JP2014530607A

JP2014530607A - 人工転写因子の送達による受容体発現の調節

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Publication number: JP2014530607A
Application number: JP2014535033A
Authority: JP
Inventors: フラマー，ヨーゼフ; ノイツナー，アルベルト; ハクスリー，アリス
Original assignee: ALIOPHTHA AG
Current assignee: ALIOPHTHA AG
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-11-20
Also published as: KR20140079780A; EA201490531A1; AU2012323032A1; IN2014CN02586A; CL2014000897A1; MX2014004331A; TN2014000117A1; HK1197083A1; SG11201400701WA; MA36970A1; CO6930308A2; EP2766484A2; WO2013053719A2; US20140296129A1; IL231865A0; ZA201401960B; CA2851560A1; CN103998609A; BR112014008456A2; WO2013053719A3

Abstract

本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメイン、核移行配列、およびタンパク質トランスダクションドメインに融合した、受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子に関する。特定の例では、これらの受容体遺伝子プロモーターは、エンドセリン受容体Ａ、エンドセリン受容体Ｂ、Ｔｏｌｌ様受容体４または高親和性ＩｇＥ受容体の発現を調節する。エンドセリンＡまたはＢ受容体に対する人工転写因子は、心血管疾患、特に眼疾患のようなエンドセリンによって調節される疾患、例えば網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、黄斑浮腫、視神経症、中心性漿液性網脈絡膜症、網膜色素変性、レーバー遺伝性視神経症などの処置に有用である。Ｔｏｌｌ様受容体４またはＩｇＥ受容体に対する人工転写因子は、それぞれ、自己免疫障害などおよびアレルギー障害の処置に有用である。

Description

発明の分野
本発明は、阻害または活性化ドメイン、核移行配列、およびタンパク質トランスダクションドメインと融合した受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される疾患の処置におけるそれらの使用に関する。

背景技術
人工転写因子（ＡＴＦ）は、遺伝子発現を調節するために有用なツールであると提案されている（Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526）。遺伝子転写の抑制または活性化のいずれかにより発現に影響する多数の天然転写因子は、ある特定のＤＮＡ配列の認識に特異的な複合ドメインを有する。このことがそれらの転写因子の特異性およびターゲット遺伝子（一つまたは複数）を改変しようと思う場合、転写因子操作のためには魅力的でないターゲットになる。しかし、ある特定のクラスの転写因子は、数個のいわゆるジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含み、それらのドメインはモジュール性であるから遺伝子工学に役立つ。ジンクフィンガーは、３個のＤＮＡ塩基対をほとんど独立してターゲティングする短鎖（アミノ酸３０個）ＤＮＡ結合モチーフである。それ故に、そのようなジンクフィンガーを数個含むタンパク質は、より長いＤＮＡ配列を認識することができる。六量体性ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、ヒトゲノム全体においてほとんど独特な１８塩基対（bp）のＤＮＡターゲットを認識する。ジンクフィンガーに関して、最初は完全に環境非依存性（context independent）であると考えられたが、より徹底的な分析からいくらかの環境特異性（context specificity）が明らかとなった（Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231）。ジンクフィンガー認識表面内のある特定のアミノ酸を変異させてＺＦモジュールの結合特異性を変えた結果、５’−ＧＮＮ−３’、５’−ＣＮＮ−３’、５’−ＡＮＮ−３’コドンの大部分、および５’−ＴＮＮ−３’コドンの一部に対する確定されたＺＦ構成要素がもたらされた（例えばいわゆるＢａｒｂａｓモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3^rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597参照）。人工転写因子に関する初期の研究は、予備選択されたジンクフィンガーを公知の３bpターゲット配列と組合せることに基づく合理的設計に集中していたが、ジンクフィンガーのある特定の環境特異性の認識により、細菌もしくは酵母１ハイブリッド、ファージディスプレイ、区画化（compartmentalized）リボソームディスプレイまたはＦＡＣＳ分析を用いたin vivo選択などの洗練された方法を用いて照合される大規模ジンクフィンガーライブラリーを産生せざるを得なくなった。

そのような人工ジンクフィンガータンパク質を使用して、ヒトゲノム内のＤＮＡローカスを高い特異性でターゲティングすることができる。従って、これらのジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性を有するタンパク質ドメインを特異的プロモーター配列に輸送して、関心が持たれる遺伝子の発現の調節をもたらすために理想的なツールである。転写サイレンシングのために適切なドメインは、Ｎ末端としてのクルッペル関連ドメイン（ＫＲＡＢ）（配列番号１）またはＣ末端ＫＲＡＢドメイン（配列番号２）、Ｓｉｎ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ、配列番号３）およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ、配列番号４）であるのに対して、遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン（配列番号５）またはＶＰ６４ドメイン（ＶＰ１６の四量体性リピート、配列番号６）によって達成される（Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。加えて、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の転写活性ドメイン（http://amigo.geneontology.org/cgi bin/amigo/term_details?term=GO:0001071）は、ターゲットタンパク質の転写調節を達成すると考えられる。

全ての公知の薬物ターゲットは、高いパーセンテージで、多くの場合に考慮すべきオフターゲット活性を伴う、低分子薬の作用によって刺激または遮断される受容体分子である。そのような受容体の例は、ヒスタミンＨ１受容体またはα−およびβ−アドレノセプターであるが、一般に遺伝子オントロジーＧＯ：０００４８８８およびＧＯ：０００４９３０によって定義されるタンパク質である。

特異的特徴が高く保存されているために、低分子薬は、所与のタンパク質ファミリーの特定のメンバーを必ずしも選択的にターゲティングすることができない一方で、生物学的製剤は、抗体に基づく新薬について示されたように大きな特異性を提供する。しかし、今のところ実質的に全ての生物学的製剤は、細胞外で作用する。

特に上述の人工転写因子は、治療的に有用な方法で遺伝子転写に影響するために適しているであろう。しかし、作用部位（核）にそのような因子を送達することは、容易には達成されず、それ故に、治療的人工転写因子アプローチの有用性が妨げられている（例えば、免疫原性および細胞形質転換の潜在性などの、この方法の全ての欠点を伴った形でレトロウイルス送達に、バトンタッチすることによって）（Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091）。

いわゆるタンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）は、タンパク質が形質膜を通過して細胞質／核質内に移行することを促進することが示された。ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド（配列番号７）およびその他の短鎖ペプチドは、積み荷タンパク質の細胞型非依存的なマクロピノサイトーシス性取込みを誘導することが示された（Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315）。そのような融合タンパク質は、細胞質内に到達した際に生物学的活性を有することが示された。興味深いことに、ミスフォールディングしたタンパク質であっても、最も高い可能性で細胞内シャペロンの作用によって、タンパク質のトランスダクション後に機能的になりうる。

血管作動性エンドセリン系は様々な疾患の発病に重要な役割を果たす。エンドセリンは、一方で血液供給の調節に関与し、他方で低酸素によって誘導される事象のカスケードの主役である。エンドセリンは、例えば血液脳関門または血液網膜関門の破壊および血管新生に関与する。さらに、エンドセリンは、神経変性に関与し、痛覚またはさらには口渇感の閾値調節にも関与する。エンドセリンは、眼圧の調節にも関与する。

エンドセリンの作用は、通常は血管周囲の平滑筋細胞上に位置するその対応する受容体、主にエンドセリン受容体Ａによって仲介される。エンドセリン系に影響することは、全身的または局所的に、くも膜下出血または脳出血などの多数の疾患の処置にとっての関心対象である。エンドセリンは、多発性硬化症の経過にも影響する。エンドセリンは、（肺）高血圧に関与し、そのうえ動脈性低血圧、心筋症およびレイノー症候群、異型狭心症ならびに他の心血管疾患にも関与する。エンドセリンは、糖尿病性腎症および糖尿病性網膜症に関与する。さらにエンドセリンは、眼において緑内障性神経変性、網膜静脈閉塞、巨細胞性動脈炎、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、中心性漿液性網脈絡膜症、レーバー病、スザック症候群、眼内出血、網膜上グリオーシス（epiretinal gliosis）およびある特定の他の病態のために役割を果たす。

眼は、その高い酸素需要に対処するためにバランスの取れた十分な灌流に強く依存する精巧な器官である。十分で安定な酸素供給を提供できないと、虚血再灌流傷害が引き起こされ、正常眼圧または正常化された眼圧にもかかわらず疾患が進行性の緑内障患者で見られるようなグリアの活性化およびニューロン損傷に繋がる。不十分な血液供給は、また、低酸素症に繋がり、糖尿病性網膜症または滲出型加齢性黄斑変性の際に明白なようにさらなる網膜損傷の潜在性を有するランナウェイ（run-away）血管新生を引き起こす。眼組織の灌流は複雑なコントロール下にあり、血圧、眼圧および血管径を調節している局所因子に依存する。そのような局所因子は、例えば、既述のエンドセリン、すなわち強い血管収縮活性を有する短鎖ペプチドである。エンドセリンの３種のアイソフォーム（ＥＴ−１、ＥＴ−２、およびＥＴ−３）は、血管壁に位置する内皮細胞によって分泌される前駆分子からエンドセリン変換酵素によって産生される。成熟ＥＴに対する２種の対応する受容体は公知であり、ＥＴＲＡおよびＥＴＲＢである。ＥＴＲＡは、血管壁を形成し、血管収縮を促進している平滑筋細胞に位置し、ＥＴＲＢは、主に内皮細胞上に発現され、一酸化窒素の放出を促進することで平滑筋の弛緩を引き起こすことによって血管拡張的に作用する。ＥＴＲＡおよびＥＴＲＢは、Ｇタンパク質共役７回膜貫通ヘリックス受容体の大きなクラスに属する。ＥＴＲＡまたはＥＴＲＢに対するＥＴの結合は、Ｇタンパク質の活性化を生じることで細胞内カルシウム濃度の増加をトリガーし、それによって広く一連の細胞反応を引き起こす。

網膜静脈閉塞、緑内障性神経変性、網膜色素変性、巨細胞性動脈炎、中心性漿液性網脈絡膜症、多発性硬化症、視神経炎、関節リウマチ、スザック症候群、放射線網膜症、網膜上グリオーシス、線維筋痛症および糖尿病性網膜症の際のように、ＥＴのレベルが上昇し、ＥＴが有害に作用する場合に、薬理学的にＥＴ系に影響することが有用であると分かる場合がある。この目的を達するために、ＥＴＲＡのダウンレギュレーションは疾患の転帰の調節を助けるであろう。しかし、ある状況のもとでは、ＥＴＲＡのアップレギュレーションが、それ故にＥＴに対する感受性増加が、例えば角膜外傷または角膜潰瘍から回復する際の角膜の創傷治癒を促進するために、望ましい場合がある。

加えて、ＥＴＲＢ介在性シグナリングは、例えば癌幹細胞の維持および腫瘍の成長の際の病態生理学的過程に繋がっている。加えて、ＥＴＲＢのアップレギュレーションが緑内障性神経変性に関連する一方で、ＥＴＲＢの阻害が緑内障の際に神経保護的に作用することが示された。さらに、ＥＴＲＢは、炎症時にアップレギュレーションされる。従って、特異的人工転写因子によるＥＴＲＢの薬理学的調節は、癌の処置、神経変性の予防、および炎症過程の調節に有用であろう。

リポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌細胞壁成分は、様々な疾患の発病に重要な役割を果たす。体内にＬＰＳが存在することは、免疫系によって対処する必要のある細菌感染の証拠となる。ＬＰＳはグラム陰性細菌の一般的な成分であるので、ＬＰＳは、免疫系を活性化できる、いわゆる危険シグナルを構成する。ＬＰＳは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）によって認識され、ＴＬＲ４は、細菌感染またはウイルス感染に関連する様々な危険シグナルまたは病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識に関与する、より大きなファミリーのＴｏｌｌ様受容体の一員である。危険シグナルとしてのＬＰＳの認識は自然免疫の重要な部分である一方で、ＴＬＲ４受容体の過剰刺激または刺激延長は、慢性炎症に関連する多様な病態に繋がっている。例は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）慢性感染、およびＨＩＶ−ＨＣＶ同時感染などの様々な肝疾患である。ＴＬＲ４シグナリングに関連する他の疾患は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）、乾癬、クローン病、ブドウ膜炎、コンタクトレンズ関連角膜炎および角膜炎である。加えて、ＴＬＲ４介在性シグナリングは、癌の進行および化学療法耐性に関与する。

薬理学的にＬＰＳの認識およびＴＬＲ４シグナリングに影響することが、ＴＬＲ４の不適切な活性化による慢性炎症に関連する疾患に有用であると分かる場合がある。従って、ＴＬＲ４プロモーターにターゲティングされている特異的ネガティブ調節性人工転写因子の作用によるＴＬＲ４タンパク質のダウンレギュレーションは、ＬＰＳによって引き起こされる慢性炎症の悪循環を断つことによって疾患の転帰を調節することを助けるであろう。

免疫グロブリンアイソタイプＥ（ＩｇＥ）は、適応免疫系の部分であって、それ自体が感染防御に、そして悪性の形質転換にも関与する。ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球上に位置する高親和性ＩｇＥ受容体（ＦＣＥＲ１）によって結合される。ＦＣＥＲ１へのＩｇＥの結合に続く、アレルゲンと呼ばれる特異的抗原を介したこれらの複合体の交差結合は、肥満細胞および好塩基球からの様々な因子の放出に繋がり、アレルギー応答を引き起こす。これらの因子の中には、ヒスタミン、ロイコトリエン、様々なサイトカイン、さらにまたリゾチーム、トリプターゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼが含まれる。これらの因子の放出は、アレルギー性鼻炎、喘息、湿疹およびアナフィラキシーなどのアレルギー疾患に関連する。

発明の概要
本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメイン、核移行配列、およびタンパク質トランスダクションドメインに融合した、受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む薬学的組成物に関する。さらに本発明は、外部刺激および他の可溶性シグナリング分子に対する細胞の反応を調節するための、ならびにそのような受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される疾患を処置することへの、そのような人工転写因子の使用に関する。

特定の一態様では、受容体遺伝子プロモーターは、エンドセリン受容体Ａプロモーターである。別の特定の態様では、本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響することに使用するための、エンドセリン受容体のレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法に関する。

別の特定の態様では、本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、エンドセリン受容体Ａプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子中間体に関する。

別の特定の態様では、受容体遺伝子プロモーターは、エンドセリン受容体Ｂプロモーターである。別の特定の態様では、本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響することに使用するための、エンドセリン受容体Ｂのレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法に関する。

別の特定の態様では、本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、エンドセリン受容体Ｂプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子中間体に関する。

別の特定の態様では、受容体遺伝子プロモーターは、Ｔｏｌｌ様受容体４プロモーターである。別の特定の態様では、本発明は、リポ多糖に対する細胞応答に影響することに使用するための、Ｔｏｌｌ様受容体４のレベルを低下または増加させるための、およびリポ多糖によって調節される疾患の処置に使用するための、特に眼疾患の処置に使用するための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、リポ多糖によって調節される疾患を処置する方法に関する。

