CN101333251A - 能启动a20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途。其制备方法包括：与A20基因启动子区靶序列特异性结合的含锌指基序多肽制备；人工转录因子合成：人工转录因子包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域，连接顺序为：跨膜域－核定位信号－结合域－功能域，将制备的含3～6个锌指基序的多肽融合到NF－p65或VP64的功能区，加上核定位信号，在其N－末端加上9个精氨酸或Tat蛋白的12个氨基酸作为蛋白转导域；本发明能有效跨过细胞膜进入细胞内启动A20基因的表达，具有良好抗血管再狭窄、动脉粥样硬化、心肌肥大、严重炎症损伤等性能，在制备克服器官移植排斥反应或心肌肥大或严重炎症损伤时细胞保护药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及其用途。
技术背景
A20基因属锌指蛋白家族，基因敲除实验表明A20基因是机体抵抗炎症不可缺少的重要功能基因。将A20基因表达于胰岛细胞能有效诱导胰岛移植耐受，超表达A20基因在同种肾脏移植中阻止移植物血管动脉粥样硬化的形成。A20基因可抑制CD40-CD40配体信号通路，从而可抑制动脉粥样硬化形成和移植物动脉粥样硬化的发生。A20基因可动态管理心脏，抑制心肌肥大。A20基因能有效抑制平滑肌细胞病理性增殖和迁移导致的血管内膜增生，能抵抗肿瘤坏死因子、FAS以及NK细胞介导的内皮细胞死亡，能有效阻断NF-KB及TOLL信号通路，而这两个通路在移植排斥反应和动脉粥样硬化中都具有重要作用。A20在烧伤血清和氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞、内皮祖细胞损伤中也具有重要作用，同时能有效抑制内皮细胞组织因子的表达达到抑制血栓形成的目的。说明A20基因除了可对抗严重的炎症如严重的创伤、感染等对细胞的损伤，同时在抑制器官移植排斥反应及防止血管动脉粥样硬化方面具有重要的应用价值。因而以A20为合成药物的靶基因，在器官移植、动脉粥样硬化、心肌肥大、严重损伤等方面具有广泛的应用前景。
以A20为合成药物的靶基因，最好的方法是通过一种药物能进入细胞内控制它的表达。利用酵母可进行单个基因的一系列研究，但由于哺乳动物基因组的抵抗，除了干细胞可进行同源和非同源的转基因外，有目的地改变哺乳动物细胞基因表达是困难的。有几个方法可有效改变在体基因表达，但都面临不能有效呈递到靶细胞组织和器官。另外同源同组的方法可整个改变基因表达，使用反义试剂、核糖核酸酶、或RNAi干扰技术能降低mRNA水平，在特定的条件下，这些策略是相当有效的。但在mRNA水平进行操作稳定性不强。另一个完全不同概念的方法选择性改变基因表达包括直接管理靶基因内源性位点的转录，几个策略可达到这个目的。例如通过突变已存在的起主要作用的等位基因转录因子，可通过设计合成DNA连接分子，聚酰胺或肽核酸预先决定DNA连接的特异性，通过作用这些管理序列的分子，竞争性抑制内源性转录因子从而达到选择性控制基因。但转录因子一般同时控制多个基因表达，不能特异作用于一个基因。而人工锌指转录因子为此提供了新的方法。
天然的转录因子通常包括两个区域，一个功能区，另一个是DNA连接区，其普遍使用锌指基序Cys2 His2作为DNA连接区，与多个基因连接。Cys2 His2锌指蛋白能作为一个单体行使功能，可有多次串连重复，不受数量限制，间隔长短可不等，与其元件结合不需要序列结构对称，他们的连接位点对回文序列不受限制。每个锌指接触三个碱基，两个锌指肽链分别折叠成两个独立的小结构域，中间通过一个柔性接头连接。如多个锌指连接可识别更多的碱基，故能识别更长的DNA特异序列。
控制内源性A20基因表达一个更有效的方法，就是实验设计合适的带有特定DNA连接特性的锌指蛋白控制基因的转录，即人工锌指转录因子。理解天然的锌指区怎样连接到特定的DNA序列，为设计连接到特定靶序列的人工转录因子提供了可能。实验设计特定基因DNA连接特性的锌指基序，再融合控制此基因表达的转录因子部分功能区，最终达到控制特定基因表达。
人工合成的锌指蛋白是大分子物质，进入细胞比较困难，因而在设计合成锌指蛋白时需要在其N-末端融合一段穿膜肽，穿膜肽又称为蛋白转导域(PTD)，以促进其能进入细胞内，Tat蛋白包括86个氨基酸，在爱滋病病毒中也含有Tat蛋白，其中位于第37-72片段之间的氨基酸定位于细胞浆及细胞核，最有效的片段是Tat蛋白中位于第4860片段之间的12个氨基酸，这12个氨基酸即是穿膜序列足够进入细胞和细胞核内，而不需要受体配体及任何需要能量的转运方式，此外9个精氨酸序列具有比Tat更好的穿膜效果，同时细胞毒性更低，作为蛋白转导域(PTD)。因此将这些序列融合到前述合成的人工锌指转录蛋白，这样合成的锌指转录蛋白可有效进入细胞内发挥作用。
基于这个原理以A20基因为药物靶构建人工锌指转录因子来启动内源性A20基因表达为其产业化提供了可能。但目前国内外未见任何以A20基因为药物靶构建人工锌指蛋白转录因子的研究报道。
发明内容
本发明的目的就在于改进直接应用A20基因的不足，提供一种以A20基因为药物靶构建的人工锌指转录因子蛋白来启动内源性A20基因表达，本发明的另一目的是提供所述能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子的用途。如在制备能启动或发挥人A20功能的药物中的用途。
为实现本发明的上述目的而采用的技术方案是这样的，即一种能以A20基因为药物靶能启动内源性A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，包括连接区、功能区及跨膜区，其特征是：采用如下的方法制备：
1、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白，其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其特征是：其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：
(1)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2 QSGDLRR、SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE
SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR、SEQ ID NO：7 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(2)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGFKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR、SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER
SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE、SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为为相同的接头HQRTH；
或(3)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR、SEQ ID NO：17Q LAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE
SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR、SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为TGKKTS；
或(4)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR、SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE
SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER、SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(5)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE、SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE
SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR、SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH。
2、根据步骤1所述的能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白，其特征是：其功能域为NF-p65或VP64的功能区；其中：所述NF-p65的核酸序列为SEQ ID NO：36。
所述所述NF-p65的蛋白序列为SEQ ID NO：37。
所述VP64的核酸序列为SEQ ID NO：38。
所述VP64的蛋白序列为SEQ ID NO：39。
3、步骤1所述的能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白，其特征是：其跨膜域为9个精氨酸或Tat蛋白(4860)的12个氨基酸；其中9个精氨酸序列为SEQ ID NO：40，Tat蛋白(4860)的12个氨基酸序列为SEQ ID NO：41。
4、步骤1所述的能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白，其特征是：所述核定位信号的核酸序列为SEQ ID NO：42。
5、步骤1所述的能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白，其特征是：结合域、功能域、核定位信号及跨膜域之间是通过以下的连接方式连接的：连接顺序如下：跨膜域-核定位信号-结合域-功能域，其中跨膜域前的起始密码子为ATg，各部分之间的连接序列ggaatccatggggtaccg，酶切位点ggatcc和ggcagc，功能域末端的终止密码子为taa。
本发明解决的主要问题是人工设计合成基于A20基因为药物靶的人工锌指转录因子，与现有技术相比具有如下优点：
1.直接应用A20基因面临不能稳定整合到基因组，不能有效长期转染，而A20基因的功能与其表达水平直接相关，因而限制了其使用效果，本发明获得的人工锌指转录因子具有核定位和跨膜信号能有效进入细胞内发挥功能，启动内源性的A20基因。
2.使用反义试剂、核糖核酸酶、或RNAi干扰技术能降低mRNA水平，但在mRNA水平进行操作稳定性不强。另一个方法选择性改变基因表达包括直接管理靶基因内源性位点的转录，例如通过突变已存在的起主要作用的等位基因转录因子，可通过设计合成DNA连接分子，聚酰胺或肽核酸预先决定DNA连接的特异性，通过作用这些管理序列的分子，竞争性抑制内源性转录因子从而达到选择性控制基因。但转录因子一般同时控制多个基因表达，不能特异作用于一个基因。而本发明设计的人工锌指转录因子能特异性的作用于靶基因，而不影响其他基因功能。
3.在抑制器官移植排斥反应等疾病治疗方面，现在使用的环孢素A等尽管具有很多的作用，但抑制骨髓等方面副作用也非常大，本发明获取的能特异性控制A20基因表达的人工锌指转录因子，利用生物信息学方法分析，计算机辅助设计及实验筛选，能有效启动A20基因表达，因为A20基因为生理性保护基因，设计合成的新型多肽将能有效避免现在临床正在使用的相关药物的副作用。
4.利用上述的设计合成人工锌指转录因子的方法，也可用来作为控制其他靶基因有效表达的方法。
5、用本发明获得的基于A20为药物靶的人工锌指蛋白转录因能启动或发挥人体内A20功能，因此在器官移植、动脉粥样硬化、心肌肥大、严重炎症损伤等方面具有广泛的应用前景。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
