JP2016516749A - 人工転写因子、および眼の不適合創傷治癒の治療のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、眼の不適合創傷治癒(maladapted wound healing)に関与する遺伝子のプロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質(polydactyl zinc finger proteins)を含む人工転写因子に関する。そのような人工転写因子は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害(fibrocontractive retinal disorders)の治療、および緑内障手術に伴う線維増殖の治療に有用である。
Description
本発明は、眼の不適合創傷治癒(maladapted wound healing)に関与する遺伝子のプロモーターを標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質(複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質)(polydactyl zinc finger proteins)を含む人工転写因子、ならびに抑制性もしくは活性化ドメイン、核局在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、およびエンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合し、疾患関連遺伝子プロモーターを特に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含むそのような人工転写因子を用いた眼の創傷治癒プロセスを調節する方法に関する。
傷害によって誘発される種々の細胞型の増殖を介する創傷治癒は、瘢痕形成をもたらし、機械的または免疫学的損傷に応答して器官の機能を維持または回復するために必要なプロセスである。しかし、不適合な創傷治癒は、適切な器官の機能を部分的にしか回復しないか、またはそれを阻害さえする瘢痕形成をもたらし得る。そのような不適合創傷修復は、生化学的だけでなく、機械的、光学的、および空間的にも非常に規則正しい様式で多くの異なる細胞型が正しく相互作用し合うことに依存している精巧な器官である眼で発生することが多い。従って、眼における不適合創傷修復による瘢痕形成は、患者の視覚障害における主要な因子である。
網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害(fibrocontractive retinal disorders)は、例えば硝子体網膜手術、糖尿病性変化、または低酸素性損傷に応答しての不適合網膜創傷修復に起因する眼の疾患である。さらに、そのような不適合創傷治癒はまた、老化および付随する硝子体の収縮とも関連付けられるが、特発性の線維収縮性網膜障害も見られる。臨床結果は、黄斑パッカー、黄斑浮腫、網膜歪み(retinal distortion)、網膜剥離、および最終的には失明である。このような疾患に対する標準的な治療は、高用量のステロイドを用いた非特異的抗炎症治療、または網膜上膜の手術による除去、または膜剥離術(membrane peeling)である。疾患の初期ステージにおいて、グリアおよびミューラー細胞、免疫細胞、(線維性)星状細胞、色素上皮細胞、ならびにミクログリアを含む網膜の種々の細胞型の活性化が、網膜を覆う透明細胞層の形成を引き起こす。疾患の後期ステージでは、この透明細胞層が、締め付けおよび収縮を開始し、最初は網膜を歪ませ、最終的には、網膜の剥離および破壊を引き起こす。この透明層を形成する網膜細胞の活性化は、増殖因子のホストおよびそれらに付随する増殖因子受容体、ならびに組織リモデリングおよび炎症と関係するその他の因子によって支配される。線維収縮性網膜障害と関係する因子は、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、色素上皮由来因子(PEDF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)−ベータ、上皮増殖因子(EGF)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HBEGF)、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−アルファ)であるが、さらにマトリックスメタロプロテアーゼ2および9(MMP2、MMP9)、ならびに組織MMP2阻害因子(TIMP2)である(Moysidis S.N. et al., 2012, Mediators Inflamm, 2012:815937)。
緑内障は、世界中で6000万人以上が罹患しており、二番目に最も多い失明性疾患である。眼圧の上昇に伴う緑内障に対する標準的な治療は、眼圧を低下させる薬物療法、または眼の手術である。緑内障ろ過手術は、薬物療法およびレーザー手術が不充分であることが分かった場合に、眼圧を制御するための至適基準である。しかし、線維芽細胞増殖の増加、または線維増殖症に起因する瘢痕組織が形成して房水の流れを妨害し、ろ過が不成功となる場合がある。現行の診療では、術後の眼における瘢痕組織形成を制限する補助とするために、抗代謝剤であるマイトマイシン−Cおよび5−フルオロウラシル(手術中に局所適用され、手術後に濾過胞へ注射される)が用いられる。このような薬剤は、手術の予後を改善することが示されているが、非選択的な形で行われる。その結果、抗代謝剤治療は、低眼圧、濾過胞炎、眼内炎、濾過胞漏出などを含む著しい副作用プロファイルを伴う。
組織線維症を予防する別の選択肢としての方法に関する最近の研究では、特に種々の増殖因子の制御による、線維芽細胞増殖の阻害に焦点が当てられてきた。VEGFおよびTGF−ベータを阻害することによる瘢痕形成低減のある程度の成功が最近の文献に報告されている(Lockwood A. et al., 2013、Curr Opin Pharmacol 13 (1), 65-71)。ヒトテノン嚢線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換が、瘢痕形成にとって最も決定的なイベントの1つであり、手術後のTGF−ベータによる組織リモデリングが、この分化転換にとって不可欠であることが実証された。TGFファミリーは、増殖、分化、アポトーシス、および細胞外マトリックスの産生などの細胞機能の制御において類似の能力を共有している。眼の場合、房水(濾過胞へ流入する)は、TGF−ベータ2を大量に含有しているが、TGF−ベータ1およびベータ2は、濾過胞の細胞において局所的に発現される。
手術後のギャップ結合情報伝達の調節は、瘢痕形成を低減するための別の可能性である。ギャップ結合は、細胞間の直接のシグナル伝達を可能とする構造である。6つのコネキシンタンパク質サブユニットがオリゴマー化して、コネクソンと称されるヘミチャネル(hemichannel)を形成し;隣接する細胞からの2つのコネクソンがドッキングして、完全な細胞間結合チャネルを形成する。ギャップ結合は、炎症、細胞遊走、および組織収縮において役割を担っている。げっ歯類での研究により、コネキシン43タンパク質の発現の一時的な減少が、皮膚の創傷治癒および瘢痕低減に有益であることが示されている(Deva N.C. et al., 2012, Inflammation 35 (4), 1276-86)。
人工転写因子(ATF)が、遺伝子発現の調節に有用なツールであるとして提案されている(Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526)。遺伝子転写の抑制または活性化のいずれかを通して発現に影響を与える多くの天然転写因子は、特定のDNA配列を認識するための複雑な特異的ドメインを持っている。このために、その特異性および(1もしくは複数の)標的遺伝子を改変することを意図する場合、それらは、操作の対象として魅力的なものとならない。しかし、転写因子の特定のクラスは、いくつかのいわゆるジンクフィンガー(ZF)ドメインを含有しており、それは、モジュラー構造であることから、遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、ほとんど独立して3つのDNA塩基対を標的とする短鎖(30アミノ酸)DNA結合モチーフである。そのようないくつかのジンクフィンガーを一緒に融合して含有するタンパク質は、従って、より長いDNA配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質(ZFP)は、全ヒトゲノムの中でほとんど唯一である18塩基対(bp)DNA標的を認識する。最初は、完全に状況非依存的(context independent)であると考えられていたが、より詳細な分析により、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性(context specificity)が明らかとなった(Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231)。ジンクフィンガー認識表面の特定のアミノ酸を変異させてZFモジュールの結合特異性を変化させることにより、5’−GNN−3’、5’−CNN−3’、5’−ANN−3’コドンのほとんど、およびいくつかの5’−TNN−3’コドンに対する確定されたZF構成要素が得られた(いわゆるBarbasモジュール、Dreier B., Barbas C.F. 3rd et al., 2005, J Biol Chem 280, 35588-35597参照)。人工転写因子に関する初期の研究は、予め選択されたジンクフィンガーを既知の3bp標的配列と組み合わせることに基づく合理的な設計に集中していたが、ジンクフィンガーのある程度の状況特異性が認識されたことで、細菌もしくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、区画化リボソームディスプレイ(compartmentalized ribosome display)、またはFACS分析を用いた生体内選別などの高度な方法を用いて情報が得られる大規模ジンクフィンガーライブラリーの作製が必要となった。
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いることで、ヒトゲノムのDNA座位を、高い特異性で標的とすることができる。従って、このようなジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性を持つタンパク質ドメインを特定のプロモーター配列へ運搬し、その結果として目的の遺伝子の発現を調節するための理想的なツールである。転写のサイレンシングに適するドメインは、N末端(配列番号1)またはC末端(配列番号2)KRABドメインとしてのクルッペル関連ドメイン(KRAB)、Sin3相互作用ドメイン(SID、配列番号3)、およびERFリプレッサードメイン(ERD、配列番号4)であり、一方、遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスVP16(配列番号5)またはVP64(VP16の四量体リピート、配列番号6)ドメインを介して達成される(Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633)。転写活性化を付与すると考えられるさらなるドメインは、CJ7(配列番号7)、p65−TA1(配列番号8)、SAD(配列番号9)、NF−1(配列番号10)、AP−2(配列番号11)、SP1−A(配列番号12)、SP1−B(配列番号13)、Oct−1(配列番号14)、Oct−2(配列番号15)、Oct−2_5x(配列番号16)、MTF−1(配列番号17)、BTEB−2(配列番号18)、およびLKLF(配列番号19)である。加えて、ジーンオントロジー GO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgibin/amigo/term_details?term=GO:0001071)によって定められるタンパク質の転写活性ドメインは、標的タンパク質の転写制御を達成するものと考えられる。
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン(PTD)は、細胞膜を通してのサイトゾル/核質へのタンパク質の移行を促進することが示された。HIV誘導TATペプチド(配列番号20)、mT02(配列番号21)、mT03(配列番号22)、R9(配列番号23)、ANTP(配列番号24)などの短鎖ペプチドは、カーゴタンパク質と融合された場合、細胞型に依存しないマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発することが示された(Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315)。サイトゾルに到達後、そのような融合タンパク質は、生物学的活性を有することが示された。興味深いことに、ミスフォールドタンパク質であっても、恐らくは細胞内シャペロンの作用により、タンパク質形質導入後に機能性となることができる。しかし、治療カーゴを細胞へ送達するためにタンパク質形質導入ドメインを用いることに対する主たる障害は、エンドソームコンパートメントから核などのその他の細胞内位置へのそのようなタンパク質の放出が限定的であることである(Koren E and Torchilin V.P., 2012, Trends in Mol Med 18, 385-393)。
本発明は、抑制性もしくは活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合しており、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよい、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子の発現を増加または減少させるための、およびそのような遺伝子によって引き起こされる、または影響を受ける疾患の治療における本発明の人工転写因子の使用にも関する。
同様に、本発明は、本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子によって引き起こされるまたは調節される疾患を治療する方法にも関する。
本発明の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、AGER(RAGE)プロモーター(配列番号25)である。この特定の実施形態では、本発明は、AGERレベルの低下または上昇によってAGERの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのAGERプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、AGERプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、AGERによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、EGFRプロモーター(配列番号26)である。この特定の実施形態では、本発明は、EGFRレベルの低下または上昇によってEGFRの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのEGFRプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、EGFRプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、EGFRによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FGFR1プロモーター(配列番号27)である。この特定の実施形態では、本発明は、FGFR1レベルの低下または上昇によってFGFR1の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFGFR1プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FGFR1プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FGFR1によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FGFR2プロモーター(配列番号28)である。この特定の実施形態では、本発明は、FGFR2レベルの低下または上昇によってFGFR2の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFGFR2プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FGFR2プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FGFR2によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FGFR3プロモーター(配列番号29)である。