別の特定の態様では、本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、Ｔｏｌｌ様受容体４プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子中間体に関する。

別の特定の態様では、受容体遺伝子プロモーターは、高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットαのプロモーターである。別の特定の態様では、本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する細胞応答に影響することに使用するための、高親和性ＩｇＥ受容体のレベルを低下または増加させるための、およびＩｇＥによって調節される疾患の処置に使用するための、特に眼疾患の処置に使用するための、そのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＩｇＥによって調節される疾患を処置する方法に関する。

別の特定の態様では、本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットαプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子中間体に関する。

受容体の発現を調節することによって細胞感受性を変化させることを示す図である。阻害／活性化ドメイン（ＲＤ＝調節ドメイン）および核移行配列（ＮＬＳ）に融合した、受容体遺伝子（ＲＧ）プロモーター（Ｐ）を特異的にターゲティングする六量体性ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質を含む人工転写因子は、ＴＡＴ又はその他のタンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）の作用によって細胞内に輸送される。受容体遺伝子の発現が、転写調節ドメインに応じて増加（＋）または抑制（−）される結果、それぞれ受容体（Ｒ１、Ｒ２またはＲ３）アゴニスト（Ａ）に対する細胞感受性の強化または減少が生じる。ヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）プロモーター領域を示す図である。推定上のＥＴＲＡプロモーターを含むＥＴＲＡ遺伝子の５’非翻訳領域を示す。ハイライトされているのは、転写開始部位（＋１で表示）ならびに人工転写因子についての潜在的な１５bpおよび１８bpターゲット部位（ＴＳ）（下線を付け、ＴＳ−８５５、ＴＳ−５５５、ＴＳ−４８７、ＴＳ−４４７、ＴＳ−３０６、ＴＳ−２３０、ＴＳ−１０３、ＴＳ−３７、ＴＳ＋７４で表示）である。ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）プロモーター領域を示す図である。ＴＬＲ４プロモーターを含むＴＬＲ４遺伝子の５’領域を示す。ハイライトされているのは、転写開始部位（＋１）、第１エクソンの開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（太字）ならびに特異的人工転写因子についての潜在的１８bpターゲット部位（下線を付け、ＴＳ−２７６、ＴＳ−５５、ＴＳ＋１１３で表示）である。ヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ａ（ＦＣＥＲ１Ａ）プロモーター領域を示す図である。近位構成的プロモーターを含むＦＣＥＲ１Ａ遺伝子の５’領域を示す。ハイライトされているのは、転写開始部位（＋１で表示）、第１エクソンの開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（太字）ならびに特異的人工転写因子についての潜在的１８bpターゲティング部位（下線を付け、ＴＳ−１４７およびＴＳ＋１７で表示）である。ヒトエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＲＢ）プロモーター領域を示す図である。ＥＴＲＢプロモーターを含むＥＴＲＢ遺伝子の５’領域を示す。ハイライトされているのは、翻訳開始部位（＋１で表示）および特異的人工転写因子についての潜在的１８bpターゲット部位（下線を付け、ＴＳ−１１４９およびＴＳ−４８７で表示）である。代替的転写開始部位がいくつか報告されているので（Arai H. et al., 1993, J Biol Chem 268, 3463-70; Tsutsumi M. et al., 1999, Gene 4, 43-9）、翻訳開始部位がターゲット部位を命名するための参照点として選ばれた。人工転写因子を示す図である。Ａ）様々なジンクフィンガータンパク質を三つの異なるプラスミドにクローニングした。様々な発現プラスミドのモジュール設計を強調するために、独特な制限酵素部位を示す。生じたＤＮＡ構築物は、以下の融合タンパク質をコードした：ＫＲＡＢ−ＮＬＳ−６ＺＦＰ−３ｘｍｙｃ（配列番号８）、ＳＩＤ−ＮＬＳ−６ＺＦＰ−３ｘｍｙｃ、ＮＬＳ−６ＺＦＰ−ＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）リンカー−ＫＲＡＢＡ−３ｘｍｙｃ、およびＮＬＳ−６ＺＦＰ−ＧＧＳＧＧＳリンカー−ＶＰ６４−３ｘｍｙｃ。人工転写因子ＡＯ７４Ａ、ＡＯ７４Ｅ、ＡＯ７４ＲおよびＡＯ７４Ｖによるヒトヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）活性の調節を示す図である。（Ａ）ＥＴＲＡプロモーターが推進するタンパク質発現の人工転写因子依存性抑制。ＥＴＲＡプロモーター内のターゲティング部位に対するＡＯ７４Ａ（配列番号１０）、ＡＯ７４Ｅ（配列番号１１）、ＡＯ７４Ｒ（配列番号１２）、およびＡＯ７４Ｖ（配列番号１３）の発現後のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す（ＲＬｕＡ＝対照Ｃに対する相対ルシフェラーゼ活性（％））。Ｃ＝対照としての黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）。人工転写因子ＡＯ７４Ａ、ＡＯ７４Ｅ、ＡＯ７４ＲおよびＡＯ７４Ｖによるヒトヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）活性の調節を示す図である。（Ｂ）トランスダクション可能なＡＯ７４Ｖタンパク質であるＡＯ７４Ｖｐ（配列番号１４）は、対照Ｂ（緩衝液処理細胞）に比べてＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しない。ＲＰ＝対照に対する相対増殖（％）。人工転写因子ＡＯ７４Ａ、ＡＯ７４Ｅ、ＡＯ７４ＲおよびＡＯ７４Ｖによるヒトヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）活性の調節を示す図である。（Ｃ）ＡＯ７４Ｖｐは、対照Ｂ（緩衝液処理細胞）に比べてヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）の増殖を阻害しない。人工転写因子ＡＯ７４Ａ、ＡＯ７４Ｅ、ＡＯ７４ＲおよびＡＯ７４Ｖによるヒトヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）活性の調節を示す図である。（Ｄ）ＡＯ７４Ｖｐは、ｈＵｔＳＭＣのＥＴ−１依存性収縮を遮断する。ｈＵｔＳＭＣを３次元コラーゲン格子内に包埋した。Ｃ＝対照としての緩衝液処理細胞。Ｂ＝緩衝液およびＥＴ−１で処理された細胞。ＡＯ７４Ｖｐ＝ＡＯ７４ＶｐおよびＥＴ−１で処理された細胞。ＲＬＡ＝対照Ｃに対する相対格子面積（％）。詳細は下記。人工転写因子ＡＯ７４ＲａおよびＡＯ７４Ｖａによって推進されるＥＴＲＡプロモーター活性の増強を示す図である。（Ａ）ＥＴＲＡプロモーターが推進するルシフェラーゼレポーターの発現は、活性化人工転写因子ＡＯ７４Ｒａ（配列番号１５）およびＡＯ７４Ｖａ（配列番号１６）の発現後に増加する。ＲＬｕＡ＝対照Ｃ（ＹＦＰ）に対する相対ルシフェラーゼ活性（％）。人工転写因子ＡＯ７４ＲａおよびＡＯ７４Ｖａによって推進されるＥＴＲＡプロモーター活性の増強を示す図である。（Ｂ）ＡＯ７４Ｖａｐ（配列番号１７）を用いた処理はｈＵｔＳＭＣの細胞増殖を阻害しない。タンパク質として送達されたＡＯ７４Ｖｐは、ｈＵｔＳＭＣ細胞に有毒ではなく、細胞増殖にマイナスに影響しない。Ｂ＝緩衝液処理された細胞。ＲＰ＝対照に対する相対増殖（％）。ＡＯ１１４９ＮおよびＡＯ１１４９Ｐによるヒトエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＲＢ）プロモーター活性の抑制を示す図である。人工転写因子ＡＯ１１４９Ｎ（配列番号１８）およびＡＯ１１４９Ｐ（配列番号１９）の発現は、ルシフェラーゼレポーターアッセイでＹＦＰ（対照Ｃ）に比べてＥＴＲＢプロモーターの活性を抑制する。ＲＬｕＡ＝対照Ｃに対する相対ルシフェラーゼ活性（％）。ＡＯ５５ＢおよびＡＯ５５ＥによるヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）活性の調節を示す図である。（Ａ）ＡＯ５５Ｂ（配列番号２０）およびＡＯ５５Ｅ（配列番号２１）の発現は、ルシフェラーゼレポーターアッセイでＹＦＰ（対照Ｃ）に比べてＴＬＲ４プロモーター活性を遮断する。ＲＬｕＡ＝対照Ｃに対する相対ルシフェラーゼ活性（％）。ＡＯ５５ＢおよびＡＯ５５ＥによるヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）活性の調節を示す図である。（Ｂ）ＴＬＲ４に依存し、ＬＰＳが誘導するインターロイキン（ＩＬ）−６分泌は、マクロファージ様Ｕ９３７細胞でのＡＯ５５Ｂ発現後に鈍る。ＡＯ５５ＢおよびＡＯ５５ＥによるヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）活性の調節を示す図である。（Ｃ）ＡＯ５５Ｂｐ（配列番号２２）を用いた処理はＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しない。ＲＰ＝対照に対する相対増殖（％）。Ｂ＝緩衝液処理された細胞。ＲＰ＝対照に対する相対増殖（％）。高親和性ＩｇＥ受容体がＡＯ１４７Ａによって調節されることを示す図である。（Ａ）ラット好塩基球性ＲＢＬ−２Ｈ３細胞において高親和性ＩｇＥ受容体αサブユニット（ＦＣＥＲ１Ａ）プロモーターが推進するルシフェラーゼレポーターの発現は、ＡＯ１４７Ａ（配列番号２３）の発現後に阻害される。ＲＬｕＡ＝対照Ｃ（ＹＦＰ）に対する相対ルシフェラーゼ活性（％）。高親和性ＩｇＥ受容体がＡＯ１４７Ａによって調節されることを示す図である。（Ｂ）ＡＯ１４７Ａｐ（配列番号２４）はＨｅＬａ細胞の増殖を阻害しない。Ｂ＝緩衝液処理された細胞。ＲＰ＝対照に対する相対増殖（％）。高親和性ＩｇＥ受容体がＡＯ１４７Ａによって調節されることを示す図である。（Ｃ）ＡＯ１４７Ａｐを用いた処理は、ヒト好塩基球性ＫＵ８１２Ｆ細胞へのヒトＩｇＥの結合を約８０％阻害する。ＩｇＥＢ＝ヒトＩｇＥおよびＦＩＴＣラベルされたマウス抗ヒトＩｇＥを使用したフローサイトメトリーによって決定された、対照（Ｂ）としての緩衝液処理細胞と比べたＦＣＥＲ１に対するＩｇＥ結合能（％）。

発明の詳細な説明
本発明は、阻害または活性化タンパク質ドメイン、核移行配列、およびタンパク質トランスダクションドメインに融合した、受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む薬学的組成物に関する。

多くの疾患の処置は、細胞性受容体シグナリングを調節することに基づく。例は、高血圧（β遮断薬がβアドレナリン受容体の機能を阻害する）、うつ病（セロトニン取込み遮断薬がアゴニスト濃度を増加させることでセロトニン受容体シグナリングを増加させる）、または緑内障（プロスタグランジンアナログがプロスタグランジン受容体を活性化し、今度は眼圧を減少させる）である。伝統的に、受容体ゴニストまたはアンタゴニストのいずれかの形態の低分子が、治療目的で受容体シグナリングに影響するために使用される。しかし、細胞性受容体シグナリングは、受容体タンパク質の発現の直接調節によっても影響されうる。

受容体の発現レベルの直接調節が容易な病理過程は、例えば以下の通りである。先天性心疾患によるうっ血性心不全の患者は、βアドレノセプターのアップレギュレーションから利益を得るであろう。というのは、心筋におけるこの受容体のダウンレギュレーションが術後心疾患のリスクに関連するからである。パーキンソン病では、ドーパミン作動薬を投与する処置がドーパミン受容体の利用性を抑制するので、ドーパミン受容体のアップレギュレーションはドーパミン作動薬投与の有効性を高めるであろう。てんかんでは、海馬におけるカンナビノイド受容体の不十分な発現は、病因に関与するので、カンナビノイド受容体のアップレギュレーションは、てんかん患者のための実行可能な治療法であろう。

受容体タンパク質のハプロ不全（成長遅延を引き起こすインスリン様成長因子Ｉ受容体のハプロ不全およびその他）によって引き起こされた遺伝病に関して、残りの機能的受容体遺伝子の追加的活性化が患者にとって有益であろう。さらに、そして何よりも、病的自己免疫の誘導および永続化は、Ｔｏｌｌ様受容体からの不適切なシグナリングに連結している。従って、Ｔｏｌｌ様受容体のダウンレギュレーションは、様々な自己免疫病の悪循環を断つ。アレルギー疾患では、高親和性ＩｇＥ受容体を経由するＩｇＥ介在性シグナリングの阻止は、アレルギー反応を管理するために有用である。癌では、成長因子受容体のダウンレギュレーションまたは細胞外マトリックス受容体のアップレギュレーションは、腫瘍進行の阻止に有益である。

そのような受容体分子の中に、形質膜内で受容体にアンカーしている７回膜貫通ドメインおよびＧタンパク質依存性シグナリングカスケードを特徴とする、いわゆる７回膜貫通またはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリータンパク質からのタンパク質が入る。そのようなタンパク質の例は、エンドセリンに対する受容体ＡおよびＢである。他の受容体タンパク質、例えばリポ多糖に対する受容体、Ｔｏｌｌ様受容体４、またはＩＬ−４受容体などの様々なサイトカイン受容体は、１回膜貫通領域を介してアンカーされる。他の受容体は、多量体性タンパク質複合体から成る。例は、α、βおよびγ鎖から成る、ＩｇＥ抗体に対する高親和性受容体、またはα、β、γ、δ、εおよびζ鎖から成るＴ細胞受容体である。従って、「受容体分子」という用語には、非常に異なる作用様式を有する種々のタンパク質ファミリーからのタンパク質が包含される。

本発明において考えられる受容体は、

によってコードされるヒト受容体分子である。

考えられるさらなる受容体は、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、レプチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子α、リンフォトキシン、プロラクチン、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、コロニー刺激因子、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＥ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、アドレノメデュリン、アンジオポエチン、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、増殖分化因子−９、肝細胞成長因子、肝細胞腫由来成長因子、インスリン様成長因子、インスリン、遊走刺激因子、ミオスタチン、血小板由来成長因子、トロンボポエチン、血管内皮成長因子、胎盤成長因子、および成長ホルモンを認識するヒト受容体である。

さらに考えられるのは、相同非ヒト遺伝子、例えばブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはマウス遺伝子によってコードされる受容体；ならびに相同植物受容体遺伝子、例えばコムギ、オオムギ、トウモロコシ、イネ、ライムギ、エンバク、ダイズ、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、アマ、豆類、タバコ、または家畜飼料用草（life-stock feed grass）などの作物に見られる遺伝子、およびリンゴ、ナシ、バナナ、柑橘類、ブドウなどの果実食物に見られる遺伝子によってコードされる受容体である。

