JP2016515596A - Opa1ハプロ不全に起因する疾患の治療のための人工転写因子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合したOPA1プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質(polydactyl zinc finger protein)を含む人工転写因子に関する。OPA1プロモーターに対して指向される人工転写因子は、常染色体優性視神経萎縮症、症候性常染色体優性視神経萎縮プラス(syndromic autosomal dominant optic atrophy plus)、および正常眼圧緑内障などのOPA1ハプロ不全に伴う疾患の治療に有用である。
Description
本発明は、活性化ドメインおよび核局在化配列と融合したOPA1遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質(複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質)(polydactyl zinc finger protein)を含む、人工転写因子、ならびにハプロ不全に繋がるOPA1での変異に起因する常染色体優性視神経萎縮症(ADOA)または症候性ADOAプラス(syndromic ADOA plus)などの疾患の治療におけるその使用に関する。
人工転写因子(ATF)が、遺伝子発現の調節に有用なツールであるとして提案されている(Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526)。遺伝子転写の抑制または活性化のいずれかを通して遺伝子発現に影響を与える多くの天然転写因子は、特定のDNA配列を認識するための複雑な特異的ドメインを持っている。このために、その特異性および(1もしくは複数の)標的遺伝子を改変することを意図する場合、それらは、操作の対象として魅力的なものとならない。しかし、転写因子の特定のクラスは、いくつかのいわゆるジンクフィンガー(ZF)ドメインを含有しており、それは、モジュラー構造であることから、遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、ほとんど独立して3つのDNA塩基対を標的とする短鎖(30アミノ酸)DNA結合モチーフである。そのようないくつかのジンクフィンガーを一緒に融合して含有するタンパク質は、従って、より長いDNA配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質(ZFP)は、全ヒトゲノムの中でほとんど唯一である18塩基対(bp)DNA標的を認識する。最初は、完全に状況非依存的(context independent)であると考えられていたが、より詳細な分析により、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性(context specificity)が明らかとなった(Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231)。ジンクフィンガー認識表面の特定のアミノ酸を変異させてZFモジュールの結合特異性を変化させることにより、5’−GNN−3’、5’−CNN−3’、5’−ANN−3’コドンのほとんど、およびいくつかの5’−TNN−3’コドンに対する確定されたZF構成要素が得られた(いわゆるBarbasモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597参照)。人工転写因子に関する初期の研究は、予め選択されたジンクフィンガーを既知の3bp標的配列と組み合わせることに基づく合理的な設計に集中していたが、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性が認識されたことで、細菌もしくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、区画化リボソームディスプレイ(compartmentalized ribosome display)、またはFACS分析を用いた生体内選別などの高度な方法を用いて情報が得られる大規模ジンクフィンガーライブラリーの作製が必要となった。
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いることで、ヒトゲノムのDNA座位を、高い特異性で標的とすることができる。従って、このようなジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性を持つタンパク質ドメインを特定のプロモーター配列へ運搬し、その結果として目的の遺伝子の発現を調節するための理想的なツールである。遺伝子転写の活性化に適するドメインは、単純ヘルペスウィルスVP16(配列番号1)またはVP64(VP16の四量体リピート、配列番号2)ドメインである(Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633)。転写活性化を付与すると考えられるさらなるドメインは、CJ7(配列番号3)、p65−TA1(配列番号4)、SAD(配列番号5)、NF−1(配列番号6)、AP−2(配列番号7)、SP1−A(配列番号8)、SP1−B(配列番号9)、Oct−1(配列番号10)、Oct−2(配列番号11)、Oct−2_5x(配列番号12)、MTF−1(配列番号13)、BTEB−2(配列番号14)、およびLKLF(配列番号15)である。加えて、ジーンオントロジーGO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgibin/amigo/term_details?term=GO:0001071)によって定められるタンパク質の転写活性ドメインは、標的タンパク質の転写制御を達成するものと考えられる。
小分子薬物は、特定の特徴の高い保存性のために、あるタンパク質ファミリーの特定のメンバーを必ずしも選択的に標的とすることはできないが、生物学的製剤は、抗体をベースとする新規薬物で示されるように、強い特異性を提供する。しかし、現在のところ、実質的にすべての生物学的製剤は、細胞外で作用する。特に、上述した人工転写因子は、治療的に有用な方法で遺伝子転写に影響を与えるのに適している。しかし、そのような因子を作用部位である核へ送達することは容易には達成されず、このため、治療人工転写因子による手法の有用性が、例えば免疫原性および細胞トランスフォーメーションの可能性などのこの方法のすべての欠点を持つレトロウィルスによる送達に依存することによって妨げられる(Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091)。
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン(PTD)は、細胞膜を通してのサイトゾル/核細胞質へのタンパク質の転位を促進することが示された。HIV誘導TATペプチド(配列番号16)などの短鎖ペプチドは、細胞型に依存しないカーゴタンパク質のマクロ飲作用による取り込みを誘発することが示された(Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315)。サイトゾルに到達後、そのような融合タンパク質は、生物学的活性を有することが示された。興味深いことに、ミスフォールドタンパク質であっても、恐らくは細胞内シャペロンの作用により、タンパク質形質導入後に機能性となることができる。
遺伝子変異は、多くの遺伝性障害の主因である。一般的に、そのような変異は、その遺伝のモードに関して優性または劣性に分類することができ、優性変異は、母性または父性であってよい一方のみの遺伝子コピーが影響を受けた場合であっても、疾患表現型を引き起こすことができるものであり、一方劣性変異の場合、疾患を引き起こすには、母性および父性の両方の遺伝子コピーが変異される必要がある。優性変異が疾患を引き起こすことができるのは、ドミナントネガティブ型作用またはハプロ不全という、2つの一般的機構のうちの1つによる。ドミナントネガティブ変異の場合、遺伝子産物は、毒性であり、疾患表現型を引き起こす新しい異常な機能を獲得する。例えば、多量体タンパク質複合体のサブユニットであり、それは、変異によって、前記タンパク質複合体の適切な機能を阻害する。優性遺伝によって遺伝する疾患はまた、ハプロ不全によっても発生可能であり、この場合、疾患を引き起こす変異は、影響を受けた遺伝子を不活性化し、それによって有効遺伝子数を低下させる。このような状況下では、二番目の完全な遺伝子コピーは、正常な機能のための充分な遺伝子産物を提供することができない。約12000のヒト遺伝子がハプロ不全であると推定されており(Huang et al., 2010, PLoS Genet. 6(10), e1001154)、そのうち約300の遺伝子が、疾患に関連していることが知られている。
神経生存は、ミトコンドリア機能に決定的に依存し、ミトコンドリア機能不全は、多くの神経変性障害の主因である(Karbowski M., Neutzner A., 2012, Acta Neuropathol 123(2), 157-71)。ATPの形態でエネルギーを提供するというその必須機能に加えて、ミトコンドリアは、カルシウム緩衝作用、多様な異化さらには代謝のプロセス、およびプログラム細胞死にも決定的に関与している。ミトコンドリアのこの重要な機能は、ミトコンドリアを維持するために、ならびにミトコンドリア機能不全およびそれに続く細胞死を防ぐために、多くの細胞機構に反映されている(Neutzner A. et al., 2012, Semin Cell Dev Biol 23, 499-508)。これらのプロセスの中でも中心的な役割は、バランスの取れたミトコンドリア形態で動的ミトコンドリアネットワークを維持することである。これは、Drp1、Fis1、Mff、MiD49、およびMiD51の場合はミトコンドリアの分裂を、またはMfn1、Mfn2、およびOPA1の場合はミトコンドリア細管(mitochondrial tubules)の融合を促進するいわゆるミトコンドリアモルフォゲンによって達成される。ミトコンドリア融合の喪失は、ATP産生の喪失を促進することが知られており、神経変性障害に伴う神経細胞死にこのプロセスを繋げるアポトーシス刺激に対して細胞を感受性とすることから、ミトコンドリア形態のバランスを取ることは不可欠である。
ミトコンドリア融合のプロセスにおける重要なプレーヤーは、視神経萎縮1またはOPA1である。OPA1は、OPA1遺伝子によってコードされ、ミトコンドリア融合に必須である大型のGTPアーゼである。加えて、OPA1は、構成要素であるクリステとしてのミトコンドリアの内部構造の維持において重要な役割を担っている。OPA1の遺伝子発現の下方制御が、融合の喪失に起因するミトコンドリア断片化を引き起こし、細胞をアポトーシス刺激に対して感受性とすることが示された。OPA1の変異は、ケジェール視神経症(Kjer's optic neuropathy)または常染色体優性視神経萎縮症(ADOA)の約70%の原因であることが識別された。ほとんどの集団において、ADOAの罹患率は、1/10000から3/100000であり、幼児期の初期から開始してゆっくり進行する視力の低下を特徴とする。視力障害は、緩やかなものから法律上の失明までの範囲にわたり、不可逆的であり、網膜神経節細胞(RGC)のゆっくりした変性に起因する。ほとんどの場合、ADOAは非症候性であるが、患者のうちの15%は、感音難聴などの眼球外の神経筋症状を起こす。現時点まで、この疾患の実行可能な治療法は存在しない。興味深いことに、特定のOPA1対立遺伝子は、高眼圧ではなく正常眼圧緑内障と関連付けられており、ここでも、正常なミトコンドリア生理機能を維持するためのOPA1の重要性が強調される。
本発明は、活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合した、OPA1プロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合したOPA1プロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、OPA1遺伝子の発現の増加における、およびOPA1遺伝子産物の産生の向上のためのそのような人工転写因子の使用にも関する。
さらに、本発明は、低OPA1レベルによって引き起こされる、または修飾される疾患の治療における、特には、ADOAおよびADOAプラスなどの眼疾患の治療に用いるためのそのような人工転写因子の使用に関する。同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、低OPA1レベルによって影響を受ける疾患の治療方法に関する。
本発明は、活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列(NLS)、および所望に応じてタンパク質形質導入ドメイン(PTD)と融合したOPA1プロモーター(配列番号17)を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質(ZFP)を含む人工転写因子(ATF)、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する(図1)。
本発明の文脈において、プロモーターは、遺伝子の制御領域として定義される。この定義は、本技術分野における一般的定義に対応する。やはり本発明の文脈において、ハプロ不全プロモーターは、ゲノム中に2つの機能的遺伝子コピーが存在する場合にのみ、あらゆる状況下ですべての細胞型において充分な遺伝子産物の産生を引き起こすことができるプロモーターとして定義される。従って、ハプロ不全遺伝子の1つの遺伝子コピーの変異は、一部のまたはすべての生理学的状況下で、生物の一部のまたはすべての細胞において不充分な遺伝子産物の産生を引き起こす。本発明の文脈において、遺伝子は、制御配列、さらにはタンパク質またはRNAの産生をもたらす遺伝子産物のための配列を含有するゲノム領域として定義される。この定義もやはり、本技術分野における一般的定義に対応する。
人工転写因子のタンパク質形質導入ドメインの媒介による細胞内送達は、病態生理学的に該当する分子を標的とする生物学的製剤の高い選択性を新規な様式で利用する新しい方法である。ADOAまたはADOAプラスなどOPA1のハプロ不全によって引き起こされる疾患の場合、不充分な遺伝子発現がそのような障害の根本原因であることから、小分子薬物を例とする現行の手法を用いた治療は考えられない。しかし、人工転写因子技術を、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)の形態の高度な薬物標的化と組み合わせることで、活性化人工転写因子を輸送し、残りの機能性遺伝子コピーの転写を高めて両方の遺伝子コピーが機能性であれば到達されることになるレベルとすることによって、OPA1のハプロ不全を分子レベルで直接扱うことができる。