この特定の実施形態では、本発明は、FGFR3レベルの低下または上昇によってFGFR3の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFGFR3プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FGFR3プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FGFR3によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FGFR4プロモーター(配列番号30)である。この特定の実施形態では、本発明は、FGFR4レベルの低下または上昇によってFGFR4の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFGFR4プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FGFR4プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FGFR4によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FLT1(VEGFR−1)プロモーター(配列番号31)である。この特定の実施形態では、本発明は、FLT1レベルの低下または上昇によってFLT1の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFLT1プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FLT1プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FLT1によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、FLT4(VEGFR−3)プロモーター(配列番号32)である。この特定の実施形態では、本発明は、FLT4レベルの低下または上昇によってFLT4の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのFLT4プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、FLT4プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、FLT4によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、GJA1(CX43)プロモーター(配列番号33)である。この特定の実施形態では、本発明は、GJA1レベルの低下または上昇によってGJA1の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのGJA1プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、GJA1プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、GJA1によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、IGF1Rプロモーター(配列番号34)である。この特定の実施形態では、本発明は、IGF1Rレベルの低下または上昇によってIGF1Rの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのIGF1Rプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、IGF1Rプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、IGF1Rによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、KDR(VEGFR−2)プロモーター(配列番号35)である。この特定の実施形態では、本発明は、KDRレベルの低下または上昇によってKDRの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのKDRプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、KDRプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、KDRによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、MET(HGFR)プロモーター(配列番号36)である。この特定の実施形態では、本発明は、METレベルの低下または上昇によってMETの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのMETプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、METプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、METによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、PDGFRAプロモーター(配列番号37)である。この特定の実施形態では、本発明は、PDGFRAレベルの低下または上昇によってPDGFRAの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのPDGFRAプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、PDGFRAプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、PDGFRAによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、PDGFRBプロモーター(配列番号38)である。この特定の実施形態では、本発明は、PDGFRBレベルの低下または上昇によってPDGFRBの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのPDGFRBプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、PDGFRAプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、PDGFRBによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域は、PNPLA2(PEDF−R)プロモーター(配列番号39)である。この特定の実施形態では、本発明は、PNPLA2レベルの低下または上昇によってPNPLA2の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのPNPLA2プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、PNPLA2プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、PNPLA2によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はTGFBR1プロモーター(配列番号40)である。この特定の実施形態では、本発明は、TGFBR1レベルの低下または上昇によってTGFBR1の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのTGFBR1プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、TGFBR1プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TGFBR1によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はTGFBR2プロモーター(配列番号41)である。この特定の実施形態では、本発明は、TGFBR2レベルの低下または上昇によってTGFBR2の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのTGFBR2プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、TGFBR2プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TGFBR2によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はTGFBR3プロモーター(配列番号42)である。この特定の実施形態では、本発明は、TGFBR3レベルの低下または上昇によってTGFBR3の活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのTGFBR3プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、TGFBR3プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TGFBR3によって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はTNFRSF1Aプロモーター(配列番号43)である。この特定の実施形態では、本発明は、TNFRSF1Aレベルの低下または上昇によってTNFRSF1Aの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのTNFRSF1Aプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、TNFRSF1Aプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TNFRSF1Aによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域はTNFRSF1Bプロモーター(配列番号44)である。この特定の実施形態では、本発明は、TNFRSF1Bレベルの低下または上昇によってTNFRSF1Bの活性に影響を与えることに用いるための、およびこのタンパク質によって調節される疾患の治療に用いるためのTNFRSF1Bプロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に、本発明は、TNFRSF1Bプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、TNFRSF1Bによって調節される疾患を治療する方法にも関する。
さらに、本発明は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害、緑内障手術後の線維増殖を治療するための記載した人工転写因子、ならびに本発明の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む線維増殖および線維収縮性網膜障害を治療する方法にも関する。
本発明はさらに、本発明の人工転写因子をコードする核酸、これらを含むベクター、およびそのようなベクターを含む宿主細胞にも関する。
本発明は、抑制性もしくは活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合しており、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよい、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む人工転写因子、ならびにそのような人工転写因子を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子の発現を調節するための、およびそのような遺伝子によって引き起こされる、または調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用にも関する。
本発明の文脈において、プロモーターは、本技術分野で公知であるように、遺伝子の制御領域として定義される。やはり本文脈において、遺伝子は、本技術分野で公知であるように、制御配列とタンパク質またはRNAの産生をもたらす遺伝子産物のための配列とを含有するゲノム領域として定義される。本文脈において、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子は、その遺伝子産物が眼の組織損傷部位での細胞増殖調節に積極的に関与しているか、またはその遺伝子産物が傷害のない場合であっても誤って活性化状態であり、過剰な細胞増殖または瘢痕形成を促進する遺伝子である。
本発明の文脈において、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位は、エンドソームコンパートメントに存在するプロテアーゼによって配列特異的な形で認識され、開裂されるペプチド配列である。やはり本発明の文脈において、タンパク質形質導入ドメインは、人工転写因子などのタンパク質を、細胞膜を通して細胞内コンパートメント中に輸送することができるペプチドとして定義される。
本発明の文脈において、遺伝子プロモーターを「特異的に」標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、そのDNA標的に対して20nM以下の結合親和性を有する。
本発明において眼の不適合創傷治癒に関与すると考えられる遺伝子は、AGER(RAGE)、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR−3)、GJA1(CX43)、IGF1R、KDR(VEGFR−2)、MET(HGFR)、PDGFRA、PDGFRB、PNPLA2(PEDF−R)、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TNFRSF1A、およびTNFRSF1Bである。
人工転写因子は、遺伝子発現の調節に有用であり、従って、遺伝子発現の調節が有益である疾患の治療に有用である。従来の薬物は、特定のタンパク質の活性を、例えばアゴニストまたはアンタゴニスト活性によって調節するものであるが、人工転写因子は、遺伝子発現を増加または減少させることにより、このようなタンパク質の利用度を変化させるものである。
従来の小分子による手法を用いる場合、タンパク質活性の調節を通して作用する治療活性小分子の同定は、異なる物質のクラスからの広範な様々な異なる分子の中から大規模な時間の掛かるスクリーニング手順を行うことにほとんど依存しており、小分子による遺伝子発現の調節は、これまでのところ可能ではない。対照的に、本発明の人工転写因子はすべて、高度に確定された全体組成を有する同じ物質クラスに属している。2つの非常に多様なプロモーター配列を標的とする2つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づく人工転写因子は、それでも、少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を持ち、全体として類似する三次構造であり、迅速かつ経済的に、標準化された方法(以下で述べるように)を介して作製することができる。従って、本発明の人工転写因子は、1つの分子クラスに含まれ、非常に広く多様な一式の標的に対する極めて高い特異性と、類似する全体組成とを組み合わせるものである。すべての生物学的製剤に関しては、抗薬物抗体の形態の免疫原性およびそれに伴う免疫反応は懸念事項である。しかし、ジンクフィンガーモジュールの高い保存性により、そのような免疫反応は、本発明の人工転写因子の適用後、軽いかもしくは発生せず、または免疫原性は排除するが標的部位への結合、従って機能は依然として維持する全体構造への小さい変更によって、回避可能であるか、もしくはさらに最小限に抑制可能である。さらに、免疫原性を低減するために、本発明の人工転写因子をポリエチレングリコールで修飾することも考えられる。
人工転写因子は、特定の遺伝子のプロモーター領域へ特異的に作用するように仕立てられることから、人工転写因子の使用は、密接に関連するタンパク質であっても、それらを選択的に標的とすることを可能とする。これは、密接に関連するタンパク質であっても、プロモーター領域の保存性が緩いものでしかないことに基づいている。本発明の人工転写因子の高い選択性を利用することで、任意のタンパク質ファミリーの特定のメンバーの発現が多くの場合組織特異的であり、人工転写因子を用いて個々に対処可能であることに基づき、薬物作用の組織特異的な標的化さえも可能である。
加えて、人工転写因子の薬物への製剤は、過去の経験に頼ることが可能であり、それによって創薬プロセスがさらに加速される。
しかし、人工転写因子は、遺伝子発現の調節を通して作用することから、効果的となるためには、細胞の核コンパートメント中に存在する必要がある。現在のところ、人工転写因子の治療的送達のための方法の選択肢は、トランスフェクションを通してのプラスミドDNAの形態であるか、またはウイルスベクターを用いることによるものである。治療目的でのプラスミドトランスフェクションは効力が低く、一方ウイルスベクターは、極めて高い免疫原性の可能性を持ち、従って、これらを特定の治療に繰り返し適用することは制限される。従って、核酸としてではなくタンパク質の形態としての送達を例とする人工転写因子を送達するその他の方法が求められている。
