JP7177047B2 - ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するための合理的に設計された合成ペプチドシャトル剤、その使用、それに関連する方法およびキット - Google Patents
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するための合理的に設計された合成ペプチドシャトル剤、その使用、それに関連する方法およびキット Download PDFInfo
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Description
表題およびその他の識別子、例えば、(a)、(b)、(i)、(ii)、などは、単に、本明細書および特許請求の範囲の読み取りを容易にするために提示される。本明細書および特許請求の範囲における表題およびその他の識別子の使用は、ステップまたは要素が、アルファベット順または番号順で、またはそれらが提示される順序で実施されることを必ずしも必要としない。
いくつかの態様では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達する方法に関する。方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度のシャトル剤の存在下で、接触させることを含む。いくつかの態様では、シャトル剤は、1つまたは複数の次のパラメーターを満たすペプチドに関する。
(a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);または
(h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
式中、
[X1]は、次記から選択される:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;および1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]は、次記から選択される:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;および-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]は、次記から選択される:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;または-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;および-A-1[+]-A-A-A;
[X4]は、次記から選択される:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];および-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];および
[リンカー]は次記から選択される:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;および-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
式中、[Φ]はアミノ酸:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、またはValであり;[+]は、アミノ酸:LysまたはArgであり;[ζ]は、アミノ酸:Gln、Asn、Thr、またはSerであり;Aはアミノ酸:Alaであり;Gはアミノ酸:Glyであり;Sはアミノ酸:Serであり;nは、1~20、1~19、1~18、1~17、1~16、1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~1~4、または1~3の整数である。
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、1つまたは複数のヒスチジンリッチドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%または少なくとも90%のヒスチジン残基を含む、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のアミノ酸のストレッチであり得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個 少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個または少なくとも9個の連続するヒスチジン残基を含み得る。理論に束縛されるものではないが、シャトル剤中のヒスチジンリッチドメインは、エンドソームの酸性条件下での、そのイミダゾール基のプロトン化によって、エンドソームにおいて、プロトンスポンジとして作用し得、エンドソーム膜不安定化の別の機序を提供し、したがって、エンドソームにより捕捉されたカーゴが、サイトゾルに到達する能力をさらに促進する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、ペプチドシャトル剤のNおよび/またはC末端に位置し得るまたはNおよび/またはC末端を向いて位置し得る。
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、1つまたは複数の好適なリンカー(例えば、フレキシブルポリペプチドリンカー)を含み得る。いくつかの実施形態では、このようなリンカーは、2つ以上の両親媒性のアルファヘリックスモチーフ(例えば、図49Dのシャトル剤FSD18を参照されたい)を離れさせ得る。いくつかの実施形態では、リンカーを用いて、さらに2つのドメイン(CPD、ELD、またはヒスチジンリッチドメイン)を相互から分離できる。いくつかの実施形態では、リンカーは、回転能力を有さない小さい疎水性アミノ酸(グリシンなど)および安定性および可動性を付与する極性セリン残基の配列を付加することにより形成され得る。リンカーは、柔らかく、シャトル剤のドメインが動くのを可能にし得る。いくつかの実施形態では、プロリンは、おおきな立体構造剛性を付加する場合があるので回避され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン/グリシンリッチリンカー(例えば、GGS、GGSGGGS、GGSGGGSGGGSなど)であり得る。いくつかの実施形態では、適したリンカーを含むシャトル剤の使用は、独立ポリペプチドカーゴを、付着細胞ではなく懸濁細胞に送達するために有利であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;または-(GnSn)nSn(GnSn)n-を含むまたはこれらからなり、Gはアミノ酸Glyであり;Sはアミノ酸Serであり、nは1~5の整数である。
いくつかの態様では、本記載のペプチドシャトル剤は、エンドソーム脱出および細胞質区画へのアクセスを促進するためにエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム漏出ドメイン」は、エンドソームにより捕捉された高分子に、細胞質区画に到達する能力を付与するアミノ酸の配列を指す。理論に束縛されるものではないが、エンドソーム漏出ドメインは、短い配列(ウイルスまたは細菌ペプチドに由来することが多い)であり、これは、エンドソーム膜の不安定化およびエンドソーム内容物の細胞質への放出を誘導すると考えられている。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム溶解性ペプチド」は、エンドソーム膜不安定化特性を有するペプチドのこの全般的なクラスを指すものとする。したがって、いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤は、エンドソーム溶解性ペプチドであるELDを含み得る。このようなペプチドの活性は、例えば、実施例2に記載されるカルセインエンドソーム脱出アッセイを使用して評価され得る。
いくつかの態様では、本記載のシャトル剤は、細胞浸透ドメイン(CPD)を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「細胞浸透ドメイン」とは、CPDを含有する高分子(例えば、ペプチドまたはタンパク質)に、細胞に形質導入される能力を付与するアミノ酸の配列を意味する。
いくつかの態様では、本記載のペプチドシャトル剤は、ポリペプチドカーゴ(例えば、独立したポリペプチドカーゴ)を、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するのに有用であり、合成ペプチドシャトル剤は、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、細胞内送達をさらに容易にするために1種または複数のCPDと融合され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴと融合されるCPDは、本記載のシャトル剤中に存在し得るCPDと同一であっても、異なっていてもよい。このような融合タンパク質は、標準組換え技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、独立ポリペプチドカーゴは、第2の生物学的に活性なカーゴ(例えば、生物学的に活性なポリペプチドまたは化合物)と、融合され、複合体形成され、または共有結合により結合され得る。或いはまたは同時に、ポリペプチドカーゴは、細胞内ターゲッティングドメインを含み得る。
非相同末端結合(NHEJ)および/または相同組換え(HDR)(Cong et al,2013)を実施するCas媒介性ゲノム編集法、
その他のタンパク質パートナーとの複合体形成を伴って、または伴わずに、プロモーター配列と、1種または数種のgRNAと、およびRNAポリメラーゼと結合された場合に転写開始を抑制および/または活性化し得る、触媒的に死んだCas(dCas)(Bikard et al,2013)、
転写抑制、転写活性化、クロマチンリモデリング、蛍光リポーター、ヒストン修飾、リコンビナーゼ系アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化、SUMO化、リボシル化およびシトルリン化を含むゲノムの特定の部位に酵素活性をもたらす方法として種々の機能性タンパク質ドメインとも融合され得る、触媒的に死んだCas(dCas)(Gilbert et al,2013)。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、50μM、45μM、40μM、35μM、30μM、25μM、20μM、15μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、0.5μM、0.1μM、または0.05μMまでの濃度まで、目的の標的真核細胞に対して非毒性であり得る。本記載のシャトル剤の細胞毒性は、任意の適した方法を使用して測定され得る。さらに、形質導入プロトコルは、シャトル剤の毒性を低減または最小にするように、および/またはトランスフェクション効率を改善/最大化するように適応され得る(例えば、使用されるシャトルおよび/またはカーゴの濃度、シャトル/カーゴ曝露時間、血清の存在下または非存在下での曝露)。
いくつかの実施形態では、本記載は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5種類の異なるタイプの本明細書において定義されるような合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤のカクテルを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、種々の種類の合成ペプチドまたはペプチドシャトル剤(例えば、異なる種類のドメインを含む種々のシャトル剤)を組み合わせることにより、種々のポリペプチドカーゴを細胞内に送達するための高められた汎用性を提供し得る。さらに、理論に束縛されるものではないが、低濃度の種々の種類のシャトル剤を組み合わせることにより、単一種類のシャトル剤(例えば、より高濃度の)を使用に伴う細胞毒性を低減するのに役立ち得る。
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達する方法に関する。方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとをシャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または100倍まで、高められる。
(1)少なくとも20アミノ酸長であり、
(3)正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
(2)両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター(4)~(15)の内の少なくとも5つが満たされるペプチド。
(4)疎水性の外面が、ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む;
(5)3.5~11の疎水性モーメント(μ)を有する;
(6)生理学的pHで少なくとも+4の予測正味電荷を有する;
(7)8~13の等電点(pI)を有する;
(8)35%~65%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)0%~30%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)35%~85%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)少なくとも5%のLがペプチド中に存在するという条件で、15%~45%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)20%~45%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)0%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)ペプチド中のAおよびLのパーセンテージ(%A+L)と、ペプチド中のKとRのパーセンテージ(%K+R)との差異は、10%以下である;