实施例1、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP1为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2 QSGDLRR、SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4Q SGNLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
pTYB11载体是NEB公司开发的一种新型的原核表达载体，含重组表达载体pTYB11-ZFP1的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Western blot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP1以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP1融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP1融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例2、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP2为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2 QSGDLRR、SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE
SEQ ID NO：5 QNSTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP2的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP2以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP2融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP2融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例3、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP3为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2 QSGDLRR、SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE
SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP3的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP3以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP3融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP3融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例4、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP4为以下6条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2 QSGDLRR、SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE
SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR、SEQ ID NO：7 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP4的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的23％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP4以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP4融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP4融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例5、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP5为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE、SEQ ID NO：5 QNSTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP5的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的30％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP5以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP5融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP5融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例6、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP6为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE、SEQ ID NO：5 QNSTLTE
SEQ ID NO：6 DPGHLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP6的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的22％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP6以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP6融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP6融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例7、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP7为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：3 SKKHLAE、SEQ ID NO：4 QSGNLTE、SEQ ID NO：5 QNSTLTE
SEQ ID NO：6 DPGHLVR、SEQ ID NO：7 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP7的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的24％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP7以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP7融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP7融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例8、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP8为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：4 QSGNLTE、SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP8的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP8以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP8融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP8融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例9、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP9为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：4 QSGNLTE、SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR
SEQ ID NO：7 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP9的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的22％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP9以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP9融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP9融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例10、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP10为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：5 QNSTLTE、SEQ ID NO：6 DPGHLVR、SEQ ID NO：7 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP10的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP10以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP10融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP10融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例11、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP11为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR、SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP11的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的32％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP11以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP11融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP11融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例12、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP12为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR、SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER
SEQ ID NO：12 TSGELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP12的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP12以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP12融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP12融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例13、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP13为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR、SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER
SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP13的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的24％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP13以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP13融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP13融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例14、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP14为以下6条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR、SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER
SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE、SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP14的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP14以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP14融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP14融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例15、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP15为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER、SEQ ID NO：12 TSGELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP15的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的32％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP15以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP15融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP15融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例16、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP16为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11Q RAHLER、SEQ ID NO：12 TSGELVR
SEQ ID NO：13 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP16的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP16以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP16融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP16融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例17、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP17为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：10 HTGHLLE、SEQ ID NO：11 QRAHLER、SEQ ID NO：12 TSGELVR、
SEQ ID NO：13 RNDTLTE、SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP17的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP17以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP10融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP17融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。其中ZFP17的核酸序列为上海生工生物公司人工合成。
实施例18、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP18为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：11 QRAHLER、SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP18的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的30％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP18以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP18融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP18融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。其中ZFP18的核酸序列为上海生工生物公司人工合成。
实施例19、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP19为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：11 QRAHLER、SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE
SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP19的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的31％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP19以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP19融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP19融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。其中ZFP19的核酸序列为上海生工生物公司人工合成。
实施例20、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP20为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：12 TSGELVR、SEQ ID NO：13 RNDTLTE、SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为相同的接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP20的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的32％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP20以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP20融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP20融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例21、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP21为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR、SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP21的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的23％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP21以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP21融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP21融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例22、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP22为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR、SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE
SEQ ID NO：19 QSGHLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP22的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP22以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP22融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP22融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例23、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP23为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR、SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE
SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP23的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的26％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP23以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP23融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP23融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例24、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP24为以下6条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR、SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE
SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR、SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP24的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP24以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP24融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP24融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例25、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP25为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE、SEQ ID NO：19 QSGHLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP25的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP25以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP25融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP25融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例26、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP26为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE、SEQ ID NO：19 QSGHLTE
SEQ ID NO：20 DCRDLAR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP26的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP26以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP26融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP26融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例27、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP27为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：17 QLAHLRA、SEQ ID NO：18 SKKHLAE、SEQ ID NO：19 QSGHLTE
SEQ ID NO：20 DCRDLAR、SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP27的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的26％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP27以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP27融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP27融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例28、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP28为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：18 SKKHLAE、SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP28的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP28以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP28融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP28融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例29、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP29为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：18 SKKHLAE、SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR
SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
重组表达载体pTYB11-ZFP29的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的22％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP29以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP29融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP29融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例30、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP30为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：19 QSGHLTE、SEQ ID NO：20 DCRDLAR、SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP30的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP30以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP30融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP30融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例31、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP31为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR、SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP31的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的26％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP31以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP31融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP31融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例32、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP32为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR、SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE
SEQ ID NO：26 TTGNLTV
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP32的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP32以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP32融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP32融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例33、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP33为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR、SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE
SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH
含重组表达载体pTYB11-ZFP33的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的23％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP33以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP33融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP33融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。其中ZFP33的核酸序列为上海生工生物公司人工合成。