タンパク質形質導入ドメイン(PTD)の媒介による人工転写因子の細胞内送達は、人工転写因子の高い選択性および多機能性を新規な様式で利用する新しい方法である。タンパク質形質導入ドメインは、細胞膜バリアを通過してカーゴタンパク質を細胞内へ送達することができる小ペプチドである。そのようなタンパク質形質導入ドメインは、例えば、HIV由来TATペプチド、mT02、mT03、R9、ANTPなどである。細胞への取り込みの様式は、恐らくはエンドサイトーシスによると考えられ、TATペプチドは、カーゴタンパク質と融合された場合、細胞型に依存しないマクロピノサイトーシスによる取り込みを誘発可能であることが示された(Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315)。細胞膜のバリアを通過し、エンドソーム小胞内に取り込まれることは、細胞へ進入する第一の工程であるが、位相幾何学的には、エンドソームコンパートメントの内部と細胞の外部とは同一である。従って、エンドソーム局在化は、細胞質または核質局在化と同等ではない。しかし、恐らくはエンドソームコンパートメントの漏出および/または膜の完全性の調節という意味でのカーゴもしくはタンパク質形質導入ドメインの何らかの固有の特性を通して、送達されたタンパク質は、エンドソームから脱出し、他の実際の細胞内標的に到達することができる。膜活性膜融合性ペプチドTAT−HA2、またはGALAもしくはKALAペプチドなどのその他のペプチドを共送達することにより、エンドソーム小胞の崩壊にある程度起因して、送達されたタンパク質のエンドソーム脱出が改善された。
しかし、膜融合性ペプチドは、期待された程は送達の促進に有効ではない。これは、タンパク質形質導入ドメインの固有の特性に起因している可能性がある。タンパク質形質導入ドメインは、細胞膜と強く相互作用を起こすことが知られている。この強い膜との相互作用は、タンパク質の内部移行、および従ってタンパク質の送達が引き起こされる機構の一部である。従って、エンドソームへの内部移行後、ここではエンドソーム膜の内部に対してであるタンパク質形質導入ドメインのこの強い膜相互作用が、エンドソーム小胞の破裂後であっても、再分布を実際に阻害している可能性がある。TAT融合人工転写因子は、ある程度の核局在化と共に、主としてエンドソームコンパートメントに存在し得る。興味深いことに、TAT−人工転写因子を染色した細胞の大部分において、破裂したエンドソーム小胞がサイトゾルに対して開放され、エンドソーム膜が明らかにTAT融合タンパク質で染色されていることを見出すことができ、このことは、エンドソーム膜の破裂後であっても、送達されたタンパク質のかなりの量がエンドソームにトラップされていることと一致する。従って、タンパク質形質導入ドメインは、細胞内への取り込みにとって不可欠ではあるが、タンパク質形質導入の発生後、有効な細胞内局在化を妨げる可能性がある。
エンドソームは、成熟して、プロテアーゼの獲得、ならびにリソソームコンパートメントとの融合前に小胞内pHの低下を示すこと、およびエンドソーム内容物のタンパク質分解などのリソソーム特性を獲得することが知られている非常に動的な小器官である。内腔のタンパク質分解活性の上昇を伴うエンドソーム成熟のプロセスは、タンパク質形質導入ドメインを用いて送達された治療タンパク質にとって有害であり、それは、そこでそのようなタンパク質がタンパク質分解を受けるからである。しかし、このプロセスは、利点に変えることができる。エンドソーム成熟は、異なるセットのプロテアーゼがpH依存的様式で異なる段階で活性化される逐次プロセスである。興味深いことに、タンパク質プロセッシングに関与するプロセスの初期に活性化されるプロテアーゼは、タンパク質の全般的な加水分解に不可欠である成熟過程の後期に活性化されるプロテアーゼよりも配列特異的である。ここで、タンパク質形質導入ドメインとカーゴタンパク質との間に初期エンドソームプロテアーゼの開裂部位を組み込むことにより、治療タンパク質がエンドソーム内腔に到達した後、カーゴタンパク質からタンパク質形質導入ドメインを分離する治療タンパク質の配列特異的消化が引き起こされる。従って、人工転写因子のTAT媒介送達後によく見られるエンドソームの破裂後、カーゴタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインの固有の特性に起因してエンドソーム膜の内部にはもはや結合されず、サイトゾル中へと脱出するために膜から脱離される。
さらに、本発明の人工転写因子は、核局在化配列(NLS)を含む。考慮される核局在化配列は、ジーンオントロジーGO:0008139によって定められるタンパク質との結合を通して核内移行を付与するアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基(K)、続いてリジン(K)またはアルギニン残基(R)、続いて任意のアミノ酸(X)、続いてリジンまたはアルギニン残基を含有する塩基性アミノ酸のクラスター(K−K/R−X−K/Rコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492)、またはSV40 NLS(配列番号45)であり、SV40 NLSが好ましい。
本発明の人工転写因子はまた、ジーンオントロジーGO:0001071によって定められるタンパク質のその他の転写活性タンパク質ドメインも含有してよく、N末端KRAB、C末端KRAB、SID、およびERDドメインなどであり、KRABまたはSIDが好ましい。考慮される活性化タンパク質ドメインは、ジーンオントロジーGO:0001071によって定められるタンパク質の転写活性ドメインであり、VP16またはVP64(VP16の四量体リピート)、CJ7、p65−TA1、SAD、NF−1、AP−2、SP1−A、SP1−B、Oct−1、Oct−2、Oct−2_5x、MTF−1、BTEB−2、およびLKLFなどであり、VP64が好ましい。
さらに、トランスフェクションによって、またはヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス系ベクターなどのウイルスベクターを介して導入される核酸の形態としての、本発明の人工転写因子のための別の選択肢としての送達方法も考慮される。
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、対応する核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または許容度改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
本発明の人工転写因子のドメインは、短鎖フレキシブルリンカー(short flexible linkers)で連結されていてよい。短鎖フレキシブルリンカーは、2から8個のアミノ酸を有し、好ましくは、グリシンおよびセリンである。考慮される特定のリンカーは、GGSGGS(配列番号46)である。人工転写因子はさらに、その検出および処理を容易とするために、エピトープタグなどのマーカーを含有してもよい。
任意のプロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子が標的遺伝子発現を生体内で調節するためには、それは、標的遺伝子のゲノム状況(genomic context)におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、DNA標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体DNAがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍(−1000から+200bp)は、内在性転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することは、生体内での所望される機能を有する人工転写因子作製の成功率を大きく高めることになる。
標的部位の選択は、機能的人工転写因子作製の成功のために極めて重要である。人工転写因子が標的遺伝子発現を生体内で調節するためには、それは、標的遺伝子のゲノム状況(genomic context)におけるその標的部位と結合する必要がある。これには、DNA標的部位へのアクセス性が必要であり、それは、この領域中の染色体DNAがヒストンの周囲に密に充填されたヌクレオソームとなっていないこと、およびメチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合に干渉しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は、密に充填され、転写不活性であるが、活発に転写される遺伝子の転写開始部位のすぐ近傍(−1000から+200bp)は、内在性転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写装置にとってアクセス可能である必要がある。従って、いずれの任意の標的遺伝子においても、この領域中の標的部位を選択することは、生体内での所望される機能を有する人工転写因子作製の成功率を大きく高めることになる。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の標的部位選択
転写開始部位の2000bp上流および500bp下流である不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域を、(G/CANN)6の一般組成を有する潜在的18bp標的部位の存在について分析し、ここで、Gはヌクレオチドグアニンであり、Cはヌクレオチドシトシン、Aはヌクレオチドアデニン、ならびにNは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表す。各プロモーター中の2つの標的部位を、転写開始部位に対するその位置に基づいて選択した。これらの標的部位は:AGER_TS1(配列番号47)、AGER_TS2(配列番号48)、EGFR_TS1(配列番号49)、EGFR_TS2(配列番号50)、FGFR1_TS1(配列番号51)、FGFR1_TS2(配列番号52)、FGFR2_TS1(配列番号53)、FGFR2_TS2(配列番号54)、FGFR3_TS1(配列番号55)、FGFR3_TS2(配列番号56)、FGFR4_TS1(配列番号57)、FGFR4_TS2(配列番号58)、FLT1_TS1(配列番号59)、FLT1_TS2(配列番号60)、FLT4_TS1(配列番号61)、FLT4_TS2(配列番号62)、GJA1_TS1(配列番号63)、GJA1_TS2(配列番号64)、IGF1R_TS1(配列番号65)、IGF1R_TS2(配列番号66)、KDR_TS1(配列番号67)、KDR_TS2(配列番号68)、MET_TS1(配列番号69)、MET_TS2(配列番号70)、PDGFRA_TS1(配列番号71)、PDGFRA_TS2(配列番号72)、PDGFRB_TS1(配列番号73)、PDGFRB_TS2(配列番号74)、PNPLA2_TS1(配列番号75)、PNPLA2_TS2(配列番号76)、TGFBR1_TS1(配列番号77)、TGFBR1_TS2(配列番号78)、TGFBR1_TS−390(配列番号79)、TGFBR2_TS1(配列番号80)、TGFBR2_TS2(配列番号81)、TGFBR3_TS1(配列番号82)、TGFBR3_TS2(配列番号83)、TNFRSF1A_TS1(配列番号84)、TNFRSF1A_TS2(配列番号85)、TNFRSF1B_TS1(配列番号86)、およびTNFRSF1B_TS2(配列番号87)である。
転写開始部位の2000bp上流および500bp下流である不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター領域を、(G/CANN)6の一般組成を有する潜在的18bp標的部位の存在について分析し、ここで、Gはヌクレオチドグアニンであり、Cはヌクレオチドシトシン、Aはヌクレオチドアデニン、ならびにNは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表す。各プロモーター中の2つの標的部位を、転写開始部位に対するその位置に基づいて選択した。これらの標的部位は:AGER_TS1(配列番号47)、AGER_TS2(配列番号48)、EGFR_TS1(配列番号49)、EGFR_TS2(配列番号50)、FGFR1_TS1(配列番号51)、FGFR1_TS2(配列番号52)、FGFR2_TS1(配列番号53)、FGFR2_TS2(配列番号54)、FGFR3_TS1(配列番号55)、FGFR3_TS2(配列番号56)、FGFR4_TS1(配列番号57)、FGFR4_TS2(配列番号58)、FLT1_TS1(配列番号59)、FLT1_TS2(配列番号60)、FLT4_TS1(配列番号61)、FLT4_TS2(配列番号62)、GJA1_TS1(配列番号63)、GJA1_TS2(配列番号64)、IGF1R_TS1(配列番号65)、IGF1R_TS2(配列番号66)、KDR_TS1(配列番号67)、KDR_TS2(配列番号68)、MET_TS1(配列番号69)、MET_TS2(配列番号70)、PDGFRA_TS1(配列番号71)、PDGFRA_TS2(配列番号72)、PDGFRB_TS1(配列番号73)、PDGFRB_TS2(配列番号74)、PNPLA2_TS1(配列番号75)、PNPLA2_TS2(配列番号76)、TGFBR1_TS1(配列番号77)、TGFBR1_TS2(配列番号78)、TGFBR1_TS−390(配列番号79)、TGFBR2_TS1(配列番号80)、TGFBR2_TS2(配列番号81)、TGFBR3_TS1(配列番号82)、TGFBR3_TS2(配列番号83)、TNFRSF1A_TS1(配列番号84)、TNFRSF1A_TS2(配列番号85)、TNFRSF1B_TS1(配列番号86)、およびTNFRSF1B_TS2(配列番号87)である。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする人工転写因子
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の特定の標的部位を標的とする特定の六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いたBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から成るか、または改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択される。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の特定の標的部位を標的とする特定の六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いたBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から成るか、または改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択される。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーター内の標的部位に特異的である六量体ジンクフィンガーは:AGER_1(配列番号88)、AGER_2(配列番号89)、EGFR_1(配列番号90)、EGFR_2(配列番号91)、FGFR1_1(配列番号92)、FGFR1_2(配列番号93)、FGFR2_1(配列番号94)、FGFR2_2(配列番号95)、FGFR3_1(配列番号96)、FGFR3_2(配列番号97)、FGFR4_1(配列番号98)、FGFR4_2(配列番号99)、FLT1_1(配列番号100)、FLT1_2(配列番号101)、FLT4_1(配列番号102)、FLT4_2(配列番号103)、GJA1_1(配列番号104)、GJA1_2(配列番号105)、IGF1R_1(配列番号106)、IGF1R_2(配列番号107)、KDR_1(配列番号108)、KDR_2(配列番号109)、MET_1(配列番号110)、MET_2(配列番号111)、PDGFRA_1(配列番号112)、PDGFRA_2(配列番号113)、PDGFRB_1(配列番号114)、PDGFRB_2(配列番号115)、PNPLA2_1(配列番号116)、PNPLA2_2(配列番号117)、TGFBR1_1(配列番号118)、TGFBR1_2(配列番号119)、TGRBR1−390B(配列番号120)、TGFBR2_1(配列番号121)、TGFBR2_2(配列番号122)、TGFBR3_1(配列番号123)、TGFBR3_2(配列番号124)、TNFRSF1A_1(配列番号125)、TNFRSF1A_2(配列番号126)、TNFRSF1B_1(配列番号127)、およびTNFRSF1B_2(配列番号128)である。