(15)10%~45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシャトル剤、合成ペプチド、組成物、および方法を用いて、天然の細胞または非遺伝子操作細胞に比べて、細胞治療の改善のために、ゲノム編集複合体(例えば、CRISPRベースゲノム編集複合体)を遺伝子操作した細胞に形質導入し得る。このような改善は、例えば、遺伝子操作された細胞の免疫原性を低減させることおよび/または遺伝子操作された細胞の活性/効力を改善することを含み得る。
CD94/NKG2Aは、MHCクラスI特異的NK抑制性受容体として機能する(Braud et al.,1998;Lee et al.,1998)。CD56brightCD16dimとして知られるNK細胞サブセット(約10%の末梢NK)により発現され、これらは通常細胞傷害性が低い(Cooper et al.,2001;Poli et al.,2009)。NKG2Aリガンドは、非古典的MHCクラスI HLA-E分子であり、あらゆるヒト細胞で発現される。NKG2A受容体によるHLA-Eの認識は、「自己免疫寛容」機序の一部であり(KIR受容体も含む)、NK細胞傷害性の負の調節をもたらす(Lee et al.,1998)。
ILT2は、NK細胞を含むいくつかの免疫細胞上で発現される抑制性受容体である(Kirwan et al.,2005)。この受容体のリガンドは、HLA-G分子であり、これは、胸腺および栄養芽層のみで天然に発現される。しかし、多くの腫瘍は、ILT2受容体活性化を介した抑制により免疫細胞攻撃を回避するためにHLA-Gを発現する能力を取得する実際に、NKLILT2-細胞は、HLA-G-過剰発現K562細胞に対して、親NKLより強力である(Wu et al.,2015)。さらに、OVCAR-3癌細胞におけるHLA-Gの過剰発現は、NK細胞媒介細胞傷害性を弱めた(Lin et al.,2007)。HLA-Eと同様に、癌細胞上でのHLA-Gの発現は、一般に、予後不良と関連している。
これらの遺伝子(カシタスB系統リンパ腫癌原遺伝子、Cblファミリー由来)はE3リガーゼをコードし、タンパク質ユビキチン化経路(細胞質タンパク質含量の調節)で機能を有する。E3リガーゼは、Ub(ユビキチン)と標的タンパク質上の特定のリシン残基との間の共有結合の形成を触媒する(哺乳動物中ではE3リガーゼは1000を超える)。Cblファミリーメンバーは、リン酸化された受容体およびアダプターに結合し、ユビキチン化することにより、免疫細胞上の受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達の負の調節に関与する(Liu et al.,2014;utz-Nicoladoni,2015)。c-cblおよびCbl-bの両方は、リン酸化されたLATアダプターをユビキチン化することが示された。NK細胞活性化後のLATの燐酸化は、その他のメディエーター、特にPLC-γを動員するのに必要であり、siRNA媒介c-cblおよびCbl-bノックダウンは、B細胞リンパ腫721.221-Cw4に対するNK細胞活性を高めた(Matalon et al.,2016)。
GSK3bは、いくつかの細胞機能、例えば、増殖、アポトーシス、炎症反応、ストレス、などに関与するSer/Thrキナーゼである(Patel et al.,2017)。NK細胞中のGSK3bの(小さい阻害剤を用いた)阻害は、AML(OCI-AML3)に対する細胞傷害性(おそらく、IFN-γ、IFN-α産生、2B4刺激およびLFA-1の発現上昇により)の増加に繋がる(Parameswaran et al.,2016;Aoukaty et al.,2005)。我々は、最近、GSK3β阻害剤のSB216763がHeLa細胞に対するNK92の細胞傷害活性を高めることを示した(データは示さず)。この効果は、IL-15とのコインキュベーションにより高められる。
CISタンパク質は、サイトカインシグナル伝達(SOCS)の抑制因子のメンバーであり、これは、リン酸化されたJAKに結合し、JAK-STATシグナル伝達経路を阻害する。近年、Cish-/-マウスにより、CISがIL15シグナル伝達の重要な抑制因子であることが示された(Delconte et al.,2016)。IL15暴露後、これらの細胞は、長期のIL15応答、IFN-γの産生上昇、および細胞傷害性能力の増加があった。さらに、IL15応答性と、NKG2D依存性細胞傷害性との間で明確な相関がある(Horng et al.,2007)。
ドメインベースの合理的に設計されたペプチドシャトル剤の、2つのポリペプチドカーゴを標的真核細胞集団に同時形質導入する能力が本明細書および国際公開第2016/161516号で実証された。本記載の実施例Iは、標的真核細胞集団中における、目的のポリペプチドカーゴ(例えば、CRISPR-エンドヌクレアーゼ)および独立したマーカータンパク質(例えば、GFP)の同時形質導入は、目的のポリペプチドカーゴの全体的な形質導入効率を高めるとは限らない。しかし、意外にも、著しく高い比率の目的のポリペプチドカーゴをうまく形質導入した標的真核細胞が、同様に、マーカータンパク質もうまく形質導入したことが発見された。逆に、目的のポリペプチドカーゴを形質導入しなかった細胞の内の著しく高比率の細胞は、同様に、マーカータンパク質も形質導入しなかった。マーカータンパク質陽性の細胞の単離(例えば、FACSにより)により、うまく目的のポリペプチドカーゴを形質導入した細胞の比率が大きく増加し、相関は、最も高いマーカータンパク質の蛍光を示す細胞集団はまた、目的のポリペプチドカーゴの最も高い形質導入比率を示すという点で、濃度依存性であることが明らかになった。
いくつかの実施形態では、本記載は、次の項目に関し得る:
1.ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達する方法であって、前記方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、
(1)少なくとも20アミノ酸長であり、
(3)正に帯電した親水性の外面および、
疎水性の外面
を有する
(2)両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター(4)~(15)の内の少なくとも5つが満たされるペプチドである。
(4)疎水性の外面が、ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む;
(5)3.5~11の疎水性モーメント(μ)を有する;
(6)生理学的pHで少なくとも+4の予測正味電荷を有する;
(7)8~13の等電点(pI)を有する;
(8)35%~65%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)0%~30%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)35%~85%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)少なくとも5%のLがペプチド中に存在するという条件で、15%~45%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)20%~45%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)0%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)ペプチド中のAおよびLのパーセンテージ(%A+L)と、ペプチド中のKとRのパーセンテージ(K+R)との差異は、10%以下であり、
(15)10%~45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される。
(ii)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、または11.0の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
(iii)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性外面を含み、この外面は、(a)ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも2個、3個または4個の隣接する正に帯電したKおよび/またはR残基;および/または(b)ヘリカルホイール投影図上に、100度の連続アミノ酸間の回転角度および/またはターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、3個から5個のKおよび/またはR残基を含む6個の隣接する残基のセグメントを含み、
(iv)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、疎水性の外面は、(a)ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも2個の隣接するL残基;および/または(b)ヘリカルホイール投影図上で、100度の連続アミノ酸間の回転角度および/またはターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、L、I、F、V、W、およびMから選択される少なくとも5個の疎水性の残基を含む10個の隣接する残基のセグメント、を含み、
(v)前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、または20%から25%、30%、35%、40%、または45%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
(vi)前記ペプチドが、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、または10.5の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
(vii)前記ペプチドが、+4、+5、+6、+7、+8、+9~+10、+11、+12、+13、+14、または+15の予測実効電荷を有し、
(viii)前記ペプチドが、10~13の予測pIを有し、または
(ix)(i)~(viii)の内の任意の組み合わせである、項目1または2に記載の方法。
(8)ペプチドが、36%~64%、37%~63%、38%~62%、39%~61%、40%~60%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)ペプチドが、1%~29%、2%~28%、3%~27%、4%~26%、5%~25%、6%~24%、7%~23%、8%~22%、9%~21%、または10%~20%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)ペプチドが、36%~80%、37%~75%、38%~70%、39%~65%、または40%~60%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)ペプチドが、15%~40%、20%~40%、20%~35%、または20%~30%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)ペプチドが、20%~40%、20%~35%、または20%~30%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)5%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)ペプチド中のAおよびL残基パーセンテージ(%A+L)と、ペプチド中のKおよび/またはR残基のパーセンテージ(K+R)との差異が、9%、8%、7%、6%、または5%以下である;および
(15)ペプチドが、15~40%、20%~35%、または20%~30%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される。
(i)ペプチドのN末端に向けておよび/またはC末端に向けて配置され;
(ii)少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%もしくは少なくとも90%のヒスチジン残基を含む、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個のアミノ酸のストレッチである、および/または少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、または少なくとも9個の連続するヒスチジン残基を含み;または
(iii)(i)および(ii)の両方である、項目5に記載の方法。
(a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);または
(h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
式中、
[X1]が、次記から選択され:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;および1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]が次記から選択され:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;および-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]が次記から選択され:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;または-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;および-A-1[+]-A-A-A;