实施例34、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP34为以下6条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR、SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE
SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER、SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为相同的接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP34的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的30％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP34以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP34融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP34融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例35、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP35为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE、SEQ ID NO：26 TTGNLTV
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP35的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP35以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP35融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP35融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例36、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP36为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE、SEQ ID NO：26 TTGNLTV
SEQ ID NO：27 QRAHLER
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP36的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP36以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP36融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP36融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例37、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP37为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：24 RSDKLTE、SEQ ID NO：25 SKKHLAE、SEQ ID NO：26 TTGNLTV
SEQ ID NO：27 QRAHLER、SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP37的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的25％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP37以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP37融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP37融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例38、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP38为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：25 SKKHLAE、SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP38的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP38以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP38融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP38融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例39、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP39为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：25 SKKHLAE、SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER
SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP39的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的26％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP39以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP39融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP39融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例40、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP40为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：26 TTGNLTV、SEQ ID NO：27 QRAHLER、SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP40的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP401以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP40融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP40融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例41、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP41为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE、SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP41的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的28％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP41以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP41融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP41融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例42、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP42为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE、SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE
SEQ ID NO：33 DPGHLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP42的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP42以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP42融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP42融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例43、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP43为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE、SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE
SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP43的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP43以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP43融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP43融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例44、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP44为以下6条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE、SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE
SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR、SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP44的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP44以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP44融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP44融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例45、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP45为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE、SEQ ID NO：33 DPGHLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP45的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP45以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP45融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP45融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例46、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP46为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE、SEQ ID NO：33 DPGHLVR