抑制性形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質を、タンパク質形質導入ドメインTATならびに転写抑制ドメインSIDと融合させて、人工転写因子AGER_1rep(配列番号129)、AGER_2rep(配列番号130)、EGFR_1rep(配列番号131)、EGFR_2rep(配列番号132)、FGFR1_1rep(配列番号133)、FGFR1_2rep(配列番号134)、FGFR2_1rep(配列番号135)、FGFR2_2rep(配列番号136)、FGFR3_1rep(配列番号137)、FGFR3_2rep(配列番号138)、FGFR4_1rep(配列番号139)、FGFR4_2rep(配列番号140)、FLT1_1rep(配列番号141)、FLT1_2rep(配列番号142)、FLT4_1rep(配列番号143)、FLT4_2rep(配列番号144)、GJA1_1rep(配列番号145)、GJA1_2rep(配列番号146)、IGF1R_1rep(配列番号147)、IGF1R_2rep(配列番号148)、KDR_1rep(配列番号149)、KDR_2rep(配列番号150)、MET_1rep(配列番号151)、MET_2rep(配列番号152)、PDGFRA_1rep(配列番号153)、PDGFRA_2rep(配列番号154)、PDGFRB_1rep(配列番号155)、PDGFRB_2rep(配列番号156)、TGFBR1_1rep(配列番号157)、TGFBR1_2rep(配列番号158)、TGFBR1−390Brep(配列番号159)、TGFBR2_1rep(配列番号160)、TGFBR2_2rep(配列番号161)、TGFBR3_1rep(配列番号162)、TGFBR3_2rep(配列番号163)、TNFRSF1A_1rep(配列番号164)、TNFRSF1A_2rep(配列番号165)、TNFRSF1B_1rep(配列番号166)、およびTNFRSF1B_2rep(配列番号167)を得た。
標的化した活性化形質導入可能人工転写因子を作製するために、六量体ジンクフィンガータンパク質を、タンパク質形質導入ドメインTATならびに転写活性化ドメインVP64と融合させて、人工転写因子PNPLA2_1akt(配列番号168)およびPNPLA2_2akt(配列番号169)を得た。
また、五量体、六量体、七量体、または八量体ジンクフィンガータンパク質を含有する本発明の人工転写因子も考慮され、ここで、対応する核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和性を改善するために、または許容度改善のためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的プロファイルを改変するために、個々のジンクフィンガーモジュールが交換される。
別の特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする本発明の人工転写因子は、配列番号88から128のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、3個までの、好ましくは1もしくは2個の個々のジンクフィンガーモジュールが、その標的配列への人工転写因子の結合を調節するために、別の選択肢としての結合特性を持つその他のジンクフィンガーモジュールと交換され、および/またはここで、12個までの、例えば12、11、10、もしくは9、特に、8、7、6、もしくは5、好ましくは、4、もしくは3、最も好ましくは、1もしくは2個の個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換される。
特定の実施形態では、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターを標的とする人工転写因子は、配列番号88から128のジンクフィンガーモジュール組成に基づくジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、3個までの、好ましくは1もしくは2個の個々のジンクフィンガーモジュールが、その標的配列への人工転写因子の結合を調節するために、別の選択肢としての結合特性を持つその他のジンクフィンガーモジュールと交換されていてよく、および/または、ここで、12個までの、最も好ましくは、1もしくは2個の個々のアミノ酸が、意図する標的部位への結合親和性は維持すると同時に考え得る免疫原性を最小限に抑える目的で、交換されていてよく、ならびにここで、転写調節ドメインは、VP16、VP64、N−KRAB、C−KRAB、SID、またはERDである。
受容体プロモーター活性の制御における人工転写因子の活性
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターによって駆動される転写に影響を与える人工転写因子の能力を評価するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイが用いられる。この目的を達成するために、そのようなプロモーターからの発現を駆動させることのできる細胞が、デュアルレポータープラスミドと共に人工転写因子発現プラスミドで共トランスフェクトされる。デュアルレポータープラスミドは、NEG−PG04およびEF1a−PG04プラスミド(ジーンコポエイア(GeneCopoeia)、ロックビル、メリーランド州)をベースとして、調べられるべき遺伝子プロモーターの制御下の分泌型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を、構成的CMVプロモーターの制御下の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)に対する遺伝子と共に含有する。この共トランスフェクションは、レポータープラスミドでトランスフェクトされた細胞中における人工転写因子発現の存在を確保するために、3:1の人工転写因子発現プラスミド:レポータープラスミド比で行われ、ガウシアルシフェラーゼおよびSEAPの活性が、製造元の推奨に従って測定される(Gaussia Luciferase Glow Assay Kit、ピアース(Pierce);SEAP Reporter Gene Assay Chemiluminescence、ロシュ(Roche))。ルシフェラーゼの値は、SEAPの活性に対して標準化され、ジンクフィンガードメイン内のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換された人工転写因子の不活性変異体を発現するコントロール細胞と比較される。トランスフェクトされた細胞の上澄中におけるルシフェラーゼ活性とSEAP活性との間の比率を測定することにより、人工転写因子プラスミドでトランスフェクトされた細胞のみにおける、受容体プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ発現のSEAP発現に対する標準化が可能である。このルシフェラーゼ発現試験は、3つの反復サンプルで少なくとも3回行われ、平均され、コントロールトランスフェクション細胞と比較され、コントロールに対する%による相対ルシフェラーゼ活性(RLuA)として表され、SEMを示すエラーバーと共にプロットされる。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターによって駆動される転写に影響を与える人工転写因子の能力を評価するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイが用いられる。この目的を達成するために、そのようなプロモーターからの発現を駆動させることのできる細胞が、デュアルレポータープラスミドと共に人工転写因子発現プラスミドで共トランスフェクトされる。デュアルレポータープラスミドは、NEG−PG04およびEF1a−PG04プラスミド(ジーンコポエイア(GeneCopoeia)、ロックビル、メリーランド州)をベースとして、調べられるべき遺伝子プロモーターの制御下の分泌型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を、構成的CMVプロモーターの制御下の分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)に対する遺伝子と共に含有する。この共トランスフェクションは、レポータープラスミドでトランスフェクトされた細胞中における人工転写因子発現の存在を確保するために、3:1の人工転写因子発現プラスミド:レポータープラスミド比で行われ、ガウシアルシフェラーゼおよびSEAPの活性が、製造元の推奨に従って測定される(Gaussia Luciferase Glow Assay Kit、ピアース(Pierce);SEAP Reporter Gene Assay Chemiluminescence、ロシュ(Roche))。ルシフェラーゼの値は、SEAPの活性に対して標準化され、ジンクフィンガードメイン内のすべてのシステイン残基がセリン残基に交換された人工転写因子の不活性変異体を発現するコントロール細胞と比較される。トランスフェクトされた細胞の上澄中におけるルシフェラーゼ活性とSEAP活性との間の比率を測定することにより、人工転写因子プラスミドでトランスフェクトされた細胞のみにおける、受容体プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ発現のSEAP発現に対する標準化が可能である。このルシフェラーゼ発現試験は、3つの反復サンプルで少なくとも3回行われ、平均され、コントロールトランスフェクション細胞と比較され、コントロールに対する%による相対ルシフェラーゼ活性(RLuA)として表され、SEMを示すエラーバーと共にプロットされる。
眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子に対する人工転写因子活性の評価
不適合創傷治癒プロセスにプラスの影響を与えるために、本発明の人工転写因子は、傷害後の細胞増殖を制限する。本発明の人工転写因子のこの機能を評価するために、不適合創傷治癒に関与する遺伝子を発現する細胞は、本発明の特定の人工転写因子で処理され、傷害後の創傷治癒速度が、電気細胞−基質インピーダンスセンシング(electric cell-substrate impedance sensing)(ECIS)を用いて測定される。このために、細胞は、96ウェルプレート(アプライドバイオフィジクス(Applied BioPhysics))中の金電極上で増殖され、人工転写因子で0、24、48、72、および96時間処理される。人工転写因子の不活性変異体で処理された細胞が、コントロールとして用いられる。ECISを用いて、高電圧の短パルスを適用することによって、細胞層の傷害前の細胞層のベースラインインピーダンスが、>40kHzで測定される。傷害後、コントロール細胞が閉じた細胞層を形成するまで、ECISを用いて細胞層の再形成がリアルタイムで追跡される。処理細胞のインピーダンス測定をコントロール細胞と比較することで、不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに特異的である人工転写因子の細胞増殖制限活性が明らかとなる。
不適合創傷治癒プロセスにプラスの影響を与えるために、本発明の人工転写因子は、傷害後の細胞増殖を制限する。本発明の人工転写因子のこの機能を評価するために、不適合創傷治癒に関与する遺伝子を発現する細胞は、本発明の特定の人工転写因子で処理され、傷害後の創傷治癒速度が、電気細胞−基質インピーダンスセンシング(electric cell-substrate impedance sensing)(ECIS)を用いて測定される。このために、細胞は、96ウェルプレート(アプライドバイオフィジクス(Applied BioPhysics))中の金電極上で増殖され、人工転写因子で0、24、48、72、および96時間処理される。人工転写因子の不活性変異体で処理された細胞が、コントロールとして用いられる。ECISを用いて、高電圧の短パルスを適用することによって、細胞層の傷害前の細胞層のベースラインインピーダンスが、>40kHzで測定される。傷害後、コントロール細胞が閉じた細胞層を形成するまで、ECISを用いて細胞層の再形成がリアルタイムで追跡される。処理細胞のインピーダンス測定をコントロール細胞と比較することで、不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに特異的である人工転写因子の細胞増殖制限活性が明らかとなる。
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合(PEG化)が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが1から40キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、ジンク配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、そのジンク配位に起因してPEG化のためのアクセス性がなく、従って、1もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたPEG化のための遊離チオール基が提供される。
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合による結合(PEG化)が、人工転写因子の溶解性向上、その腎クリアランスの低減、およびその免疫原性の制御のために考慮される。考慮されるのは、サイズが1から40キロダルトンの範囲であるアミンさらにはチオール反応性ポリエチレングリコールである。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いることで、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子中の唯一の必須チオール基含有アミノ酸は、ジンク配位に必須であるジンクフィンガーモジュール中に位置するシステイン残基である。このようなチオール基は、そのジンク配位に起因してPEG化のためのアクセス性がなく、従って、1もしくは複数のシステイン残基を本発明の人工転写因子に含めることで、チオール特異的ポリエチレングリコール試薬を用いたPEG化のための遊離チオール基が提供される。
医薬組成物
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与用の組成物、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与用の組成物、特に経眼局所投与用の組成物(例えば点眼剤としての経眼局所投与用の組成物)、または硝子体内、結膜下、眼球周囲(parabulbar)、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、眼球周囲、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、遅延放出製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与の様式に応じて異なる。
本発明はまた、上記で定める人工転写因子を含む医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、特にはヒトに対する注射全身投与用の組成物、特に静脈内投与用の組成物、吸入投与用の組成物、および局所投与用の組成物、特に経眼局所投与用の組成物(例えば点眼剤としての経眼局所投与用の組成物)、または硝子体内、結膜下、眼球周囲(parabulbar)、もしくは眼球後投与用の組成物である。点眼剤、および硝子体内、結膜下、眼球周囲、もしくは眼球後投与用組成物が特に好ましい。組成物は、活性成分を単独で含むか、または、好ましくは、薬学的に許容されるキャリアと一緒に含む。さらに、遅延放出製剤も考慮される。活性成分の用量は、治療されるべき疾患に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与の様式に応じて異なる。
さらに、経口送達に有用である医薬組成物、特に、適切にカプセル化された活性成分を含む組成物、またはそれ以外で胃での分解に対して保護された組成物も考慮される。例えば、そのような医薬組成物は、膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含有してよく、腸溶コーティングで覆われてもよい。
医薬組成物は、およそ1%からおよそ95%の活性成分を含む。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で作製され、例えば、従来の混合、溶解、または凍結乾燥プロセスである。
活性成分の溶液の使用、ならびに懸濁液または分散液、特には等張性水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましく、これらは、例えば、活性成分を単独で、またはマンニトールを例とするキャリアと共に含む凍結乾燥組成物の場合、使用前に作製されてよい。医薬組成物は、滅菌されてよく、ならびに/または保存剤、安定化剤、湿潤剤および/もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧制御のための塩、および/もしくはバッファーを例とする賦形剤を含んでよく、例えば従来の溶解および凍結乾燥プロセスによるなど、それ自体公知である方法で作製される。前記溶液または懸濁液は、典型的にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、もしくはゼラチンである増粘剤、またはTween 80(商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタン モノオレエート)を例とする可溶化剤も含んでよい。
