Thr Phe Thr Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gly Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 58 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 58 tat aag tgc cct gat tgt ggg aag agt ttt agt cag agt tcc agc ctc 48
Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 att cgc cac cag cgg aca cac 69
Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 60 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 60 tat gag tgt cag gac tgt ggg agg gcc ttc aac cag aac tcc tcc ctg 48
Tyr Glu Cys Gln Asp Cys Gly Arg Ala Phe Asn Gln Asn Ser Ser Leu 1 5 10 15 ggg cgg cac aag agg aca cac 69
Gly Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Tyr Glu Cys Gln Asp Cys Gly Arg Ala Phe Asn Gln Asn Ser Ser Leu 1 5 10 15 Gly Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 62 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 62 tac aaa tgt gaa gaa tgt ggc aaa gct ttt aac cag tcc tca acc ctt 48
Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 act aga cat aag ata gtt cat 69
Thr Arg His Lys Ile Val His 20 <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Ile Val His 20 <210> 64 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 64 tat aag tgc atg gag tgt ggg aag gct ttt aac cgc agg tca cac ctc 48
Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 aca cgg cac cag cgg att cac 69
Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 66 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 66 tat aca tgt aaa cag tgt ggg aaa gcc ttc agt gtt tcc agt tcc ctt 48
Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 cga aga cat gaa acc act cac 69
Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 67 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 68 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 69 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Lys His Xaa His 20 <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 70 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 71 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Val His Xaa His 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = Ser or Thr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 72 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 73 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser His Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 74 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Val His Xaa His 20 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = Ser or Thr <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 75 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> coordinating residue <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10-14, 16, 17 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 76 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa His Xaa His 20 <210> 77 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide motif <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, or Gly <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Ala, Ser, Leu, Val, or Arg <221> VARIANT <222> 3-4, 6, 8-11, 17, 19-23 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Met, Ser, Thr, Ala, Cys, or Asn <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Leu, Ile, Val, or Met <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa = Leu, Ile, or Val <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Arg, Lys, Asn, Gln, Glu, Ser, Thr, Ala, Ile, or Tyr <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Phe, Ser, Thr, Asn, Lys, or His <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa = Phe, Tyr, Val, or Cys <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa = Asn, Asp, Gln, Thr, Ala, or His <221> VARIANT <222> (24)...(24) <223> Xaa = Arg, Lys, Asn, Ala, Ile, Met, or Trp <400> 77 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Eukaryote <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Glu or Gln <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Lys or Arg <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Tyr or Phe <400> 78 Thr Gly Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 <210> 79 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 79 tgcctgcagc atttgtggga ggaagtttg 29 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 80 atgctgcagg cttaaggctt ctcgccggtg 30 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C; y = T or C; s = G or C; r = G or A <400> 81 gcgtccggac ncayacnggn sara 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C; b = G, C, or T; r = G or A; w = A or T; y = T or C <400> 82 cggaattcan nbrwanggyy tytc 24 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid motif <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Glu or Gln <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Lys or Arg <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Tyr or Phe <400> 83 His Thr Gly Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 <210> 84 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 84 gggcccgggg agaagcctta cgcatgtcca gtcgaatctt gtgatagaag attc 54 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C; b = G, C, or T; s = G or C <400> 85 ctccccgcgg ttcgccggtg tggattctga tatgsnbsnb aagsnbsnbs nbsnbtgaga 60