考慮されるタンパク質形質導入ドメインは、HIV TAT、ペプチドmT02(配列番号18)、ペプチドmT03(配列番号19)、R9ペプチド(配列番号20)、ANTPドメイン(配列番号21)、または細胞膜を通してカーゴを輸送することができるその他のペプチドである。
さらに、免疫原性を低下させるために、本発明の人工転写因子をポリエチレングリコールで修飾することも考慮される。加えて、本発明の人工転写因子を眼および脳などの免疫特権器官に適用することは、いずれの免疫反応をも回避し、人工転写因子に対する全身寛容を誘導する。免疫特権器官以外での慢性疾患の治療の場合、予め眼内注射を行うことによる免疫寛容の誘導が考慮される。
優性視神経萎縮症は、ハプロ不全に繋がるOPA1遺伝子の変異によって引き起こされる。優性視神経萎縮症の患者は、視神経を形成する網膜神経節細胞の進行的な喪失に起因して、最終的には失明をもたらす進行的な視力喪失を患う。興味深いことに、ほとんどの優性視神経萎縮症患者は、眼球外の症状を提示しない。患者のうちの小さいサブセットのみが、痙性対麻痺および難聴などのさらなる眼球外神経症状を示すいわゆる優性視神経萎縮症プラスの表現型に罹患する。OPA1は、ミトコンドリア内部のクリステの構造を安定化すること、およびミトコンドリア細管同士の融合を促進することにより、構造的レベルでのミトコンドリア機能の維持に関与している。ミトコンドリアは、ATPの形態での細胞エネルギーの主たる生産者であることから、OPA1は、細胞エネルギーレベルを維持するために必要である。OPA1機能の喪失は、アポトーシス機構を介する細胞死を促進することが知られている。ヒトの身体のほとんどすべての細胞において、ミトコンドリア機能を充分なレベルに維持するための充分なOPA1タンパク質を産生するには、OPA1遺伝子の1つの機能性コピーで充分である。しかし、特にエネルギーを必要とする網膜神経節細胞は、そのミトコンドリアの状態に関して特別な必要性を有しているため、1つのOPA1遺伝子コピーでは産生することのできないOPA1のレベルに依存しており、このため、ハプロ不全OPA1変異は、網膜神経節細胞死を伴い、視力喪失および失明をもたらす結果となる。本発明の人工転写因子を用いることにより、残った機能性OPA1遺伝子からのOPA1タンパク質の産生を正常レベル以上にまで高めることによって、網膜神経節細胞中のOPA1タンパク質レベルを上昇させることができ、それによって、ミトコンドリア機能が回復され、網膜神経節細胞死および付随する視力喪失が予防される。
OPA1のハプロ不全は、理論的には、ウィルス導入によって変異OPA1遺伝子の追加の機能性コピーを供給し、それによって遺伝子量を増加させることを通して、従来の遺伝子療法の手法によって治療することが可能である。しかし、遺伝子療法において安全であると考えられている現在利用可能なウィルスベクターは、約5から8キロ塩基よりも大きい遺伝子を輸送することができない。いくつかの遺伝子の場合はこれで充分であるが、OPA1遺伝子は、8キロ塩基よりも大きいと考えられ、従って、現在利用可能なベクターを用いた遺伝子療法の候補ではない。加えて、遺伝子発現の厳密な制御は、送達された遺伝子の甚だしい過剰発現およびそれに伴う毒性副作用の可能性を持つ遺伝子療法を用いては達成されない。
ウィルス導入のこの制限は、本発明の人工転写因子には適用されない。ハプロ不全遺伝子のサイズは、本発明で述べる治療手法にとって無関係であり(図1)、最も大きな遺伝子であっても、人工転写因子による調節の対象となる。加えて、本発明の人工転写因子によって遺伝子発現が増加される度合いは、状況に応じた人工転写因子の投与によって、または転写調節という意味での活性がより高いもしくは低い代替的な活性化ドメインの使用によって調節される。加えて、OPA1 mRNAは、広範な選択的スプライシングを受けることによって、複数のOPA1アイソフォームの産生を引き起こし、それらはすべて、OPA1がその機能を実行するために必要である。特に、種々のOPA1アイソフォームの異なるタンパク質プロセッシングは、OPA1がその機能を実行するために必須である機構上の必要条件である。
機能性遺伝子コピーにおけるOPA1 mRNA産生を増加させるために本発明の人工転写因子のウィルス送達を用いることによって、この必須プロセスを起こすことができ、それによって、OPA1ハプロ不全に起因する疾患の機能的治癒が提供される。
治療剤のためのプールとして従来から用いられる小分子のクラスは、遺伝子発現の標的化調節に適さない。従って、多くの有望な薬物標的および関連する疾患は、従来の医薬的手法の対象とならない。対照的に、本発明の人工転写因子はすべて、高度に確定された全体組成を有する同じ物質クラスに属している。2つの非常に多様なプロモーター配列を標的とする2つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子は、それでも、少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を持ち、全体として類似する三次構造であり、迅速かつ経済的に、標準化された方法(以下で述べるように)を介して作製することができる。従って、本発明の人工転写因子は、1つの分子クラスにおいて、非常に広く多様な一式の標的に対する極めて高い特異性と、類似する全体組成とを併せ持つものである。加えて、本発明の人工転写因子の薬物への製剤は、過去の経験に頼ることが可能であり、それによって創薬プロセスがさらに加速される。
本発明はまた、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質がOPA1プロモーター領域を特異的に標的としているOPA1のハプロ不全に繋がるOPA1における変異によって引き起こされる疾患の治療における、そのような人工転写因子の使用にも関する。同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患を治療する方法に関し、ここで、治療されるべき疾患は、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質がOPA1プロモーターを特異的に標的とし、OPA1遺伝子のハプロ不全によって引き起こされる。
考慮されるポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質である。「四量体」、「五量体」、「六量体」、「七量体」、および「八量体」は、ジンクフィンガータンパク質が、それぞれ、4、5、6、7、および8個の部分タンパク質構造から成ることを意味しており、その各々は、特定のヌクレオチドトリプレットに対する結合特異性を有する。好ましくは、人工転写因子は、六量体ジンクフィンガータンパク質を含む。
OPA1プロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子がOPA1遺伝子発現を生体内で調節するためには、OPA1遺伝子のゲノム状況(genomic context)におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、DNA標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体DNAがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍(−1000から+200bp)は、内在性転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することにより、生体内での所望される機能を有する人工転写因子を良好に作製することが可能となる。
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子がOPA1遺伝子発現を生体内で調節するためには、OPA1遺伝子のゲノム状況(genomic context)におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、DNA標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体DNAがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍(−1000から+200bp)は、内在性転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することにより、生体内での所望される機能を有する人工転写因子を良好に作製することが可能となる。
ヒトOPA1遺伝子プロモーター内の標的部位選択
ヒトOPA1オープンリーディングフレーム(図2)の開始コドンの1000bp上流の領域を、(G/C/ANN)6の一般組成を有する潜在的18bp標的部位の存在について分析し、ここで、Gはヌクレオチドのグアニンであり、Cはヌクレオチドのシトシン、Aはヌクレオチドのアデニン、ならびにNは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表す。4つの標的部位、OPA_TS1(配列番号22)、OPA_TS2(配列番号23)、OPA_TS3(配列番号24)、およびOPA_TS4(配列番号25)を選択した。
ヒトOPA1オープンリーディングフレーム(図2)の開始コドンの1000bp上流の領域を、(G/C/ANN)6の一般組成を有する潜在的18bp標的部位の存在について分析し、ここで、Gはヌクレオチドのグアニンであり、Cはヌクレオチドのシトシン、Aはヌクレオチドのアデニン、ならびにNは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表す。4つの標的部位、OPA_TS1(配列番号22)、OPA_TS2(配列番号23)、OPA_TS3(配列番号24)、およびOPA_TS4(配列番号25)を選択した。
OPA1遺伝子プロモーターを標的とする形質導入可能人工転写因子
具体的な六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いたいわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から成るか、または酵母ワンハイブリッド技術を用いてジンクフィンガータンパク質ライブラリーから選択した。OPA1遺伝子プロモーターを標的とする活性化形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP_OPA1_1(配列番号26)、ZFP_OPA1_2(配列番号27)、ZFP_OPA1_3(配列番号28)、ZFP_OPA1_4(配列番号29)、ZFP_OPA1_5(配列番号30)、ZFP_OPA1_6(配列番号31)、ZFP_OPA1_7(配列番号32)、ZFP_OPA1_8(配列番号33)、ZFP_OPA1_9(配列番号34)、ZFP_OPA1_10(配列番号35)、ZFP_OPA1_11(配列番号36)、ZFP_OPA1_12(配列番号37)、ZFP_OPA1_13(配列番号38)、ZFP_OPA1_14(配列番号39)、ZFP_OPA1_15(配列番号40)、ZFP_OPA1_16(配列番号41)、ZFP_OPA1_17(配列番号42)、およびZFP_OPA1_18(配列番号43)を、転写活性化ドメインVP64と融合して、NLSおよび3× mycエピトープタグも含有する人工転写因子OPA_akt1(配列番号44)、OPA_akt2(配列番号45)、OPA_akt3(配列番号46)、OPA_akt4(配列番号47)、OPA_akt5(配列番号48)、OPA_akt6(配列番号49)、OPA_akt7(配列番号50)、OPA_akt8(配列番号51)、OPA_akt9(配列番号52)、OPA_akt10(配列番号53)、OPA_akt11(配列番号54)、OPA_akt12(配列番号55)、OPA_akt13(配列番号56)、OPA_akt14(配列番号57)、OPA_akt15(配列番号58)、OPA_akt16(配列番号59)、OPA_akt17(配列番号60)、およびOPA_akt18(配列番号61)を得た。
具体的な六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いたいわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から成るか、または酵母ワンハイブリッド技術を用いてジンクフィンガータンパク質ライブラリーから選択した。OPA1遺伝子プロモーターを標的とする活性化形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP_OPA1_1(配列番号26)、ZFP_OPA1_2(配列番号27)、ZFP_OPA1_3(配列番号28)、ZFP_OPA1_4(配列番号29)、ZFP_OPA1_5(配列番号30)、ZFP_OPA1_6(配列番号31)、ZFP_OPA1_7(配列番号32)、ZFP_OPA1_8(配列番号33)、ZFP_OPA1_9(配列番号34)、ZFP_OPA1_10(配列番号35)、ZFP_OPA1_11(配列番号36)、ZFP_OPA1_12(配列番号37)、ZFP_OPA1_13(配列番号38)、ZFP_OPA1_14(配列番号39)、ZFP_OPA1_15(配列番号40)、ZFP_OPA1_16(配列番号41)、ZFP_OPA1_17(配列番号42)、およびZFP_OPA1_18(配列番号43)を、転写活性化ドメインVP64と融合して、NLSおよび3× mycエピトープタグも含有する人工転写因子OPA_akt1(配列番号44)、OPA_akt2(配列番号45)、OPA_akt3(配列番号46)、OPA_akt4(配列番号47)、OPA_akt5(配列番号48)、OPA_akt6(配列番号49)、OPA_akt7(配列番号50)、OPA_akt8(配列番号51)、OPA_akt9(配列番号52)、OPA_akt10(配列番号53)、OPA_akt11(配列番号54)、OPA_akt12(配列番号55)、OPA_akt13(配列番号56)、OPA_akt14(配列番号57)、OPA_akt15(配列番号58)、OPA_akt16(配列番号59)、OPA_akt17(配列番号60)、およびOPA_akt18(配列番号61)を得た。
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、OPA1プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または寛容性改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