油中の懸濁液は、油成分として、注射目的として慣習的である植物油、合成油、または半合成油を含む。それに関して、8から22個、特には12から22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含有する液体脂肪酸エステルが特に言及されてよい。このような脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大で6個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコールであり、特には、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油が特に有用である。
注射用製剤の製造は、通常、滅菌条件下で行われ、例えばアンプルまたはバイアルへの充填、および容器のシールも同様である。
非経口投与の場合、水溶性形態、例えば水溶性塩である活性成分の水溶液、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/もしくはデキストランを例とする増粘剤、ならびに所望される場合は安定化剤を含有する水性注射用懸濁液が特に適している。活性成分は、所望に応じて賦形剤と一緒に、凍結乾燥剤の形態であってもよく、非経口投与の前に、適切な溶媒を添加することによって溶液とされてよい。
吸入用組成物は、スプレーとしてのエアロゾルの形態で、ミスト、または液滴の形態で投与されてよい。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネビュライザーで、すなわち、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを例とする適切な噴射剤を用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された医薬の短い噴出の形態で気道または肺へ特定量の医薬を送達する装置で送達することができる溶液または懸濁液から作製される。また、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースと共に、吸入用粉末スプレーを提供することも可能である。
点眼剤は、好ましくは、組成物を涙液と等張性(295〜305mOsm/L)とする適切な剤を含む活性成分の等張性水溶液である。考慮される剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに、組成物は、pHを5から8、好ましくは7.0から7.4に維持するために、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはTrisバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン)を例とするバッファーも含む。組成物はさらに、パラベン、塩化ベンザルコニウムなどの四級アンモニウム塩、ポリヘキサメチレンビグアニジン(PHMB)などを例とする抗微生物保存剤を含有してよい。点眼剤はさらに、ゲル様点眼剤を作製するためにキサンタンガムを、および/またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、もしくはポリビニルピロリドンなどのその他の増粘剤を含有してもよい。
治療方法における人工転写因子の使用
さらに、本発明は、眼の局所的傷害後の細胞応答に影響を及ぼすのに用いるための、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに対して指向される人工転写因子に関する。同様に、本発明は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害、ならびに緑内障手術に関連する線維増殖を治療する方法にも関し、その方法は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに指向される人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。本発明の人工転写因子の有効量は、治療されるべき特定の疾患の種類に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。眼への投与の場合、月1回の0.5から1mgの硝子体内注射が好ましい。全身投与の場合、月1回の10mg/kgの注射が好ましい。加えて、眼の硝子体内に遅延放出デポ剤(slow release deposits)を埋め込むことも好ましい。
さらに、本発明は、眼の局所的傷害後の細胞応答に影響を及ぼすのに用いるための、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに対して指向される人工転写因子に関する。同様に、本発明は、網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜上膜などの線維収縮性網膜障害、ならびに緑内障手術に関連する線維増殖を治療する方法にも関し、その方法は、眼の不適合創傷治癒に関与する遺伝子のプロモーターに指向される人工転写因子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。本発明の人工転写因子の有効量は、治療されるべき特定の疾患の種類に応じて異なり、ならびに、種、その年齢、体重、および個々の病状、個々の薬物動態データ、ならびに投与のモードに応じて異なる。眼への投与の場合、月1回の0.5から1mgの硝子体内注射が好ましい。全身投与の場合、月1回の10mg/kgの注射が好ましい。加えて、眼の硝子体内に遅延放出デポ剤(slow release deposits)を埋め込むことも好ましい。
DNAプラスミドのクローニング
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)は、プロメガ(Promega)からである。高正確性Platinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen))を、すべての標準的PCR反応に適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kit、NucleoSpin Plasmid kit、またはNucleoBond Xtra Midi Plus kit(マッハライ・ナーゲル(Macherey-Nagel))を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するDNA配列は、配列決定によって確認した(マイクロシンス(Microsynth))。
すべてのクローニング工程において、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)は、プロメガ(Promega)からである。高正確性Platinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン(Invitrogen))を、すべての標準的PCR反応に適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kit、NucleoSpin Plasmid kit、またはNucleoBond Xtra Midi Plus kit(マッハライ・ナーゲル(Macherey-Nagel))を用い、製造元の説明書に従って単離する。オリゴヌクレオチドは、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)から購入する。新たに作製されたプラスミドのすべての該当するDNA配列は、配列決定によって確認した(マイクロシンス(Microsynth))。
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(ゲンスクリプト(GenScript))に挿入することで、それぞれ、pAN1049(配列番号170)、pAN1073(配列番号171)、およびpAN1670(配列番号172)を得た。pBluescript SK(+)ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のZFモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、pBluescript(および1ZFP、2ZFP、または3ZFPを含有するその誘導産物)、およびpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を、まず1つの制限酵素でインキュベートし、その後、SAPで処理する。NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含有する六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改良を加えたGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(ゲンスクリプト(GenScript))に挿入することで、それぞれ、pAN1049(配列番号170)、pAN1073(配列番号171)、およびpAN1670(配列番号172)を得た。pBluescript SK(+)ベクター中に、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーを段階的に組み立てる。各個別のクローニング工程の過程で複数のZFモジュールが挿入されて非機能性タンパク質が得られることを回避するために、pBluescript(および1ZFP、2ZFP、または3ZFPを含有するその誘導産物)、およびpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を、まず1つの制限酵素でインキュベートし、その後、SAPで処理する。NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて酵素を除去し、その後、第二の制限エンドヌクレアーゼを添加する。
pBluescript−1ZFPLのクローニングは、5μgのpBluescriptを、XhoI、SAP、および続いてSpeIで処理することによって行う。インサートは、10μgのpAN1049(16の異なるGNN ZFモジュールを放出)またはpAN1073(15の異なるCNN ZFモジュールを放出)またはpAN1670(15の異なるANN ZFモジュールを放出)を、SpeI、SAP、および続いてXhoIと共にインキュベートすることによって作製する。pBluescript−2ZFPLおよびpBluescript−3ZFPLの作製の場合、7μgのpBluescript−1ZFPLまたはpBluescript−2ZFPLを、AgeIで切断し、脱リン酸化し、SpeIで切断する。インサートは、それぞれ10μgのpAN1049またはpAN1073またはpAN1670に、SpeI、SAP、および続いてXmalを適用することによって得る。pBluescript−6ZFPLのクローニングは、14μgのpBluescript−3ZFPLを、AgeI、SAP、およびその後SpeIで処理することによって行い、切断ベクターを得た。3ZFPLインサートは、SpeI、SAP、および続いてXmaIと共にインキュベートすることにより、20μgのpBluescript−3ZFPLから放出された。
1、2、および3つのZFPを含有するライブラリーにおける連結反応は、インサート:ベクターのモル比3:1で設定し、200ngの切断ベクター、400UのT4 DNAリガーゼを合計体積20μLで用い、室温で一晩行った。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーの連結反応は、2000ngのpBluescript−3ZFPL、500ngの3ZFPLインサート、4000UのT4 DNAリガーゼを合計体積200μL中に含有させ、これを、10の20μLに分割し、別々に室温で一晩インキュベートした。連結反応の一部を、各ライブラリーに対して必要とされるクローンの数に応じたいくつかの方法によって大腸菌中にトランスフォームした。pBluescript−1ZFPLおよびpBluescript−2ZFPLの作製の場合、3μLの連結反応を、大腸菌NEB5−アルファのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いた。pBluescript−3ZFPLの連結反応のプラスミドDNAは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌NEB5−アルファにトランスフォームした(エクイバイオ(EquiBio)製EasyjecT Plusエレクトロポレーターまたはエッペンドルフ(Eppendorf)製Multiporator、2.5kVおよび25μF、バイオラッド(Bio-Rad)製2mm エレクトロポレーションキュベット)。pBluescript−6ZFPライブラリーの連結反応は、NucleoSpin Gel and PCR Clean−up kitに適用し、DNAを15μLの脱イオン水で溶出した。約60ngの脱塩DNAを、50μLのNEB 10−ベータ エレクトロコンピテント大腸菌(ニューイングランドバイオラボズ)と混合し、EasyjecT PlusまたはMultiporator、2.5kV、25μF、および2mm エレクトロポレーションキュベットを用い、製造元の推奨に従ってエレクトロポレーションを行った。各ライブラリーに対して複数のエレクトロポレーションを行い、その後、細胞を直接プールしてライブラリーのサイズを拡張した。ヒートショックトランスフォーメーションまたはエレクトロポレーションの後、SOC媒体をこの細菌に適用し、37℃および250rpmでの1時間のインキュベーションの後、30μLのSOC培養物を段階希釈に用い、アンピシリンを含有するLBプレートに播種した。翌日、得られたライブラリークローンの総数を特定した。加えて、各ライブラリーの10のクローンを選択して、プラスミドDNAを単離し、制限酵素消化によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドのうちの少なくとも3つを配列決定し、ライブラリーの多様性を確認した。残りのSOC培養物を、アンピシリンを含有する100mLのLB培地に移し、37℃および250rpmで一晩培養した。これらの細胞を用いて、各ライブラリーに対するプラスミドMidi DNAを作製した。
酵母ワンハイブリッドスクリーンのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、互換性プレイベクター(compatible prey vector)に導入する。この目的のために、pGAD10(クロンテック(Clontech))の多重クローニング部位を、ベクターをXhoI/EcoRIで切断し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドOAN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC、配列番号173)およびOAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG、配列番号174)を挿入することによって修飾した。得られたベクターpAN1025(配列番号175)を切断し、脱リン酸化し、6ZFPライブラリーインサートを、XhoI/SpeIによってpBluescript−6ZFPLから放出させる。連結反応、およびNEB 10−ベータ エレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションは、pBluescript−6ZFPライブラリーについて上述した通りに行った。
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターpAN1375(配列番号176)にも導入する。このプレイベクターは、以下のようにして構築した:pRS315(配列番号177)を、ApaI/NarIで切断し、アニーリングしたOAN1143(CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC、配列番号178)およびOAN1144(TGCATGAATGCATGCGG、配列番号179)を挿入して、pAN1373(配列番号180)を得た。pAN1025からのSphIインサートを、SphIで切断したpAN1373に連結して、pAN1375を得た。
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、改良プレイベクターpAN1920(配列番号181)にも導入する。
なおさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを、プレイベクターpAN1992(配列番号182)にも挿入する。
酵母ワンハイブリッドスクリーニング用のベイトプラスミドのクローニング 各ベイトプラスミドにおいて、中心部に18bpの潜在的人工転写因子標的部位を持つ60bpの配列を選択し、制限分析のためにNcoI部位を含める。オリゴヌクレオチドの設計およびアニーリングは、5’HindIIIおよび3’XhoI部位が生成されるように行い、それによって、HindIII/XhoIで切断されたpAbAi(クロンテック)に直接連結可能となる。産物のNcoIによる消化および配列決定を用いて、ベイトプラスミドの組み立てを確認する。