[X4]が次記から選択され:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];および-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];および
[リンカー]が、次記から選択され:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;および-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
式中、
[Φ]が、アミノ酸:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、またはValであり;
[+]が、アミノ酸:LysまたはArgであり;
[ζ]が、アミノ酸:Gln、Asn、Thr、またはSerであり;
Aが、アミノ酸:Alaであり;
Gが、アミノ酸:Glyであり;
Sが、アミノ酸:Serであり;および
nが、1~20、1~19、1~18、1~17、1~16、1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~1~4、または1~3の整数である。
(ii)前記ペプチドが:
(a)配列番号104、105、107、108、110~131、133~135、138、140、142、145、148、151、152、169~242、および243~10242のいずれか1個のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり;
(b)配列番号158および/または159のアミノ酸配列モチーフを含み;または
(c)配列番号159のアミノ酸配列モチーフに作動可能に連結された配列番号158のアミノ酸配列モチーフを含み;または
(iii)(i)および(ii)の両方である、項目1~8のいずれか1項に記載の方法。
(ii)前記CPDが、細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン、TAT、PTD4、ペネトラチン(アンテナペディア)、pVEC、M918、Pep-1、Pep-2、キセントリー(Xentry)、アルギニンストレッチ、トランスポータン、SynB1、SynB3またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、または
(iii)(i)および(ii)の両方である、項目10に記載の方法。
(a)配列番号1~15、63または64のいずれか1つのアミノ酸配列、またはエンドソーム溶解活性を有するそのバリアントまたは断片を含むELD;
(b)配列番号16~27または65のいずれか1つのアミノ酸配列または細胞膜透過性活性を有するそのバリアントまたは断片を含むCPD;または
(c)(a)および(b)の両方を含む、項目10または11に記載の方法。
(ii)前記ペプチドが、配列番号17または65のアミノ酸配列を有するTATまたはPTD4であるCPD、または配列番号17または65と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一性を有し、細胞膜透過活性を有するそのバリアントであるCPDを含み、または
(iii)(i)および(ii)の両方である、項目10~12のいずれか1項に記載の方法。
(ii)標的真核細胞とポリペプチドカーゴとをシャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または100倍まで、高められる、項目1~14のいずれか1項に記載の方法。
(a)核移行シグナル(NLS);
(b)核小体シグナル配列;
(c)ミトコンドリアシグナル配列;または
(d)ペルオキシソームシグナル配列、である、項目26に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
(b)前記核小体シグナル配列が、BIRC5もしくはRECQL4に由来する、
(c)前記ミトコンドリアシグナル配列が、Tim9もしくは酵母チトクロムcオキシダーゼサブユニットIVに由来する、または
(d)前記ペルオキシソームシグナル配列が、PTS1に由来する、項目27に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
(b)前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ:RNA誘導性エンドヌクレアーゼ、CRISPRエンドヌクレアーゼ、I型CRISPRエンドヌクレアーゼ、II型CRISPRエンドヌクレアーゼ、III型CRISPRエンドヌクレアーゼ、IV型CRISPRエンドヌクレアーゼ、V型CRISPRエンドヌクレアーゼ、VI型CRISPRエンドヌクレアーゼ、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、CasY、CasX、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、DNA誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート(NgAgo)、またはそれらの任意の組合せであり;
(c)前記抗体が細胞内抗原を認識し;および/または
(d)前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、項目30に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
(1)少なくとも20アミノ酸長であり、
(3)正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
(2)両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター(4)~(15)の内の少なくとも5つが満たされるペプチド。
(4)疎水性の外面が、ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む;
(5)3.5~11の疎水性モーメント(μ)を有する;
(6)生理学的pHで少なくとも+4の予測正味電荷を有する;
(7)8~13の等電点(pI)を有する;
(8)35%~65%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)0%~30%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)35%~85%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)少なくとも5%のLがペプチド中に存在するという条件で、15%~45%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)20%~45%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)0%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)ペプチド中のAおよびLのパーセンテージ(%A+L)と、ペプチド中のKとRのパーセンテージ(K+R)との差異は、10%以下である;
(15)10%~45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される。
(a)項目1~15または18のいずれか1項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること;
(b)標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること;
(c)標的真核細胞中のポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること;および
(d)標的真核細胞中のポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、ペプチドを特定すること。
(a)項目1~15または18のいずれか1項で定義のシャトル剤;
(b)1種または複数のCRISPR結合エンドヌクレアーゼ;および
(c)1種または複数のガイドRNA。
(a)目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた標的真核細胞集団を同時形質導入すること;および
(b)マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。
(ii)マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、またはマーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、項目51に記載の方法。
(b)ペプチド形質導入剤が、項目17または18で定義の合成ペプチドシャトル剤であるか、またはそれを含み;
(c)標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、T細胞、NK細胞、または樹状細胞を含み;
(d)目的のポリペプチドカーゴが、(i)項目24~31のいずれか1項で定義のポリペプチドカーゴ;および/または(ii)1種または複数のCRISPR結合エンドヌクレアーゼ単独でまたは1種または複数の対応する項目38~43のいずれか1項で定義のガイドRNAおよび/または直鎖DNAテンプレートと一緒の該1種または複数のCRISPR結合エンドヌクレアーゼであり;
(e)(a)~(d)の任意の組み合わせである、項目59に記載の方法。
実施例1:
材料および方法
1.1 材料
すべての化学物質は、別に断りのない限り、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA or Oakville,ON,Canada)から、または同等の等級のものをBioShop Canada Inc.(Mississauga,ON,Canada)またはVWR(Ville Mont-Royal,QC,Canada)から購入した。
1.2 試薬
HeLa、HEK293A、HEK293T、THP-1、CHO、NIH3T3、CA46、Balb3T3およびHT2、KMS-12、DOHH2、REC-1、HCC-78、NCI-H196およびHT2細胞は、American Type Culture Collection(Manassas,VA,USA)から入手し、製造業者の使用説明書に従って培養した。筋芽細胞は、Professor J.P. Tremblay(Universite Laval,Quebec,Canada)により寄贈された初代ヒト細胞である。
融合タンパク質を、T5プロモーターを含有する、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性ベクターを使用して標準条件下で、細菌(大腸菌BL21DE3)中で発現させた。培地は、1リットルあたり、24gの酵母抽出物、12gのトリプトン、4mLのグリセロール、2.3g KH2PO4および12.5g K2HPO4を含有していた。細菌培養液を、撹拌下、適当な抗生物質(例えば、アンピシリン)とともに37℃でインキュベートした。発現は、1mM IPTGの最終濃度を用い、0.5から0.6の間の光学密度(600nm)で、30℃で3時間誘導した。5000RPMで遠心分離した後、細菌を回収し、細菌ペレットを-20℃で保存した。
この研究に使用したすべてのペプチドは、GLBiochem(Shanghai、China)から購入し、その純度は、高性能液体クロマトグラフィー解析および質量分析法によって確認した。いくつかの場合には、ペプチド二量体の調製を可能にするC末端システイン残基を含有するようにペプチドを合成した。これらの二量体のペプチドを、2つの単量体のC末端システイン間のジスルフィド橋を用いて直接合成した。本実施例において、試験した合成ペプチドおよびシャトル剤の各々のアミノ酸配列および特徴は、表1.3、表B1、および表C1にまとめている。
MW:分子量
pI:等電点
電荷:正(+)および負(-)に帯電した残基の合計数
ペプチドシャトル剤は、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を促進する
2.1 エンドソーム脱出アッセイ
エンドソーム漏出を研究するために、およびシャトル剤の添加が、ポリペプチドカーゴのエンドソーム漏出を促進するか否かを調べるために、顕微鏡ベースの、およびフローサイトメトリーベースの蛍光アッセイを開発した。これら方法は、国際出願第PCT/CA2016/050403号の実施例2に記載されている。
カルセインは、細胞外培地に投与された場合に、細胞によって、容易に内部移行される膜不透過性蛍光分子である。その蛍光は、pH依存性であり、カルセインは、高濃度で自己消光する。内部移行すると、カルセインは、細胞エンドソームにおいて、高濃度で捕捉されるようになり、点状パターンとして蛍光顕微鏡によって、可視化され得る。エンドソーム漏出後、カルセインは、細胞質に放出され、この放出は、拡散パターンとして蛍光顕微鏡によって、可視化され得る。
カルセインが細胞質中に放出されると、蛍光強度シグナルが増大するので、顕微鏡に加えて、フローサイトメトリーによって、エンドソーム漏出のより定量的な解析が可能となる。カルセイン蛍光は、エンドソームの酸性環境と比較して、生理学的pHで(例えば、サイトゾル中で)最適である。
2.2.1 HeLa細胞
HeLa細胞を培養し、実施例2.1に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイにおいて、試験した。フローサイトメトリー解析の結果は、以下にまとめられている。各場合において、フローサイトメトリー結果はまた、蛍光顕微鏡により確認された(データは示さず)。
種々の細胞株に対するシャトル剤の効果を調べるために、HEK293A細胞を培養し、実施例2.1に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイで試験した。フローサイトメトリー解析の結果を、以下の表2.8、および図1Bにまとめている。