レトロウイルスは、免疫原性を生じる潜在性が例外的に高いので、ある特定の処置の反復適用へのレトロウイルスの使用は限定されている。そのような免疫反応は、ジンクフィンガーモジュールの高い保存性のせいで本発明の人工転写因子の適用後に軽微もしくは不在になるであろうし、または全体構造に小さな変化を加えて免疫原性を除去すると同時にターゲット部位との結合性を、よって機能を、まだ保持していることによって回避もしくはさらに極小化することができよう。さらに、ポリエチレングリコールを用いた本発明の人工転写因子の改変は、免疫原性を低下させると考えられる。加えて、眼および脳などの免疫特権を持つ器官への本発明の人工転写因子の適用は、任意の免疫反応を回避し、人工転写因子に対する全身寛容を誘導するであろう。免疫特権を持つ器官外の慢性疾患の処置について、事前の眼内注射による免疫寛容の誘導が考えられている。

受容体活性の調節のための低分子の同定は、主に、異なるクラスの物質由来の多種多様な異なる分子の中からの大規模で時間がかかるスクリーニング手順に依存する。特に、所与の受容体分子に対するそのような低分子薬の迅速で合理的な設計は、全く骨が折れる。対照的に、本発明の人工転写因子は全て、高度に定義された全体組成を有する同一物質クラスに属する。２種類の非常に多様なプロモーター配列をターゲティングする、六量体性ジンクフィンガータンパク質に基づく２種類の人工転写因子は、全体的に類似の三次構造で、なお８５％という最小アミノ酸配列同一性を有し、標準法（下記）により迅速で経済的な方法で産生させることができる。従って、本発明の人工転写因子は、１クラスの分子内に、非常に広く多様なセットのターゲットに対する例外的に高い特異性と、全体的に類似の組成とを兼備している。加えて、本発明の人工転写因子の薬物への製剤化は、以前の経験に頼ることができ、薬物開発工程をさらに促進する。

タンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）が仲介する人工転写因子の細胞内送達は、受容体分子をターゲティングするために生物学的製剤の高い選択性を新規な方式で利用する新しい方法である。従来薬が、ある特定の受容体の活性を調節する一方で、人工転写因子は、これらのタンパク質の利用性を変化させる。そして、人工転写因子はそのような受容体遺伝子のプロモーター領域に特異的に作用するように作られているので、本発明により、密接に関係するタンパク質であっても選択的にターゲティングできるようになる。これは、密接に関係するタンパク質であってもプロモーター領域が大ざっぱに保存されているにすぎないことに基づく。タンパク質トランスダクションドメインが介在する人工転写因子の送達は、非限定的に、例えばインスリン、エンドセリンのようなホルモン、またはインターロイキン、ケモカインおよびサイトカインなどの免疫調節ペプチド、さらには抗体、抗原および分子パターンを含む外部刺激に対する細胞の反応を調節するために有用である。さらには、グルタミン酸またはγ−アミノ酪酸などの他の可溶性シグナリング分子、および他の神経伝達物質に対する細胞応答もこのアプローチによって調節することができる。本発明による人工転写因子の高い選択性を利用すると、所与の受容体タンパク質ファミリーのある特定のメンバーの、多くの場合に組織特異的な発現に基づき、薬物作用の組織特異的ターゲティングでさえ可能である。

本発明は、また、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングするような受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される疾患の処置に、そのような人工転写因子を使用することに関する。同様に本発明は、治療有効量の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法に関し、その際、処置されるべき疾患は、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングする受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される。

考えられるポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、四量体性、五量体性、六量体性または七量体性ジンクフィンガータンパク質である。「四量体性」、「五量体性」、「六量体性」および「七量体性」は、ジンクフィンガータンパク質が、それぞれ特定のヌクレオチドトリプレットに結合特異性を有するそれぞれ４、５、６、および７個の部分タンパク質構造から成ることを意味する。好ましくは、人工転写因子は、六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む。

所与のプロモーター領域内のターゲット部位の選択
ターゲット部位の選択は、機能的な人工転写因子の産生成功のために重要である。人工転写因子がターゲットの遺伝子発現をin vivoで調節するために、その人工転写因子はターゲット遺伝子のゲノム環境でそのターゲット部位と結合しなければならない。これは、ＤＮＡターゲット部位に到達可能であることを必要とし、この領域の染色体ＤＮＡがヒストン周囲でヌクレオソームに密に充填されておらず、メチル化などのＤＮＡ修飾が人工転写因子の結合を妨害しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分が密に充填され、転写不活性である一方で、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍（−１０００〜＋２００bp）は、内因性転写因子およびＲＮＡポリメラーゼなどの転写機構にとって到達可能でなければならない。従って、任意の所与のターゲット遺伝子のこの領域内からターゲット部位を選択することは、所望のin vivo機能を有する人工転写因子の産生成功率を大きく高めるであろう。

ヒトエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＲＡ）プロモーター領域内のターゲット部位の選択
エンドセリン受容体Ａプロモーターを特異的にターゲティングする六量体性ジンクフィンガータンパク質（６ＺＦＰ）は、以下のようにヒトＥＴＲＡ遺伝子を分析することによって決定される。

ヒトＥＴＲＡ遺伝子（プロモーター領域配列番号２５、コード領域配列番号２６を含むゲノム領域）は、７個のイントロンによって分離された８個のエクソンから構成される（Hosoda K. et al., 1992, J Biol Chem 267, 18797-18804）。エクソン１およびイントロン１は、５’非コード領域に位置し、転写開始部位は、ＡＴＧ翻訳開始コドンの５０２bp上流である。

転写開始部位に対して−１０００bp〜＋１００bpのＥＴＲＡプロモーター領域を、（ＧＮＮ）_６ターゲット部位について分析した（図２および表１）。ＺｉＦｉＴソフトウェアを使用して（Sander J.D. et al., 2010, Nucleic Acids Res 38, W462-468）、ＴＳ−８５５およびＴＳ＋７４を同定し、ＺＦＰ−８５５ＡおよびＺＦＰ＋７４Ａを設計するためにＢａｒｂａｓセットのＧＮＮジンクフィンガーモジュールを選んだ。

予備選択されたジンクフィンガーモジュールに基づくジンクフィンガータンパク質の合理的設計は公知であるが、高親和性ジンクフィンガータンパク質の同定のために不偏のＺＦＰ含有ライブラリーに基づくスクリーニングアプローチが優れていることが分かった。そのため、最初にＺｉＦｉＴプログラムによって除外された追加的な（ＧＮＮ）_６配列（ＴＳ−１０３）を選択した。さらに、ＴＳ−８５５からＴＳ＋７４の間からＧＮＮまたはＣＮＮトリプレットを含む他の１８bpターゲット部位を選択した。加えて、６ＺＦＰライブラリーでスクリーニングするためにＴＳ−８５５からＴＳ−３０６の間から１５bpターゲット部位を選択した。

ヒトエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＲＢ）プロモーター領域内のターゲット部位の選択
ＥＴＲＢの発現を調節するための人工転写因子についての結合部位を以下のように選択した：ＥＴＲＢ遺伝子の５’領域（配列番号２７）は、翻訳開始部位の−１１９５、−８１７、−２２９および−２５８bp上流に推定上の転写開始部位を含む。そのため、ＧＮＮまたはＣＮＮトリプレットから成る１８bpのターゲット部位を、−１１４９bpから−４８７bpの間から選択した（図５参照）。

ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）プロモーター領域内のターゲット部位の選択
６個のＧ／ＣＮＮトリプレットから成る、ＴＬＲ４の発現を調節している人工転写因子についての１８bpの潜在的結合部位を、転写開始部位に対して−２７６bpから＋１１３bpの間のＴＬＲ４遺伝子の５’領域（配列番号２８）から選択した（図３参照）。

ヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ａ（ＦＣＥＲ１Ａ）プロモーター領域内のターゲット部位の選択
ＦＣＥＲ１Ａ発現調節人工転写因子についての結合部位を、ＦＣＥＲ１Ａ遺伝子の５’領域（配列番号２９）から選択した。ヒトＦＣＥＲ１Ａプロモーターは、転写開始部位から約２００bp上流の近位調節領域、およびＩＬ−４応答配列を含むさらに上流の遠位領域を含む（Nishiyama C., 2006, Biosci Biotechnol Biochem 70 (1), 1-9）。ＦＣＥＲ１Ａ調節人工転写因子の潜在的結合部位を、転写開始部位に対して−１４７bpおよび＋１７bpの近位調節領域から選択した。

六量体性ジンクフィンガータンパク質を選択するための改変された酵母１ハイブリッド（Ｙ１Ｈ）選別
Gonzalez B. et al., 2010, Nat Protoc 5, 791-810によって公表されたライブラリークローニング計画に基づき、酵母シャトルベクターｐＧＡＤ１０（ｐＡＮ１０２５）を改変して、ジンクフィンガータンパク質コードライブラリーの効率的な産生を可能にした。クローニング効率を改善するために、ジンクフィンガータンパク質コードライブラリーの最初の組立てをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで行い、続いてそのライブラリーをｐＡＮ１０２５に転移させた。連続消化およびＤＮＡ脱リン酸を用いて、頭同士またはしっぽ同士ライゲーションしたジンクフィンガーモジュールの形成を阻止することで、効果的なライブラリーカバー度を向上させた。

従来のＹ１Ｈスクリーニングは、比較的小型プールの天然タンパク質から所与のＤＮＡ配列に関する転写因子を同定することを目標にする。今回の目標は、使用されたターゲット部位に結合する潜在性を全てが有する非常に大規模なプールのタンパク質（約１６×１０^６種）から六量体性ジンクフィンガータンパク質（６ＺＦＰ）を選択することであった。これは、最高のターゲット部位親和性を有する６ＺＦＰを同定するために追加的な選択圧を使用することを必要とする。従来のＹ１Ｈ分析のためにオーレオバシジンＡ（Aureobasidin A；ＡｂＡ）濃度２００ng/mlが典型的に使用されるのに対して、採用されたＹ１Ｈ系（MatchMaker Gold, Clontech）で通常達成される以上に選択性を改善するために、最大４０００ng/mlのＡｂＡが有用であった。

選択圧をさらに増加させることで所与のターゲット部位にいっそう高い結合能を有する６ＺＦＰを同定するために、Ｙ１Ｈ系をさらに改変した。第一ラウンドの選択のために、２μ複製起点に基づく酵母ベクターに人工転写因子ライブラリーを組込んだ。そのようなベクターは、酵母細胞内で独立して約５０コピーに複製し、６ＺＦＰの強い産生に繋がった。第２ラウンドの選択のために、コピー数１〜２個／細胞の低コピー性ＡＲＳ／ＣＥＮベクターに基づく酵母ベクターに人工転写因子ライブラリーを組込んだ。より低い発現レベルのライブラリー性ジンクフィンガータンパク質のせいで、４０００ng/ml ＡｂＡと組合せたＡＲＳ／ＣＥＮに基づくＹ１Ｈ選別は、より高感度であり、それらの対応するターゲット配列に対する結合親和性がより高い６ＺＦＰをもたらす。

^ａ)第１カラムにＥＴＲＡプロモーターのターゲット部位（転写開始部位までの距離に従い命名）を示す。
^ｂ)第２カラムに、Ｙ１Ｈ選別でＥＴＲＡプロモーターのターゲット部位に結合すると同定されたＺＦＰの命名を示す。命名計画は以下の通りである：ＺＦＰの後にターゲット部位名および選別で単離された異なるＺＦＰを示す文字。
^ｃ)第３カラムに、個別のジンクフィンガーモジュールをそれらの樹立された結合選好性に従って詳述することによってＺＦＰの構成を示す。ＧＭ０１はＧＡＡトリプレットに、ＧＭ０２はＧＣＡに、ＧＭ０３はＧＧＡに、ＧＭ０４はＧＴＡに、ＧＭ０５はＧＡＣに、ＧＭ０６はＧＣＣに、ＧＭ０７はＧＧＣに、ＧＭ０８はＧＴＣに、ＧＭ０９はＧＡＧに、ＧＭ１０はＧＣＧに、ＧＭ１１はＧＧＧに、ＧＭ１２はＧＴＧに、ＧＭ１３はＧＡＴに、ＧＭ１４はＧＣＴに、ＧＭ１５はＧＧＴに、ＧＭ１６はＧＴＴに、そしてさらに、ＣＭ０１はＣＡＣに、ＣＭ０２はＣＡＡに、ＣＭ０３はＣＡＧに、ＣＭ０４はＣＡＴに、ＣＭ０５はＣＣＡに、ＣＭ０６はＣＣＣに、ＣＭ０７はＣＣＧに、ＣＭ０８はＣＣＴに、ＣＭ０９はＣＧＡに、ＣＭ１０はＣＧＣに、ＣＭ１１はＣＧＧに、ＣＭ１２はＣＧＴに、ＣＭ１３はＣＴＡに、ＣＭ１４はＣＴＧに、そしてＣＭ１５はＣＴＴに選好的に結合性のジンクフィンガーモジュールを示す。
^ｄ)第４カラムに、それぞれのターゲット部位配列に結合すると同定されたＺＦＰの配列ＩＤを表す。

^ａ)第１カラムにＥＴＲＢプロモーターのターゲット部位（翻訳開始部位までの距離に従い命名）を示す。
^ｂ)第２カラムに、Ｙ１Ｈ選別でＥＴＲＢプロモーターのターゲット部位に結合すると同定されたＺＦＰの命名を示す。命名計画は以下の通りである：ＺＦＰの後にターゲット部位名および選別で単離された異なるＺＦＰを示す文字。
^ｃ)第３カラムに、個別のジンクフィンガーモジュールをそれらの樹立された結合選好性に従って詳述することによってＺＦＰの構成を示す。ＧＭ０１はＧＡＡトリプレットに、ＧＭ０２はＧＣＡに、ＧＭ０３はＧＧＡに、ＧＭ０４はＧＴＡに、ＧＭ０５はＧＡＣに、ＧＭ０６はＧＣＣに、ＧＭ０７はＧＧＣに、ＧＭ０８はＧＴＣに、ＧＭ０９はＧＡＧに、ＧＭ１０はＧＣＧに、ＧＭ１１はＧＧＧに、ＧＭ１２はＧＴＧに、ＧＭ１３はＧＡＴに、ＧＭ１４はＧＣＴに、ＧＭ１５はＧＧＴに、ＧＭ１６はＧＴＴに、そしてさらに、ＣＭ０１はＣＡＣに、ＣＭ０２はＣＡＡに、ＣＭ０３はＣＡＧに、ＣＭ０４はＣＡＴに、ＣＭ０５はＣＣＡに、ＣＭ０６はＣＣＣに、ＣＭ０７はＣＣＧに、ＣＭ０８はＣＣＴに、ＣＭ０９はＣＧＡに、ＣＭ１０はＣＧＣに、ＣＭ１１はＣＧＧに、ＣＭ１２はＣＧＴに、ＣＭ１３はＣＴＡに、ＣＭ１４はＣＴＧに、そしてＣＭ１５はＣＴＴに選好的に結合性のジンクフィンガーモジュールを示す。
^ｄ)第４カラムに、それぞれのターゲット部位配列に結合すると同定されたＺＦＰの配列ＩＤを表す。