atcttctatc acaag 75 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 86 ctagacccgg gaattcgtcg acg 23 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 87 gatccgtcga cgaattcccg ggt 23 <210> 88 <211> 38 <212> DNA <213> syArtificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C <400> 88 ccggtnnntg ggcgtacnnn tgggcgtcan nntgggcg 38 <210> 89 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C <400> 89 tcgacgccca nnntgacgcc cannngtacg cccannna 38 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 90 ccgggtcgcg cgtgggcggt accg 24
<210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 91 tcgacggtac cgcccacgcg cgac 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 92 ccgggtcgcg agcgggcggt accg 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 93 tcgacggtac cgcccgctcg cgac 24 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 94 ccgggtcgtg cttgggcggt accg 24 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 95 tcgacggtac cgcccaagca cgac 24 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 96 ccgggtcggg actgggcggt accg 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 97 tcgacggtac cgcccagtcc cgac 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 98 ccgggtcggg agtgggcggt accg 24 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 99 tcgacggtac cgcccactcc cgac 24 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 100 ccgggtcgga catgggcggt accg 24 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe for gel shift assay <400> 101 tcgacggtac cgcccatgtc cgac 24 <210> 102 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 102 tat aag tgt aag gaa tgt ggg cag gcc ttt aga cag cgt gca cat ctt 48
Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Gln Ala Phe Arg Gln Arg Ala His Leu 1 5 10 15 att cga cat cac aaa ctt cac 69
Ile Arg His His Lys Leu His 20 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Gly Gln Ala Phe Arg Gln Arg Ala His Leu 1 5 10 15 Ile Arg His His Lys Leu His 20 <210> 104 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 104 tat aag tgt cat caa tgt ggg aaa gcc ttt att caa tcc ttt aac ctt 48
Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 cga aga cat gag aga act cac 69
Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 106 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 106 ttc cag tgt aat cag tgt ggg gca tct ttt act cag aaa ggt aac ctc 48
Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu 1 5 10 15 ctc cgc cac att aaa ctg cac 69
Leu Arg His Ile Lys Leu His 20 <210> 107 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg His Ile Lys Leu His 20 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n =A, T, G, or C; 48-51 nucleotides in length <400> 108 acccacactg gccagaaacc cn 22 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = A, T, G, or C; 42-45 nucleotides in length <400> 109 gatctgaatt cattcaccgg tn 22 <210> 110 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 110 tac aaa tgt gaa gaa tgt ggc aaa gcc ttt agg cag tcc tca cac ctt 48
Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 act aca cat aag ata att cat 69
Thr Thr His Lys Ile Ile His 20 <210> 111 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Thr His Lys Ile Ile His 20 <210> 112 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 112 tat gag tgt gat cac tgt gga aaa tcc ttt agc cag agc tct cat ctg 48
Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 aat gtg cac aaa aga act cac 69
Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 113 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 114 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 114 tac atg tgc agt gag tgt ggg cga ggc ttc agc cag aag tca aac ctc 48
Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc ata cac cag agg aca cac 69
Ile Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 116 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 116 tat gaa tgt gaa aaa tgt ggc aaa gct ttt aac cag tcc tca aat ctt 48
Tyr Glu Cys Glu Lys Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 act aga cat aag aaa agt cat 69