シャトル剤の初代細胞に対する効果を調べるために、初代筋芽細胞を培養し、実施例2.1に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイで試験した。フローサイトメトリー解析の結果を、以下の表2.9および表2.10、および図4にまとめている。各場合において、フローサイトメトリー結果は、蛍光顕微鏡によっても確認された。
3.1 タンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、FBSを含有する適当な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別の滅菌1.5mLチューブ中で、示した濃度のカーゴタンパク質を、50μLの、血清を含まない(特に断りのない限り)新鮮培地中で、シャトル剤として試験されるペプチド(0.5~5μM)とともに37℃で(プロトコルに応じて)1または10分間予混合した(プレインキュベートした)。ウェル中の培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温した新たに調製したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて3回洗浄した。細胞を、カーゴタンパク質/シャトル剤混合物とともに37℃で示した時間(例えば、1、5または60分間)インキュベートした。インキュベートした後、細胞を、37℃に予め加温した新たに調製したPBSおよび/またはヘパリン(0.5mg/mL)を用いて3回迅速に洗浄した。ヒトTHP-1血液細胞には、その後の解析(顕微鏡およびフローサイトメトリー)における望ましくない細胞膜結合タンパク質バックグラウンドを避けるために、ヘパリンを用いる洗浄が必要であった。細胞を、50μLの、血清を含む新鮮培地中、37℃で最後にインキュベートし、その後解析した。
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した(カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した)。シャトル剤にペプチドを添加し、必要に応じて、滅菌PBSまたは細胞培地(無血清)を添加して、細胞を覆うのに十分な最終容量(例えば、96ウェルプレートのウェルあたり10~100μL)の、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、ペプチド/カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも3種:(1)ペプチド単独(例えば、試験される最高濃度で)の対照、(2)カーゴ単独の対照、および(3)カーゴまたはシャトル剤を何ら含まない対照を含めた。ウェル中の培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温したPBSを用いて1回洗浄し、カーゴタンパク質/ペプチド混合物とともに37℃で所望時間にわたりインキュベートした。ウェル中のペプチド/カーゴ混合物を除去し、細胞をPBSを用いて1回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。解析の前に、細胞をPBSを用いて最後にもう一度洗浄し、新鮮完全培地を添加した。
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある懸濁細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した(カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した)。シャトル剤にペプチドを添加し、必要に応じて、滅菌PBSまたは細胞培養培地(血清不含)を添加して、細胞を再懸濁に十分な最終容量(例えば、96ウェルプレートのウェルあたり10~100μL)の、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤/ペプチドを実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも3種:(1)ペプチド単独(例えば、試験される最高濃度で)の対照、(2)カーゴ単独の対照、および(3)カーゴまたはシャトル剤を何ら含まない対照を含めた。細胞を400gで2分間遠心分離し、次いで、培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温したPBSに再懸濁した。細胞を400gで再度2分間遠心分離し、PBSを除去し、細胞をシャトル剤/カーゴ混合物と共に、所望の時間にわたり37℃で再懸濁した。その後、200μLの完全培地を細胞に直接添加した。細胞を、400gで2分間遠心分離し、培地を除去した。ペレットを37℃に予め加温した200μLのPBS中に再懸濁し、洗浄した。別の遠心分離を実施後、PBSを除去し、細胞を50μLのトリプシン-EDTA溶液中で2分間再懸濁した。200μLの完全培地を直接加え、細胞を、400gで2分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を200μLの完全培地に再懸濁した。
細胞質および核細胞区画における蛍光タンパク質カーゴの送達を、蛍光ランプ(モデルU-LH100HGAPO)および種々のフィルターを備えたOlympus IX70(商標)顕微鏡(Japan)を用いて観察した。Olympus filter U-MF2(商標)(C54942-Exc495/Em510)を使用して、GFPおよびFITC標識抗体の蛍光シグナルを観察した。OlympusフィルターHQ-TR(商標)(V-N41004-Exc555-60/Em645-75)を使用して、mCherry(商標)およびGFP抗体蛍光シグナルを観察した。OlympusフィルターU-MWU2(商標)(Exc330/Em385)を使用して、DAPIまたはBlue Hoechst蛍光シグナルを観察した。50μLの新鮮培地中でインキュベートされた細胞を、種々の倍率視野(4x~40x)で顕微鏡(明視野および蛍光)によって、直接観察した。CoolSNAP-PRO(商標)カメラ(シリーズA02D874021)を使用して細胞を観察し、Image-Proplus(商標)ソフトウェアを使用して画像を取得した。
付着細胞を、24プレートウェルのウェルあたり1.5x105個細胞を滅菌ガラスストリップ上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。固定のために、細胞をウェルあたり500μLのホルムアルデヒド(3.7% v/v)中、室温で15分間インキュベートし、PBSを用いて3回5分間洗浄した。透過処理のために、細胞をウェルあたり500μLのTriton(商標)X-100(0.2%)中、室温で10分間インキュベートし、PBSを用いて3回5分間洗浄した。ブロッキングのために、細胞を、ウェルあたり500μLの、1% BSA(PBS/BSA)を含有するPBS中で、室温で60分間インキュベートした。一次マウスモノクローナル抗体をPBS/BSA(1%)で希釈した。細胞を、30μLの一次抗体中で、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSを用いて3回5分間洗浄した。二次抗体をPBS/BSA(1%)で希釈し、細胞を250μLの二次抗体中で、室温、暗所で30分間インキュベートした。細胞をPBSを用いて3回5分間洗浄した。細胞を含有するガラスストリップを、10μLの封入剤、DAPIを含むFluoroshield(商標)を用いて顕微鏡ガラススライドに取り付けた。
GFPの蛍光を、フローサイトメトリー(Accuri C6、Becton、Dickinson and Company社 (BD)を使用して定量化した。処理細胞における蛍光タンパク質の内部移行による蛍光の増大を定量化するために、未処理細胞を使用してベースラインを確立した。未処理細胞の最大蛍光を上回る蛍光シグナルを有する細胞のパーセンテージ、「平均%」または「Pos細胞(%)」を使用して、陽性蛍光細胞を特定する。「相対蛍光強度(FL1-A)」は、シャトル剤を用いる蛍光タンパク質送達後の蛍光シグナルを有する各細胞からのすべての蛍光強度の平均に相当する。また、細胞に対応するフローサイトメトリーによりスキャンされるイベント(大きさおよび粒度)も解析した。未処理細胞と比較して、処理細胞のスキャンされた総イベントにおける細胞のパーセンテージを比較して、細胞毒性(細胞生存率%)をモニタリングした。
該当する場合には、レザズリン試験を用いて細胞の生存率を評価した。レザズリンは、代謝的に活性な細胞中で、ミトコンドリア酵素によって、青色から桃色に変換されるナトリウム塩着色剤である。生存細胞のパーセンテージを定量化するために、生存細胞のみに起こるこの比色変換を、分光法解析によって、測定できる。レザズリンのストック溶液を、水中、1mg/100mLで調製し、4℃で保存した。96ウェルプレートの各ウェルに25μLのストック溶液を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートし、その後、分光法解析した。レザズリン酵素反応に使用したインキュベーション時間は、ウェル中で使用した細胞の量および培地の容量に応じて変えた。
N末端に6xヒスチジンタグおよびセリン/グリシンリッチリンカーならびにC末端にセリン/グリシンリッチリンカーおよび停止コドン(-)を含有するGFPタンパク質を発現するように、GFPをコードする遺伝子を、T5細菌発現ベクターに挿入した。組換えGFPタンパク質を、実施例1.4に記載されるように精製した。GFP構築物の配列は、以下であった:
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
GFP配列には下線を付与した。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP組換えタンパク質を、0、3または5μMのCM18-TATとともに同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.2に記載されるように明視野および蛍光顕微鏡により観察した。図5に示される結果は、GFPが、シャトル剤CM18-TATの存在下でHeLa細胞に細胞内に送達されたことを示す。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1~3.3に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP組換えタンパク質を、種々の濃度のCM18-TAT-Cysまたは二量体化されたCM18-TAT-Cys(dCM18-TAT-Cys)と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に1時間曝露した。結果は、表3.1および図6A~6Bに示されている。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP組換えタンパク質(5μM)を、CM18-TAT-Cys、CM18-ペネトラチン-Cysおよび各々(dCM18-TAT-Cys、dCM18-ペネトラチン-Cys)の二量体の種々の濃度および組合せと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表3.3および図8に、ならびに表3.4および図9に示されている。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP組換えタンパク質(5μM)を、各5μMの以下のペプチド:TAT-Cys、CM18、ペネトラチン-Cys、TAT-Cys+CM18、ペネトラチン-Cys+CM18およびCM18-TAT-Cysのそれぞれと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。GFP蛍光を明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化した。顕微鏡結果(データは示さず)は、GFPが、CM18-TAT-Cysを使用してうまく細胞内に送達されたことを示した。しかし、GFPは、単一ドメインペプチドを単独(CM18、TAT-Cys、ペネトラチン-Cys)または一緒に(CM18+TAT-Cys、CM18+ペネトラチン-Cys)使用すると、うまく細胞内に送達されなかった。これらの結果は、カルセインエンドソーム脱出アッセイに関して表2.1および表2.2に示されるものと一致する。
実施例3における実験は、シャトル剤の、GFPを細胞内に送達する能力を示した。この実施例において、示された実験は、シャトル剤がまた、CPDと融合されているGFPカーゴタンパク質(TAT-GFP)の細胞内送達も増大させ得ることを示す。
構築は、TAT配列が、6xヒスチジンタグとGFP配列の間にクローニングされた点を除いて、実施例3.4に示されるように実施した。6xヒスチジンタグ、TAT、GFPおよび停止コドン(-)は、セリン/グリシンリッチリンカーにより分離されている。組換えTAT-GFPタンパク質を、実施例1.4に記載されるように精製した。TAT-GFP構築物の配列は以下であった:
(MW=34.06kDa;pI=8.36)
TAT配列には下線を付与した。
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載されるタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、TAT-GFP組換えタンパク質(5μM)を、3μMのCM18-TAT-Cysと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞およびGFP蛍光を、10xおよび40x倍率で明視野および蛍光顕微鏡により可視化し(実施例3.2に記載されるように)、結果例が、図10に示されている。顕微鏡結果により、CM18-TAT-Cysの非存在下で、TAT-GFPは、低い強度の、文献に報告されたようなエンドソーム分布を示すことが明らかになった。対照的に、TAT-GFPは、シャトル剤CM18-TAT-Cysの存在下で細胞質および核に送達される。理論に束縛されるものではないが、TATペプチド自体は、核移行シグナル(NLS)として作用し得、TAT-GFPの核局在化を説明する。これらの結果は、CM18-TAT-Cysが、TAT-GFP形質導入効率を増大させ、エンドソームにより捕捉されたTAT-GFPが、細胞質および核区画に到達することを可能にすることを示す。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載されるタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、TAT-GFP組換えタンパク質(5μM)を、種々の濃度のCM18-TAT-Cys(0、0.5、1、3または5μM)と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表4.3および図11Aに示されている。対応する細胞毒性データは、図11Bに示されている。