SEQ ID NO：34 RSDDLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP46的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的33％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP46以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP46融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP46融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例47、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP47为以下5条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述5条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：31 RSDDLVR、SEQ ID NO：32 QSGNLTE、SEQ ID NO：33 DPGHLVR
SEQ ID NO：34 RSDDLVR、SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP47的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP47以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP47融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP47融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例48、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP48为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：32 QSGNLTE、SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP48的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的27％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP48以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP48融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP48融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例49、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP49为以下4条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述4条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：32 QSGNLTE、SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR
SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP49的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP49以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP49融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP49融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例50、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域锌指多肽为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽ZFP50为以下3条短肽，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述3条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：33 DPGHLVR、SEQ ID NO：34 RSDDLVR、SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
含重组表达载体pTYB11-ZFP50的表达工程菌RE2566经诱导表达后，对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析。凝胶成像分析结果显示目的蛋白产量占大肠杆菌ER2566总蛋白的29％。Westernblot结果显示，实验组可见明显的印迹，阴性对照组未见印迹反应。说明ZFP50以融合蛋白的形式进行原核表达是成功的。将上述原核表达获取的ZFP50融合蛋白纯化，以SP1作为对照检测其与A20基因启动子区结合情况，EMSA结果显示上述人工设计合成的ZFP50融合蛋白能高效的与A20基因启动子区结合，说明设计合成的蛋白序列具有良好的生物学功能。
实施例1～50中的ZFP1～ZFP50的核酸序列均为上海生工生物公司人工合成。
实施例51、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其功能域为NF-p65或VP64的功能区；其中：所述NF-p65的核酸序列为SEQ ID NO：36；所述所述NF-p65的蛋白序列为SEQ ID NO：37；所述VP64的核酸序列为SEQ ID NO：38；所述VP64的蛋白序列为SEQ ID NO：39。
实施例52、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其跨膜域为9个精氨酸或Tat蛋白(4860)的12个氨基酸；其中9个精氨酸序列为SEQ ID NO：40；Tat蛋白(4860)的12个氨基酸序列为SEQ ID NO：41。
实施例53、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；所述核定位信号的核酸序列为SEQ ID NO：42。
实施例54、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域、功能域、核定位信号及跨膜域之间是通过以下的连接方式连接的：连接顺序如下：跨膜域-核定位信号-结合域-功能域，其中跨膜域前的起始密码子为ATg，各部分之间的连接序列ggaatccatggggtaccg，酶切位点ggatcc和ggcagc，功能域末端的终止密码子为taa。
实施例55、一种能启动体内A20基因表达的人工锌指转录因子蛋白其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其结合域、功能域、核定位信号及跨膜域之间是通过以下的连接方式连接的：连接顺序如下：跨膜域-核定位信号-结合域-功能域，其中跨膜域前的起始密码子为ATg，各部分之间的连接序列ggaatccatggggtaccg，酶切位点ggatcc和ggcagc，功能域末端的终止密码子为taa。按实施例4方法制备与A20基因启动子区特异性结合的锌指多肽结合域ZFP4，按实施例52、53方法制备功能域及跨膜域，按实施例53方法制备核定位信号，按实施例54制备的人工锌指转录因子蛋白核酸序列克隆克隆到pcDNA3.1载体，其序列为SEQ IDNO：43。
实施例56.一种基于A20为药物靶的新型人工锌指转录因子蛋白设计制备，按实施例(1-50)方法制备与A20基因启动子区特异性结合的锌指多肽结合域，按实施例52、53方法制备功能域及跨膜域，按实施例53方法制备核定位信号，按实施例54进行人工锌指转录因子蛋白合成。
将上述方法获得的人工锌指转录因子质粒或病毒载体或活性蛋白分别在内皮细胞、平滑肌细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞作用，用FLAG抗体、A20抗体检测，经western blot确定与对照组相比能高效促进A20靶基因表达而发挥生物学效应。
获得的人工锌指转录因子蛋白导入到内皮细胞，与对照组相比能有效启动内皮细胞A20基因表达，抑制肿瘤坏死因子、内毒素、高血糖、氧化型低密度脂蛋白诱导的细胞凋亡、坏死以及粘附分子的表达。
新型人工锌指转录因子蛋白导入到平滑肌细胞，能有效启动A20基因表达，能有效抑制平滑肌细胞的病理性增殖。
所有人工锌指转录因子以按实施例55制备的人工锌指转录因子蛋白效果最佳。
实施例57.一种基于A20为药物靶的新型人工锌指转录因子蛋白设计制备，按实施例(1-50)方法制备与A20基因启动子区特异性结合的锌指多肽结合域，按实施例52、53方法制备功能域及跨膜域，按实施例53方法制备核定位信号，按实施例54进行人工锌指转录因子蛋白合成。新型人工锌指转录因子蛋白导入到内皮祖细胞，与对照组相比能有效启动内皮祖细胞A20基因表达，抑制肿瘤坏死因子、内毒素、高血糖、氧化型低密度脂蛋白诱导的细胞损伤。所有人工锌指转录因子以实施例55制备的人工锌指转录因子蛋白效果最佳。
实施例58.一种基于A20为药物靶的新型人工锌指转录因子蛋白设计制备，按实施例(1-50)方法制备与A20基因启动子区特异性结合的锌指多肽结合域，按实施例52、53方法制备功能域及跨膜域，按实施例53方法制备核定位信号，按实施例54进行人工锌指转录因子蛋白合成。新型人工锌指转录因子病毒载体作用于移植血管，与对照组相比，人工锌指转录因子病毒载体作用的移植血管可见强的A20基因表达，移植血管3个月后仍保持通畅，未见血栓形成和血管内膜增生，而对照组移植血管3个月全部闭塞，部分移植血管血栓形成，部分可见内膜增生明显，经检测证实为增殖的平滑肌细胞。所有人工锌指转录因子以实施例55制备的人工锌指转录因子蛋白效果最佳。
与本专利申请有关的序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学朱楚洪
<120>能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途
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aggacatatg agaccttcaa gagcatcatg aagaagagtc ctttcagcgg acccaccgac 120
ccccggcctc cacctcgacg cattgctgtg ccttcccgca gctcagcttc tgtccccaag 180
ccagcacccc agccctatcc ctttacgtca tccctgagca ccatcaacta tgatgagttt 240