Thr Arg His Lys Lys Ser His 20 <210> 117 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Tyr Glu Cys Glu Lys Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Lys Ser His 20 <210> 118 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 118 tat gag tgc aat gaa tgt ggg aag ttt ttt agc cag agc tcc agc ctc 48
Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Phe Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 att aga cat agg aga agt cac 69
Ile Arg His Arg Arg Ser His 20 <210> 119 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Phe Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Arg Arg Ser His 20 <210> 120 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 120 tat gag tgt cac gat tgc gga aag tcc ttt agg cag agc acc cac ctc 48
Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 act cag cac cgg agg atc cac 69
Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 121 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 122 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 122 tat gag tgt cac gat tgc gga aag tcc ttt agg cag agc acc cac ctc 48
Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 act cgg cac cgg agg atc cac 69
Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 123 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 124 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 124 cac aag tgc ctt gaa tgt ggg aaa tgc ttc agt cag aac acc cat ctg 48
His Lys Cys Leu Glu Cys Gly Lys Cys Phe Ser Gln Asn Thr His Leu 1 5 10 15 act cgc cac caa cgc acc cac 69
Thr Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 125 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 His Lys Cys Leu Glu Cys Gly Lys Cys Phe Ser Gln Asn Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 126 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 126 tac cac tgt gac tgg gac ggc tgt gga tgg aaa ttc gcc cgc tca gat 48
Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gaa ctg acc agg cac tac cgt aaa cac 75
Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 127 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 128 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 128 tac aga tgc tca tgg gaa ggg tgt gag tgg cgt ttt gca aga agt gat 48
Tyr Arg Cys Ser Trp Glu Gly Cys Glu Trp Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gag tta acc agg cac ttc cga aag cac 75
Glu Leu Thr Arg His Phe Arg Lys His 20 25 <210> 129 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Tyr Arg Cys Ser Trp Glu Gly Cys Glu Trp Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Phe Arg Lys His 20 25 <210> 130 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 130 ttc agc tgt agc tgg aaa ggt tgt gaa agg agg ttt gcc cgt tct gat 48
Phe Ser Cys Ser Trp Lys Gly Cys Glu Arg Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gaa ctg tcc aga cac agg cga acc cac 75
Glu Leu Ser Arg His Arg Arg Thr His 20 25 <210> 131 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Phe Ser Cys Ser Trp Lys Gly Cys Glu Arg Arg Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Ser Arg His Arg Arg Thr His 20 25 <210> 132 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 132 ttc gcc tgc agc tgg cag gac tgc aac aag aag ttc gcg cgc tcc gac 48
Phe Ala Cys Ser Trp Gln Asp Cys Asn Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gag ctg gcg cgg cac tac cgc aca cac 75
Glu Leu Ala Arg His Tyr Arg Thr His 20 25 <210> 133 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Phe Ala Cys Ser Trp Gln Asp Cys Asn Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Ala Arg His Tyr Arg Thr His 20 25 <210> 134 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 134 tac cac tgc aac tgg gac ggc tgc ggc tgg aag ttt gcg cgc tca gac 48
Tyr His Cys Asn Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 gag ctc acg cgc cac tac cga aag cac 75
Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 135 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Tyr His Cys Asn Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 136 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(72) <400> 136 ttc ctc tgt cag tat tgt gca cag aga ttt ggg cga aag gat cac ctg 48
Phe Leu Cys Gln Tyr Cys Ala Gln Arg Phe Gly Arg Lys Asp His Leu 1 5 10 15 act cga cat atg aag aag agt cac 72
Thr Arg His Met Lys Lys Ser His 20 <210> 137 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Phe Leu Cys Gln Tyr Cys Ala Gln Arg Phe Gly Arg Lys Asp His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Met Lys Lys Ser His 20 <210> 138 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 138 tgtcgaatct gcatgcgtaa cttcagtcgt agtgaccacc ttaccaccca catccggacc 60
cacactggcc agaaaccc 78 <210> 139 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR <400> 139 ggtggcggcc gttacttact tagagctcga cgtcttactt acttagcggc cgcactagta 60