本発明に従うOPA1プロモーターを標的とする人工転写因子はまた、配列番号26および43で開示されるジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質も含み、ここで、個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換される。
本発明の人工転写因子はまた、ジーンオントロジーGO:0001071によって定められる遺伝子転写を増加させることのできるその他のタンパク質ドメインも含有してよく、VP16、VP64(VP16の四量体リピート)、CJ7、p65−TA1、SAD、NF−1、AP−2、SP1−A、SP1−B、Oct−1、Oct−2、Oct−2_5x、MTF−1、BTEB−2、LKLFなどであり、VP64またはAP−2が好ましい。
さらに、本発明の人工転写因子は、核局在化配列(NLS)を含む。考慮される核局在化配列は、ジーンオントロジーGO:0008139によって定められるタンパク質との結合を通して核内移行を付与するアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基(K)、続いてリジン(K)またはアルギニン残基(R)、続いて任意のアミノ酸(X)、続いてリジンまたはアルギニン残基を含有する塩基性アミノ酸のクラスター(K−K/R−X−K/Rコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492)、またはSV40 NLS(配列番号62)であり、SV40 NLSが好ましい。
OPA1遺伝子のプロモーター領域に指向されるが、タンパク質形質導入ドメインを持たない人工転写因子も、本発明の主題である。それらは、上記で定められる本発明の人工転写因子のための中間体であるか、またはそのまま用いられてもよい。
トランスフェクションによって、またはヘルペスウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス系のベクターなどのウィルスベクターを介して導入される核酸の形態としての、本発明の人工転写因子のための別の選択肢としての送達方法も考慮される。
本発明の人工転写因子のドメインは、短鎖フレキシブルリンカー(short flexible linkers)で連結されていてよい。短鎖フレキシブルリンカーは、2から8個のアミノ酸を有し、好ましくは、グリシンおよびセリンである。考慮される特定のリンカーは、GGSGGS(配列番号63)である。人工転写因子はさらに、その検出および処理を容易とするために、マーカーを含有してもよい。
OPA1プロモーターを標的とする人工転写因子による処理後におけるOPA1上方制御およびミトコンドリア活性改善の評価
OPA1プロモーター特異的人工転写因子で処理したHeLa細胞が、バッファーコントロールで処理した細胞と比較され、OPA1のタンパク質レベルが、特異的抗OPA1抗体を用いた定量的赤外−蛍光ウェスタンブロットによって評価される。OPA1タンパク質レベルの増加は、人工転写因子での処理後にOPA1の産生が増加したことを示す。OPA1特異的人工転写因子での処理の有益な効果を測定するために、ミトコンドリアの忠実性(mitochondrial fidelity)および細胞生存率が評価されている。このために、OPA1特異的人工転写因子で処理した細胞が、ミトコンドリアの毒ロテノンによる処理を通して引き起こされる酸化的傷害後のミトコンドリア反応性酸素産生に関して、コントロール処理細胞と比較される。ミトコンドリア反応性酸素産生は、フローサイトメトリーおよび活性酸素特異的染料MitoSoxを用いて測定される。加えて、ミトコンドリア健全性のパラメーターとしてのミトコンドリア膜電位が、電位感受性TMRE蛍光のフローサイトメトリー検出によって測定される。コントロール細胞と比較した人工転写因子処理細胞における反応性酸素種産生の低下、またはミトコンドリア膜電位の上昇は、OPA1標的化人工転写因子の有益な活性を示すものである。さらに、OPA1標的化人工転写因子で処理した細胞またはコントロール処理細胞のスタウロスポリン、ロテノン、およびアクチノマイシンDによるアポトーシス誘導に対する感受性も測定される。このために、アポトーシス細胞死の指標としてのチトクロムcの放出が、処理細胞の蛍光顕微鏡観察を用いて測定され、コントロール細胞と比較される。
OPA1プロモーター特異的人工転写因子で処理したHeLa細胞が、バッファーコントロールで処理した細胞と比較され、OPA1のタンパク質レベルが、特異的抗OPA1抗体を用いた定量的赤外−蛍光ウェスタンブロットによって評価される。OPA1タンパク質レベルの増加は、人工転写因子での処理後にOPA1の産生が増加したことを示す。OPA1特異的人工転写因子での処理の有益な効果を測定するために、ミトコンドリアの忠実性(mitochondrial fidelity)および細胞生存率が評価されている。このために、OPA1特異的人工転写因子で処理した細胞が、ミトコンドリアの毒ロテノンによる処理を通して引き起こされる酸化的傷害後のミトコンドリア反応性酸素産生に関して、コントロール処理細胞と比較される。ミトコンドリア反応性酸素産生は、フローサイトメトリーおよび活性酸素特異的染料MitoSoxを用いて測定される。加えて、ミトコンドリア健全性のパラメーターとしてのミトコンドリア膜電位が、電位感受性TMRE蛍光のフローサイトメトリー検出によって測定される。コントロール細胞と比較した人工転写因子処理細胞における反応性酸素種産生の低下、またはミトコンドリア膜電位の上昇は、OPA1標的化人工転写因子の有益な活性を示すものである。さらに、OPA1標的化人工転写因子で処理した細胞またはコントロール処理細胞のスタウロスポリン、ロテノン、およびアクチノマイシンDによるアポトーシス誘導に対する感受性も測定される。このために、アポトーシス細胞死の指標としてのチトクロムcの放出が、処理細胞の蛍光顕微鏡観察を用いて測定され、コントロール細胞と比較される。
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合(PEG化)が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが1から40キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、亜鉛配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、その亜鉛配位に起因してPEG化のためにアクセス可能ではなく、従って、1もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたPEG化のための遊離チオール基が提供される。
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合(PEG化)が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが1から40キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、亜鉛配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、その亜鉛配位に起因してPEG化のためにアクセス可能ではなく、従って、1もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたPEG化のための遊離チオール基が提供される。
医薬組成物
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与、特に点眼剤を例とする経眼局所投与、または硝子体内、結膜下、テノン嚢下(parabulbar)、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、テノン嚢下、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬理学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、徐放性製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与、特に点眼剤を例とする経眼局所投与、または硝子体内、結膜下、テノン嚢下(parabulbar)、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、テノン嚢下、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬理学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、徐放性製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。
さらに、経口送達に有用である医薬組成物、特に、適切にカプセル化された活性成分を含む組成物、またはそれ以外で胃での分解に対して保護された組成物も考慮される。例えば、そのような医薬組成物は、膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含有してよく、腸溶コーティングで覆われてもよい。
医薬組成物は、およそ1%からおよそ95%の活性成分を含む。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で作製され、例えば、従来の混合、溶解、または凍結乾燥プロセスである。
活性成分の溶液の使用、ならびに懸濁液または分散液、特には等張性水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましく、これらは、例えば、活性成分を単独で、またはマンニトールを例とするキャリアと共に含む凍結乾燥組成物の場合、使用前に作製されてよい。医薬組成物は、滅菌されてよく、ならびに/または保存剤、安定化剤、湿潤剤および/もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧制御のための塩、および/もしくはバッファーを例とする賦形剤を含んでよく、例えば従来の溶解および凍結乾燥プロセスによるなど、それ自体公知である方法で作製される。前記溶液または懸濁液は、典型的にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、もしくはゼラチンである増粘剤、またはTween 80(商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタン モノオレエート)を例とする可溶化剤も含んでよい。
油中の懸濁液は、油成分として、注射目的として慣習的である植物油、合成油、または半合成油を含む。それに関して、8から22個、特には12から22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含有する液体脂肪酸エステルが特に言及されてよい。このような脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大で6個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコールであり、特には、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油が特に有用である。
注射用製剤の製造は、通常、滅菌条件下で行われ、例えばアンプルまたはバイアルへの充填、および容器のシールも同様である。
非経口投与の場合、水溶性形態、例えば水溶性塩である活性成分の水溶液、または、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/もしくはデキストランを例とする増粘剤、ならびに所望される場合は安定化剤を含有する水性注射用懸濁液が特に適している。活性成分は、所望に応じて賦形剤と一緒に、凍結乾燥剤の形態であってもよく、非経口投与の前に、適切な溶媒を添加することによって溶液とされてもよい。
吸入用組成物は、スプレー、ミストとしてのエアロゾルの形態で、または液滴の形態で投与されてよい。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネビュライザーで、すなわち、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを例とする適切な噴射剤を用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された医薬の短い噴出の形態で気道または肺へ特定量の医薬を送達する装置で送達することができる溶液または懸濁液から作製される。また、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースと共に、吸入用粉末スプレーを提供することも可能である。
点眼剤は、好ましくは、組成物を涙液と等張性(295〜305mOsm/L)とする適切な剤を含む活性成分の等張性水溶液である。考慮される剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに、組成物は、pHを5から8、好ましくは7.0から7.4に維持するために、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはTrisバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン)を例とするバッファーも含む。組成物はさらに、パラベン、塩化ベンザルコニウムなどの四級アンモニウム塩、ポリヘキサメチレンビグアニジン(PHMB)などを例とする抗微生物保存剤を含有してよい。点眼剤はさらに、ゲル様点眼剤を作製するためにキサンタンガムを、および/またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、もしくはポリビニルピロリドンなどのその他の増粘剤を含有してもよい。
治療方法における人工転写因子の使用
さらに、本発明は、OPA1産生の増加に使用するための、およびOPA1によって影響を受ける疾患の治療に用いるための、特に、そのような眼疾患の治療に用いるための、上述したOPA1プロモーターに指向される人工転写因子に関する。OPA1によって調節される疾患は、常染色体優性視神経萎縮症、常染色体優性視神経萎縮症プラス、ならびに正常眼圧緑内障である。