実施例3および4における実験は、シャトル剤の、GFPおよびTAT-GFPを細胞内に送達する能力を示した。この実施例で示される実験は、シャトル剤が、核移行シグナル(NLS)と融合されたGFPタンパク質カーゴの核送達を促進し得ることを示す。
構築は、最適化されたNLS配列を、GFP配列と停止コドン(-)の間に挿入したという点を除いて実施例3.4に記載されるように実施した。NLS配列は、GFP配列および停止コドンから2つのセリン/グリシンリッチリンカーにより分離されている。組換えGFP-NLSタンパク質を、実施例1.4に記載されるように精製した。GFP-NLS構築物の配列は、以下であった:
NLS配列には下線を付与した。
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM)を、5μMのCM18-TAT-Cysと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して曝露した。5分後、GFP蛍光を、10x、20xおよび40xの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によより可視化し(実施例3.2に記載されるように)、結果例が図12に示されている。顕微鏡結果は、GFP-NLSが、わずか5分のインキュベーション後に、シャトル剤CM18-TAT-Cysの存在下で核に効率的に送達されることを示した。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS組換えタンパク質(5μM)を、0、0.5、1、3または5μMのCM18-TAT-Cysと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表5.1および図13Aに示されている。対応する細胞毒性データは、図13Bに示されている。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS組換えタンパク質(5μM)を、CM18-TAT-Cys、CM18-ペネトラチン-Cysおよび各々(dCM18-TAT-Cys、dCM18-ペネトラチン-Cys)の二量体の種々の濃度および組合せと同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表5.2および表5.3、並びに図14および図15に示されている。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS組換えタンパク質(5μM)を、CM18-TAT-Cys(3.5μM)の単独で、またはこれと、dCM18-ペネトラチン-Cys(1μM)を一緒に、同時インキュベートした。細胞を、単純DMEM培地(「DMEM」)または10% FBS(「FBS」)を含有するDMEM培地中で5分または1時間インキュベートし、その後、実施例3.3に記載されたようなフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表5.4、および図16に示されている。シャトル剤またはGFP-NLSで処理されなかった細胞(「ctrl」)およびGFP-NLSを用いたが、シャトル剤を用いないで処理した細胞(「GFP-NLS 5μM」)を対照として使用した。
シャトル剤のGFP-NLSを細胞内に送達する能力を、懸濁液中で成長する急性単球性白血病細胞株であるTHP-1細胞において、試験した。THP-1細胞を培養し(実施例1を参照のこと)、実施例3.1に記載されるタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS組換えタンパク質(5μM)を、1μMのCM18-TAT-Cysと同時インキュベートし、または1μMのCM18-TAT-Cysを加えずにインキュベートし、THP-1細胞に対して5分間曝露し、その後、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表5.5、および図17Aに示されている。対応する細胞毒性データは、図17Bに示されている。
実施例3~5における実験は、シャトル剤の、GFP、TAT-GFPおよびGFP-NLSの形質導入効率を増大させる能力を示した。この実施例で提供される実験は、シャトル剤がまた、より大きなタンパク質カーゴ:FITC標識抗チューブリン抗体も送達できることを示す。FITC標識抗チューブリン抗体は、(Abcam、ab64503)から購入し、150KDaの推定分子質量を有する。送達および顕微鏡プロトコルは、実施例3に記載されている。
FITC標識抗チューブリン抗体(0.5μM)を、5μMのCM18-TAT-Cysと同時インキュベートし、HeLa細胞に対して1時間曝露した。抗体送達を明視野(20x)および蛍光顕微鏡(20xおよび40x)により可視化した。図18に示されるように、細胞質での蛍光チューブリン繊維が可視化され、細胞の内側の抗体の機能性を実証した。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。FITC標識抗チューブリン抗体(0.5μM)を、3.5μMのCM18-TAT-Cys、CM18-ペネトラチン-CysもしくはdCM18-ペネトラチン-Cysまたは、3.5μMのCM18-TAT-Cysと0.5μMのdCM18-ペネトラチン-Cysの組合せと同時インキュベートし、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表6.1および図19Aに示されている。対応する細胞毒性データは、図19Bに示されている。
CM18-TAT-Cysは、細胞内プラスミドDNA送達を可能にするが、プラスミド発現は不十分である
この実施例では、GFPをコードするプラスミドを使用するHEK293A細胞における、CM18-TAT-Cysシャトル剤の、プラスミドDNAを細胞内送達する能力を試験した。
遺伝子導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある哺乳動物細胞(HEK293A)を回収し、24ウェルプレート中に播種した(ウェルあたり50,000個細胞)。細胞を、FBSを含有する適切な成長培地で一晩インキュベートした。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブで、Cy5(商標)蛍光で標識したpEGFPを、37℃で10分間、100μLの最終容量で、新鮮PBS中、CM18-TAT-Cys(0.05、0.5または5μM)と混合した。ウェル中の培地を除去し、細胞を、PBSを用いて3回迅速に洗浄し、500μLの、FBSを含まない加温培地を添加した。細胞にpEGFPおよびCM18-TAT-Cys溶液を添加し、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSを用いて洗浄し、FBSを含有する新鮮培地を添加した。細胞を37℃でインキュベートし、その後、実施例3に記載されるようなフローサイトメトリー解析に供した。
プラスミドDNA(pEGFP)を、Cy5(商標)色素を用い、製造業者の使用説明書(Mirus Bio LLC)に従って標識した。Cy5(商標)部分は、標準遺伝子導入プロトコルを使用する非標識プラスミドと比較した場合に、遺伝子導入効率に影響を及ぼさなかった(データは示さず)。フローサイトメトリー解析は、DNA細胞内送達に対応するCy5(商標)発光、核送達の成功、DNA転写およびタンパク質発現に対応するGFP発光の定量化を可能にした。結果は、表7.1、および図20に示されている。
HEK293A細胞で観察されたペプチドCM18-TAT-Cys(0.1%、表7.1を参照されたい)の不十分な遺伝子導入効率の後で、別の細胞株(HeLa)中で、CM18-TAT-Cysを用いて、表1.3、表B1、および表C1に記載のほかのペプチドと共に、実験を繰り返した。
シャトル剤へのヒスチジンリッチドメインの付加は、GFP-NLS形質導入効率をさらに改善する
8.1 HeLa細胞におけるHis-CM18-TAT-CysによるGFP-NLS形質導入:顕微鏡による可視化
GFP-NLS(5μM、実施例5を参照のこと)を、5μMのCM18-TAT-CysまたはHis-CM18-TATと同時インキュベートし、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞内送達されたGFP-NLSの核蛍光が、蛍光顕微鏡により確認され(データは示さず)、GFP-NLSの核への送達の成功を示す。
HeLa細胞を培養し、実施例3.1に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS(5μM)を、0、1、3または5μMのCM18-TAT-CysまたはHis-CM18-TATと同時インキュベートし、HeLa細胞に対して1時間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表8.1および図21Aに示されている。対応する細胞毒性データは、図21Bに示されている。
His-CM18-PTD4は、GFP-NLS、mCherry(商標)-NLSおよびFITC標識抗チューブリン抗体の形質導入効率および核送達を増大させる
9.1 タンパク質形質導入プロトコル
プロトコルA:細胞培地における送達のためのタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、FBSを含有する適当な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブ中で、所望の濃度のカーゴタンパク質を、50μLの新鮮血清不含培地(特に断りのない限り)中で所望の濃度のシャトル剤とともに37℃で10分間予め混合した(プレインキュベートした)。ウェル中の培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温したPBSを用いて1~3回(使用した細胞の種類に応じて)洗浄した。細胞を、カーゴタンパク質/シャトル剤混合物とともに37℃で所望時間にわたりインキュベートした。インキュベートした後、細胞を、37℃に予め加温したPBSおよび/またはヘパリン(0.5mg/mL)を用いて3回洗浄した。ヒトTHP-1血液細胞には、その後の解析(顕微鏡およびフローサイトメトリー)における望ましくない細胞膜結合タンパク質バックグラウンドを避けるためにヘパリンを用いる洗浄を使用した。細胞を、50μLの、血清を含む新鮮培地中、37℃で最後にインキュベートし、その後解析した。
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した(カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した)。シャトル剤にカーゴタンパク質を添加し、必要に応じて、滅菌PBSを添加して、細胞を覆うのに十分な最終容量(例えば、96ウェルプレートのウェルあたり10~100μL)で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤/カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも3種:(1)シャトル剤単独(例えば、試験される最高濃度で)の対照、(2)カーゴ単独の対照および(3)カーゴまたはシャトル剤のいずれも含まない対照などを含めた。ウェル中の培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温したPBSを用いて1回洗浄し、次いで、所望の時間にわたり、すべての細胞を覆うように、シャトル剤/カーゴ混合物を添加した。ウェル中のシャトル剤/カーゴ混合物を除去し、細胞をPBSを用いて1回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。解析の前に、細胞をPBSを用いて1回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。
形質導入アッセイが実施される1日前に、対数増殖期にある懸濁細胞を回収し、96ウェルプレート(ウェルあたり20,000個細胞)中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした(実施例1を参照のこと)。翌日、別個の滅菌1.5mLチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した(カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した)。シャトル剤にカーゴタンパク質を添加し、必要に応じて、滅菌PBSまたは細胞培養培地(無血清)を添加して、細胞を再懸濁するのに十分な最終容量(例えば、96ウェルプレートのウェルあたり10~100μL)で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤/カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも3種:(1)シャトル剤単独(例えば、試験される最高濃度で)の対照、(2)カーゴ単独の対照および(3)カーゴまたはシャトル剤のいずれも含まない対照などを含めた。細胞を400gで2分間遠心分離し、次いで、培地を除去し、細胞を、37℃に予め加温したPBSに再懸濁した。細胞を400gで再度2分間遠心分離し、PBSを除去し、細胞をシャトル剤/カーゴ混合物中に再懸濁した。所望のインキュベーション時間後、100μLの完全培地を細胞に直接添加した。細胞を、400gで2分間遠心分離し、培地を除去した。ペレットを37℃に予め加温した200μLのPBS中に再懸濁し、洗浄した。別に遠心分離した後、PBSを除去し、細胞を100μLの完全培地に再懸濁した。解析の前に最後の2つのステップを1回反復した。