^ａ)第１カラムにＴＬＲ４プロモーターのターゲット部位（転写開始部位までの距離に従い命名）を示す。
^ｂ)第２カラムに、Ｙ１Ｈ選別でＴＬＲ４プロモーターのターゲット部位に結合すると同定されたＺＦＰの命名を示す。命名計画は以下の通りである：ＺＦＰの後にターゲット部位名および選別で単離された異なるＺＦＰを示す文字。
^ｃ)第３カラムに、個別のジンクフィンガーモジュールをそれらの樹立された結合選好性に従って詳述することによってＺＦＰの構成を示す。ＧＭ０１はＧＡＡトリプレットに、ＧＭ０２はＧＣＡに、ＧＭ０３はＧＧＡに、ＧＭ０４はＧＴＡに、ＧＭ０５はＧＡＣに、ＧＭ０６はＧＣＣに、ＧＭ０７はＧＧＣに、ＧＭ０８はＧＴＣに、ＧＭ０９はＧＡＧに、ＧＭ１０はＧＣＧに、ＧＭ１１はＧＧＧに、ＧＭ１２はＧＴＧに、ＧＭ１３はＧＡＴに、ＧＭ１４はＧＣＴに、ＧＭ１５はＧＧＴに、ＧＭ１６はＧＴＴに、そしてさらに、ＣＭ０１はＣＡＣに、ＣＭ０２はＣＡＡに、ＣＭ０３はＣＡＧに、ＣＭ０４はＣＡＴに、ＣＭ０５はＣＣＡに、ＣＭ０６はＣＣＣに、ＣＭ０７はＣＣＧに、ＣＭ０８はＣＣＴに、ＣＭ０９はＣＧＡに、ＣＭ１０はＣＧＣに、ＣＭ１１はＣＧＧに、ＣＭ１２はＣＧＴに、ＣＭ１３はＣＴＡに、ＣＭ１４はＣＴＧに、そしてＣＭ１５はＣＴＴに選好的に結合性のジンクフィンガーモジュールを示す。
^ｄ)第４カラムに、それぞれのターゲット部位配列に結合すると同定されたＺＦＰの配列ＩＤを表す。

^ａ)第１カラムにＦＣＥＲ１Ａプロモーターのターゲット部位（転写開始部位までの距離に従い命名）を示す。
^ｂ)第２カラムに、Ｙ１Ｈ選別でＦＣＥＲ１Ａプロモーターターゲット部位に結合すると同定されたＺＦＰの命名を示す。命名計画は以下の通りである：ＺＦＰの後にターゲット部位名および選別で単離された異なるＺＦＰを示す文字。
^ｃ)第３カラムに、個別のジンクフィンガーモジュールをそれらの樹立された結合選好性に従って詳述することによってＺＦＰの構成を示す。ＧＭ０１はＧＡＡトリプレットに、ＧＭ０２はＧＣＡに、ＧＭ０３はＧＧＡに、ＧＭ０４はＧＴＡに、ＧＭ０５はＧＡＣに、ＧＭ０６はＧＣＣに、ＧＭ０７はＧＧＣに、ＧＭ０８はＧＴＣに、ＧＭ０９はＧＡＧに、ＧＭ１０はＧＣＧに、ＧＭ１１はＧＧＧに、ＧＭ１２はＧＴＧに、ＧＭ１３はＧＡＴに、ＧＭ１４はＧＣＴに、ＧＭ１５はＧＧＴに、ＧＭ１６はＧＴＴに、そしてさらに、ＣＭ０１はＣＡＣに、ＣＭ０２はＣＡＡに、ＣＭ０３はＣＡＧに、ＣＭ０４はＣＡＴに、ＣＭ０５はＣＣＡに、ＣＭ０６はＣＣＣに、ＣＭ０７はＣＣＧに、ＣＭ０８はＣＣＴに、ＣＭ０９はＣＧＡに、ＣＭ１０はＣＧＣに、ＣＭ１１はＣＧＧに、ＣＭ１２はＣＧＴに、ＣＭ１３はＣＴＡに、ＣＭ１４はＣＴＧに、そしてＣＭ１５はＣＴＴに選好的に結合性のジンクフィンガーモジュールを示す。
^ｄ)第４カラムに、それぞれのターゲット部位配列に結合すると同定されたＺＦＰの配列ＩＤを表す。

本発明による人工転写因子は、表１〜４の第３カラムに示されたジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、その際、最大３個の個別のジンクフィンガーモジュールは、人工転写因子のターゲット配列への結合を調節する代替結合特性を有する他のジンクフィンガーモジュールと交換される。

本発明による人工転写因子は、表１〜４の第３カラムに示されたジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、その際、潜在的免疫原性を最小化する一方で、目的のターゲット部位に対する結合親和性を保持するために、個別のアミノ酸が交換される。

好ましくは、本発明による人工転写因子は、配列番号３１〜配列番号３７、配列番号３９〜配列番号４３、配列番号４５〜配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４〜配列番号５７、配列番号５９〜配列番号６４、配列番号６６〜配列番号８０、配列番号８２〜配列番号９５、配列番号９７〜配列番号１１８、配列番号１２０〜配列番号１３６、配列番号１３８〜配列番号１４３、配列番号１４５〜配列番号１５３、配列番号１５５〜配列番号１６４、配列番号１６６〜配列番号１７３、配列番号１７５〜配列番号１８１、および配列番号１８３〜配列番号１９１から成る群より選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む。

より好ましくは、本発明による人工転写因子は、配列番号１３５の五量体性ジンクフィンガータンパク質、または配列番号３３、５４、５６、６４、６８、８３、８４、８５、９７、１０１、１１４、１１８、１２２、１２７、１３３、１４０、１４２、１４６、１４７、１５６、１５９、１６９、１７１、１７３、１７５、１８１、１８４、１８７、１８９、および１９１から成る群より選択されるタンパク質配列の六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む。

配列番号１３５の五量体性ジンクフィンガータンパク質、または配列番号５６、８３、８５、１０１、１１４、１１８、１２７、１３３、１４０、１４２、１４６、１４７、１５６、１５９、１７５、および１８１から成る群より選択されるタンパク質配列の六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子がいっそうさらに好ましい。

配列番号１１８、１２７、１４６、１５６、または１７５の六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子がいっそうさらに好ましい。

配列番号１１８、１２７、１５６、または１７５の六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子がいっそうさらに好ましい。

配列番号１１８、１５６、または１７５の六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子が最も好ましい。

ポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、阻害または活性化タンパク質ドメインのいずれかである調節ドメインに融合している。考えられる阻害タンパク質ドメインは、Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤおよびＥＲＤドメインなどの、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の転写活性ドメイン、好ましくはＫＲＡＢまたはＳＩＤである。考えられる活性化タンパク質ドメインは、ＶＰ１６またはＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体性リピート）などの、遺伝子オントロジーＧＯ：０００１０７１によって定義されるタンパク質の転写活性ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。

阻害または活性化タンパク質ドメインに融合したポリダクチルジンクフィンガータンパク質に加えて、本発明の人工転写因子は、核移行配列（ＮＬＳ）を含む。考えられる核移行配列は、遺伝子オントロジーＧＯ：０００８１３９によって定義されるタンパク質への結合によって核内移行を付与しているアミノ酸モチーフ、例えばリシン残基の次にリシンまたはアルギニン残基、その次に任意のアミノ酸、その次にリシンまたはアルギニン残基を含む塩基性アミノ酸クラスター（Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492）またはＳＶ４０ＮＬＳであり、ＳＶ４０ＮＬＳが好ましい。

本発明の人工転写因子は、さらに場合によりタンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）を含む。考えられるタンパク質トランスダクションドメインは、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ＨＳＶ−１ＶＰ２２ペプチド、合成ペプチドｍＴ０２（ＰＶＲＲＰＲＲＲＲＲＲＫ、配列番号１９２、Yoshikawa T. et al. 2009 Biomaterials 30, 3318-23）、合成ペプチドｍＴ０３（ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲＫ、配列番号１９３）、Ｒ９ペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号１９４）、ＡＮＴＰドメイン、および防御抗原／致死因子Ｎ末端ＰＴＤ、好ましくはＴＡＴＰＴＤである。

受容体遺伝子プロモーターに対するが、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子もまた、本発明の対象である。それらの人工転写因子は、本明細書上記に定義されたような本発明の人工転写因子についての中間体である。

ＥＴＲＡに対するが、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子もまた、本発明の対象である。それらの人工転写因子は、本明細書上記に定義されたような本発明の人工転写因子についての中間体である。

ＥＴＲＢプロモーターに対するが、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子もまた、本発明の対象である。それらの人工転写因子は、本明細書上記に定義されたような本発明の人工転写因子についての中間体である。

ＴＬＲ４プロモーターに対するが、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子もまた、本発明の対象である。それらの人工転写因子は、本明細書上記に定義されたような本発明の人工転写因子についての中間体である。

ＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対するが、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子もまた、本発明の対象である。それらの人工転写因子は、本明細書上記に定義されたような本発明の人工転写因子についての中間体である。

本発明の人工転写因子のドメインは、短鎖可動性リンカーによって結合することができる。短鎖可動性リンカーは、２〜８個のアミノ酸、好ましくはグリシンおよびセリンを有する。考えられる特別なリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）である。人工転写因子は、さらに、それらの検出およびプロセッシングを容易にするためにマーカーを含みうる。

受容体プロモーター活性を調節する上での人工転写因子の活性
ジンクフィンガーモジュールに基づく人工転写因子は、受容体プロモーターのあるターゲット部位に特異的に結合するために、Ｙ１Ｈスクリーニングを用いて選択されたＺＦＰ（表１〜４参照）から、図６に示されたスキームに従って構築された。これらの人工転写因子は、Ｎ末端ＫＲＡＢ、Ｃ末端ＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＶＰ６４などの異なる転写活性ドメインを含んでいた。公表されたデータに基づき（Beerli R.R. et al., 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）、ＫＲＡＢおよびＳＩＤドメインは転写リプレッサーとして作用すると予測される一方で、ＶＰ６４は転写活性化を仲介する。受容体プロモーターによって推進される転写に人工転写因子（６ＺＦＰと転写活性ドメインの間の融合物）が影響する潜在性を評価するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを採用した。この目的を達するために、あるプロモーターから発現を推進する能力がある細胞に、二重レポータープラスミドと一緒に人工転写因子発現プラスミドを同時トランスフェクションした。二重レポータープラスミドは、ＮＥＧ−ＰＧ０４およびＥＦ１ａ−ＰＧ０４プラスミドに基づいて問題の受容体プロモーターのコントロール下の分泌型Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子を構成的ＣＭＶプロモーターのコントロール下の分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）と一緒に組込まれていた（GeneCopoeia, Rockville, MD）。

多数のプロモーターが、細胞型特異的発現パターンを提示し、ある細胞型では実質的に発現せず、他の細胞型では高レベル発現する。従って、プロモーター調節研究に適切な細胞モデルの選択は、所与の受容体プロモーターの組織特異性に依存する。本明細書に示した例では、子宮頸癌細胞系であるＨｅＬａ細胞は、ＥＴＲＡ、ＥＴＲＢまたはＴＬＲ４プロモーターからのルシフェラーゼレポーターを発現することができる。ＦＣＥＲ１Ａプロモーターのコントロール下でのルシフェラーゼの発現は、このプロモーターの組織特異性のせいでＨｅＬａ細胞において不可能であった。そのため、ＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対する人工転写因子の機能を評価するためには、ラット好塩基球性白血病ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を採用した。この細胞系は、ＦＣＥＲ１Ａプロモーターが推進するルシフェラーゼレポーターの発現を支援し、ヌクレオフェクション（nucleofection）を用いて約５０％の効率でトランスフェクション可能であった。

レポータープラスミドとルシフェラーゼでトランスフェクションされた細胞での人工転写因子（ＡＴＦ）の発現の存在を確実にするために、この同時トランスフェクションを３：１のＡＴＦ：レポータープラスミド比で行い、製造業者の推奨に従ってＳＥＡＰ活性を測定した（GeneCopoeia, Rockville, MD）。ルシフェラーゼの値をＳＥＡＰ活性に対して基準化し、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現している対照細胞（１００％に設定）と比較した。トランスフェクション後の細胞上清中のルシフェラーゼとＳＥＡＰ活性の間の比を測定することにより、人工転写因子プラスミドをトランスフェクションされた細胞の場合にのみ、受容体プロモーターが推進するルシフェラーゼの発現をＳＥＡＰの発現に対して基準化することが可能であった。このアプローチは異なる実験間のトランスフェクション効率の差について説明および基準化するために有用であることが分かり、所与の受容体プロモーターの人工転写因子介在性調節を定量できるようにした。

全てのルシフェラーゼ発現研究（図７Ａ〜１１Ａ）をトリプリケートで少なくとも３回行い、平均をとり、トランスフェクション後の対照細胞と比較し、相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬｕＡ）として対照に対する％で表現し、ＳＥＭを示すエラーバーを付けてプロットした。

人工転写因子のための命名慣習は次の通りである：哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現された人工転写因子であって、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、核移行配列およびＳＩＤまたはＫＲＡＢ（ＮまたはＣ末端）などの負調節ドメインから成る人工転写因子は、文字ＡＯに続き、ターゲット部位を表す数字およびＹ１Ｈスクリーニングを用いて同定されたある特定のＺＦＰを識別する文字で示される。この名称への小文字の「ａ」の付加は、活性化ＶＰ６４ドメインを含む人工転写因子を示す。小文字の「ｐ」の付加は、異種発現系で産生された精製人工転写因子タンパク質であって、前述のドメインに加えてタンパク質トランスダクションドメインＴＡＴおよびＨＡタグを含む精製人工転写因子タンパク質を示す（配列番号１９５）。

図７Ａに、ＥＴＲＡプロモーター依存性ルシフェラーゼ発現の人工転写因子依存性ダウンレギュレーションを示す。ＨｅＬａ細胞に上記ＥＴＲＡプロモータールシフェラーゼ／構成的ＳＥＡＰレポーター構築物、およびＡＯ７４Ａ、ＡＯ７４Ｅ、ＡＯ７４Ｒ、ＡＯ７４Ｖまたは対照（Ｃと表示）としての黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）についての発現プラスミドを同時トランスフェクションした。これらの人工転写因子は、ＥＴＲＡプロモーターのＴＳ＋７４に対し、負調節性ＳＩＤドメインを含む。ＡＯ７４ＡおよびＡＯ７４ＥはＥＴＲＡプロモーターが推進する発現を約７０％抑制したが、ＡＯ７４ＲおよびＡＯ７４ＶはＥＴＲＡプロモーターをバックグラウンドのレベルまで遮断する能力があった。