さらに、本発明は、OPA1産生の増加に使用するための、およびOPA1によって影響を受ける疾患の治療に用いるための、特に、そのような眼疾患の治療に用いるための、上述したOPA1プロモーターに指向される人工転写因子に関する。OPA1によって調節される疾患は、常染色体優性視神経萎縮症、常染色体優性視神経萎縮症プラス、ならびに正常眼圧緑内障である。
同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、OPA1によって影響を受ける疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、正常眼圧緑内障または優性視神経萎縮症と関連する神経変性を治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療されるべき特定の疾患の種類に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。眼への投与の場合、月1回の0.5から1mgの硝子体内注射が好ましい。全身投与の場合、月1回の10mg/kgの注射が好ましい。加えて、眼の硝子体内に徐放性デポジット剤(slow release deposits)を埋め込むことも好ましい。
人工転写因子の動物での使用
さらに、本発明は、遺伝子産物産生を高めるための、動物のOPA1プロモーターを標的とする人工転写因子の使用にも関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要とする動物に、局所投与に適する組成物で直接投与される。
さらに、本発明は、遺伝子産物産生を高めるための、動物のOPA1プロモーターを標的とする人工転写因子の使用にも関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要とする動物に、局所投与に適する組成物で直接投与される。
DNAプラスミドのクローニング
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)は、プロメガ(Promega)からである。高正確性Platinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen))を、すべての標準的PCR反応に適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kit、NucleoSpin Plasmid kit、またはNucleoBond Xtra Midi Plus kit(マッハライ・ナーゲル(Macherey-Nagel))を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するDNA配列は、配列決定によって確認した(マイクロシンス(Microsynth))。
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)は、プロメガ(Promega)からである。高正確性Platinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen))を、すべての標準的PCR反応に適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kit、NucleoSpin Plasmid kit、またはNucleoBond Xtra Midi Plus kit(マッハライ・ナーゲル(Macherey-Nagel))を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するDNA配列は、配列決定によって確認した(マイクロシンス(Microsynth))。
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(ゲンスクリプト(GenScript))に挿入することで、それぞれ、pAN1049(配列番号64)、pAN1073(配列番号65)、およびpAN1670(配列番号66)を得た。pBluescript SK(+)ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のZFモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、pBluescript(および1ZFP、2ZFP、または3ZFPを含有するその誘導産物)、およびpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を、まず1つの制限酵素でインキュベートし、その後、SAPで処理する。NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(ゲンスクリプト(GenScript))に挿入することで、それぞれ、pAN1049(配列番号64)、pAN1073(配列番号65)、およびpAN1670(配列番号66)を得た。pBluescript SK(+)ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のZFモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、pBluescript(および1ZFP、2ZFP、または3ZFPを含有するその誘導産物)、およびpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を、まず1つの制限酵素でインキュベートし、その後、SAPで処理する。NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
pBluescript−1ZFPLのクローニングは、5μgのpBluescriptを、XhoI、SAP、および続いてSpeIで処理することによって行う。インサートは、10μgのpAN1049(16の異なるGNN ZFモジュールを放出)またはpAN1073(15の異なるCNN ZFモジュールを放出)またはpAN1670(15の異なるANN ZFモジュールを放出)を、SpeI、SAP、および続いてXhoIと共にインキュベートすることによって作製する。pBluescript−2ZFPLおよびpBluescript−3ZFPLの作製の場合、7μgのpBluescript−1ZFPLまたはpBluescript−2ZFPLを、AgeIで切断し、脱リン酸化し、SpeIで切断する。インサートは、それぞれ10μgのpAN1049またはpAN1073またはpAN1670に、SpeI、SAP、および続いてXmalを適用することによって得る。pBluescript−6ZFPLのクローニングは、14μgのpBluescript−3ZFPLを、AgeI、SAP、およびその後SpeIで処理することによって行い、切断ベクターを得た。3ZFPLインサートは、SpeI、SAP、および続いてXmaIと共にインキュベートすることにより、20μgのpBluescript−3ZFPLから放出された。
1、2、および3つのZFPを含有するライブラリーにおける連結反応は、インサート:ベクターのモル比3:1で設定し、200ngの切断ベクター、400UのT4 DNAリガーゼを合計体積20μLで用い、室温で一晩行った。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーの連結反応は、2000ngのpBluescript−3ZFPL、500ngの3ZFPLインサート、4000UのT4 DNAリガーゼを合計体積200μL中に含有させ、これを、10の20μLに分割し、別々に室温で一晩インキュベートした。連結反応の一部を、各ライブラリーに対して必要とされるクローンの数に応じたいくつかの方法によって大腸菌中にトランスフォームした。pBluescript−1ZFPLおよびpBluescript−2ZFPLの作製の場合、3μLの連結反応を、大腸菌NEB5−アルファのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いた。pBluescript−3ZFPLの連結反応のプラスミドDNAは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌NEB5−アルファにトランスフォームした(エクイバイオ(EquiBio)製EasyjecT Plusエレクトロポレーターまたはエッペンドルフ(Eppendorf)製Multiporator、2.5kVおよび25μF、バイオラッド(Bio-Rad)製2mm エレクトロポレーションキュベット)。pBluescript−6ZFPライブラリーの連結反応は、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitに適用し、DNAを15μLの脱イオン水で溶出した。約60ngの脱塩DNAを、50μLのNEB 10−ベータ エレクトロコンピテント大腸菌(ニューイングランドバイオラボズ)と混合し、EasyjecT PlusまたはMultiporator、2.5kV、25μF、および2mm エレクトロポレーションキュベットを用い、製造元の推奨に従ってエレクトロポレーションを行った。各ライブラリーに対して複数のエレクトロポレーションを行い、その後、細胞を直接プールしてライブラリーのサイズを拡張した。ヒートショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションの後、SOC媒体をこの細菌に適用し、37℃および250rpmでの1時間のインキュベーションの後、30μLのSOC培養物を段階希釈に用い、アンピシリンを含有するLBプレートに播種した。翌日、得られたライブラリークローンの総数を特定した。加えて、各ライブラリーの10のクローンを選択して、プラスミドDNAを単離し、制限酵素消化によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドのうちの少なくとも3つを配列決定し、ライブラリーの多様性を確認した。残りのSOC培養物を、アンピシリンを含有する100mLのLB培地に移し、37℃および250rpmで一晩培養した。これらの細胞を用いて、各ライブラリーに対するプラスミドMidi DNAを作製した。
酵母ワンハイブリッドスクリーンのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、互換性プレイベクター(compatible prey vector)に導入する。この目的のために、pGAD10(クロンテック(Clontech))の多重クローニング部位を、ベクターをXhoI/EcoRIで切断し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドOAN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC、配列番号67)およびOAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG、配列番号68)を挿入することによって修飾した。得られたベクターpAN1025(配列番号69)を切断し、脱リン酸化し、6ZFPライブラリーインサートを、XhoI/SpeIによってpBluescript−6ZFPLから放出させる。連結反応、およびNEB 10−ベータ エレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションは、pBluescript−6ZFPライブラリーについて上述した通りに行った。
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターpAN1375(配列番号70)にも導入する。このプレイベクターは、以下のようにして構築した:pRS315(配列番号71)を、ApaI/NarIで切断し、アニーリングしたOAN1143(CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC、配列番号72)およびOAN1144(TGCATGAATGCATGCGG、配列番号73)を挿入して、pAN1373(配列番号74)を得た。pAN1025からのSphIインサートを、SphIで切断したpAN1373に連結して、pAN1375を得た。
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターpAN1920(配列番号75)にも導入する。
なおさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、プレイベクターpAN1992(配列番号76)にも挿入する。
酵母ワンハイブリッド用のベイトプラスミドのクローニング
各ベイトプラスミドにおいて、中心部に18bpの潜在的人工転写因子標的部位を持つ60bpの配列を選択し、制限分析のためにNcoI部位を含める。オリゴヌクレオチドの設計およびアニーリングは、5’HindIIIおよび3’XhoI部位が生成されるように行い、それによって、HindIII/XhoIで切断されたpAbAi(クロンテック)に直接連結可能となる。産物のNcoIによる消化および配列決定を用いて、ベイトプラスミドの組み立てを確認する。
各ベイトプラスミドにおいて、中心部に18bpの潜在的人工転写因子標的部位を持つ60bpの配列を選択し、制限分析のためにNcoI部位を含める。オリゴヌクレオチドの設計およびアニーリングは、5’HindIIIおよび3’XhoI部位が生成されるように行い、それによって、HindIII/XhoIで切断されたpAbAi(クロンテック)に直接連結可能となる。産物のNcoIによる消化および配列決定を用いて、ベイトプラスミドの組み立てを確認する。
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Goldを、クロンテックから、YPD培地およびYPDカンテンをカールロス(Carl Roth)から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/L グルコース、6.8g/L Na2HPO4・2H2O、9.7g/L NaH2PO4・2H2O(すべてカールロスより)、1.4g/L 酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/L 酵母窒素ベース、0.1g/L L−トリプトファン、0.1g/L L−ロイシン、0.05g/L L−アデニン、0.05g/L L−ヒスチジン、0.05g/L ウラシル(すべてシグマアルドリッチより)を含有していた。SD−U培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、SD−Lは、L−ロイシンなしで作製した。SDカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、16g/L Bacto Agar(BD)を含有していた。オーレオバシジンA(AbA)は、クロンテックから購入した。