シャトル剤形質導入効率に対する異なるプロトコルの効果を比較するために、HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAまたはBを使用するタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、プロトコルAを使用し、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、10μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して1時間曝露するか、またはプロトコルBを使用し、35μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表9.1および図22Aに示されている。(「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発する細胞のパーセンテージである)。
用量反応実験を実施して、タンパク質形質導入効率に対するHis-CM18-PTD4濃度の効果を評価した。HeLa細胞を培養し、実施例9.1のプロトコルBに記載されるタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、0、50、35、25または10μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表9.2および図22Bに示されている。
GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、実施例9.1に記載されるようにプロトコルBを使用して、35μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。次いで、細胞を、実施例3.2および3.2aに記載されるように蛍光顕微鏡解析に供した。
FITC標識抗チューブリン抗体(0.5μM、Abcam、ab64503)を、実施例9.1に記載されるようにプロトコルBを使用して、50μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。次いで、細胞を、実施例3.2および3.2aに記載されるように蛍光顕微鏡解析に供し、HeLa細胞における抗チューブリン抗体のFITC蛍光を、最終洗浄ステップ後に20xの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、直ちに可視化した。結果例は、図24Cおよび図24Dに示されている。陰性対照試料(すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにFITC標識抗チューブリン抗体に対して曝露された細胞;データは示さず)では有意なFITC蛍光は観察されなかった。
GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、実施例9.1に記載されるようにプロトコルBを使用して、50μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。洗浄ステップ後、HeLa細胞のGFP蛍光を、種々の時間間隔後に20xの倍率で蛍光顕微鏡(実施例3.2)によって、直ちに可視化した。図27に典型的な結果が示されており、これでは、45、75、100および120秒後に蛍光顕微鏡像が取得された(それぞれ、図27A、27B、27Cおよび27Dを参照のこと)。
mCherry(商標)-NLS組換えタンパク質を、実施例1.4に記載されるように構築し、細菌発現系から発現、精製した。mCherry(商標)-NLS組換えタンパク質の配列は、以下であった:
NLS配列には下線を付与した。
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
His-CM18-PTD4の、GFP-NLSを懸濁細胞の核に送達する能力を、THP-1細胞を使用して試験した。THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAおよびCを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。GFP-NLS(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、1μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、THP-1細胞に対して1時間曝露するか(プロトコルA)、または5μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、THP-1細胞に対して15秒間曝露した(プロトコルC)。細胞を、実施例3.3に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表9.3、および図31に示されている。
GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、実施例9.1に記載されるようなプロトコルCを使用して、5μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、次いで、THP-1細胞に対して15秒間曝露した。細胞を、実施例3.2に記載されるような顕微鏡可視化に供した。
10.1 HeLa細胞における種々のシャトル剤によるGFP-NLS形質導入:フローサイトメトリー
HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、50μMの種々のシャトル剤と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表10.1および図29Aに示されている。「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、10μMのTAT-KALA、His-CM18-PTD4またはHis-C(LLKK)3C-PTD4と1、2または5分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表10.2および図29Bに示されている。「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルCを使用してタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、5μMのTAT-KALA、His-CM18-PTD4またはHis-C(LLKK)3C-PTD4と1、2または5分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表10.3および図29Cに示されている。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、50μMの種々のシャトル剤と同時インキュベートし(アミノ酸配列および特性については表1.3を参照のこと)、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。細胞を、実施例3.3に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表10.3aおよび表10.3bならびに図29Eおよび図29Fに示されている。「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
HeLa細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、50μMの種々の単一ドメインペプチド(TAT、PTD4、ペネトラチン、CM18、C(LLKK)3C、KALA)または2ドメインペプチドHis-PTD4(ELDを欠く)と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表10.4および図29Dに示されている。「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれの単一ドメインペプチドまたはシャトル剤も伴わずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、実施例9.1に記載されるようにプロトコルBを使用して、50μMのシャトル剤と同時インキュベートし、次いで、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。2分のインキュベーション後、細胞を、実施例3.2に記載されるように顕微鏡によって、可視化した。
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルCを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、1μMのTAT-KALA、His-CM18-PTD4またはHis-C(LLKK)3C-PTD4と15、30、60、または120秒間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージ(「Pos細胞(%)」)が、表10.4aに、および図34Aに示されている。平均蛍光強度は、表10.5および図34Bに示されている。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
血清の存在下で低濃度のシャトル剤を用いる反復毎日処理は、THP-1細胞において、GFP-NLS形質導入をもたらす
11.1 THP-1細胞におけるHis-CM18-PTD4またはHis-C(LLKK)3C-PTD4を用いるGFP-NLS形質導入:フローサイトメトリー
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載のプロトコルAに対し、以下の修正を行って、タンパク質形質導入アッセイにより試験した。GFP-NLS組換えタンパク質(5、2.5または1μM、実施例5.1を参照のこと)を、0.5もしくは0.8μMのHis-CM18-PTD4と、または0.8μMのHis-C(LLKK)3C-PTD4と同時インキュベートし、次いで、THP-1細胞に対して、血清を含有する細胞培養培地の存在下で各日150分間曝露した。1日または3日間のシャトル剤/カーゴに対する反復曝露後に、細胞を洗浄し、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表11.1、および図35A、35B、35Cおよび35Fに示されている。陰性対照(「Ctrl」)は、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLS組換えタンパク質(5μM)とともにインキュベートされた細胞に該当する。
12.1 種々の付着細胞および懸濁細胞における、His-CM18-PTD4によるGFP-NLS形質導入:フローサイトメトリー
実施例9.1に記載されるようなプロトコルB(付着細胞)またはC(懸濁細胞)を使用して、シャトル剤His-CM18-PTD4の、GFP-NLSを種々の接着および懸濁細胞の核に送達する能力を調べた。試験した細胞株には、HeLa、Balb3T3、HEK293T、CHO、NIH3T3、筋芽細胞、ジャーカット、THP-1、CA46およびHT2細胞を含め、これらを実施例1に記載されるように培養した。GFP-NLS(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、35μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、付着細胞に対して10秒間曝露するか(プロトコルB)、または5μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、懸濁細胞に対して15秒間曝露した(プロトコルC)。細胞を洗浄し、実施例3.3に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表12.1および図36に示されている。「Pos細胞(%)」は、GFPシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。
実施例9.1に記載されるように、GFP-NLS組換えタンパク質(5μM、実施例5.1を参照のこと)を、プロトコルAを使用して、35μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、付着細胞に対して10秒間曝露するか、またはプロトコルBを使用して、5μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、懸濁細胞に対して15秒間曝露した。細胞を洗浄した後、GFP蛍光を、明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化した。293T(図37A)、Balb3T3(図37B)、CHO(図37C)、筋芽細胞(図37D)、ジャーカット(図37E)、CA46(図37F)、HT2(図37G)、およびNIH3T3(図37H)細胞の、10x倍率で取得したGFP蛍光の画像例を示す。挿入図は、実施例3.3に記載されるように実施された対応するフローサイトメトリー結果で、GFP-NLS-陽性細胞のパーセンテージを示す。陰性対照試料(すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにGFP-NLSに対して曝露された細胞;データは示さず)では有意なGFP蛍光は観察されなかった。
13.1 Cas9-NLS組換えタンパク質