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Goldを、クロンテックから、YPD培地およびYPDカンテンをカールロス(Carl Roth)から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/L グルコース、6.8g/L Na2HPO4・2H2O、9.7g/L NaH2PO4・2H2O(すべてカールロスより)、1.4g/L 酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/L 酵母窒素ベース、0.1g/L L−トリプトファン、0.1g/L L−ロイシン、0.05g/L L−アデニン、0.05g/L L−ヒスチジン、0.05g/L ウラシル(すべてシグマアルドリッチより)を含有していた。SD−U培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、SD−Lは、L−ロイシンなしで作製した。SDカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、16g/L Bacto Agar(BD)を含有していた。オーレオバシジンA(AbA)は、クロンテックから購入した。
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Goldを、クロンテックから、YPD培地およびYPDカンテンをカールロス(Carl Roth)から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/L グルコース、6.8g/L Na2HPO4・2H2O、9.7g/L NaH2PO4・2H2O(すべてカールロスより)、1.4g/L 酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/L 酵母窒素ベース、0.1g/L L−トリプトファン、0.1g/L L−ロイシン、0.05g/L L−アデニン、0.05g/L L−ヒスチジン、0.05g/L ウラシル(すべてシグマアルドリッチより)を含有していた。SD−U培地は、ウラシル以外のすべての成分を含有し、SD−Lは、L−ロイシンなしで作製した。SDカンテンプレートは、リン酸ナトリウムを含有していないが、16g/L Bacto Agar(BD)を含有していた。オーレオバシジンA(AbA)は、クロンテックから購入した。
ベイト酵母株の調製
約5μgの各ベイトプラスミドを、全体積20μL中、BstBIで線状化し、反応ミックスの半分を、S・セレビシエ Y1H Goldのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて5mLのYPD培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の1ミリリットルを、新しいYPD培地で1:20に希釈し、30℃、225rpmで2〜3時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、1OD600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、1mLの滅菌水で1回、1mLのTE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗浄する。最後に、酵母細胞を、50μLのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精子由来一本鎖DNA(シグマアルドリッチ)、10μLのBstBI線状化ベイトプラスミド(上記参照)、および300μLのPEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(重量/体積)PEG3350)と混合する。細胞およびDNAを、ローラー上、室温にて20分間インキュベートし、その後、42℃のウォーターバス中に15分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、100μLの滅菌水に再懸濁し、SD−Uカンテンプレート上に広げる。30℃での3日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのSD−U上で増殖する8つのクローンを選択して、オーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに5つの1:10の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの5μLを、SD−U、SD−U 100ng/mL AbA、SD−U 150ng/mL AbA、およびSD−U 200ng/mL AbAを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。30℃で3日間のインキュベーションの後、SD−U上で良好に増殖し、AbAに対して最も感受性の高い3つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(クロンテック)によって、製造元の説明に従って確認する。3つのクローンのうちの1つを、続いてのY1Hスクリーニングに用いる。
約5μgの各ベイトプラスミドを、全体積20μL中、BstBIで線状化し、反応ミックスの半分を、S・セレビシエ Y1H Goldのヒートショックトランスフォーメーションに直接用いる。トランスフォーメーションの前日に、酵母細胞を用いて5mLのYPD培地に播種し、室温にてローラー上で一晩増殖させる。このプレ培養物の1ミリリットルを、新しいYPD培地で1:20に希釈し、30℃、225rpmで2〜3時間インキュベートする。各トランスフォーメーション反応において、1OD600の細胞を遠心分離で回収し、酵母細胞を、1mLの滅菌水で1回、1mLのTE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗浄する。最後に、酵母細胞を、50μLのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精子由来一本鎖DNA(シグマアルドリッチ)、10μLのBstBI線状化ベイトプラスミド(上記参照)、および300μLのPEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(重量/体積)PEG3350)と混合する。細胞およびDNAを、ローラー上、室温にて20分間インキュベートし、その後、42℃のウォーターバス中に15分間配置する。最後に、酵母細胞を遠心分離で回収し、100μLの滅菌水に再懸濁し、SD−Uカンテンプレート上に広げる。30℃での3日間のインキュベーションの後、各トランスフォーメーション反応からのSD−U上で増殖する8つのクローンを選択して、オーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。プレ培養物を、ローラー上、室温にて一晩増殖させた。各培養物において、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調節した。この第一の希釈物から、滅菌水を用いて、さらに5つの1:10の段階希釈物を作製した。各クローンにおいて、各段階希釈物からの5μLを、SD−U、SD−U 100ng/mL AbA、SD−U 150ng/mL AbA、およびSD−U 200ng/mL AbAを含有するカンテンプレート上にスポッティングした。30℃で3日間のインキュベーションの後、SD−U上で良好に増殖し、AbAに対して最も感受性の高い3つのクローンを選択して、さらなる分析を行う。ベイトプラスミドの酵母ゲノム中への安定な組み込みは、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(クロンテック)によって、製造元の説明に従って確認する。3つのクローンのうちの1つを、続いてのY1Hスクリーニングに用いる。
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質導入
約500μLの酵母ベイト菌株プレ培養物を、1LのYPD培地中に希釈し、OD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)、30℃および225rpmでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する(5分間、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、400μLのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて3分間インキュベートする。細胞−DNA懸濁液を、予め冷却しておいた2mm エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を(EasyjecT PlusエレクトロポレーターまたはMultiporator、2.5kV、および25μF)、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、100mLのYPD:1M ソルビトール 1:1ミックスに移し、30℃、225rpmで60分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、1〜2mLのSD−L培地に再懸濁する。200μLのアリコートを、1000〜4000ng/mL AbAを含有する15cm SD−Lカンテンプレート上に広げる。さらに、50μLの細胞懸濁液を用いて、1/100および1/1000希釈物を作製し、50μLの未希釈および希釈細胞を、SD−L上に播種する。すべてのプレートを、30℃で3日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のSD−Lプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、AbA含有SD−Lプレートは、プレイ6ZFPがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
約500μLの酵母ベイト菌株プレ培養物を、1LのYPD培地中に希釈し、OD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)、30℃および225rpmでインキュベートする。細胞を、スイングアウトローターによる遠心分離で回収する(5分間、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の作製は、Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各トランスフォーメーション反応において、400μLのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を、1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混合し、氷上にて3分間インキュベートする。細胞−DNA懸濁液を、予め冷却しておいた2mm エレクトロポレーションキュベットに移す。複数のエレクトロポレーション反応を(EasyjecT PlusエレクトロポレーターまたはMultiporator、2.5kV、および25μF)、すべての酵母細胞懸濁液がトランスフォームされるまで行う。エレクトロポレーションの後、酵母細胞を、100mLのYPD:1M ソルビトール 1:1ミックスに移し、30℃、225rpmで60分間インキュベートする。細胞を遠心分離で回収し、1〜2mLのSD−L培地に再懸濁する。200μLのアリコートを、1000〜4000ng/mL AbAを含有する15cm SD−Lカンテンプレート上に広げる。さらに、50μLの細胞懸濁液を用いて、1/100および1/1000希釈物を作製し、50μLの未希釈および希釈細胞を、SD−L上に播種する。すべてのプレートを、30℃で3日間インキュベートする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体のプレートから算出する。未希釈細胞のSD−Lプレートは、すべての形質転換体の増殖を示しているが、AbA含有SD−Lプレートは、プレイ6ZFPがそのベイト標的部位と良好に結合した場合にのみ、コロニー形成が見られた。
正の相互作用の検証と6ZFPをコードするプレイプラスミドの回復
初期分析において、40の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のAbAを含有するSD−Lプレートから取り出し、酵母細胞を、1000〜4000ng/mL AbAのSD−L上に2回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、1つのコロニーを用いて、5mL SD−L培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調節し、さらに5つの1/10希釈物を作製し、各段階希釈物の5μLを、SD−L、SD−L 500ng/mL AbA、1000ng/mL AbA、SD−L 1500ng/mL AbA、SD−L 2000ng/mL AbA、SD−L 2500ng/mL AbA、SD−L 3000ng/mL AbA、およびSD−L 4000ng/mL AbAプレート上にスポッティングする。クローンを、高AbA濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、5mLの初期SD−Lプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを100μLの水または残りの培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマアルドリッチ、L2524)を添加後、細胞を37℃、300rpmにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト(spheroblasts)を、10μLの20%(重量/体積)SDS溶液を添加することで溶解し、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−20℃で少なくとも1時間凍結させる。その後、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA1バッファー、およびスパチュラ1杯分のガラスビーズ(シグマアルドリッチ、G8772)を添加し、チューブを、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA2バッファーを添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートし、その後NucleoSpin Plasmid kitプロトコルを継続することによってさらに改善される。30μLの溶出バッファーによる溶出後、5μLのプラスミドDNAを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌DH5アルファにトランスフォームする。2つの別々のコロニーを、アンピシリン含有LBプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する6ZFP間のコンセンサス配列について分析する。
初期分析において、40の良好なサイズのコロニーを、最も高い濃度のAbAを含有するSD−Lプレートから取り出し、酵母細胞を、1000〜4000ng/mL AbAのSD−L上に2回再度画線し、単一コロニーを得た。各クローンにおいて、1つのコロニーを用いて、5mL SD−L培地に播種し、細胞を室温で一晩増殖させる。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調節し、さらに5つの1/10希釈物を作製し、各段階希釈物の5μLを、SD−L、SD−L 500ng/mL AbA、1000ng/mL AbA、SD−L 1500ng/mL AbA、SD−L 2000ng/mL AbA、SD−L 2500ng/mL AbA、SD−L 3000ng/mL AbA、およびSD−L 4000ng/mL AbAプレート上にスポッティングする。クローンを、高AbA濃度で増殖する能力に従ってランク付けする。最も良好に増殖したクローンから、5mLの初期SD−Lプレ培養物を用いて細胞の遠心沈殿を行い、それらを100μLの水または残りの培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマアルドリッチ、L2524)を添加後、細胞を37℃、300rpmにて、水平振とう機上で数時間インキュベートする。生成されたスフェロブラスト(spheroblasts)を、10μLの20%(重量/体積)SDS溶液を添加することで溶解し、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合し、−20℃で少なくとも1時間凍結させる。その後、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA1バッファー、およびスパチュラ1杯分のガラスビーズ(シグマアルドリッチ、G8772)を添加し、チューブを、1分間のボルテックス撹拌によって激しく混合する。プラスミドの単離は、NucleoSpin Plasmid kitからの250μLのA2バッファーを添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートし、その後NucleoSpin Plasmid kitプロトコルを継続することによってさらに改善される。30μLの溶出バッファーによる溶出後、5μLのプラスミドDNAを、ヒートショックトランスフォーメーションによって大腸菌DH5アルファにトランスフォームする。2つの別々のコロニーを、アンピシリン含有LBプレートから取り出し、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートを配列決定する。得られた結果を、各標的部位に対する6ZFP間のコンセンサス配列について分析する。