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Goldを、クロンテックから、YPD培地およびYPDカンテンをカールロス(Carl Roth)から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/L グルコース、6.8g/L Na2HPO4・2H2O、9.7g/L NaH2PO4・2H2O(すべてカールロスより)、1.4g/L 酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/L 酵母窒素ベース、0.1g/L L−トリプトファン、0.1g/L L−ロイシン、0.05g/L L−アデニン、0.05g/L L−ヒスチジン、0.05g/L ウラシル(すべてシグマアルドリッチより)を含有していた。SD−U培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、SD−Lは、L−ロイシンなしで作製した。SDカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、16g/L Bacto Agar(BD)を含有していた。オーレオバシジンA(AbA)は、クロンテックから購入した。
ベイト酵母株の調製
約5μgの各ベイトプラスミドを、全体積20μL中、BstBIで線状化し、反応ミックスの半分を、S・セレビシエ Y1H Goldのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて5mLのYPD培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の1ミリリットルを、新しいYPD培地で1:20に希釈し、30℃、225rpmで2〜3時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、1OD600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、1mLの滅菌水で1回、1mLのTE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗浄する。最後に、酵母細胞を、50μLのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精子由来一本鎖DNA(シグマアルドリッチ)、10μLのBstBI線状化ベイトプラスミド(上記参照)、および300μLのPEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(重量/体積)PEG3350)と混合する。細胞およびDNAを、ローラー上、室温にて20分間インキュベートし、その後、42℃のウォーターバス中に15分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、100μLの滅菌水に再懸濁し、SD−Uカンテンプレート上に広げる。30℃での3日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのSD−U上で増殖する8つのクローンを選択して、オーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに5つの1/10の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの5μLを、SD−U、SD−U 100ng/mL AbA、SD−U 150ng/mL AbA、およびSD−U 200ng/mL AbAを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。30℃で3日間のインキュベーションの後、SD−U上で良好に増殖し、AbAに対して最も感受性の高い3つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(クロンテック)によって、製造元の説明に従って確認する。3つのクローンのうちの1つを、続いてのY1Hスクリーニングに用いる。
約5μgの各ベイトプラスミドを、全体積20μL中、BstBIで線状化し、反応ミックスの半分を、S・セレビシエ Y1H Goldのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて5mLのYPD培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の1ミリリットルを、新しいYPD培地で1:20に希釈し、30℃、225rpmで2〜3時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、1OD600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、1mLの滅菌水で1回、1mLのTE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗浄する。最後に、酵母細胞を、50μLのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精子由来一本鎖DNA(シグマアルドリッチ)、10μLのBstBI線状化ベイトプラスミド(上記参照)、および300μLのPEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(重量/体積)PEG3350)と混合する。細胞およびDNAを、ローラー上、室温にて20分間インキュベートし、その後、42℃のウォーターバス中に15分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、100μLの滅菌水に再懸濁し、SD−Uカンテンプレート上に広げる。30℃での3日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのSD−U上で増殖する8つのクローンを選択して、オーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに5つの1/10の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの5μLを、SD−U、SD−U 100ng/mL AbA、SD−U 150ng/mL AbA、およびSD−U 200ng/mL AbAを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。30℃で3日間のインキュベーションの後、SD−U上で良好に増殖し、AbAに対して最も感受性の高い3つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(クロンテック)によって、製造元の説明に従って確認する。3つのクローンのうちの1つを、続いてのY1Hスクリーニングに用いる。
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質導入
約500μLの酵母ベイト菌株プレ培養物を、1LのYPD培地中に希釈し、OD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)、30℃および225rpmでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する(5分間、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、400μLのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて3分間インキュベートする。細胞−DNA懸濁液を、予め冷却しておいた2mm エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を(EasyjecT PlusエレクトロポレーターまたはMultiporator、2.5kV、および25μF)、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、100mLのYPD:1M ソルビトール 1:1ミックスに移し、30℃、225rpmで60分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、1〜2mLのSD−L培地に再懸濁する。200μLのアリコートを、1000〜4000ng/mL AbAを含有する15cm SD−Lカンテンプレート上に広げる。さらに、50μLの細胞懸濁液を用いて、1/100および1/1000希釈物を作製し、50μLの未希釈および希釈細胞を、SD−L上に播種する。すべてのプレートを、30℃で3日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のSD−Lプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、AbA含有SD−Lプレートは、プレイ6ZFPがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
約500μLの酵母ベイト菌株プレ培養物を、1LのYPD培地中に希釈し、OD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)、30℃および225rpmでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する(5分間、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、400μLのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて3分間インキュベートする。細胞−DNA懸濁液を、予め冷却しておいた2mm エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を(EasyjecT PlusエレクトロポレーターまたはMultiporator、2.5kV、および25μF)、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、100mLのYPD:1M ソルビトール 1:1ミックスに移し、30℃、225rpmで60分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、1〜2mLのSD−L培地に再懸濁する。200μLのアリコートを、1000〜4000ng/mL AbAを含有する15cm SD−Lカンテンプレート上に広げる。さらに、50μLの細胞懸濁液を用いて、1/100および1/1000希釈物を作製し、50μLの未希釈および希釈細胞を、SD−L上に播種する。すべてのプレートを、30℃で3日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のSD−Lプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、AbA含有SD−Lプレートは、プレイ6ZFPがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
正の相互作用の検証と6ZFPをコードするプレイプラスミドの回復
初期分析において、40の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のAbAを含有するSD−Lプレートから取り出し、酵母細胞を、1000〜4000ng/mL AbAのSD−L上に2回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、1つのコロニーを用いて、5mL SD−L培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調節し、さらに5つの1/10希釈物を作製し、各段階希釈物の5μLを、SD−L、SD−L 500ng/mL AbA、1000ng/mL AbA、SD−L 1500ng/mL AbA、SD−L 2000ng/mL AbA、SD−L 2500ng/mL AbA、SD−L 3000ng/mL AbA、およびSD−L 4000ng/mL AbAプレート上にスポッティングする。クローンを、高AbA濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、5mLの初期SD−Lプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを100μLの水または残りの培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマアルドリッチ、L2524)を添加後、細胞を37℃、300rpmにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト(spheroblasts)を、10μLの20%(重量/体積)SDS溶液を添加することで溶解し、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−20℃で少なくとも1時間凍結させる。その後、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA1バッファー、およびスパチュラ1杯分のガラスビーズ(シグマアルドリッチ、G8772)を添加し、チューブを、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA2バッファーを添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートし、その後標準NucleoSpin Plasmid kitプロトコルを継続することによってさらに改善される。30μLの溶出バッファーによる溶出後、5μLのプラスミドDNAを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌DH5アルファにトランスフォームする。2つの別々のコロニーを、アンピシリン含有LBプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する6ZFP間のコンセンサス配列について分析する。