図８Ａに、受容体プロモーターをターゲティングする転写因子を産生するためのアプローチの多用途性を強調する。ＡＯ７４ＶまたはＡＯ７４Ｒ中の阻害ドメインＳＩＤを活性化ドメインＶＰ６４と単に交換することによって、ＥＴＲＡプロモーターの転写活性を約４００％に上げる能力がある活性化転写因子を産生することができた。

同じアプローチを用いて、ＥＴＲＢ受容体プロモーターをターゲティングする人工転写因子を構築した。図９Ａに、ＥＴＲＢプロモーターのターゲット部位ＴＳ−１１４９（図２参照）に対するＺＦＰおよび阻害ＳＩＤドメインを含むＡＯ１１４９ＮおよびＡＯ１１４９ＰによるＥＴＲＢプロモーター活性の抑制を示す。ＨｅＬａ細胞にＥＴＲＢプロモータールシフェラーゼ／ＳＥＡＰレポーター構築物、およびＡＯ１１４９Ｎ、ＡＯ１１４９Ｐまたは対照としてのＹＦＰについての発現プラスミドを同時トランスフェクションした。ＡＯ１１４９Ｎは、ＥＴＲＢプロモーター活性を約８０％抑制したが、ＡＯ１１４９ＰはＥＴＲＢプロモーターをほぼバックグラウンドのレベルまで遮断した。

ＴＬＲ４プロモーター中のターゲット部位ＴＳ−５５に対するＺＦＰ（図３参照）およびＣ末端の阻害ＫＲＡＢドメインから成るＴＬＲ４特異的人工転写因子ＡＯ５５ＢおよびＡＯ５５Ｅの活性を分析するために、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ／ＳＥＡＰレポーターアッセイを採用した。図１０に示すように、ＨｅＬａ細胞でのＡＯ５５ＢまたはＡＯ５５Ｅの発現は、ＴＬＲ４プロモーターが推進する発現を抑制し、ＡＯ５５Ｂは、ＹＦＰを発現しているトランスフェクション済み対照細胞に比べて、ルシフェラーゼ発現を完全に遮断した。

ＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対する人工転写因子の活性を評価するために、ラット好塩基球性ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に上記のようにＦＣＥＲ１Ａプロモーターが推進するＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＣＭＶが推進するＳＥＡＰと一緒にＡＯ１４７Ａを発現させた。この人工転写因子は、ターゲット部位ＴＳ−１４７に対し、Ｎ末端ＫＲＡＢドメインを含む。ＦＣＥＲ１Ａプロモーターの組織特異性およびヌクレオポレーションを用いたトランスフェクションの容易さに基づきＲＢＬ−２Ｈ３細胞を選んだ。図１１に示すように、ＡＯ１４７Ａを産生しているＲＢＬ−２Ｈ３細胞でのＦＣＥＲ１Ａ推進発現は、ＹＦＰ発現対照細胞（Ｃ）よりも約８０％減少している。

まとめると、受容体プロモーター推進調節の人工転写因子介在性調節は実行可能であって、人工転写因子の構築のために使用された調節ドメインに応じて、発現を最大４００％アップレギュレーションするか、または発現を完全に遮断し、ほぼ２桁の規模の調節範囲の可能性を開く。

人工転写因子の潜在的有毒作用の評価
人工転写因子は所与のターゲット部位について選択され、そして選ばれたターゲット部位がヒトゲノム内で唯一であったにもかかわらず、人工転写因子は、類似の配列に結合することによってオフターゲット効果を有し得るため、それによって有毒作用を発揮するおそれがある。そのような有毒作用は、そのような人工転写因子の機能的アッセイを潜在的に妨害するおそれがある。任意の所与の独特な１８bpターゲット部位について、任意の数の高度に類似の配列を１、２または３個の置換と共に同定することができる。これらの配列は、人工転写因子を結合させるおそれがあり、オフターゲット効果に繋がるおそれがある一方で、大部分のそのようなオフターゲット部位は、活発に転写される遺伝子の調節配列以外の位置にあり、人工転写因子処理のオフターゲット効果の潜在性を大きく改善している。以下の実験について、１μMのトランスダクション可能な人工転写因子タンパク質で細胞を処理し、潜在毒性の尺度としての細胞増殖を、ＭＴＳアッセイを用いて評価した。各実験をトリプリケートで少なくとも３回行い、人工転写因子で処理された細胞の増殖の平均をとり、対応する緩衝液で処理された対照に対するパーセントとして表現した。注目すべきは、人工転写因子の名称への「ｐ」の付加は、タンパク質トランスダクションドメインを有さない人工転写因子をコードする発現プラスミドではなく、ＴＡＴタンパク質トランスダクションドメイン、ジンクフィンガータンパク質、およびＳＩＤ、ＫＲＡＢまたはＶＰ６４のような調節ドメインを含むタンパク質を示す。

図７Ｂに示すように、ＡＯ７４Ｖのトランスダクション可能版である１μMのＡＯ７４Ｖｐタンパク質でＨｅＬａ細胞を２日間処理しても、緩衝液で処理された細胞に比べて増殖の喪失を生じなかった。同様に、ＡＯ７４ＶｐでｈＵｔＳＭＣを処理しても、これらの細胞に有毒ではなく、細胞の増殖を阻害しなかった（図７Ｃ）。加えて、ＺＦＰ−７４Ｖに基づく活性化人工転写因子タンパク質ＡＯ７４Ｖａｐは、ｈＵｔＳＭＣの増殖に全く有毒作用を示さなかった（図８Ｂ）。これらのデータは、ＺＦＰ−７４Ｖを含む人工転写因子のオフターゲット結合がヒトゲノムにおいて無視できることに一致する。同様に、ＴＬＲ４特異的人工転写因子ＡＯ５５Ｂｐ（図１０Ｃ）を用いたＨｅＬａ細胞の処理も、ＦＣＥＲ１Ａ特異的ＡＯ１４７Ａｐを用いた処理も（図１１Ｂ）、増殖の喪失を生じなかった。まとめると、全ての被験人工転写因子は、それらの目的のターゲット部位に高度に特異的であって、細胞死または増殖減少を生じるおそれのあるオフターゲット効果を引き起こさない。

細胞応答アッセイを用いた人工転写因子の機能的分析
ＴＡＴに基づくタンパク質送達後に内因性受容体プロモーターに及ぼす人工転写因子の機能を確認するために、受容体ゴニスト処理に対する細胞応答を人工転写因子処理細胞と対照処理細胞との間で観察した。

人工転写因子処理後のＥＴＲＡのダウンレギュレーションの評価
平滑筋細胞（ＳＭＣ）は、ＥＴＲＡを発現し、ＥＴ−１曝露後に収縮する能力がある。抗ＥＴＲＡプロモーター性人工転写因子ＡＯ７４Ｖの有効性を測定するために、ヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）をモデル系として使用した。この目的を達するために、ｈＵｔＳＭＣを３次元コラーゲン格子内に包埋し、１μM ＡＯ７４Ｖｐまたは緩衝液対照で３日間処理し、その後０または１００nM ＥＴ−１に曝露した。タンパク質処理または緩衝液処理を２４時間毎に繰り返した。格子をその支持体から剥離し、ＥＴ−１を添加後に格子の収縮を観察した。図７Ｄに示すように、ＥＴ−１に曝露された対照格子は、ＥＴ−１で処理されなかった格子の約７８％まで収縮した。対照的に、ＡＯ７４Ｖで処理された格子は、ＥＴ−１で処理されなかった対照格子に比べてＥＴ−１の存在下で有意には収縮しなかった。これは、ＡＯ７４Ｖｐで処理後にＥＴ−１が誘導するｈＵｔＳＭＣの収縮が完全に遮断されたことに一致する。図７Ｄに示されるデータは、六つ組で行った３回の独立した実験のＥＴ−１添加から９時間後の平均格子面積を表す。一般線形一変量モデルを採用しているＳＰＳＳソフトウェアパッケージを用いた統計解析から、ＡＯ７４Ｖｐの遮断作用についての高い有意性（＊＊はｐ＜０．００１を表す）が明らかになった。

人工転写因子処理後のＴＬＲ４ダウンレギュレーションの評価
マクロファージは、ＴＬＲ４を発現し、ＴＬＲ４へのＬＰＳ結合に応答してＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインを産生する。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激されたＵ９３７細胞は、ヒトマクロファージ様細胞に関する広く受け入れられているモデルである。抗ＴＬＲ４プロモーター人工転写因子ＡＯ５５Ｂの有効性を測定するために、ＡＯ５５Ｂまたは対照としてＹＦＰを発現しているＵ９３７細胞をＰＭＡで刺激し、その後０．５ng/ml ＬＰＳで８時間攻撃し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−６の産生を測定した。図１０Ｂに示すように、ＡＯ５５Ｂの発現は、ＩＬ−６の分泌を対照細胞の約２５％、有意に低下させた（ｐ＜０．００５）。Ｕ９３７のヌクレオフェクション効率が約５０％である（これらの実験でＡＯ５５Ｂが約５０％の細胞だけに発現されたことを意味する）ことを考慮すると、ＡＯ５５ＢによるＩＬ−６産生の実際の抑制は５０％程度である。

人工転写因子処理後のＦＣＥＲ１機能の評価
マクロファージ、肥満細胞および好塩基球の表面上のヘテロ三量体性高親和性ＩｇＥ受容体ＦＣＥＲ１へのＩｇＥ抗体の結合は、アトピー個体においてアレルギー応答をトリガーする第一段階である。アレルゲンとの遭遇は、ＩｇＥロードしたＦＣＥＲ１分子の交差結合に繋がり、細胞内シグナリングカスケードをトリガーし、アレルギー性メディエーターおよびサイトカインの放出を生じる。従って、ＩｇＥが例えば好塩基球に結合できることは、アレルギー過程での重要な一段階である。ＦＣＥＲ１のαサブユニットのプロモーターに対する人工転写因子で処理後のＩｇＥの結合性を評価するために、ヒト好塩基球性ＫＵ８１２Ｆ細胞を１μM ＡＯ１４７Ａｐまたは緩衝液で毎日４８時間にわたり処理した。処理後に、フローサイトメトリーを用いてＩｇＥの結合性を測定した。３回の独立した実験のＡＯ１４７Ａ処理ＫＵ８１２Ｆ細胞の平均ＩｇＥ結合性（ＩｇＥＢ）を図１１Ｃに示す。ＡＯ１４７Ａｐを用いた処理は、好塩基球性細胞のＩｇＥ結合性を対照処理細胞よりも約８０％減少させた。関心が持たれることに、人工転写因子ＡＯ１４７Ａｐは、ＦＣＥＲ１受容体複合体のαサブユニットだけに対するものの、受容体全体の機能はＩｇＥに結合する能力に関して大きく低下している。従って、アレルゲンが誘導するＦＣＥＲ１の交差結合は大きく低下し、アレルギーメディエーターの放出閾値を上げていると予想される。いくつかの他の受容体とは異なり、ＦＣＥＲ１は、三つの異なる遺伝子ローカスによってコードされるα、β、およびγサブユニットから構成される多量体性タンパク質複合体である。α鎖１本、β鎖１本およびγ鎖２本を含み、α鎖がＩｇＥ結合部位を提供している、正しく組立てられたＦＣＥＲ１だけが、アレルギー応答をトリガーすることができる。従って、例えば適切な人工転写因子でＦＣＥＲ１α鎖（ＦＣＥＲ１Ａ）の発現をダウンレギュレーションすることは、ＦＣＥＲ１の正しい組立ておよび機能を全体として阻止するであろう。この考えは、アナフィラキシーが撤廃されているＦＣＥＲ１Ａ−／−マウスによって裏付けられている（Dombrowicz D., 1993, Cell 75, 969-976）。従って、人工転写因子技法を用いたＦＣＥＲ１Ａ発現のターゲティングは、アレルギー反応を抑止するために適切である。さらに、人工転写因子は一つのターゲット遺伝子に高度に特異的であるものの、多量体性受容体は一般に人工転写因子介在性ノックダウンが容易である。

薬学的組成物
本発明は、また、上記と同義の人工転写因子を含む薬学的組成物に関する。考えられる薬学的組成物は、温血動物、特にヒトに非経口全身投与用の、特に静脈内投与用の組成物、吸入用の組成物、および局所投与用、特に眼科局所投与用の組成物、例えば点眼薬としての組成物または硝子体内、結膜下、傍眼球（parabulbar）もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼薬および硝子体内、結膜下、傍眼球または眼球後投与用の組成物が特に好ましい。その組成物は、活性成分を単独で、または好ましくは薬学的に許容されうる担体と一緒に含む。徐放製剤がさらに考えられる。活性成分の薬用量は、処置される疾患ならびに種、その齢、体重、および個別の状態、個別の薬物動態データ、ならびに投与様式に依存する。

経口送達に有用な薬学的組成物、特に適切に封入された活性成分を含む組成物またはその他の方法で腸内分解から保護されている組成物がさらに考えられる。例えば、そのような薬学的組成物は、膜透過性促進剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含有することがあり、腸溶コーティングで包まれている場合がある。

薬学的組成物は、活性成分を約１％〜約９５％含む。１回投与剤形は、例えば、アンプル、バイアル、インヘラー、点眼薬などである。

本発明の薬学的組成物は、本質的に公知の方法で、例えば従来の混合、溶解または凍結乾燥工程によって調製される。

活性成分の溶液、そしてまた懸濁物または分散物、特に等張の水溶液、懸濁物または分散物の使用が優先され、それらは、例えば活性成分を単独で、または担体、例えばマンニトールと一緒に含む凍結乾燥組成物の場合、用時調製することができる。薬学的組成物は、滅菌されている場合があり、かつ／または添加物、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、溶解補助剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤を含む場合があり、本質的に公知の方法で、例えば従来の溶解および凍結乾燥工程により調製される。既述の溶液または懸濁物は、増粘剤、典型的にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、もしくはゼラチン、または同じく溶解補助剤、例えばＴｗｅｅｎ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を含みうる。

油中懸濁物は、注射に通例の植物油、合成油、または半合成油を油成分として含む。それに関して、８〜２２、特に１２〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含有する液体脂肪酸エステルについて特記することができる。これらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大６個の炭素原子を有し、１価または多価であり、例えば１、２または３価のアルコール、特にグリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、ダイズ油およびラッカセイ油などの植物油が特に有用である。

例えばアンプルまたはバイアルへの充填、および容器の密封と同様に、注射用製剤の製造は、通常、無菌条件で実施される。

非経口投与のために、水溶性形態の活性成分、例えば水溶性塩の水溶液、または増粘物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン、ならびに所望により安定化剤を含有する水性注射用懸濁物が特に適切である。場合により添加剤と一緒になった活性成分は、また、凍結乾燥物の形態の場合があり、非経口投与前に適切な溶媒の添加によって溶液に調製することができる。