形質導入可能人工転写因子活性を試験するための安定したルシフェラーゼ/分泌アルカリホスファターゼリポーター細胞株の作製用のリポータープラスミドのクローニング
ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼを、構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼと共に含有するレポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含有する42bpを、AflIII/SpeIでpAN1660(配列番号183)中にクローニングした。このようなレポーターコンストラクトは、HEK 293 FlpIn TRex(インビトロジェン)細胞などのFlpIn部位含有細胞への安定な組み込みのためのFlpIn部位を含有する。
ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼを、構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼと共に含有するレポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含有する42bpを、AflIII/SpeIでpAN1660(配列番号183)中にクローニングした。このようなレポーターコンストラクトは、HEK 293 FlpIn TRex(インビトロジェン)細胞などのFlpIn部位含有細胞への安定な組み込みのためのFlpIn部位を含有する。
定量的RT−PCRによる遺伝子発現レベルの決定
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン(Qiagen)、ヒルデン、ドイツ)を製造元の説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、10μL/mL β−メルカプトエタノールを含有するRLT Plus Lysis bufferに再懸濁させる。QIAshredderスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、ゲノムDNAを除去する。1容量分の70%エタノールを添加し、すべてのライセートをRNeasyスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、RNAを、最終体積30μLのRNaseフリー水で溶出する。RNAは、次に使用するまで−80℃で保存する。cDNAの合成は、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を製造元の説明書に従って用いて行う。cDNAの合成は、2μL 10×バッファー、0.8μL 25×dNTPミックス、2μL 10×RT ランダムプライマー、1μL Multiscribe逆転写酵素、および4.2μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。最終体積10μLのRNAを添加し、反応を、以下の条件下で行う:25℃にて10分間、続いて37℃で2時間、および最終工程として85℃で5分間。定量的PCRは、1μL 20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μL TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)、および8μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。各反応において、1μLのcDNAを添加する。qPCRは、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を以下の条件で用いて行う:50℃で2分間の初期工程、続いて95℃で10分間の第一の変性、ならびに95℃で15秒間および60℃で1分間の40サイクルから成るさらなる工程。
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン(Qiagen)、ヒルデン、ドイツ)を製造元の説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを、10μL/mL β−メルカプトエタノールを含有するRLT Plus Lysis bufferに再懸濁させる。QIAshredderスピンカラムを用いた均質化後、すべてのライセートをgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、ゲノムDNAを除去する。1容量分の70%エタノールを添加し、すべてのライセートをRNeasyスピンカラムに移す。複数回の洗浄工程の後、RNAを、最終体積30μLのRNaseフリー水で溶出する。RNAは、次に使用するまで−80℃で保存する。cDNAの合成は、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を製造元の説明書に従って用いて行う。cDNAの合成は、2μL 10×バッファー、0.8μL 25×dNTPミックス、2μL 10×RT ランダムプライマー、1μL Multiscribe逆転写酵素、および4.2μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。最終体積10μLのRNAを添加し、反応を、以下の条件下で行う:25℃にて10分間、続いて37℃で2時間、および最終工程として85℃で5分間。定量的PCRは、1μL 20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μL TaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(いずれも、アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)、および8μL H2Oを含有する20μLの合計反応体積中で行う。各反応において、1μLのcDNAを添加する。qPCRは、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ブランチバーグ、ニュージャージー州、米国)を以下の条件で用いて行う:50℃で2分間の初期工程、続いて95℃で10分間の第一の変性、ならびに95℃で15秒間および60℃で1分間の40サイクルから成るさらなる工程。
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、標準的な手順(AgeI/XhoI)を用いて、目的のジンクフィンガーアレイ、SV40 NLS、3× mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号184)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号185)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号186)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号187)の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、標準的な手順(AgeI/XhoI)を用いて、目的のジンクフィンガーアレイ、SV40 NLS、3× mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号184)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号185)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号186)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号187)の融合タンパク質として哺乳類細胞中で発現するための哺乳類発現ベクター中にクローニングする。
安定にトランスフェクトされたテトラサイクリン誘導性細胞を作製するためのプラスミドを、以下のようにして作製した:ポリダクチルジンクフィンガードメイン、制御ドメイン(N末端KRAB、C末端KRAB、SID、またはVP64)、およびSV40 NLSを含む人工転写因子をコードするDNA断片を、EcoRV/AgeIを用いてpAN2071(配列番号188)中にクローニングする。これらの人工転写因子発現プラスミドは、AAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコポエイア)を用いた共トランスフェクションにより、ヒトゲノムのAAVS1座位に組み込むことができる。
細胞培養およびトランスフェクション
HeLa細胞を、4.5g/L グルコース、10% 熱失活ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(すべてシグマアルドリッチから)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5% CO2、37℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、7000HeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種する。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドmidi製剤(Plasmid midi preparations)を、3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、ウェルあたり100μLの新しいDMEMで培地を入れ替える。
HeLa細胞を、4.5g/L グルコース、10% 熱失活ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(すべてシグマアルドリッチから)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5% CO2、37℃で増殖させる。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、7000HeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種する。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造元の説明書に従って用いて、共トランスフェクションを行う。人工転写因子を、およびルシフェラーゼをコードするプラスミドmidi製剤(Plasmid midi preparations)を、3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、ウェルあたり100μLの新しいDMEMで培地を入れ替える。
Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株の作製および維持
安定なテトラサイクリン誘導性Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株を、Flpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用い、pFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクトすることによって、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株を作製する。誘導性293発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組換えを介して組み込む。安定なFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/mL ブラストサイジン、および100μg/mL ハイグロマイシン)を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度1μg/mLまで添加する。
安定なテトラサイクリン誘導性Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株を、Flpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用い、pFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクトすることによって、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株を作製する。誘導性293発現細胞株を作製するために、目的の遺伝子を含有するpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組換えを介して組み込む。安定なFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/mL ブラストサイジン、および100μg/mL ハイグロマイシン)を含有する選択培地で維持する。遺伝子発現の誘導のために、テトラサイクリンを最終濃度1μg/mLまで添加する。
TALENを用いる安定して人工転写因子を発現する細胞株の作製および維持
テトラサイクリン誘導性プロモーターの支配下で人工転写因子を安定に発現する細胞株を作製するために、細胞を、目的の人工転写因子およびAAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコポエイア)プラスミドを含有するpAN2071をベースとする発現コンストラクトにより、Effectene(キアゲン)トランスフェクション試薬を製造元の推奨に従って用いて共トランスフェクトする。トランスフェクションの8時間後、増殖培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、新しい増殖培地を添加した。トランスフェクションの24時間後、細胞を、抗生物質を含まないTet−approved FBS(テトラサイクリンフリーFBS、タカラ)を含有する増殖培地に、1:10の比率で分割した。トランスフェクションの48時間後、ピューロマイシン選択を細胞型特異的濃度で開始し、細胞を、7〜10日間選択圧下に維持した。安定な細胞のコロニーをプールし、選択培地で維持した。
テトラサイクリン誘導性プロモーターの支配下で人工転写因子を安定に発現する細胞株を作製するために、細胞を、目的の人工転写因子およびAAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコポエイア)プラスミドを含有するpAN2071をベースとする発現コンストラクトにより、Effectene(キアゲン)トランスフェクション試薬を製造元の推奨に従って用いて共トランスフェクトする。トランスフェクションの8時間後、増殖培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、新しい増殖培地を添加した。トランスフェクションの24時間後、細胞を、抗生物質を含まないTet−approved FBS(テトラサイクリンフリーFBS、タカラ)を含有する増殖培地に、1:10の比率で分割した。トランスフェクションの48時間後、ピューロマイシン選択を細胞型特異的濃度で開始し、細胞を、7〜10日間選択圧下に維持した。安定な細胞のコロニーをプールし、選択培地で維持した。
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの間のHis6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするDNA断片を、標準的な手順を用い、EcoRV/NotIにより、pET41a+(ノバゲン(Novagen))をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号189)中にクローニングする。
人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの間のHis6タグ融合タンパク質としての大腸菌での発現ために、人工転写因子をコードするDNA断片を、標準的な手順を用い、EcoRV/NotIにより、pET41a+(ノバゲン(Novagen))をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号189)中にクローニングする。
人工転写因子タンパク質の作製