初期分析において、40の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のAbAを含有するSD−Lプレートから取り出し、酵母細胞を、1000〜4000ng/mL AbAのSD−L上に2回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、1つのコロニーを用いて、5mL SD−L培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調節し、さらに5つの1/10希釈物を作製し、各段階希釈物の5μLを、SD−L、SD−L 500ng/mL AbA、1000ng/mL AbA、SD−L 1500ng/mL AbA、SD−L 2000ng/mL AbA、SD−L 2500ng/mL AbA、SD−L 3000ng/mL AbA、およびSD−L 4000ng/mL AbAプレート上にスポッティングする。クローンを、高AbA濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、5mLの初期SD−Lプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを100μLの水または残りの培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマアルドリッチ、L2524)を添加後、細胞を37℃、300rpmにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト(spheroblasts)を、10μLの20%(重量/体積)SDS溶液を添加することで溶解し、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−20℃で少なくとも1時間凍結させる。その後、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA1バッファー、およびスパチュラ1杯分のガラスビーズ(シグマアルドリッチ、G8772)を添加し、チューブを、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA2バッファーを添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートし、その後標準NucleoSpin Plasmid kitプロトコルを継続することによってさらに改善される。30μLの溶出バッファーによる溶出後、5μLのプラスミドDNAを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌DH5アルファにトランスフォームする。2つの別々のコロニーを、アンピシリン含有LBプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する6ZFP間のコンセンサス配列について分析する。
分泌型ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼの組み合わせアッセイのためのOPA1遺伝子プロモーター領域のクローニング
OPA1プロモーター領域を含有するDNA断片を、pAN1485(NEG−PG04、ジーンコペイア(GeneCopeia))中にクローニングし、OPA1遺伝子プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型胚性アルカリホスファターゼを含有するレポータープラスミドpAN1680(配列番号77)が得られ、ルシフェラーゼのアルカリホスファターゼシグナルに対する標準化が可能となった。
OPA1プロモーター領域を含有するDNA断片を、pAN1485(NEG−PG04、ジーンコペイア(GeneCopeia))中にクローニングし、OPA1遺伝子プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型胚性アルカリホスファターゼを含有するレポータープラスミドpAN1680(配列番号77)が得られ、ルシフェラーゼのアルカリホスファターゼシグナルに対する標準化が可能となった。
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
Gensynthesis(ゲンスクリプト(GenScript))を通して作製したかまたは酵母ワンハイブリッドで選択したポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、AgeI/XhoIによる標準的な手順を用いて、目的のジンクフィンガーレイ、SV40 NLS、3× mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号78)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号79)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号80)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号81)の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
Gensynthesis(ゲンスクリプト(GenScript))を通して作製したかまたは酵母ワンハイブリッドで選択したポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、AgeI/XhoIによる標準的な手順を用いて、目的のジンクフィンガーレイ、SV40 NLS、3× mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号78)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号79)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号80)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号81)の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
安定にトランスフェクトされたテトラサイクリン誘導性細胞を作製するためのプラスミドを、以下のようにして作製した:ポリダクチルジンクフィンガードメイン、制御ドメイン(N末端KRAB、C末端KRAB、SID、またはVP64)、SV40 NLS、および3× mycエピトープタグを含む人工転写因子をコードするDNA断片を、EcoRV/NotIを用いてpcDNA5/FRT/TO(インビトロジェン)中にクローニングする。
細胞培養およびトランスフェクション
HeLa細胞を、4.5g/L グルコース、10% 熱失活ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(すべてシグマアルドリッチから)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5% CO2、37℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、7000HeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種する。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドmidi製剤(Plasmid midi preparations)を、3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、ウェルあたり100μLの新しいDMEMで培地を入れ替える。
HeLa細胞を、4.5g/L グルコース、10% 熱失活ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(すべてシグマアルドリッチから)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5% CO2、37℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、7000HeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種する。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドmidi製剤(Plasmid midi preparations)を、3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、ウェルあたり100μLの新しいDMEMで培地を入れ替える。
Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株の作製および維持
安定なテトラサイクリン誘導性Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株を、Flpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用い、pFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクトすることによって、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株を作製する。誘導性293発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組換えを介して組み込む。安定なFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/mL ブラストサイジン、および100μg/mL ハイグロマイシン)を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度1μg/mLまで添加する。
安定なテトラサイクリン誘導性Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株を、Flpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用い、pFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクトすることによって、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株を作製する。誘導性293発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組換えを介して組み込む。安定なFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/mL ブラストサイジン、および100μg/mL ハイグロマイシン)を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度1μg/mLまで添加する。
ルシフェラーゼ/SEAPプロモーター活性組み合せアッセイ
HeLa細胞を、人工転写因子発現コンストラクト、ならびにOPA1プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを持つプラスミドで共トランスフェクトする(Gaussia luciferase Glow Assay Kit、ピアース(Pierce);SEAP Reporter Gene Assay chemiluminescent、ロシュ(Roche))。トランスフェクションの2日後、細胞培養物上澄を回収し、ルシフェラーゼ活性およびSEAP活性を、Gaussia luciferase Glow Assay Kit(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific))およびSEAP reporter gene assay(ロシュ)をそれぞれ用いて測定した。ジンクフィンガードメイン中のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換されている不活性人工転写因子のための発現プラスミドの共トランスフェクションを、コントロールとして用いた。ルシフェラーゼ活性は、SEAP活性に対して標準化し、コントロールに対するパーセントとして表した。
HeLa細胞を、人工転写因子発現コンストラクト、ならびにOPA1プロモーターの支配下の分泌型ガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを持つプラスミドで共トランスフェクトする(Gaussia luciferase Glow Assay Kit、ピアース(Pierce);SEAP Reporter Gene Assay chemiluminescent、ロシュ(Roche))。トランスフェクションの2日後、細胞培養物上澄を回収し、ルシフェラーゼ活性およびSEAP活性を、Gaussia luciferase Glow Assay Kit(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific))およびSEAP reporter gene assay(ロシュ)をそれぞれ用いて測定した。ジンクフィンガードメイン中のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換されている不活性人工転写因子のための発現プラスミドの共トランスフェクションを、コントロールとして用いた。ルシフェラーゼ活性は、SEAP活性に対して標準化し、コントロールに対するパーセントとして表した。
定量的RT−PCRによる遺伝子発現レベルの決定
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン(Qiagen)、ヒルデン、ドイツ)を製造元の説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、10μL/mL β−メルカプトエタノールを含有するRLT Plus Lysis bufferに再懸濁させる。QIAshredderスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、ゲノムDNAを除去する。同容量の70%エタノールを添加し、すべてのライセートをRNeasyスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、RNAを、最終体積30μLのRNaseフリー水で溶出する。RNAは、次に使用するまで−80℃で保存する。cDNAの合成は、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を製造元の説明書に従って用いて行う。cDNAの合成は、2μL 10×バッファー、0.8μL 25×dNTPミックス、2μL 10×RT ランダムプライマー、1μL Multiscribe逆転写酵素、および4.2μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。最終体積10μLのRNAを添加し、反応を、以下の条件下で行う:25℃にて10分間、続いて37℃で2時間、および最終工程として85℃で5分間。定量的PCRは、1μL 20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μL TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)、および8μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。各反応において、1μLのcDNAを添加する。qPCRは、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を以下の条件で用いて行う:50℃で2分間の初期工程、続いて95℃で10分間の第一の変性、ならびに95℃で15秒間および60℃で1分間の40サイクルから成るさらなる工程。