gatctgaatt cattcaccgg t 81 <210> 140 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 140 ttc cag tgt aaa act tgt cag cga aag ttc tcc cgg tcc gac cac ctg 48
Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 aag acc cac acc agg act cat 69
Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 141 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 142 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 142 ttt gcc tgc gag gtc tgc ggt gtt cga ttc acc agg aac gac aag ctg 48
Phe Ala Cys Glu Val Cys Gly Val Arg Phe Thr Arg Asn Asp Lys Leu 1 5 10 15 aag atc cac atg cgg aag cac 69
Lys Ile His Met Arg Lys His 20 <210> 143 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Phe Ala Cys Glu Val Cys Gly Val Arg Phe Thr Arg Asn Asp Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ile His Met Arg Lys His 20 <210> 144 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(75) <400> 144 tat gta tgc gat gta gag gga tgt acg tgg aaa ttt gcc cgc tca gat 48
Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 aag ctc aac aga cac aag aaa agg cac 75
Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 145 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 146 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 146 tat att tgc aga aag tgt gga cgg ggc ttt agt cgg aag tcc aac ctt 48
Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 atc aga cat cag agg aca cac 69
Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 147 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 148 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(69) <400> 148 tat cta tgt agt gag tgt gac aaa tgc ttc agt aga agt aca aac ctc 48
Tyr Leu Cys Ser Glu Cys Asp Lys Cys Phe Ser Arg Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 ata agg cat cga aga act cac 69
Ile Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 149 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Tyr Leu Cys Ser Glu Cys Asp Lys Cys Phe Ser Arg Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 150 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 150 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ala His Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 151 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 151 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Phe Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 152 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 152 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser His Xaa Xaa 1 5 10 15 Thr His Xaa His 20 <210> 153 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 153 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser His Xaa Xaa 1 5 10 15 Val His Xaa His 20 <210> 154 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 154 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile His Xaa His 20 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> CONFLICT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 155 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 156 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 156 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Thr His Xaa Xaa 1 5 10 15 Gln His Xaa His 20 <210> 157 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 4-6, 8, 10, 14 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 157 Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Thr His Xaa Xaa Arg His 1 5 10 15 Xaa His <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 158 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile His Xaa His 20 <210> 159 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 159 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 160 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 160 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Gly Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 161 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 161 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Gly Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 162 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 163 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 163 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp His Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 164 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 164 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp His Xaa Xaa 1 5 10 15 Thr His Xaa His 20 <210> 165 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 165 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 166 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 166 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser His Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20 <210> 167 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purified polypeptide <221> VARIANT <222> 1, 9 <223> Xaa = Phe or Tyr <221> VARIANT <222> 2, 6-8, 10, 12, 16 <223> Xaa = any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid; 2-5 amino acids in length <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = hydrophobic residue <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa = any amino acid; 3-5 amino acids in length <400> 167 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Thr Asn Xaa Xaa 1 5 10 15 Arg His Xaa His 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クェン，ヨン−ド 大韓民国、インチョン 403−011、ブピョ ン−グ、ブピョン・１−ドン 70−５、ド ン−ア・アパートメント 27−701 (72)発明者 キム，ヒョン−ウォン 大韓民国、ソウル 133−100、ソンドン− グ、オクス−ドン、オクス・ハイツ 104 −402 (72)発明者 リュ，ウン・ヒョン 大韓民国、デジョン 300−130、ドン− グ、パンアム−ドン、ジュゴン・アパート メント 501−212 (72)発明者 ファン，ムン・ソン 大韓民国、デジョン 305−390、ユソン− グ、ジョンミン−ドン 298−２ 202 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA04 CA07 DA12 EA04 FA02 GA11 HA08 HA19 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ48 QQ49 QQ79 QR32 QR58 QR62 QR76 QS05 QS36 QX02 4H045 AA10 AA30 AA50 BA09 BA17 BA18 BA41 CA40 EA60 FA73 FA74

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡ上の標的部位を認識するジンクフィンガードメインを
    同定する方法であって、（ａ）プロモーターに作動可能に連結されたリポーター
    遺伝子を含むリポーター構築物を含有する細胞を提供する工程、ここで、リポー
    ター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識す
    る場合には、所定レベルを超過して発現するが、転写因子がプロモーターの招集
    部位のみを認識する場合にはその限りでない； （ｂ）（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイ
    ン及び（iii）試験ジンクフィンガードメインを含む非天然のタンパク質をコー
    ドする複数のハイブリッド核酸を提供する工程、ここで、試験ジンクフィンガー
    ドメインのアミノ酸配列は、複数のメンバー間で異なる； （ｃ）一つ以上の複数の核酸が、一つ以上の細胞に入ることができる条件下で、
    複数のハイブリッド核酸を前記細胞と接触させる工程； （ｄ）細胞内でハイブリッド核酸が発現できるようにする条件で前記細胞を維持
    する工程；及び （ｅ）細胞が（ｂ）のハイブリッド核酸を含み、そして標的部位を認識する試験
    ジンクフィンガードメインをコードするハイブリッド核酸を含むことを指標とし
    て、細胞が、リポーター遺伝子を所定レベルを超えて発現させることを同定する
    工程を含む、方法。
  2. 【請求項２】 前記細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記細胞が、酵母細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyce
    s cerevisiae）細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記リポーター遺伝子が、選択可能なマーカーである、請求
    項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記選択可能なマーカーが、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２
    、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記リポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＣＡＴ、ルシファラー
    ゼ、ＧＵＳ及びＧＦＰからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含
    む、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、二つのジンクフィンガードメイ
    ンを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、三つのジンクフィンガードメ
    インを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 （ｉ）保存されたドメインの境界部分をコードする配列に
    アニールするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノム核酸、伝令ＲＮＡ
    （ｍＲＮＡ）混合物、または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）混合物から試験ジンクフ
    ィンガードメインをコードする核酸源を増幅し、増幅された断片を製造する工程
    ；及び （ii）増幅された断片を利用して請求項１の工程（ｂ）の複数のハイブリッド核
    酸内に含まれるハイブリッド核酸を構築する工程を更に含む、請求項１に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 （ｉ）配列データベースから候補ジンクフィンガードメイ
    ンのアミノ酸配列を同定する工程； （ii）前記候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸をコードする候補核酸を提
    供する工程；及び （iii）前記候補核酸を利用して工程（ｂ）の複数のハイブリッド核酸内に含ま
    れるハイブリッド核酸を構築する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記選択可能マーカーは、代謝産物の合成に必要な栄養要
    求性遺伝子であり、前記細胞のゲノムは、この栄養要求性遺伝子の機能的コピー
    を欠いており、かつ、（ｄ）工程の間、前記細胞は前記代謝産物無しで調製され
    た培地中で維持される、請求項５に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 第２標的部位を認識する第２試験ジンクフィンガードメイ
    ンを同定するために（ａ）乃至（ｅ）工程が繰り返される、請求項１に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 第１試験ジンクフィンガードメイン及び第２試験ジンクフ
    ィンガードメインを含むポリペプチドをコードする核酸の構築を更に含む、請求
    項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡ上の標的部位を認識するジンクフィンガードメイン
    を同定する方法であって、（ａ）プロモーターに作動可能に連結されたリポータ
    ー遺伝子を含むリポーター構築物を含有する細胞を提供する工程、ここで、リポ
    ーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識
    する場合には、所定レベルを超過して発現されるが、転写因子がプロモーターの
    招集部位のみを認識する場合にはその限りでない； （ｂ）保存されたドメインの境界部分をコードする核酸にアニールするオリゴヌ
    クレオチドプライマーを用いて、それぞれ試験ジンクフィンガードメインをコー
    ドする複数の核酸配列を増幅させる工程； （ｃ）（ｂ）の各核酸配列を（ｉ）転写活性化ドメインをコードする核酸配列及
    び（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列に連結し
    て複数のハイブリッド核酸を形成する工程； （ｄ）一つ以上のハイブリッド核酸が一つ以上の細胞に入ることが可能な条件下
    で、（ｃ）の複数のハイブリッド核酸を（ａ）の細胞と接触させる工程； （ｅ）細胞内でのハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で前記細胞を維持
    する工程；及び （ｆ）細胞が（ｃ）のハイブリッド核酸を含み、そして、リポーター遺伝子を所
    定のレベルを超えて発現させる細胞を同定する工程であって、ここで、このハイ
    ブリッド核酸がＤＮＡの標的部位を認識するジンクフィンガードメインをコード
    する工程を含む、方法。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が、酵母細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記リポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＣＡＴ、ルシファラ
    ーゼ、ＧＵＳ及びＧＦＰからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを
    含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、二つのジンクフィンガードメ
    インを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試験ジンクフィンガードメインが、プロモーター上の標的
    部位を認識するか否かを決定する方法であって、（ａ）プロモーターに作動可能
    に連結されたリポーター遺伝子を含むリポーター構築物を提供する工程であって
    、ここで、リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部
    位の両方を認識する場合には所定レベルを超えて発現されるが、転写因子がプロ
    モーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない； （ｂ）（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイ
    ン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインを含む非天然のタンパク質をコ
    ードする複数のハイブリッド核酸を提供する工程； （ｃ）リポーター構築物が細胞に入ることを可能にする条件下でリポーター構築
    物を細胞と接触させる工程； （ｄ）（ｃ）工程の前、（ｃ）工程の後または（ｃ）工程と同時に、ハイブリッ
    ド核酸が細胞に入ることが可能な条件下で、前記ハイブリッド核酸を前記細胞と
    接触させる工程； （ｅ）細胞内でハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で前記細胞を維持す
    る工程；及び （ｆ）細胞内のリポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで所定レ
    ベルを超えるリポーター遺伝子の発現が、試験ジンクフィンガードメインが標的
    部位を認識することの指標である工程を含む、方法。
  22. 【請求項２２】 保存されたドメインの境界部位をコードする配列にアニー
    ルするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ混合物
    、またはｃＤＮＡ混合物から試験ジンクフィンガードメインをコードする核酸を
    増幅する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 （ｉ）配列データベース中の候補ジンクフィンガードメイ
    ンのアミノ酸配列を同定する工程； （ii）前記候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列をコードする候補核酸
    を提供する工程；及び （iii）前記候補核酸を利用し、工程（ｂ）の複数のハイブリッド核酸内に含ま
    れるハイブリッド核酸を構築する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 試験ジンクフィンガードメインがプロモーター上の標的部
    位を認識しするか否かを決定する方法であって、（ａ）プロモーターに作動可能
    に連結されたリポーター遺伝子を含むリポーター構築物を含む第１細胞を提供す
    る工程であって、ここで、リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集
    部位及び標的部位の両方を認識する場合には所定レベルを超えて発現されるが、
    転写因子がプロモーターの招集部位だけを認識する場合にはその限りでない工程
    ； （ｂ）（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集体結合部位を認識するＤＮＡ結合
    ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインを含むタンパク質をコー
    ドするハイブリッド核酸を含む第２細胞を提供する工程； （ｃ）前記第１細胞及び第２細胞を融合して、融合された細胞を形成する工程；
    （ｄ）細胞内でハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で前記融合された細
    胞を維持する工程；及び （ｅ）融合された細胞内のリポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、こ
    こで所定レベルを超えるリポーター遺伝子の発現は試験ジンクフィンガードメイ
    ンが標的部位を認識することの指標である工程を含む、方法。
  25. 【請求項２５】 前記第１及び第２細胞が、反対に交配する型の酵母細胞で
    ある、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 試験ジンクフィンガードメインが、プロモーター上の標的
    部位を認識するか否かを決定する方法であって、（ａ）プロモーターに作動可能
    に連結されたリポーター遺伝子を含む複数のリポーター構築物を提供する工程で
    あって、ここで、リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び
    標的部位の両方を認識する場合には所定レベルを超えて発現されるが、転写因子
    がプロモーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない； （ｂ）（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイ
    ン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインを含む非天然のタンパク質をコ
    ードするハイブリッド核酸を含有する細胞を提供する工程； （ｃ）複数のリポータ構築物の一つ以上が細胞内に入ることを可能にする条件下
    で、複数のリポーター構築物を細胞と接触させる工程； （ｄ）細胞内でハイブリッド核酸が発現することができる条件下で、前記細胞を
    維持する工程；及び （ｅ）細胞が（ａ）のリポーター遺伝子を含み、細胞内のリポーター構築物が試
    験ジンクフィンガードメインにより認識される標的部位を含むことを指標として
    、所定レベルを超えてリポーター遺伝子を発現させる細胞を同定する工程を含む
    、方法。
  27. 【請求項２７】 前記標的結合部位が、２乃至６個のヌクレオチド長である
    、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 複数のリポーター構築物が、その標的結合部位の二つ以上
    の位置にＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの全ての可能な組合を含む、請求項２７に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 複数のリポーター構築物が、その標的結合部位の三つ以上
    の位置にＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの全ての可能な組合を含む、請求項２８に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 第２試験ジンクフィンガードメインに対し、前記工程（ａ
    ）乃至（ｅ）を繰り返し、第２結合優先性を同定する、請求項２６に記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 第１、第２試験ジンクフィンガードメインを含むポリペプ
    チドをコードする核酸を構築する工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 複数のジンクフィンガードメインの同定方法であって、請
    求項１の方法を遂行して、第１試験ジンクフィンガードメインを同定し、請求項
    １の方法を再遂行し、第１試験ジンクフィンガードメインが認識する標的部位と
    相異する標的部位を認識する第２試験ジンクフィンガードメインを同定すること
    を含む方法。
  33. 【請求項３３】 キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を製
    造する方法であって、請求項３２の方法を遂行する工程、第１及び第２試験ジン
    クフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする核酸を構築する工程を含
    む方法。
  34. 【請求項３４】 ジンクフィンガードメインにより認識されるＤＮＡ配列を
    同定する方法であって、請求項２４の方法を遂行し、第１試験ジンクフィンガー
    ドメインにより認識される第１標的部位を同定する工程、 請求項２４の方法を再遂行し、第２試験ジンクフィンガードメインにより認識さ
    れる第２標的部位を同定する工程を含む方法。
  35. 【請求項３５】 キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の製
    造方法であって、請求項３４の方法を遂行する工程、第１及び第２試験ジンクフ
    ィンガードメインを含むポリペプチドをコードする核酸を構築する工程を含む方
    法。
  36. 【請求項３６】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号６８）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 請求項３６のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  38. 【請求項３８】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号６９）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 請求項３８のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  40. 【請求項４０】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号７０）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 請求項４０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  42. 【請求項４２】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号７１）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  43. 【請求項４３】 請求項４２のポリペプチドをコードする配列を含有する核