実施例1.4に記載されるように、Cas9-NLS組換えタンパク質を構築し、細菌発現系から発現させ、精製した。製造されたCas9-NLS組換えタンパク質の配列は、以下であった:
NLS配列には下線を付与した。
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
このアッセイによって、うまく送達された活性CRISPR/Cas9複合体を視覚的に特定することが可能になる。図39Aに示されるように、アッセイは、蛍光タンパク質mCherry(商標)およびGFPを、その2つのオープンリーディングフレームを隔てた停止コドンとともにコードする発現プラスミドDNAを細胞に遺伝子導入することを含む。発現プラスミドを用いる細胞の遺伝子導入は、mCherry(商標)発現をもたらすが、GFP発現をもたらさない(図39B)。次いで、プラスミドDNAを停止コドンで切断するように設計/プログラムされているCRISPR/Cas9複合体が、mCherry(商標)を発現する遺伝子導入された細胞に、細胞内送達される(図39D)。活性CRISPR/Cas9複合体の形質導入の成功は、プラスミドDNAを停止コドンで切断するCRISPR/Cas9複合体をもたらす(図39C)。一部の細胞では、切断されたプラスミドのランダムな非相同DNA修復が生じ、停止コドンの除去、したがって、GFP発現および蛍光をもたらす(図39E)。
RNA(crRNAおよびtracrRNA)を、実施例13.2のプラスミド中のmCherry(商標)およびGFPコード配列の間に停止コドンを含有するEMX1遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするように設計した。使用したcrRNAおよびtracrRNAの配列は以下であった:
T7エンドヌクレアーゼI(T7E1)と用いて、培養細胞中のオンターゲットCRISPR/Casゲノム編集イベントを検出できる。概要を示すと、標的細胞由来のゲノムDNAをPCRで増幅する。その後、PCR産物を変性し、再アニーリングして野生型DNAとCRISPR/Cas変異DNAとの間でヘテロ二本鎖形成を可能とする。ミスマッチDNAを認識し、切断するT7E1を用いてヘテロ二本鎖を消化する。得られた切断および完全長PCR産物は、ゲル電気泳動法により可視化される。
実施例9.1に記載されるようなプロトコルAを使用して、Cas9-NLS組換えタンパク質(25nM、実施例13.1)およびPPIB遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするcrRNA/tracrRNA(50nM、下記を参照のこと)から構成される混合物を、10μMのHis-CM18-PTD4またはHis-C(LLKK)3C-PTD4と同時インキュベートし、無血清培地中でHeLa細胞とともに16時間インキュベートした。
構築したcrRNAおよびtracrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用して、Cas9-NLS組換えタンパク質(2.5μM、実施例13.1)およびHPTR遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするcrRNA/tracrRNA(2μM、以下を参照のこと)から構成される混合物を、35μMのHis-CM18-PTD4、His-CM18-PTD4-His、His-C(LLKK)3C-PTD4またはEB1-PTD4と同時インキュベートし、HeLaまたはジャーカット細胞とともにPBS中で2分間インキュベートした。
構築したcrRNAおよびtracrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
14.1 HOXB4-WT組換えタンパク質
ヒトHOXB4組換えタンパク質を、実施例1.4に記載されるように構築し、細菌発現系から発現させ、精製した。製造したHOXB4-WT組換えタンパク質の配列は以下であった:
開始剤メチオニンおよび6xヒスチジンタグは太字である。
対照および処理細胞を、別の滅菌1.5mLチューブに移し、300gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを適切なバッファーに再懸濁して、細胞を溶解する。その後、RNAアーゼ不含70%エタノールを添加し、続いて、ピペッティングによって、混合する。溶解物をRNeasy(商標)Miniスピンカラムに移し、13000RPMで30秒間遠心分離する。適切なバッファーを用いる数回の洗浄および遠心分離ステップの後、溶出物を、氷上で滅菌1.5mLチューブ中に集め、次いで、各チューブ中のRNA量を分光光度計を用いて定量化する。DNアーゼ処理のために、2μgのRNAを15μLのRNアーゼ不含水で希釈する。次いで、1.75μLの10X DNアーゼバッファーおよび0.75μLのDNアーゼを添加し、続いて、37℃で15分間インキュベートする。逆転写酵素処理のために、0.88μLのEDTA(50nM)を添加し、続いて、75℃で5分間インキュベートする。PCRチューブ中で、0.5μgのDNアーゼ処理RNAを、4μLのiScript(商標)逆転写Supermix(5X)および20μLのヌクレアーゼ不含水と混合する。PCR機器において、次のプログラム:25℃で5分、42℃で30分および85℃で5分、を用いて混合物をインキュベートする。新たに合成されたcDNAを滅菌1.5mLチューブ中に移し、2μLのヌクレアーゼ不含水で希釈する。ウェルあたり18μLのqPCR機器(CFX-96(商標))の混合物を解析のためにPCRプレートに加える。
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、形質導入の1日前にTHP-1細胞を、30000個細胞/ウェルで播種した。HOXB4-WT組換えタンパク質(0.3、0.9または1.5μM、実施例14.1)を、種々の濃度のHis-CM18-PTD4(0、0.5、7.5、0.8または1μM)と同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でTHP-1細胞に対して2.5時間曝露した。HOXB4活性のマーカーとして標的遺伝子のmRNAレベルを測定するために、細胞を実施例14.2に記載されるようなリアルタイムPCR解析に供し、次いで、陰性対照細胞(処理なし)において、検出された標的遺伝子mRNAレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全RNAレベル(ng/μL)も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表14.1および図42に示されている。
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の1日前にTHP-1細胞を、30000個細胞/ウェルで播種した。HOXB4-WT組換えタンパク質(1.5μM、実施例14.1)を、His-CM18-PTD4(0.8μM)と同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でTHP-1細胞に対して0、2.5、4、24または48時間曝露した。HOXB4活性のマーカーとして標的遺伝子のmRNAレベルを測定するために、細胞を実施例14.2に記載されるようなリアルタイムPCR解析に供し、次いで、陰性対照細胞(処理なし)において、検出された標的遺伝子mRNAレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全RNAレベル(ng/μL)も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表14.2および図43に示されている。
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の1日前にTHP-1細胞を、30000個細胞/ウェルで播種した。HOXB4-WT組換えタンパク質(0.3μM、実施例14.1)を、His-CM18-PTD4(0.8μM)と同時インキュベートし、次いで、THP-1細胞に対して血清の存在下で0、0.5、1、2、2.5、3または4時間曝露した。HOXB4活性のマーカーとして標的遺伝子のmRNAレベルを測定するために、細胞を実施例14.2に記載されるようなリアルタイムPCR解析に供し、次いで、陰性対照細胞(処理なし)において、検出された標的遺伝子mRNAレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全RNAレベル(ng/μL)も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表14.3および図44に示されている。
実施例9.1に記載されるようなプロトコルBを使用して、組換えHOXB4-WT転写因子(25μM、実施例14.1)を35μMのHis-CM18-PTD4と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して10秒間曝露した。形質導入されたHOXB4-WTが核に蓄積するのを可能にするために30分インキュベートした後、実施例3.2aに記載されるように、細胞を固定し、透過処理し、免疫標識した。HOXB4-WTを1/500希釈した一次マウス抗HOXB4モノクローナル抗体(Novus Bio 重量%NBP2-37257)および1/1000希釈した二次抗マウス抗体Alexa(商標)-594(Abcam #150116)を使用して標識した。核をDAPIを用いて標識した。実施例3.2に記載されるように、20xおよび40xの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、細胞を可視化し、結果例は、図45に示されている。核標識(図45Aおよび45C)とHOXB4-WT標識(図45Bおよび45D)の間に同時局在性が観察され、HOXB4-WTが、シャトル剤His-CM18-PTD4の存在下で30分後に核にうまく送達されたことを示す。白色三角窓は、核(DAPI)およびHOXB4-WT免疫標識の間の同時局在性の領域の例を示す。
THP-1細胞を培養し、実施例9.1に記載されるようなプロトコルAを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の1日前にTHP-1細胞を、30000個細胞/ウェルで播種した。HOXB4-WT組換えタンパク質(1.5μM、実施例14.1)を、0.8μMのシャトル剤His-CM18-PTD4、TAT-KALA、EB1-PTD4、His-C(LLKK)3C-PTD4およびHis-CM18-PTD4-Hisと同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でTHP-1細胞に対して2.5時間曝露した。HOXB4活性のマーカーとして標的遺伝子のmRNAレベルを測定するために、細胞を実施例14.2に記載されるようなリアルタイムPCR解析に供し、次いで、陰性対照細胞(処理なし)において、検出された標的遺伝子mRNAレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全RNAレベル(ng/μL)も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表14.4および図47に示されている。
シャトル剤His-CM18-PTD4の、ラット脳細胞の核において、インビボでGFP-NLSを送達する能力を試験した。
別個の滅菌1.5mLチューブ中で、シャトル剤His-CM18-PTD4を、滅菌蒸留水により室温で希釈した。次いで、カーゴタンパク質として使用されるGFP-NLSを、シャトル剤に添加し、必要に応じて、滅菌PBSを添加して、ラット脳における注射のために十分な最終容量(例えば、各注射脳部位あたり5μL)で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤/カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。GFP-NLS単独の注射に対応する1種の陰性対照を実験に含めた。
複数の異なるペプチドを、独立したポリペプチドカーゴを細胞内で真核細胞のサイトゾル/核に送達できるポリペプチドベースのシャトル剤を特定する目的で最初にスクリーニングした。一方では、大規模スクリーニングの取り組みにより、細胞膜透過性ドメイン(CPD)と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン(ELD)、および任意選択で1つまたは複数のヒスチジンリッチドメインを含むドメインベースペプチドシャトル剤が、真核細胞中の独立したポリペプチドカーゴの形質導入効率を増大させ、それにより、カーゴがサイトゾル/核区画に到達するという発見に至った(実施例1~15を参照されたい)。逆に、これらのスクリーニングの取り組みは、ポリペプチドカーゴ形質導入能力、過度の毒性、および/またはその他の望ましくない特性(例えば、不十分な溶解度および/または安定性)を持たないまたはそれらが低いいくつかのペプチドを明らかにした。
表A1に示したパラメーター、および得られた経験的知識(例えば、実施例1~15)を用いて、そのパラメーターが、うまくいくペプチドシャトル剤の設計に使用できるか否かを評価するために、表B1に記載のペプチドをマニュアルで設計した。
合成ペプチドシャトル剤のコンピューター支援設計
C.1 機械学習支援設計手法
表C1に記載のペプチドは、“Machine Learning Assisted Design of Highly Active Peptides for Drug Discovery’’(Giguere et al.,2014)と題するSebastien Giguereらによる論文に記載のアルゴリズムを用いて設計した。このコンピューター予測法は、カーネル学習法および機械学習法に基づくアルゴリズムの使用をベースにしている(Shawe-Taylor J.and Cristianini N.,2004)。これらのアルゴリズムは、目的の生物学的作用に応じて、最大生物活性を有するペプチドを選別することを目的とする。ここで、我々は、タンパク質形質導入アッセイで現在までに試験した全てのペプチドを考慮し、それらを3つの別々のグループに分けた。グループの構成は、実施例Aで記載のように計算した「形質導入スコア」をベースにした。グループ1は、低毒性で効果的細胞送達を示すペプチドから構成し;グループ2は、効果的細胞送達を示すが、毒性の高いペプチドから構成し;およびグループ3は、何らの大きなポリペプチドカーゴ形質導入能力も示さなかったペプチドから構成した。