吸入用組成物は、スプレー、ミストのようなエアロゾル形態で、または滴剤の形態で投与することができる。エアロゾルは、定量インヘラーまたはネブライザーで、すなわち適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を用いて患者によって吸入されるエアロゾル化医薬品の短いバーストの形態で特定量の医薬品を気道または肺に送達する装置で、送達することができる溶液または懸濁物から調製される。乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤を有する吸入用粉末スプレーを提供することも可能である。

点眼液は、好ましくは、組成物を涙液と等張（２９５〜３０５mOsm/l）にするために適切な薬剤を含む、活性成分の等張水溶液である。考えられる薬剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに組成物は、ｐＨを５〜８の間に、好ましくは７．０〜７．４に維持するために、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、リン酸−クエン酸緩衝液、またはトリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエメタン）を含む。組成物は、さらに、抗菌保存料、例えばパラベン、塩化ベンザルコニウムなどの第四級アンモニウム塩、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）などを含有しうる。点眼液は、さらに、ゲル様点眼液を産生するためにキサンタンガム、および／またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、もしくはポリビニルピロリドンなどの他の増粘剤を含有しうる。

処置方法への人工転写因子の使用
さらに本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響することに使用するための、エンドセリン受容体のレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、上記エンドセリン受容体Ａプロモーターに対する人工転写因子に関する。同様に本発明は、エンドセリン受容体Ａプロモーターに対する治療有効量の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法に関する。

エンドセリンによって調節される疾患は、例えば、本態性高血圧、肺高血圧、慢性心不全などの心血管疾患、さらにまた慢性腎不全である。加えて、放射線不透過物質適用の前、途中、および後の腎保護は、エンドセリン応答を鈍らせることによって達成される。加えて、多発性硬化症は、エンドセリン系によってマイナスの影響を受ける。

エンドセリンによって調節されるさらなる疾患は、緑内障性神経変性、眼血液循環での血管調節不全、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、視神経症、中心性漿液性網脈絡膜症、網膜色素変性、スザック症候群、およびレーバー遺伝性視神経症などの糖尿病性腎疾患または眼疾患である。

同様に本発明は、治療有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法に関する。特に本発明は、有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、緑内障性神経変性、眼血液循環での血管調節不全を処置する方法、特に網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、黄斑浮腫、視神経症、中心性漿液性網脈絡膜症、網膜色素変性、およびレーバー遺伝性視神経症を処置する方法に関する。有効量の本発明の人工転写因子は、処置されるべき特定種類の疾患ならびに種、その齢、体重、および個別の状態、個別の薬物動態データ、ならびに投与様式に依存する。眼内投与のために、月１回０．５〜１mgの硝子体注射が好ましい。全身適用のために、月１回１０mg/kgの注射が好ましい。加えて、眼硝子体内への徐放デポ剤の植込みも好ましい。

さらに本発明は、エンドセリンに対する細胞応答に影響することに使用するための、エンドセリン受容体Ｂのレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、上記エンドセリン受容体Ｂプロモーターに対する人工転写因子に関する。同様に本発明は、エンドセリン受容体Ｂプロモーターに対する治療有効量の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法に関する。

ＥＴ−１依存性のＥＴＲＢ介在性人工転写因子によって調節される疾患は、ある特定の癌、神経変性および炎症関連障害である。

さらに本発明は、ＬＰＳに対する細胞応答に影響することに使用するための、ＴＬＲ４のレベルを低下または増加させるための、およびＬＰＳによって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、上記ＴＬＲ４プロモーターに対する人工転写因子に関する。同様に本発明は、ＴＬＲ４プロモーターに対する治療有効量の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＬＰＳによって調節される疾患を処置する方法に関する。ＬＰＳによって調節される疾患は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、乾癬、クローン病、ブドウ膜炎、コンタクトレンズ関連角膜炎、角膜炎、癌の化学療法耐性などである。

さらに本発明は、ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体に対する細胞応答に影響することに使用するための、ＦＣＥＲ１のレベルを低下または増加させるための、およびＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患の処置に使用するための、特にそのような眼疾患の処置に使用するための、上記ＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対する人工転写因子に関する。

同様に本発明は、ＦＣＥＲ１Ａプロモーターに対する治療有効量の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患を処置する方法に関する。ＩｇＥまたはＩｇＥ−抗原複合体によって調節される疾患は、アレルギー性鼻炎、喘息、湿疹およびアナフィラキシーなどである。

植物での人工転写因子の使用
さらに本発明は、植物受容体を対象とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子をコードするＤＮＡは、植物定着微生物または植物のトランスフォーメーションのためのベクターにクローニングされる。または、人工転写因子は、局所適用に適した組成物の状態で植物に直接適用される。

実施例
ＤＮＡプラスミドのクローニング
全てのクローニング段階のために、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼをNew England Biolabsから購入した。エビ−アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）をPromegaから購入した。高忠実度Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を全ての標準ＰＣＲ反応に適用した。ＤＮＡフラグメントおよびプラスミドを、NucleoSpin Extract IIキット、NucleoSpin Plasmidキット、またはNucleoBond Xtra Midi Plusキット（Macherey-Nagel）を用いて製造業者の説明書に従って単離した。オリゴヌクレオチドを、Sigma-Aldrichから購入した。新規産生プラスミドの全ての関連ＤＮＡ配列は、配列決定（Microsynth）によって検証した。

２種の六量体性ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ−８５５ＡおよびＺＦＰ＋７４Ａ）の設計およびクローニング
ＥＴＲＡの発現を調節する人工転写因子を産生させるために、ＴＡＴ−ＫＲＡＢ−ＺＦＰから成る融合タンパク質を設計し、対応するコドン最適化ＤＮＡ配列を遺伝子合成によって得た。融合タンパク質のＺＦＰ部分について、ＺｉＦｉＴソフトウェア（Sander J.D. et al., 2010, Nucleic Acids Res 38, W462-468; 2007, Nucleic Acids Res 35, W599-605）を用いて、いわゆる「Ｂａｒｂａｓモジュール」セットを使ってパラメーターを「モジュール組立て」に設定して、潜在的（ＧＮＮ）_６６ＺＦＰターゲット部位についてヒトＥＴＲＡプロモーター領域（転写開始部位に対して−１０００bp〜＋１００bp；参照配列ＤＮＡＮＧ＿０１３３４３）をスクリーニングした。ターゲット部位−８５５（転写開始部位に対して−８５５bpから開始）に結合させる目的のＺＦＰ−８５５Ａについて、Wright D.A. et al., 2006, Nat Protoc 1, 1637-1652に従ってＺＦ５９−ＺＦ５９−ＺＦ７２−ＺＦ５８−ＺＦ７１−ＺＦ６７を構築した。同様に、ターゲット部位＋７４（転写開始部位に対して＋７４bp）に結合させる目的のＺＦＰ＋７４Ａについて、ＺＦ６５−ＺＦ６２−ＺＦ５８−ＺＦ６５−ＺＦ５９−ＺＦ５９を組立てた。

人工転写因子のためのリプレッサードメインとして、ヒトＫＯＸ１タンパク質のアミノ酸１〜９７番から成るＫＲＡＢドメインを選んだ（Beerli, R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633）。核ターゲティングのために、アミノ酸ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９６）（ＳＶ４０ＮＬＳに対応）およびＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１９７）（ＦＬＡＧタグ）を融合タンパク質に組入れた。ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ−ＫＲＡＢ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＳｐｅＩ−ＺＦＰ−８５５Ａ−ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ−ＺＦＰ＋７４Ａ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＺＦＰ−８５５ＡをＺＦＰ＋７４Ａに置換するため）をコードする合成遺伝子をコドン最適化し、GenScriptによって合成した。ＫＲＡＢ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＺＦＰ−８５５ＡおよびＫＲＡＢ−ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＺＦＰ＋７４Ａは、挿入物とベクターとの両方をＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断後にｐｃＤＮＡ３（−）（Invitrogen）に挿入し、それぞれｐＡＮ１０２１およびｐＡＮ１０２２が生じた。

プレイ−プラスミドのための六量体性ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
ＧＮＮおよび／またはＣＮＮ結合性ジンクフィンガー（ＺＦ）モジュールを含むいくつかの六量体性ジンクフィンガータンパク質ライブラリーをGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングし、次の改善点を得た。ＧＮＮおよびＣＮＮＺＦモジュールをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７（GenScript）に挿入し、それぞれｐＡＮ１０４９およびｐＡＮ１０７３が生じた。ＺＦＰライブラリーの段階的組立てはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターで行った。各個別のクローニング段階の間で複数のＺＦモジュールが挿入されて非機能的タンパク質に導くことを避けるために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（およびそれに由来する１個のＺＦＰ、２個のＺＦＰ、または３個のＺＦＰを含む産物）およびｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３を１種の制限酵素と共に最初にインキュベーションし、その後ＳＡＰで処理した。NucleoSpin Extract IIキットによって酵素を除去し、その後第２の制限エンドヌクレアーゼを添加した。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬのクローニングは、５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＸｈｏＩ、ＳＡＰ、および続いてＳｐｅＩで処理することによって行った。挿入物は、１０μgのｐＡＮ１０４９（１６個の異なるＧＮＮＺＦモジュールの放出）またはｐＡＮ１０７３（１５個の異なるＣＮＮＺＦモジュールの放出）をＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｈｏＩと共にインキュベーションすることによって産生させた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬを産生させるために、７μgのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬをＡｇｅＩで切断し、脱リン酸し、ＳｐｅＩで切断した。ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａＩをそれぞれ１０μgのｐＡＮ１０４９またはｐＡＮ１０７３に適用することによって挿入物を得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬのクローニングは、６μgのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬをＡｇｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＳｐｅＩで処理することによって行い、切断ベクターを得た。ＳｐｅＩ、ＳＡＰ、および続いてＸｍａＩと共にインキュベーションすることによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬから３ＺＦＰＬ挿入物を放出させた。

１、２、および３個のＺＦＰを含むライブラリーのためのライゲーション反応を、合計体積２０μl中に切断ベクター２００ng、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００Ｕを用いて挿入物：ベクターのモル比３：１でＲＴ（室温）にて一晩と設定した。六量体性ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのライゲーション反応物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬ２０００ng、３ＺＦＰＬ挿入物５００ng、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４０００Ｕを合計体積２００μl中に含んでおり、それを２０μl、１０個に分割し、ＲＴで一晩別々にインキュベーションした。各ライブラリーに必要なクローンの数に応じて、いくつかの方法によりライゲーション反応物の部分量をEscherichia coliにトランスフォーメーションした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−１ＺＦＰＬおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−２ＺＦＰＬの産生のために、ライゲーション反応物３μlを、E. coli NEB 5-alphaの熱ショックトランスフォーメーションのために直接使用した。０．０５μm ＶＭＷＰフィルター（Millipore）を用いてＤＮＡ等級Ｈ_２Ｏで１時間透析することによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−３ＺＦＰＬのライゲーション反応物を脱塩し、その後エレクトロコンピテントE. coli NEB 5-alpha（EquiBio製EasyjecT Plusエレクトロポレーター、２．５kVおよび２５μF、Bio-Rad製２mmエレクトロポレーションキュベット）にトランスフォーメーションした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーのライゲーション反応物をNucleoSpin Extract IIキットに適用し、ＤＮＡを脱イオン水１５μl中に溶離させた。約６０ngの脱塩ＤＮＡをＮＥＢ１０−ｂｅｔａエレクトロコンピテントE. coli（New England Biolabs）５０μlと混合し、EasyjecT Plus、２．５kV、２５μFおよび２mmエレクトロポレーションキュベットを用いて、製造業者が推奨するようにエレクトロポレーションを行った。各ライブラリーについて複数のエレクトロポレーションを行い、その後、細胞を直接プールしてライブラリーの規模を拡大した。熱ショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションの後に、ＳＯＣ培地をその細菌に適用し、３７℃および２５０rpmで１時間インキュベーション後に、ＳＯＣ培養物３０μlを使用し、段階希釈およびアンピシリンを含有するＬＢ平板上での平板培養に供した。翌日、得られたライブラリークローンの合計数を決定した。加えて、各ライブラリーのクローン１０個を選び、プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化によって挿入物の組込みをチェックした。ライブラリーの多様性を検証するために、これらのプラスミドの少なくとも３種を配列決定した。残りのＳＯＣ培養物をアンピシリン含有ＬＢ培地１００mlに移し、３７℃および２５０rpmで一晩培養した。これらの細胞を用いて、各ライブラリーについてプラスミドＭｉｄｉＤＮＡを調製した。

酵母１ハイブリッド選別のために、六量体性ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを適合性プレイ−ベクターに転移させた。そのために、ベクターをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ９７１（ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣ、配列番号１９８）およびＯＡＮ９７２（ＡＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧ、配列番号１９９）を挿入することによって、ｐＧＡＤ１０（Clontech）の複数のクローニング部位を改変した。生じたベクターｐＡＮ１０２５を切断および脱リン酸し、６ＺＦＰライブラリー挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰＬからＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって放出させた。ライゲーション反応およびＮＥＢ１０−ｂｅｔａエレクトロコンピテントE. coliへのエレクトロポレーションは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−６ＺＦＰライブラリーに関して上に記載したように行った。

感度が増加した酵母１ハイブリッド選別のために、６ＺＦＰライブラリーを別の適合性プレイ−ベクターに転移させた。そのために、ＡｐａＩ、ＮａｒＩフラグメントがアニーリングしたオリゴヌクレオチドＯＡＮ１１４３（ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣ、配列番号２００）およびＯＡＮ１１４４（ＴＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧ、配列番号２０１）によって置換された改変ｐＲＳ３１５（Sikorski, R.S. and Hieter, P., 1989, Genetics 122(1), 19-27）であるｐＡＮ１３７３にｐＡＮ１０２５の１４６０bp ＳｐｈＩフラグメントをライゲーションした。この改変の結果、上に概要を述べたライブラリークローニング計画と適合性の高コピー性２μ複製起点に比べて、低コピー性ＡＲＳ／ＣＥＮを含む酵母１ハイブリッドベクターが生じた。