    酸。
  44. 【請求項４４】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉ
    ｓ（配列番号７２）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり
    、Ｘbは、疎水性残基であり、Ｘｃは、セリンまたはスレオニンである）を含む
    精製されたポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 請求項４４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  46. 【請求項４６】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号７３）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  47. 【請求項４７】 請求項４６のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  48. 【請求項４８】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号７４）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであ
    り、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 請求項４８のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  50. 【請求項５０】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉ
    ｓ（配列番号７５）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり
    、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 請求項５０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  52. 【請求項５２】 配列番号６５と６０％相同性なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 請求項５２のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  54. 【請求項５４】 配列番号２９、１２７、１２９、１３１、１３３及び１３
    ５からなる群より選択されたアミノ酸配列と６０％相同なアミノ酸配列を含む精
    製されたポリペプチド。
  55. 【請求項５５】 請求項５４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  56. 【請求項５６】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５０）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  57. 【請求項５７】 請求項５６のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  58. 【請求項５８】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５１）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  59. 【請求項５９】 請求項５８のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  60. 【請求項６０】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５２）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  61. 【請求項６１】 請求項６０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  62. 【請求項６２】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５３）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 請求項６２のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  64. 【請求項６４】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５４）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  65. 【請求項６５】 請求項６４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  66. 【請求項６６】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５５）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  67. 【請求項６７】 請求項６６のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  68. 【請求項６８】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５６）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  69. 【請求項６９】 請求項６８のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  70. 【請求項７０】 アミノ酸配列、Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−
    Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列
    番号１５７）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは
    、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  71. 【請求項７１】 請求項７０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  72. 【請求項７２】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５８）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  73. 【請求項７３】 請求項７２のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  74. 【請求項７４】 アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−
    Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈ
    ｉｓ（配列番号１５９）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンで
    あり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
  75. 【請求項７５】 請求項７４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  76. 【請求項７６】 配列番号１０７と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  77. 【請求項７７】 請求項７６のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  78. 【請求項７８】 配列番号１３７と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  79. 【請求項７９】 請求項７８のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  80. 【請求項８０】 配列番号１４５と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  81. 【請求項８１】 請求項８０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  82. 【請求項８２】 配列番号１４９と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  83. 【請求項８３】 請求項８２のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  84. 【請求項８４】 配列番号１４１と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製さ
    れたポリペプチド。
  85. 【請求項８５】 請求項８４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
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