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン(Qiagen)、ヒルデン、ドイツ)を製造元の説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、10μL/mL β−メルカプトエタノールを含有するRLT Plus Lysis bufferに再懸濁させる。QIAshredderスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、ゲノムDNAを除去する。同容量の70%エタノールを添加し、すべてのライセートをRNeasyスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、RNAを、最終体積30μLのRNaseフリー水で溶出する。RNAは、次に使用するまで−80℃で保存する。cDNAの合成は、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を製造元の説明書に従って用いて行う。cDNAの合成は、2μL 10×バッファー、0.8μL 25×dNTPミックス、2μL 10×RT ランダムプライマー、1μL Multiscribe逆転写酵素、および4.2μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。最終体積10μLのRNAを添加し、反応を、以下の条件下で行う:25℃にて10分間、続いて37℃で2時間、および最終工程として85℃で5分間。定量的PCRは、1μL 20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μL TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)、および8μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。各反応において、1μLのcDNAを添加する。qPCRは、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を以下の条件で用いて行う:50℃で2分間の初期工程、続いて95℃で10分間の第一の変性、ならびに95℃で15秒間および60℃で1分間の40サイクルから成るさらなる工程。
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの間のHis6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするDNA断片を、標準的な手順を用い、EcoRV/NotIにより、pET41a+(ノバゲン(Novagen))をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号82)中にクローニングする。
人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの間のHis6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするDNA断片を、標準的な手順を用い、EcoRV/NotIにより、pET41a+(ノバゲン(Novagen))をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号82)中にクローニングする。
BL21(DE3)などの適切な大腸菌宿主細胞中におけるOPA1を標的とする形質導入可能人工転写因子の細菌産生のための発現コンストラクトは、pAN1964(配列番号83)、pAN2053(配列番号84)、pAN2055(配列番号85)、pAN2057(配列番号86)、pAN2059(配列番号87)、pAN2061(配列番号88)、およびpAN2063(配列番号89)である。
人工転写因子タンパク質の作製
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌BL21(DE3)を、100μM ZnCl2を添加した1L LB培地中、OD600が0.8から1の間に到達するまで増殖させ、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体(inclusion bodies)を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し(5000g、4℃、15分間)、20mLの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗浄した。精製した封入体を、30mLの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)中にて1時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、4℃および13000gで40分間遠心分離し、0.45μm PVDFフィルターを通してろ過した。Hisタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いて、Aktaprime FPLC(GEヘルスケア(GE Healthcare))上のHis−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がSIDドメインを含有している場合は、バッファーS(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーK(50mM Tris−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、14000rpmで30分間、4℃で遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア(Millipore))を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバゲン)を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4 pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー 50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から作製した。タンパク質を、VP64バッファー(550mM NaCl pH 7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌BL21(DE3)を、100μM ZnCl2を添加した1L LB培地中、OD600が0.8から1の間に到達するまで増殖させ、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体(inclusion bodies)を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し(5000g、4℃、15分間)、20mLの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗浄した。精製した封入体を、30mLの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)中にて1時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、4℃および13000gで40分間遠心分離し、0.45μm PVDFフィルターを通してろ過した。Hisタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いて、Aktaprime FPLC(GEヘルスケア(GE Healthcare))上のHis−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がSIDドメインを含有している場合は、バッファーS(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーK(50mM Tris−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、14000rpmで30分間、4℃で遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア(Millipore))を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバゲン)を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4 pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー 50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から作製した。タンパク質を、VP64バッファー(550mM NaCl pH 7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
ELDIA(酵素結合DNA相互作用アッセイ)を用いた人工転写因子のDNA結合活性の決定
BSAで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート(ピアース)を、洗浄バッファー(25mM Tris/HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20)で3回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下(50pmol/ウェル)、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で1時間インキュベートする。3回の洗浄工程後、1×10-12から5×10-7Mの60bpプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中(10mM Tris/HCl pH7.5、60mM KCl、1mM DTT、2% グリセロール、5mM MgCl2、および100μM ZnCl2)、非特異的競合相手(0.1mg/mL サケ精子由来ssDNA、シグマ)の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で1時間インキュベートする。洗浄後(5回)、ウェルを、3% BSAを用いて室温で30分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−HRPを、結合バッファーに室温で1時間添加する。5回の洗浄工程後、TMB基質(シグマ)を添加し、2から30分間室温でインキュベートする。TMB停止溶液(シグマ)を添加して反応を停止し、サンプル吸光を、450nmで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってSigma Plot V8.1を用いて行う。
BSAで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート(ピアース)を、洗浄バッファー(25mM Tris/HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20)で3回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下(50pmol/ウェル)、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で1時間インキュベートする。3回の洗浄工程後、1×10-12から5×10-7Mの60bpプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中(10mM Tris/HCl pH7.5、60mM KCl、1mM DTT、2% グリセロール、5mM MgCl2、および100μM ZnCl2)、非特異的競合相手(0.1mg/mL サケ精子由来ssDNA、シグマ)の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で1時間インキュベートする。洗浄後(5回)、ウェルを、3% BSAを用いて室温で30分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−HRPを、結合バッファーに室温で1時間添加する。5回の洗浄工程後、TMB基質(シグマ)を添加し、2から30分間室温でインキュベートする。TMB停止溶液(シグマ)を添加して反応を停止し、サンプル吸光を、450nmで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってSigma Plot V8.1を用いて行う。
タンパク質形質導入
約80%のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、37℃のOptiMEMまたは増殖培地中、2時間から120時間にわたって、0.01から1μMの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、24時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、10〜500μM ZnCl2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