分泌型ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼの併用アッセイのための受容体プロモーター領域のクローニング
ＥＴＲＡ、ＥＴＲＢ、ＴＬＲ４またはＦＣＥＲ１Ａのプロモーター領域を含むＤＮＡフラグメントをｐＡＮ１４８５（NEG-PG04, GeneCopeia）またはｐＡＮ１４８６（EF1a-PG04, GeneCopeia）にクローニングし、その結果、受容体プロモーターのコントロール下の分泌型Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよび構成的ＣＭＶプロモーターのコントロール下の分泌型アルカリホスファターゼが組込まれたレポータープラスミドが生じ、アルカリホスファターゼシグナルに対してルシフェラーゼを基準化することが可能になった。詳細には、ＯＡＮ９８１（ＡＡＴＣＧＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＴＴ、配列番号２０２）およびＯＡＮ９８２（ＡＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧ、配列番号２０３）を用いてヒトゲノムＤＮＡからＥＴＲＡプロモーターを増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｃＩ／ＸｈｏＩにクローニングし、ｐＡＮ１０３１が生じた。ＸｈｏＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＢａｍＨＩを用いてＥＴＲＡプロモーターをｐＡＮ１０３１から切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＡＮ１４８６にクローニングし、その結果ｐＡＮ１４９２が生じた。ＯＡＮ１２３２（ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＧＧＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＴＴＧＣＣＣ、配列番号２０４）およびＯＡＮ１２３３（ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣ、配列番号２０５）を用いてヒトゲノムＤＮＡからＥＴＲＢプロモーターを増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｃＩ／ＫｐｎＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１４３２が生じた。ＥＴＲＢプロモーターをｐＡＮ１４３２のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩから切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＥｃｏＲＩで切断されたｐＡＮ１４８６にクローニングし、その結果ｐＡＮ１４８９が生じた。ＯＡＮ１２３４（ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡＴＡＣ，配列番号２０６）およびＯＡＮ１２３５（ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧ、配列番号２０７）を用いてヒトゲノムＤＮＡからＴＬＲ４プロモーターを増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｌＩ／ＫｐｎＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１４３３が生じた。ＴＬＲ４プロモーターフラグメントをｐＡＮ１４３３のＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩから切断し、ｐＡＮ１４８６のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＢｇｌＩＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１４９１が生じた。ＯＡＮ１２４９（ＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＡＧＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＣ、配列番号２０８）およびＯＡＮ１２５０（ＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧ、配列番号２０９）を用いてｐＡＮ１４９１からＴＬＲ４プロモーターを増幅させ、ｐＡＮ１４８６のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１５０９が生じた。ＯＡＮ１２３６（ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＡＧＣ、配列番号２１０）およびＯＡＮ１２３７（ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＴＡＡＡＧＧＴＴＣ、配列番号２１１）を用いてヒトゲノムＤＮＡからＦＣＥＲ１Ａプロモーターを増幅させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｃＩ／ＫｐｎＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１４３４が生じた。ＦＣＥＲ１ＡプロモーターをｐＡＮ１４３４のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩから切断し、ｐＡＮ１４８６のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＥｃｏＲＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１４９０が生じた。ＯＡＮ１２６１（ＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＡＴ、配列番号２１２）およびＯＡＮ１２６２（ＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧ、配列番号２１３）を用いてｐＡＮ１４９０からＦＣＥＲ１Ａプロモーターを増幅させ、ｐＡＮ１４８５のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩにクローニングし、その結果ｐＡＮ１５１５が生じた。

ベイト−プラスミドのクローニング
各ベイト−プラスミドについて、ＥＴＲＡ、ＥＴＲＢ、ＴＬＲ４またはＦＣＥＲ１Ａプロモーター領域中の上流および下流配列から採取された２１bpに隣接する１８bpターゲット部位を用いた。制限分析のためにＮｃｏＩ部位を包含させた。オリゴヌクレオチドを設計し、５’ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’ＸｈｏＩ部位を産生するようにアニーリングし、そのことから、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断されたｐＡｂＡｉ（Clontech）中への直接ライゲーションが可能になった（表５）。

哺乳類トランスフェクションのための人工転写因子のクローニング
ＤＮＡフラグメントＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶ−ＮＮＮＮＮＮ−ＸｈｏＩ−ＮＮＮＮＮＮ−ＡｇｅＩ−３ｘｍｙｃ−ＳＴＯＰ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩの産生のために、Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１０３２（ＡＡＴＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧ、配列番号２４６）、およびＯＡＮ１０３３（ＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡ、配列番号２４７）を用いてｐＷＳ２５０から３ｘｍｙｃタグを増幅し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで切断されたｐｃＤＮＡ３（−）にライゲーションし、その結果ｐＡＮ１１０９が生じた。Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１０３４（ＡＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡ、配列番号２４８）、およびＯＡＮ１０３５（ＧＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴ、配列番号２４９）を用いてｐＡＮ１０２１からＫＲＡＢ−ＮＬＳを増幅させた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩで切断し、ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩで切断されたｐＡＮ１１０９にライゲーションし、その結果ｐＡＮ１１１０が生じた。

ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１０３６（ＡＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴ、配列番号２５０）、ＯＡＮ１０３７（ＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＣ、配列番号２５１）を用いてＺＦＰ−８５５ＡのＤＮＡ配列をｐＡＮ１０２１から増幅させ、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩで切断されたｐＡＮ１１１０にクローニングし、ｐＡＮ１１１１を産生させた。同様に、ＯＡＮ１０３８（ＡＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣ、配列番号２５２）およびＯＡＮ１０３９（ＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＣＣＧＣＣ、配列番号２５３）を用いてｐＡＮ１０２２からＺＦＰ＋７４Ａを増幅させ、ｐＡＮ１１１０にクローニングし、その結果ｐＡＮ１１１２が生じた。

ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩ消化を用いてｐＡＮ１１１１のＺＦＰ−８５５Ａを適切な６ＺＦＰによって（酵母１ハイブリッド選別によって確認）、例えばＺＦＰ−８５５Ｃによって置換し、その結果ｐＡＮ１１３３が生じた。

加えて、ＳＩＤ−ＮＬＳ（ＳＩＤはBeerli, R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633によるとＭａｄｍＳｉｎ３相互作用ドメインのアミノ酸１〜３６番に対応する）を、最初のＤＮＡ合成段階でPlatinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼを用いてＯＡＮ１０９６（ＡＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡ、配列番号２５４）、ＯＡＮ１０９７（ＡＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴ、配列番号２５５）、ＯＡＮ１０９８（ＧＧＴＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＧＣ、配列番号２５６）、ＯＡＮ１０９９（ＧＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＧＧＴＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧ、配列番号２５７）をアニーリングすることによって産生した。Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１０９６、およびＯＡＮ１０９９を用いた第２のＤＮＡ合成段階のためのテンプレートとして、このＰＣＲ産物の一定分量を使用した。第２のＰＣＲ産物をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶで切断されたｐＡＮ１１１１中のＫＲＡＢ−ＮＬＳを置換するために使用した。結果として生じたプラスミドｐＡＮ１２０８を用いて、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩ処理後にＺＦＰ−８５５ＡをＹ１Ｈ選別からの任意の６ＺＦＰと置換した。

さらに、タンパク質ドメインの順序を、Gommans, W.M. et al., 2007, Mol Carcinog 46, 391-401に従って再配列させ、Ｎ末端ＮＬＳに続いて６ＺＦＰ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）リンカー配列、ヒトＫＲＡＢのアミノ酸１１〜５５番およびＣ末端３ｘｍｙｃタグとなるようにした。最初に、テンプレートとしてのｐＡＮ１１３３、Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１１００（ＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴ、配列番号２５８）、ＯＡＮ１１０１（ＧＣＧＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡ、配列番号２５９）を用いたＰＣＲによってＤＮＡフラグメントＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ−ＮＮＮＮＮＮ−ＢａｍＨＩ−３ｘｍｙｃ−ＳＴＯＰ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを産生させ、これをＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＡＮ１１０９にライゲーションしてｐＡＮ１１８３を産生させた。２番目に、テンプレートとしてのｐＡＮ１１３３、Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１１０４（ＧＣＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＧ、配列番号２６０）、ＯＡＮ１１０５（ＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＡＴＧＡＧＴＣＣＴＣＴ、配列番号２６１）を用いたＰＣＲによってＥｃｏＲＶ−ＡＴＧ−ＮＬＳ−ＸｈｏＩ−ＸｍａＩ−ＺＦＰ−８５５Ｃ−ＡｇｅＩ−ＧＧＳＧＧＳリンカー−ＥｃｏＲＩを作り、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶクローニングを用いてｐＡＮ１１８３に挿入してｐＡＮ１１８４を産生させた。３番目に、Platinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ、ＯＡＮ１１０６（ＧＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＴ、配列番号２６２）、ＯＡＮ１１０７（ＧＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣ、配列番号２６３）を用いてｐＡＮ１１３３からヒトＫＲＡＢのアミノ酸１１〜５５を増幅し、これをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断されたｐＡＮ１１８４にライゲーションした。最終的なプラスミドｐＡＮ１１８５を使用して、ＸｈｏＩ／ＡｇｅＩで切断することによってＺＦＰ−８５５ＣをＹ１Ｈ選別からの任意の６ＺＦＰと置換した。

活性化ＡＴＦのクローニングのために、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断し、アニーリングしたＯＡＮ１２５３（配列番号２６４）、ＯＡＮ１２５４（配列番号２６５）、ＯＡＮ１２５５（配列番号２６６）およびＯＡＮ１２５６（配列番号２６７）を挿入することによってＣ末端ＫＲＡＢドメインをＶＰ６４コード配列によって置換した。

改変された酵母１ハイブリッド（Ｙ１Ｈ）選別
酵母株および培地
Saccharomyces cerevisiae Y1H GoldをClontechから、ＹＰＤ培地およびＹＰＤ寒天培地をCarl Rothから購入した。合成ドロップアウト（ＳＤ）培地は、２０g/lグルコース、６．８g/l Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、９．７g/l ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ（全てCarl Roth製）、１．４g/l酵母合成ドロップアウト培地補充剤、６．７g/l酵母窒素ベース、０．１g/l Ｌ−トリプトファン、０．１g/l Ｌ−ロイシン、０．０５g/l Ｌ−アデニン、０．０５g/l Ｌ−ヒスチジン、０．０５g/lウラシル（全てSigma-Aldrich製）を含有していた。ＳＤ−Ｕ培地は、ウラシル以外の全成分を含有しており、ＳＤ−Ｌは、Ｌ−ロイシンなしで調製した。ＳＤ寒天平板は、リン酸ナトリウムを含有せず、１６g/l Bacto Agar（ＢＤ）を含有した。オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）はClontechから購入した。

ベイト酵母株の調製
ＢｓｔＢＩを合計体積２０μlで用いて各ベイト−プラスミド約５μgを直線状にし、反応混合物の半分を、S. cerevisiae Y1H Goldの熱ショックトランスフォーメーションのために直接使用した。トランスフォーメーション前日にＹＰＤ培地５mlに植菌するために酵母細胞を採用して、ローラー上にてＲＴで一晩成長させた。この前培養物１mlを新鮮ＹＰＤ培地で１：２０希釈し、３０℃、２２５rpmで２〜３時間インキュベーションした。各トランスフォーメーション反応のために、ＯＤ_６００が１のものを遠心分離によって回収し、酵母細胞を無菌水１mlで１回、ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０mMトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mM ＥＤＴＡ、１００mM酢酸リチウム）１mlで１回洗浄した。最終的に、酵母細胞をＴＥ／ＬｉＡｃ５０μl中に再懸濁し、サケ精巣由来１本鎖ＤＮＡ（Sigma-Aldrich）５０μg、ＢｓｔＢＩで直線状にしたベイト−プラスミド１０ul（上記参照）、およびＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０mMトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mM ＥＤＴＡ、１００mM酢酸リチウム、５０％(w/v)ＰＥＧ３３５０）３００μlと混合した。細胞およびＤＮＡをローラー上にてＲＴで２０分間インキュベーションし、その後４２℃の湯浴に１５分間入れた。最終的に、酵母細胞を遠心分離によって収集し、無菌水１００μl中に再懸濁し、ＳＤ−Ｕ寒天平板上に広げた。３０℃で３日間インキュベーション後に、各トランスフォーメーション反応物からＳＤ−Ｕ上に成長している８個のクローンを選び、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対するそれらの感受性を分析した。前培養物をローラー上にてＲＴで一晩成長させた。各培養物について、ＯＤ_６００を測定し、無菌水でＯＤ_６００を０．３に調整した。この最初の希釈から５回の追加的な１／１０希釈段階を無菌水で行った。各クローンについて各希釈段階からの５μlを、ＳＤ−Ｕ、ＳＤ−Ｕ１００ng/ml ＡｂＡ、ＳＤ−Ｕ１５０ng/ml ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｕ２００ng/ml ＡｂＡを含有する寒天平板上にスポットした。３０℃で３日間インキュベーション後に、ＳＤ−Ｕ上で成長良好で、ＡｂＡに対して最も感受性が高いクローン３個をさらなる分析のために選んだ。酵母ゲノムへのベイト−プラスミドの安定組込みは、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1（Clontech）によって、製造業者の説明書に従って検証した。３個のクローンの１個をその後のＹ１Ｈ選別のために使用した。

六量体性ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株のトランスフォーメーション
酵母ベイト株前培養物５０μlをＹＰＤ培地１００ml中に希釈し、ＯＤ_６００＝１．６〜２．０になるまで（約２０時間）、３０℃および２２５rpmでインキュベーションした。スイングアウトローターで遠心分離（５min、１５００×ｇ、４℃）することによって細胞を収集した。エレクトロコンピテント細胞の調製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行った。各トランスフォーメーション反応のために、エレクトロコンピテント−ベイト酵母細胞４００μlを、６ＺＦＰライブラリーをコードするプレイ−プラスミド１μgと混合し、氷上で３分間インキュベーションした。予冷した２mmエレクトロポレーションキュベットに細胞−ＤＮＡ懸濁物を移した。エレクトロポレーション（EasyjecT Plusエレクトロポレーター、２．５kVおよび２５μF）の後に、酵母細胞をＹＰＤ：１Ｍソルビトールの１：１混合物８mlに移し、３０℃および２２５rpmで９０分間インキュベーションした。細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤ−Ｌ培地１ml中に懸濁した。１０００〜４０００ng/ml ＡｂＡを含有する１０cm ＳＤ−Ｌ寒天平板上に５０μl分量を広げた。加えて、細胞懸濁物５０μlを用いて１／１００および１／１０００希釈物を作り、未希釈細胞および希釈済み細胞５０μlをＳＤ−Ｌ平板上に植えた。全ての平板を３０℃で３日間インキュベーションした。希釈済みトランスフォーマントを有する平板から、得られたクローンの合計数を計算した。未希釈細胞を有するＳＤ−Ｌ平板が全てのトランスフォーマントの成長を示す一方で、プレイ６ＺＦＰがそのベイトのターゲット部位にうまく結合した場合にのみ、ＡｂＡを含有するＳＤ−Ｌ平板はコロニーの形成を生じた。