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌BL21(DE3)を、100μM ZnCl2を添加した1L LB培地中、OD600が0.8から1の間に到達するまで増殖させ、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体(inclusion bodies)を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し(5000g、4℃、15分間)、20mLの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗浄した。精製した封入体を、30mLの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)中にて1時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、4℃および13000gで40分間遠心分離し、0.45μm PVDFフィルターを通してろ過した。Hisタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いて、Aktaprime FPLC(GEヘルスケア(GE Healthcare))上のHis−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がSIDドメインを含有している場合は、バッファーS(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーK(50mM Tris−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、14000rpmで30分間、4℃で遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア(Millipore))を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバゲン)を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4 pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー 50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から作製した。タンパク質を、VP64バッファー(550mM NaCl pH 7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
ある人工転写因子の発現プラスミドでトランスフォームされた大腸菌BL21(DE3)を、100μM ZnCl2を添加した1L LB培地中、OD600が0.8から1の間に到達するまで増殖させ、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離で回収し、細菌ライセートを超音波処理によって作製し、封入体(inclusion bodies)を精製した。このために、封入体を遠心分離で回収し(5000g、4℃、15分間)、20mLの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗浄した。精製した封入体を、30mLの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)中にて1時間、氷上で可溶化した。可溶化した封入体を、4℃および13000gで40分間遠心分離し、0.45μm PVDFフィルターを通してろ過した。Hisタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いて、Aktaprime FPLC(GEヘルスケア(GE Healthcare))上のHis−トラップカラムを用いて精製した。精製人工転写因子を含有する画分をプールし、人工転写因子がSIDドメインを含有している場合は、バッファーS(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメイン含有人工転写因子の場合は、バッファーK(50mM Tris−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析の後、タンパク質サンプルを、14000rpmで30分間、4℃で遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア(Millipore))を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含有する人工転写因子の場合、タンパク質は、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバゲン)を製造元の推奨に従って用いて、可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4 pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー 50mM HEPES pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から作製した。タンパク質を、VP64バッファー(550mM NaCl pH 7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
ELDIA(酵素結合DNA相互作用アッセイ)を用いた人工転写因子のDNA結合活性の決定
BSAで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート(ピアース)を、洗浄バッファー(25mM Tris/HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20)で3回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下(50pmol/ウェル)、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で1時間インキュベートする。3回の洗浄工程後、1×10-12から5×10-7Mの60bpプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中(10mM Tris/HCl pH7.5、60mM KCl、1mM DTT、2% グリセロール、5mM MgCl2、および100μM ZnCl2)、非特異的競合相手(0.1mg/mL サケ精子由来ssDNA、シグマ)の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で1時間インキュベートする。洗浄後(5回)、ウェルを、3% BSAを用いて室温で30分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−HRPを、結合バッファーに室温で1時間添加する。5回の洗浄工程後、TMB基質(シグマ)を添加し、2から30分間室温でインキュベートする。TMB停止溶液(シグマ)を添加して反応を停止し、サンプル励起を、450nmで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってSigma Plot V8.1を用いて行う。
BSAで予めブロッキングしたニッケルコーティングプレート(ピアース)を、洗浄バッファー(25mM Tris/HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20)で3回洗浄する。プレートを、保存バッファー中の飽和条件下(50pmol/ウェル)、精製人工転写因子でコーティングし、軽く振とうしながら室温で1時間インキュベートする。3回の洗浄工程後、1×10-12から5×10-7Mの60bpプロモーター配列を含有するアニーリングしたビオチン化オリゴを、結合バッファー中(10mM Tris/HCl pH7.5、60mM KCl、1mM DTT、2% グリセロール、5mM MgCl2、および100μM ZnCl2)、非特異的競合相手(0.1mg/mL サケ精子由来ssDNA、シグマ)の存在下、結合した人工転写因子と共に室温で1時間インキュベートする。洗浄後(5回)、ウェルを、3% BSAを用いて室温で30分間ブロッキングする。抗ストレプトアビジン−HRPを、結合バッファーに室温で1時間添加する。5回の洗浄工程後、TMB基質(シグマ)を添加し、2から30分間室温でインキュベートする。TMB停止溶液(シグマ)を添加して反応を停止し、サンプル励起を、450nmで読み取る。リガンド結合動態のデータ分析を、ヒルに従ってSigma Plot V8.1を用いて行う。
タンパク質形質導入
約80%のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、37℃のOptiMEMまたは増殖培地中、2時間から120時間にわたって、0.01から1μMの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、24時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、10〜500μM ZnCl2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
約80%のコンフルエンシーまで増殖した細胞を、37℃のOptiMEMまたは増殖培地中、2時間から120時間にわたって、0.01から1μMの人工転写因子で処理するか、または疑似処理し、所望に応じて、24時間ごとに人工転写因子を添加する。所望に応じて、10〜500μM ZnCl2を増殖培地に添加してよい。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、カバーガラス上に播種してさらに試験する。
免疫蛍光
細胞を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15% Triton X−100で15分間処理し、10% BSA/PBSでブロッキングし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベートする。サンプルを、PBS/1% BSAで3回洗浄し、Alexa Fluor 546(1:1000、インビトロジェン)と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、DAPI(1mg/mLの1:1000で3分間、シグマ)を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
細胞を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15% Triton X−100で15分間処理し、10% BSA/PBSでブロッキングし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベートする。サンプルを、PBS/1% BSAで3回洗浄し、Alexa Fluor 546(1:1000、インビトロジェン)と結合したヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、DAPI(1mg/mLの1:1000で3分間、シグマ)を用いて対比染色する。サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて分析する。
ルシフェラーゼ/SEAPプロモーター活性組み合せアッセイ
人工転写因子の活性を試験するために、レポーター細胞株を用いた。このレポーター細胞株は、ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを含有するHEK 293FlpIn TRex細胞をベースとする。
人工転写因子の活性を試験するために、レポーター細胞株を用いた。このレポーター細胞株は、ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの支配下のガウシアルシフェラーゼおよび構成的CMVプロモーターの支配下の分泌型アルカリホスファターゼを含有するHEK 293FlpIn TRex細胞をベースとする。
1×105 レポーター細胞/ウェルを、タンパク質形質導入の24時間前に6ウェルプレートに播種する。播種の24時間後、培地をプレートから吸引し、細胞をPBSで1回洗浄する。タンパク質処理のために、人工転写因子またはコントロールタンパク質を、OptiMEM中、1μMの最終濃度まで希釈し、細胞に添加し、インキュベーター中にて(37℃;5%CO2)2時間インキュベートする。タンパク質形質導入の後、細胞を通常の増殖培地で24時間増殖させた。上澄を96ウェルプレートに移し、2000rpmで5分間遠心分離した。ガウシアルシフェラーゼの測定の場合、Pierce(商標)Gaussia Luciferase Glow Assay Kit(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific))を、製造元の説明書に従って用いた。希釈標準溶液を室温に平衡化し、セレンテラジンを1:100の希釈率で添加した。20μLの細胞上澄を、不透明96ウェルプレートに移し、50μLの希釈標準溶液を添加した。10分間のインキュベーションの後、MicroLumatPlus(ベルトールドテクノロジーズ(Berthold Technologies))を用い、1.0秒の積分時間で発光を測定した。分泌型アルカリホスファターゼ活性の測定の場合、化学発光SEAP Reporter Gene Assay(ロシュ)を、製造元の説明書に従って用いた。細胞上澄を、希釈バッファーで1:4に希釈し、65℃で5分間の熱失活を行った。熱失活サンプルの50μLを、不透明96ウェルプレートに移し、50μLの不活性化バッファーを添加した。室温で5分間のインキュベーションの後、基質バッファー中1:20のAP基質から成る基質試薬の50μLを添加し、緩やかに撹拌しながら室温で10分間インキュベートした。MicroLumatPlus(ベルトールドテクノロジーズ)を用い、1.0秒の積分時間で発光を測定した。
細胞インピーダンスの測定またはECIS
人工転写因子またはコントロールタンパク質で処理した細胞を、8ウェルラインアレイまたは8W1E ECIS培養器(アプライドバイオフィジクス)中、24時間、またはインピーダンスが一定となるまで増殖させる。細胞層の創傷を、ECIS ZTheta(アプライドバイオフィジクス)の創傷プロトコルを用いて誘導し、治癒を、リアルタイムで24時間、またはコントロール処理細胞のインピーダンスが一定となるまで追跡する。
人工転写因子またはコントロールタンパク質で処理した細胞を、8ウェルラインアレイまたは8W1E ECIS培養器(アプライドバイオフィジクス)中、24時間、またはインピーダンスが一定となるまで増殖させる。細胞層の創傷を、ECIS ZTheta(アプライドバイオフィジクス)の創傷プロトコルを用いて誘導し、治癒を、リアルタイムで24時間、またはコントロール処理細胞のインピーダンスが一定となるまで追跡する。
Claims (11)
- 活性化もしくは抑制性タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインと融合したポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、エンドソーム特異的プロテアーゼ認識部位と融合していてもよく、眼の不適合創傷治癒(maladapted wound healing)に関与する遺伝子のプロモーターを特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含む、人工転写因子。
- エンドソーム特異的プロテーゼ認識部位を含む、請求項1に記載の人工転写因子。
- 配列番号88から128までより成る群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含む、請求項1に記載の人工転写因子。
- 配列番号88から128までより成る群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含み、ここで、3個までの個々のジンクフィンガーモジュールが、代わりとなる結合特性を持つ他のジンクフィンガーモジュールと交換される、および/または、ここで、12個までの個々のアミノ酸が交換される、請求項1に記載の人工転写因子。
- ポリエチレングリコール残基をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子を含む医薬組成物。
- 遺伝子プロモーターからの発現の増加または減少に用いるための請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 線維収縮性網膜障害(fibrocontractive retinal disorders)の治療のための請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 網膜グリオーシス、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、および/または網膜上膜の治療のための請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 緑内障手術後の線維増殖の治療のための請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の人工転写因子の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、線維増殖および線維収縮性網膜障害を治療する方法。
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2014
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