約80%のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、37℃のOptiMEMまたは増殖培地中、2時間から120時間にわたって、0.01から1μMの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、24時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、10〜500μM ZnCl2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
免疫蛍光
細胞を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15% Triton X−100で15分間処理し、10% BSA PBSでブロッキングし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベートする。サンプルを、PBS/1% BSAで3回洗浄し、Alexa Fluor 546(1:1000、インビトロジェン)と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、DAPI(1mg/mLの1:1000で3分間、シグマ)を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
細胞を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15% Triton X−100で15分間処理し、10% BSA PBSでブロッキングし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベートする。サンプルを、PBS/1% BSAで3回洗浄し、Alexa Fluor 546(1:1000、インビトロジェン)と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、DAPI(1mg/mLの1:1000で3分間、シグマ)を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
ウェスタンブロッティング
タンパク質レベルを測定するために、RIPAバッファー(ピアース)を用いて細胞を溶解し、タンパク質ライセートを、Laemmliサンプルバッファーと混合する。SDS−PAGEにより、タンパク質をそのサイズに従って分離し、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜に転写させる。タンパク質の検出は、マウスまたはラビットで産生された特異的一次抗体を用いて行う。一次抗体の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体および発光に基づく検出(ECLプラス、ピアース)によるか、または赤外レーザースキャナを用いて蛍光検出および定量されるDyLight700もしくはDyLight800と結合した二次抗体によって行う。
タンパク質レベルを測定するために、RIPAバッファー(ピアース)を用いて細胞を溶解し、タンパク質ライセートを、Laemmliサンプルバッファーと混合する。SDS−PAGEにより、タンパク質をそのサイズに従って分離し、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜に転写させる。タンパク質の検出は、マウスまたはラビットで産生された特異的一次抗体を用いて行う。一次抗体の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体および発光に基づく検出(ECLプラス、ピアース)によるか、または赤外レーザースキャナを用いて蛍光検出および定量されるDyLight700もしくはDyLight800と結合した二次抗体によって行う。
ミトコンドリア機能の測定
フローサイトメトリー分析のために、処理細胞を10mM EDTA/PBSで回収する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。ミトコンドリア膜電位の測定のために、分析前に、細胞をFACSバッファーP(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA、1μg/mL 4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI、シグマ)、10nM テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE、シグマ))中に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートする。ミトコンドリア膜電位消失のための50μM カルボニルシアニド3−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、シグマ)での処理をコントロールとして用いる。ミトコンドリア質量の測定のために、分析前に、細胞をFACSバッファーM(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA、1μg/mL DAPI、および100nM MitoTracker green FM(インビトロジェン))中に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートする。ミトコンドリアROS測定のために、細胞をFACSバッファーR(PBS、5mM EDTA、0.5% BSA、1μg/mL DAPI、および5μM MitoSOX(インビトロジェン))中に再懸濁し、37℃で10分間インキュベートし、PBSで洗浄し、FACSバッファーR2(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA)中に再懸濁する。フローサイトメトリー分析を、FlowJoソフトウェア(ツリースター社(Tree Star Inc.))を用い、CyAnADP(ダコ(Dako))で行う。
フローサイトメトリー分析のために、処理細胞を10mM EDTA/PBSで回収する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。ミトコンドリア膜電位の測定のために、分析前に、細胞をFACSバッファーP(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA、1μg/mL 4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI、シグマ)、10nM テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE、シグマ))中に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートする。ミトコンドリア膜電位消失のための50μM カルボニルシアニド3−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、シグマ)での処理をコントロールとして用いる。ミトコンドリア質量の測定のために、分析前に、細胞をFACSバッファーM(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA、1μg/mL DAPI、および100nM MitoTracker green FM(インビトロジェン))中に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートする。ミトコンドリアROS測定のために、細胞をFACSバッファーR(PBS、5mM EDTA、0.5% BSA、1μg/mL DAPI、および5μM MitoSOX(インビトロジェン))中に再懸濁し、37℃で10分間インキュベートし、PBSで洗浄し、FACSバッファーR2(PBS、5mM EDTA、0.5%(重量/体積) BSA)中に再懸濁する。フローサイトメトリー分析を、FlowJoソフトウェア(ツリースター社(Tree Star Inc.))を用い、CyAnADP(ダコ(Dako))で行う。
アポトーシス誘導の測定
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4% EMグレードのパラホルムアルデヒド(ピアース、28908)を用い、室温で30分間固定する。次に、細胞を、PBS中の0.15%(体積/体積)Triton X−100を用い、室温で15分間透過処理し、続いてPBS中の10%(重量/体積)BSAを用い、室温で1時間ブロッキングする。サンプルを、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗チトクロムc抗体(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、556432、1:1000)を用い、4℃で一晩インキュベートする。細胞を、ブロッキングバッファーで15分間3回洗浄し、次にAlexa Fluor 546−結合ヤギ抗マウスIgG抗体(インビトロジェン)と共に室温で1時間インキュベートする。アポトーシスの尺度としてのチトクロムc放出を、盲検観察者により、蛍光顕微鏡で分析する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4% EMグレードのパラホルムアルデヒド(ピアース、28908)を用い、室温で30分間固定する。次に、細胞を、PBS中の0.15%(体積/体積)Triton X−100を用い、室温で15分間透過処理し、続いてPBS中の10%(重量/体積)BSAを用い、室温で1時間ブロッキングする。サンプルを、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗チトクロムc抗体(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、556432、1:1000)を用い、4℃で一晩インキュベートする。細胞を、ブロッキングバッファーで15分間3回洗浄し、次にAlexa Fluor 546−結合ヤギ抗マウスIgG抗体(インビトロジェン)と共に室温で1時間インキュベートする。アポトーシスの尺度としてのチトクロムc放出を、盲検観察者により、蛍光顕微鏡で分析する。偽処理細胞をコントロールとして用いる。
Claims (22)
- 活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列と融合したポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、OPA1遺伝子プロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む、人工転写因子。
- タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、請求項1に記載の人工転写因子。
- 六量体ジンクフィンガータンパク質を含む、請求項1または2に記載の人工転写因子。
- 前記活性化タンパク質ドメインが、配列番号1のVP16、配列番号2のVP64、配列番号3のCJ7、配列番号4のp65TA1、配列番号5のSAD、配列番号6のNF−1、配列番号7のAP−2、配列番号8のSP1−A、配列番号9のSP1−B、配列番号10のOct−1、配列番号11のOct−2、配列番号12のOct2−5x、配列番号13のMTF−1、配列番号14のBTEB−2、または配列番号15のLKLFである、請求項1から3のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記核局在化配列が、K−K/R−X−K/Rコンセンサス配列を含有する塩基性アミノ酸クラスターまたは配列番号62のSV40 NLSである、請求項1から4のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号16のHIV由来TATペプチド、配列番号18の合成ペプチドmT02、配列番号19の合成ペプチドmT03、配列番号20のR9ペプチド、または配列番号21のANTPドメインである、請求項2から5のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 配列番号26から43までから成る群より選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- ポリエチレングリコール残基をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の人工転写因子を含む医薬組成物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の人工転写因子をコードする核酸。
- 請求項10に記載の核酸を含むベクター。
- ウィルスベクターである、請求項11に記載のベクター。
- 請求項11または12に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号83から89の発現コンストラクトを含有する、請求項13に記載の大腸菌宿主細胞。
- 請求項10に記載の核酸を含むウィルスキャリア。
- アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、シュードタイプアデノ随伴ウィルス、シュードタイプレトロウィルス、シュードタイプレンチウィルス、およびシュードタイプアデノウィルスから成る群より選択される、請求項15に記載のウィルスキャリア。
- 請求項15または16に記載のウィルスキャリアを含む医薬組成物。
- OPA1遺伝子プロモーターからの発現の増加に用いるための、請求項1から8のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- OPA1遺伝子プロモーターからの発現の増加に用いるための、請求項10に記載の核酸。
- 常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、および緑内障の治療に用いるための、請求項1から8のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、および緑内障の治療に用いるための、請求項10に記載の核酸。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の人工転写因子または請求項10に記載の核酸の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、常染色体優性萎縮症、常染色体優性萎縮症プラス、または緑内障の治療方法。
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