cccaccatgg tgtttccttc tgggcagatc agccaggcct cggccttggc cccggcccct 300
ccccaagtcc tgccccaggc tccagcccct gcccctgctc cagccatggt atcagctctg 360
gcccaggccc cagcccctgt cccagtccta gccccaggcc ctcctcaggc tgtggcccca 420
cctgccccca agcccaccca ggctggggaa ggaacgctgt cagaggccct gctgcagctg 480
cagtttgatg atgaagacct gggggccttg cttggcaaca gcacagaccc agctgtgttc 540
acagacctgg catccgtcga caactccgag tttcagcagc tgctgaacca gggcatacct 600
gtggcccccc acacaactga gcccatgctg atggagtacc ctgaggctat aactcgccta 660
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cccaatggcc tcctttcagg agatgaagac ttctcctcca ttgcggacat ggacttctca 780
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attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
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ccccaagaag aagaggaagg tgggaatcca tggggtaccg ctcgagccgg gtgaaaaacc 1020
ttacaaatgt ccggaatgtg gtaaaagctt cagtcagagc ggtgatctgc gtcgccacca 1080
gcgcactcac acgggcgaaa aaccgtacaa gtgcccagaa tgtggcaaga gtttcagcag 1140
caagaaacat ctggcggaac atcagcgtac gcataccggt gagaaaccgt acaaatgtcc 1200
tgaatgcggg aaaagcttta gtcagagcgg taatctgacc gaacaccagc gtacccatac 1260
cggcgagaaa ccgtataagt gtccggaatg cggcaagagc tttagccaga acagcacgct 1320
gacggagcac cagcgcaccc atacgggtga aaagccatat aaatgcccgg aatgcggtaa 1380
aagtttcagc gatccgggtc atctggtgcg tcatcagcgt acccacaccg gtgagaagcc 1440
gtataaatgt cccgaatgtg gtaagagttt tagtcgtaat gatacactga cggaacacca 1500
acgcacgcat accggtaaaa agactagtgg atccatggaa ttccagtacc tgccagatac 1560
agacgatcgt caccggattg aggagaaacg taaaaggaca tatgagacct tcaagagcat 1620
catgaagaag agtcctttca gcggacccac cgacccccgg cctccacctc gacgcattgc 1680
tgtgccttcc cgcagctcag cttctgtccc caagccagca ccccagccct atccctttac 1740
gtcatccctg agcaccatca actatgatga gtttcccacc atggtgtttc cttctgggca 1800
gatcagccag gcctcggcct tggccccggc ccctccccaa gtcctgcccc aggctccagc 1860
ccctgcccct gctccagcca tggtatcagc tctggcccag gccccagccc ctgtcccagt 1920
cctagcccca ggccctcctc aggctgtggc cccacctgcc cccaagccca cccaggctgg 1980
ggaaggaacg ctgtcagagg ccctgctgca gctgcagttt gatgatgaag acctgggggc 2040
cttgcttggc aacagcacag acccagctgt gttcacagac ctggcatccg tcgacaactc 2100
cgagtttcag cagctgctga accagggcat acctgtggcc ccccacacaa ctgagcccat 2160
gctgatggag taccctgagg ctataactcg cctagtgaca ggggcccaga ggccccccga 2220
cccagctcct gctccactgg gggccccggg gctccccaat ggcctccttt caggagatga 2280
agacttctcc tccattgcgg acatggactt ctcagccctg ctgagtcaga tcagctccgg 2340
cagcgactac aaggacgacg atgacaagta actcgagtct agctagaggg cccgtttaaa 2400
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2460
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2520
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2580
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2640
tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta 2700
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2760
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2820
ttccccgtca agctctaaat cggggcatcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2880
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2940
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 3000
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgg 3060
ggatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat 3120
tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag gcaggcagaa 3180
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 3240
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc 3300
taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct 3360
gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga 3420
agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta 3480
tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 3540
atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 3600
cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 3660
cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag 3720
cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 3780
ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 3840
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 3900
cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 3960
gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 4020
tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 4080
tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 4140
gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 4200
cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 4260
gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 4320
gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 4380
tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 4440
cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt 4500
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 4560
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 4620
tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 4680
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 4740
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 4800
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 4860
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 4920
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 4980
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 5040
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 5100
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 5160
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 5220
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 5280