正の相互作用の検証および６ＺＦＰをコードするプレイ−プラスミドの回収
最初の分析のために、最高ＡｂＡ濃度を含有するＳＤ−Ｌ平板から十分な大きさのコロニー４０個を釣り上げ、３０００〜４０００ng/ml ＡｂＡを有するＳＤ−Ｌ上に酵母細胞を２回再画線し、単一コロニーを得た。各クローンについて、コロニー１個を用いてＳＤ−Ｌ培地５mlに接種し、ＲＴで一晩成長させた。翌日、無菌水でＯＤ_６００を０．３に調整し、追加的な１／１０希釈物５個を調製し、各希釈段階の５μlを、ＳＤ−Ｌ、ＳＤ−Ｌ１０００ng/ml ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ１５００ng/ml ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ２０００ng/ml ＡｂＡ、ＳＤ−Ｌ３０００ng/ml ＡｂＡ、およびＳＤ−Ｌ４０００ng/ml ＡｂＡの平板２枚上にスポットした。高いＡｂＡ濃度で成長する能力に従ってクローンを順位付けした。最良成長しているクローンから最初のＳＤ−Ｌ前培養物５mlを使用して細胞を遠沈し、水または残留培地１００μl中に細胞を再懸濁した。５０Ｕリチカーゼ（lyticase）（Sigma-Aldrich, L2524）の添加後に、３０℃および３００rpmで水平シェーカー上で細胞を１時間インキュベーションした。産生したスフェロブラストをNucleoSpin PlasmidキットからのＡ１緩衝液２５０μlで希釈し、スパーテル先端に１杯のガラスビーズ（Sigma-Aldrich, G8772）を添加し、２０秒間ボルテックス撹拌することによってチューブを激しく混合した。ガラスビーズを沈降させ、上清２５０μlを新しいチューブに移し、標準NucleoSpin Plasmidキットプロトコールを続けるために使用した。溶離緩衝液５０μlで溶離後に、熱ショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡ５μlをE. coli DH5 alphaにトランスフォーメーションした。個別のコロニー２個をアンピシリン含有ＬＢ平板から釣り上げ、プラスミドを単離し、ライブラリー挿入物を配列決定した。得られた結果は、各ターゲット部位に対する６ＺＦＰ間でのコンセンサス配列のために分析された。

細胞培養およびトランスフェクション
４．５g/lグルコース、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、２mM Ｌ−グルタミン、および１mMピルビン酸ナトリウム（全てSigma-Aldrich製）を補充されたDulbecco改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）中でＨｅＬａ細胞を５％ＣＯ_２中で３７℃にて成長させた。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、ＨｅＬａ細胞７０００個／ウェルを９６ウェル平板に蒔いた。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬（Qiagen）を用いて製造業者の説明書に従って同時トランスフェクションを行った。人工転写因子およびルシフェラーゼをコードするPlasmid midi調製物を３：１の比で使用した。トランスフェクションの６時間後および２４時間後に培地を１００μl／ウェルの新鮮ＤＭＥＭと交換した。１０％ＦＢＳ、２mMグルタミン、および１mMピルビン酸ナトリウムを補充されたＲＭＰＩ−１６４０培地中でＵ９３７細胞（Sigma）およびＫＵ８１２Ｆ細胞（Sigma）を成長させた。Cell Line NucleofectorキットＣ（Amaxa）またはCell Line NucleofectorキットＴ（Amaxa）を用いて、製造業者の提案に従うヌクレオフェクションによってＵ９３７細胞およびＫＵ８１２Ｆ細胞をトランスフェクションした。２mMグルタミンおよび１mMピルビン酸塩を補充された７０％ＭＥＭ／２０％ＲＭＰＩ−１６４０／１０％熱不活化ＦＢＳ中でＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＤＳＭＺ）を成長させた。Cell line nucleofectorキットＴ（Amaxa）を用いてＲＢＬ−２Ｈ３細胞をヌクレオフェクションした。平滑筋細胞成長培地２を用いて、供給業者の提案に従って初代ヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ、PromoCell）を成長させた。

ルシフェラーゼ／ＳＥＡＰプロモーター活性の併用アッセイ
ＨｅＬａ細胞またはＲＢＬ−２Ｈ３細胞に人工転写因子発現構築物ならびにＥＴＲＡ、ＥＴＲＢ、ＴＬＲ４またはＦＣＥＲ１プロモーターのコントロール下の分泌型Gaussiaルシフェラーゼおよび構成的ＣＭＶプロモーターのコントロール下の分泌型アルカリホスファターゼを有するプラスミド（Secrete-Pair Dual Luminescence Assay, GeneCopeia, Rockville, MD）を同時トランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、細胞培養上清を収集し、Secrete-Pair Dual Luminescenceアッセイ（GeneCopoeia）またはＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ（Roche)を用いてルシフェラーゼ活性およびＳＥＡＰ活性を測定した。人工転写因子発現構築物の代わりのＹＦＰ−Ｎ１（Clontech）の同時トランスフェクションを対照として役立てた。ＳＥＡＰ活性に対してルシフェラーゼ活性を基準化し、対照に対する％として表現した。

ヒト子宮平滑筋細胞（ｈＵｔＳＭＣ）格子収縮アッセイ
無菌ウシコラーゲン（３．１mg/ml;#5005-B Nutacon）２５０μlを１０×ＰＢＳ３０μlおよび０．１ＮＮａＯＨ２２．５μlと混合し、ｐＨ７．４に到達させた。中和したコラーゲンにＳＭＣ培地２の２００μl中のｈＵｔＳＭＣ２５０００個を添加し、穏やかに混合し、２４ウェル組織培養平板に移し、３７℃、５％ＣＯ_２で４５分間重合させた。重合後に、ＳＭＣ成長培地２を５００μl添加した。人工転写因子で処理するために、重合直後ならびに再度２４および４８時間後に、１μM ＡＯ７４Ｖまたは対照として適切な量の緩衝液を添加した。重合の７２時間後に、穏やかに撹拌することによって、またはスパチュラの助けで容器の壁から格子を剥離し、１００nM ＥＴ−１または緩衝液対照を添加した。格子をスキャンし、ImageJソフトウェアを用いた画像解析によって格子面積を決定した。

ＩＬ−６の検出
１×１０^６個のＵ９３７細胞にＴＬＲ４特異的人工転写因子用の発現プラスミドまたは対照ベクターを製造業者（Amaxa）の推奨に従ってヌクレオフェクションした。各ヌクレオフェクションからの細胞１．２５×１０^５個を１２ウェル平板に移し、１００nMホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ；Sigma）で４８時間刺激し、その後多様なＬＰＳ濃度で８時間刺激した。ＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（Orgenium）を用いて製造業者の推奨に従って細胞培養上清中のＩＬ−６濃度を分析した。

ＩｇＥ結合能のフローサイトメトリー決定
ＫＵ８１２Ｆ細胞へのＩｇＥの結合を決定するために、細胞１×１０^６個をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）２ml中で１回洗浄し、その後ＦＡＣＳ緩衝液０．５ml中に再懸濁した。細胞２×１０^５個を１０μg/mlヒトＩｇＥ（abcam）と共に３０分間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液５００μlで１回洗浄し、その後ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩｇＥ（５μg/ml, abcam）を３０分間添加した。ＦＡＣＳ緩衝液５００μl中で試料を１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液７００μl中に再懸濁した。試料をフローサイトメトリー（Cyan ADP, Beckman Coulter）によって分析した。未染色の細胞およびＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩｇＥだけで処理された細胞を対照として使用した。

ＭＴＳアッセイを用いた細胞増殖の決定
ＨｅＬａ細胞またはｈＵｔＳＭＣ、７０００個を９６ウェル平板内の培地１００μl中に蒔き、特異的人工転写因子または適切な緩衝液対照でそれぞれ４８または７２時間処理した。細胞増殖を決定するために、CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay（Promega）を製造業者の推奨に従って使用した。トリプリケートで行った実験を独立して少なくとも３回繰り返した。

人工転写因子タンパク質の産生
E. coli BL21（ＤＥ３）に所与の人工転写因子用の発現プラスミドをトランスフォーメーションし、０．８から１の間のＯＤ_６００に到達するまで１００μM ＺｎＣｌ_２補充ＬＢ培地１Ｌ中で成長させ、１mM ＩＰＴＧで２時間誘導した。遠心分離によって細菌を回収し、超音波処理によって細菌溶解物を調製し、封入体を精製した。このために、遠心分離（５０００ｇ、４℃、１５分）によって封入体を収集し、結合緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、５００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール；ｐＨ７．５）２０ml中で３回洗浄した。精製された封入体は、氷上で結合緩衝液Ａ（５０mM ＨＥＰＥＳ、５００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、６ＭＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）３０ml中で１時間可溶化した。可溶化された封入体を４℃および１３，０００ｇで４０分間遠心分離し、０．４５μm ＰＶＤＦフィルターに通して濾過した。Ｈｉｓタグ付き人工転写因子を、Aktaprime FPLC（GeHealthcare）でＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムを用いて、結合緩衝液Ａおよび溶離緩衝液Ｂ（５０mM ＨＥＰＥＳ、５００mM ＮａＣｌ、５００mMイミダゾール、６ＭＧｕＨＣｌ；ｐＨ７．５）を使用して精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、その人工転写因子がＳＩＤドメインを含む場合は緩衝液Ｓ（５０mMトリス−ＨＣｌ、５００mM ＮａＣｌ、２００mMアルギニン、１００μM ＺｎＣｌ_２、５mM ＧＳＨ、０．５mM ＧＳＳＧ、５０％グリセロール；ｐＨ７．５）で、またはＫＲＡＢドメインを含む人工転写因子については緩衝液Ｋ（５０mMトリス−ＨＣｌ、３００mM ＮａＣｌ、５００mMアルギニン、１００μM ＺｎＣｌ_２、５mM ＧＳＨ、０．５mM ＧＳＳＧ、５０％グリセロール；ｐＨ８．５）で、４℃にて一晩透析した。透析後に、タンパク質試料を１４，０００rpｍで３０分間４℃にて遠心分離し、０．２２μm Millex-GVフィルターチップ（Millipore）を用いて無菌濾過した。

統計解析
必要に応じて、Studentのｔ検定（Excel, Microsoft Cooperation）またはＳＰＳＳを用いた一般線形単変量モデル（IBM）を採用して、統計解析を行った。示した全ての実験結果は、三つの独立した実験結果の平均にＳＥＭを表すエラーバーを付けたものである。

Claims

阻害または活性化タンパク質ドメイン、核移行配列、およびタンパク質トランスダクションドメインに融合した受容体遺伝子プロモーターを、特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子。
受容体遺伝子プロモーターがエンドセリン受容体Ａプロモーターである人工転写因子。
受容体遺伝子プロモーターがエンドセリン受容体Ｂプロモーターである人工転写因子。
受容体遺伝子プロモーターがＴｏｌｌ様受容体４プロモーターである人工転写因子。
受容体遺伝子プロモーターがＦＣＥＲ１Ａプロモーターである人工転写因子。
六量体性ジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１、２、３、４または５記載の人工転写因子。
配列番号３１〜配列番号３７、配列番号３９〜配列番号４３、配列番号４５〜配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４〜配列番号５７、配列番号５９〜配列番号６４、配列番号６６〜配列番号８０、配列番号８２〜配列番号９５、配列番号９７〜配列番号１１８、配列番号１２０〜配列番号１３６、配列番号１３８〜配列番号１４３、配列番号１４５〜配列番号１５３、配列番号１５５〜配列番号１６４、配列番号１６６〜配列番号１７３、配列番号１７５〜配列番号１８１、および配列番号１８３〜配列番号１９１から成る群より選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項２、３、４または５記載の人工転写因子。
配列番号５６、８３、８５、１０１、１１４、１１８、１２７、１３３、１４０、１４２、１４６、１４７、１５６、１５９、１７５、および１８１から成る群より選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項２、３、４または５記載の人工転写因子。
配列番号１１８、１３３、１５６、または１７５のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項２、３、４または５記載の人工転写因子。
ジンクフィンガータンパク質が阻害タンパク質ドメインに融合している、請求項１〜９のいずれか一項記載の人工転写因子。
阻害タンパク質ドメインが、配列番号１のＮ末端ＫＲＡＢ、配列番号２のＣ末端ＫＲＡＢ、配列番号３のＳＩＤ、または配列番号４のＥＲＤである、請求項１０記載の人工転写因子。
ジンクフィンガータンパク質が活性化タンパク質ドメインに融合している、請求項１〜９のいずれか一項記載の人工転写因子。
活性化タンパク質ドメインが、配列番号５のＶＰ１６または配列番号６のＶＰ６４である、請求項１２記載の人工転写因子。
核移行配列が、Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒコンセンサス配列を含む塩基性アミノ酸クラスターまたは配列番号１９６のＳＶ４０ＮＬＳである、請求項１〜１３のいずれか一項記載の人工転写因子。
タンパク質トランスダクションドメインが、配列番号７のＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ＨＳＶ−１ＶＰ２２ペプチド、配列番号１９２の合成ペプチドｍＴ０２、配列番号１９３の合成ペプチドｍＴ０３、配列番号１９４のＲ９ペプチド、ＡＮＴＰドメイン、または防御抗原／致死因子Ｎ末端ＰＴＤである、請求項１〜１４のいずれか一項記載の人工転写因子。
阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、エンドセリン受容体Ａプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子。
阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、エンドセリン受容体Ｂプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子。
阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、Ｔｏｌｌ様受容体４プロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子。
阻害または活性化タンパク質ドメインおよび核移行配列に融合した、ＦＣＥＲ１Ａプロモーターを特異的にターゲティングするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子。
請求項１〜１９記載の人工転写因子を含む薬学的組成物。
外部刺激および他の可溶性シグナリング分子に対する細胞の反応の調節において使用するための、請求項１〜１９記載の人工転写因子。
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングする受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される疾患の処置において使用するための、請求項１〜１９記載の人工転写因子。
エンドセリンに対する細胞応答に影響させることにおいて使用するための、エンドセリン受容体Ａのレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置において使用するための、請求項２または６〜１６記載の人工転写因子。
エンドセリンに対する細胞応答に影響させることにおいて使用するための、エンドセリン受容体Ｂのレベルを低下または増加させるための、およびエンドセリンによって調節される疾患の処置において使用するための、請求項３、６〜１５または１７記載の人工転写因子。
リポ多糖に対する細胞応答に影響させることにおいて使用するための、Ｔｏｌｌ様受容体４のレベルを低下または増加させるための、およびリポ多糖によって調節される疾患の処置において使用するための、請求項４、６〜１５または１８記載の人工転写因子。
ＩｇＥに対する細胞応答に影響させることにおいて使用するための、ＩｇＥ受容体のレベルを低下または増加させるための、およびＩｇＥによって調節される疾患の処置において使用するための、請求項５〜１５または１９記載の人工転写因子。
治療有効量の請求項１〜２６記載の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法であって、処置されるべき疾患が、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が受容体遺伝子プロモーターを特異的にターゲティングする受容体への特異的エフェクターの結合によって調節される方法。
治療有効量の請求項２、３、または６〜１７記載の人工転写因子を、それを必要とする患者に投与することを含む、エンドセリンによって調節される疾患を処置する方法。