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 5340
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 5400
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 5460
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 5520
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 5580
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 5640
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 5700
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 5760
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 5820
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 5880
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 5940
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 6000
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 6060
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 6120
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 6180
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 6240
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 6300
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 6360
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 6420
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 6480
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 6540
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 6600
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 6660
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 6720
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 6780
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc 6823
Claims (6)
1、一种能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，其蛋白结构包括结合域、功能域、核定位信号及跨膜域；其特征是：其结合域为与A20基因启动子区靶序列(18bp)特异性结合的锌指基序多肽，其中：
(1)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：1；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：2QSGDLRR
SEQ ID NO：3SKKHLAE
SEQ ID NO：4QSGNLTE
SEQ ID NO：5QNSTLTE
SEQ ID NO：6DPGHLVR
SEQ ID NO：7RNDTLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(2)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：8；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：9 THLDLIR
SEQ ID NO：10 HTGHLLE
SEQ ID NO：11 QRAHLER
SEQ ID NO：12 TSGELVR
SEQ ID NO：13 RNDTLTE
SEQ ID NO：14 RSDKLTE
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(3)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：15；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：16 RSDNLVR
SEQ ID NO：17 QLAHLRA
SEQ ID NO：18 SKKHLAE
SEQ ID NO：19 QSGHLTE
SEQ ID NO：20 DCRDLAR
SEQ ID NO：21 QSGDLRR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(4)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：22；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：23 DCRDLAR
SEQ ID NO：24 RSDKLTE
SEQ ID NO：25 SKKHLAE
SEQ ID NO：26 TTGNLTV
SEQ ID NO：27 QRAHLER
SEQ ID NO：28 SRRTCRA
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH；
或(5)结合域A20基因启动子区靶序列(18bp)为SEQ ID NO：29；
所述特异性结合的锌指基序多肽为以下6条短肽中的3～6条，通过TGEKP连接构成融合多肽，该融合多肽的N-端氨基酸序列为LEPGEKP-，C-端为TGKKTS：所述6条短肽的锌指基序按排列的顺序为：
SEQ ID NO：30 ERSHLRE
SEQ ID NO：31 RSDDLVR
SEQ ID NO：32 QSGNLTE
SEQ ID NO：33 DPGHLVR
SEQ ID NO：34 RSDDLVR
SEQ ID NO：35 RSDELVR
上述锌指基序N-端序列为相同的接头，设定为YKCPECGKSFS-，C-端为接头HQRTH。
2、根据权利要求1所述的能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，其特征是：其功能域为NF-p65或VP64的功能区；其中：所述NF-p65的核酸序列为SEQ ID NO：36；所述所述NF-p65的蛋白序列为SEQ ID NO：37；所述VP64的核酸序列为SEQ ID NO：38；所述VP64的蛋白序列为SEQ ID NO：39。
3、根据权利要求1所述的能启动体内A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，其特征是：其跨膜域为9个精氨酸或Tat蛋白(48 60)的12个氨基酸；其中9个精氨酸序列为SEQ ID NO：40；Tat蛋白(48 60)的12个氨基酸序列为SEQ ID NO：41。
4、根据权利要求1所述的能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，其特征是：所述核定位信号的核酸序列为SEQ ID NO：42。
5、根据权利要求1所述的能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子，其特征是：结合域、功能域、核定位信号及跨膜域之间是通过以下的连接方式连接的：连接顺序如下：跨膜域-核定位信号-结合域-功能域，其中跨膜域前的起始密码子为ATg，各部分之间的连接序列ggaatccatggggtaccg，酶切位点ggatcc和ggcagc，功能域末端的终止密码子为taa。
6、权利要求1所述的能启动A20基因表达的人工锌指蛋白转录因子在制备能启动或发挥人A20功能的药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200810069331 CN101333251A (zh) | 2008-01-30 | 2008-01-30 | 能启动a20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200810069331 CN101333251A (zh) | 2008-01-30 | 2008-01-30 | 能启动a20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101333251A true CN101333251A (zh) | 2008-12-31 |
Family
ID=40196159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200810069331 Pending CN101333251A (zh) | 2008-01-30 | 2008-01-30 | 能启动a20基因表达的人工锌指蛋白转录因子及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101333251A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140296129A1 (en) * | 2011-10-11 | 2014-10-02 | Aliophtha Ag | Regulation of receptor expression through delivery of artificial transcription factors |
| CN106380522A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-08 | 无锡市人民医院 | 特异性抑制stat3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用 |
-
2008
- 2008-01-30 CN CN 200810069331 patent/CN101333251A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140296129A1 (en) * | 2011-10-11 | 2014-10-02 | Aliophtha Ag | Regulation of receptor expression through delivery of artificial transcription factors |
| CN106380522A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-08 | 无锡市人民医院 | 特异性抑制stat3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用 |
| CN106380522B (zh) * | 2016-08-30 | 2018-04-17 | 无锡市人民医院 | 特异性抑制stat3活性的真核重组蛋白及其制备方法和应用 |
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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