コンピューター支援設計手法を採用して、表A1に示す設計パラメーターのほとんどまたは全てを満たすペプチドバリアントの設計および生成の実現性を実証した。第1に、この手法には、構造上異なるがそれでも成功するペプチドシャトル剤の一次アミノ酸配列をマニュアルで検討および比較し、構造的パラメーター(2)、(3)および(4)を満たすこと(すなわち、両親媒性のアルファヘリックス形成、正に帯電した面、および12%~50%の高度疎水性コア)に繋がる一般的コンセンサス配列を特定することを含めた。第2に、この手法には、設計パラメーターのほとんど、または全てを満たすペプチドバリアントのリストを生成するために、コンピューター支援ランダムペプチド配列生成と、それに続けて、記述子フィルタリング、コンセンサス配列および(1)と(5)~(15)の設計パラメーターの内の1つまたは複数の組み込みを含めた。これについては、以下にさらに詳しく考察する。
(a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);または
(h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
式中、[X1]、[X2]、[X3]、[X4]、および[リンカー]は、下表で定義の通りである:
実施例2に一般的に記載のようにカルセインエンドソーム脱出アッセイを実施し、蛍光顕微鏡法(データは示さず)およびフローサイトメトリー(FSD5の結果を以下に示す)により特性を明らかにした。
FSD18は、FSD5に類似の結果を示した(データは示さず)。
実施例3.1a(付着細胞)または実施例3.1b(懸濁細胞)に一般的に記載のようにして、示された濃度で、カーゴとしての10μMのGFP-NLSを用い、示した時間にわたり合理的に設計されたペプチドを用いて、種々の細胞型におけるタンパク質形質導入アッセイを実施した後、フローサイトメトリー(実施例3.3)および蛍光顕微鏡法(実施例3.2)により特性を明らかにした。フローサイトメトリー分析の結果を下表に示す。蛍光顕微鏡により、細胞の核へのGFP-NLSの送達の成功が実証された(データは示さず)。
F.1 HeLa細胞におけるFSD5による蛍光標識抗体の形質導入
ペプチドFSD5およびカーゴとしての抗体を用いて、1分のインキュベーション時間後に、実施例3.1で一般的に記載のタンパク質形質導入アッセイを実施した後、蛍光顕微鏡法(実施例3.2)により特性を明らかにした。図50は、HeLa細胞中でペプチドFSD5(8μM)により1分間送達されたヤギ抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor(登録商標)488)および抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor(登録商標)594)抗体の細胞質形質導入ならびに蛍光顕微鏡法により20x倍率でAlexa Fluor 594 Ab(図50A)で;および10xと20x倍率でAlexa Fluor 488 Ab(それぞれ、図50Bおよび50C)で可視化した結果を示す。生細胞の明視野および蛍光像をそれぞれ上段および下段パネルに示す。
抗NUP98抗体(10μg)を、7.5μMのFSD19と同時インキュベートし、HeLa細胞に対して4時間曝露した。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒド4%で固定し、0.1%トリトン(商標)で透過処理し、蛍光標識(Alexa(商標)Fluor 488)ヤギ抗ラット抗体で標識した。核周辺膜および細胞核に結合した抗体は、20x(上段パネル)および40x(下段パネル)の蛍光顕微鏡法により可視化した。図50Dに示すように、緑色蛍光シグナル(左パネル)が核膜から発光され、また、ヘキスト染色と重なり合わせさっており(右パネル)、抗NUP98抗体が、その形質導入後に細胞の内側でその機能を保持したことを示している。
モノクローナル(mAb)およびポリクローナル(pAb)抗活性化カスパーゼ3抗体(2μg)を7.5μMのFSD23の存在下でTHP-1およびジャーカット細胞と5分間、独立に、同時インキュベートした。それぞれの抗体の抗アポトーシス性効果を、ELISA切断型PARPアッセイによりカスパーゼ3活性化アポトーシスのレベルにより評価し、後述のように分光法により定量化した。
我々は、合理的に設計されたペプチドシャトル剤の機能的CRISPRベースゲノム編集複合体を真核細胞の核に送達する能力を標準的DNA切断アッセイを用いて試験した。これらのアッセイを用いて、CRISPR/Cas9およびCRISPR/Cpf1媒介細胞ゲノムDNA配列HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1)およびDNMT1(DNA(シトシン-5-)-メチルトランスフェラーゼ1)の切断を測定した。種々のシャトル剤によるゲノム編集複合体の細胞内送達後、短い(72bp)および長い(1631bp)DNAテンプレートの相同組換え(HDR)をHPRTゲノム切断部位で実施し、測定した。
G.1.1 機能的CRISPR/Cas9-NLS複合体の形質導入
Cas9-NLS組換えタンパク質は、実施例13.1に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cas9-NLS組換えタンパク質およびHPTR遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするcrRNA/tracrRNA(下記参照)から構成される混合物を、種々の濃度のFSD5、FSD8、FSD10またはFSD18と同時インキュベートし、さらに、HeLa、HCC-78、NIC-H196またはREC-1細胞と共にPBS中で2分間、または血清含有培地中で48時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびtracrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
Cas9-NLS組換えタンパク質(2.5μM)(実施例13.1を参照されたい);HPTR遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするcrRNA/tracrRNA(2μM)(上記参照);ペプチドシャトル剤FSD5(15μM);および0ngまたは500ngの短い直鎖テンプレートDNA(72bp;下記参照)を含む混合物を調製した。
図51Gは、短いDNAテンプレートの非存在下(「テンプレートなし」)または存在下(+500ng)で、FSD5(15μM)により形質導入されたCRISPR/Cas9複合体による標的HPRTゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、2つの切断産物バンド(より濃い中実矢印)のみの相対シグナル%の合計である。これらの結果は、テンプレートDNAの存在下または非存在下で、FSD5が機能的CRISPR/Cas9複合体を形質導入できることを示す。
Cas9-NLS組換えタンパク質(2.5μM)(実施例13.1を参照されたい);HPTR遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするcrRNA/tracrRNA(2μM)(上記参照);ペプチドシャトル剤FSD5(15μM);および0ngまたは500ngのGFPをコードする長い直鎖テンプレートDNA(1631bp;下記参照)を含む混合物を調製した。
実施例3.1aに記載の形質導入プロトコルを用いて、Cpf1-NLS組換えタンパク質(2.5μM)およびDNMT1遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするcrRNA(2μM;下記を参照のこと)から構成される混合物を、種々の濃度のFSD18と同時インキュベートし、さらに、HeLaまたはNK細胞と共にHeLa細胞中で2分間、またはPBS中のNK細胞中でもしくは血清不含培地中で90秒間インキュベートした。
製造したCpf1-NLS組換えタンパク質の配列は以下であった:
NLS配列には下線を付与した。
セリン/グリシンリッチリンカーは太字である。
使用したcrRNAの配列は、以下であった:
これらの実施例は、合理的に設計されたペプチドシャトル剤の複数遺伝子標的の同時の送達および編集を可能とする。機能的CRISPRベースゲノム編集複合体を真核細胞の核に送達し、標準的DNA切断アッセイを用いて、ゲノム編集の成功を評価した。これらのアッセイを用いて、CRISPR/Cas9媒介細胞ゲノムDNA配列HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1)およびB2M(β2ミクログロブリンHLAサブユニット)の切断を測定し、さらに、CRISPR/Cpf1媒介細胞ゲノムDNA配列NKG2A(阻害性NK細胞受容体2A)、GSK3(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3)、CBLB(E3ユビキチンタンパク質リガーゼ)、DNMT1(DNA(シトシン-5-)-メチルトランスフェラーゼ1)およびB2M(β2ミクログロブリンHLAサブユニット)の切断を測定した。我々はまた、同じ細胞中で1つまたは2つの遺伝子を標的とする複数のCRISPR系の送達を用いたより複雑なゲノム編集手法を実施した。CRISPR/Cas9およびCRISPR/Cpf1複合体を、一緒にHeLa細胞に送達し、HPRTおよびDNMT1遺伝子をそれぞれ編集したか、またはエキソン2の2つの異なる座位のB2M遺伝子を編集した。最終的に、我々は、それぞれ特殊なcrRNAを有する2つのCRISPR/Cpf1複合体を同時送達し、NK細胞のB2M遺伝子中の2つのエキソンを編集した。
Cas9-NLS組換えタンパク質は、実施例13.1に記載のようにして調製された。Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cas9-NLS組換えタンパク質とそのそれぞれのcrRNA/tracrRNAとから構成される混合物、またはCpf1-NLS組換えタンパク質とB2M遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするそのそれぞれのシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、種々の濃度のペプチドFSD10、FSD18、FSD19、FSD21、FSD22、またはFSD23と同時インキュベートし、さらに、HeLa、THP-1またはNK細胞と共にPBS中で90秒間、または血清不含培地中で1時間、または血清含有培地中で48時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびtracrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cpf1-NLS組換えタンパク質と、GSK3、CBLBおよびおDNMT1遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、種々の濃度のFSD10、FSD18、FSD19またはFSD23と同時インキュベートし、さらに、NK細胞と共に血清含有培地中で48時間、およびTHP-1またはPBS中の初代筋芽細胞中で90秒間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cpf1-NLS組換えタンパク質と、NKG2A遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、種々の濃度のFSD10、FSD21、FSD22またはFSD23と同時インキュベートし、さらに、NKおよびNK-92細胞と共にPBS中で90秒間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
Cas9-NLS組換えタンパク質は、実施例13.1に記載のようにして調製された。Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cas9-NLS組換えタンパク質とそのそれぞれのcrRNA/tracrRNAとから構成される混合物、またはCpf1-NLS組換えタンパク質とDNMT1、HPRTおよびB2M遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするそのそれぞれのシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、種々の濃度のFSD10、FSD18、FSD21またはFSD23と同時インキュベートし、さらに、HeLaおよびNK細胞と共にPBS中で90秒間または2分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびtracrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cpf1-NLS組換えタンパク質と、B2M遺伝子の3つの選択されたヌクレオチド配列の1つを標的とするシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、(3μM)のFSD18と同時インキュベートし、さらに、THP-1細胞と共にPBS中で90秒間インキュベートした。Cpf1-NLS組換えタンパク質と、それぞれ3つの異なるB2M遺伝子のヌクレオチド配列を標的とする3つのガイド(下記参照)のから構成される混合物を用いて、同じ実験を実施した。実施例G.7に記載のようにして、フローサイトメトリー実験を実施した。また、実施例13.4に記載のように、T7E1プロトコルアッセイで進めるために、細胞をPBSで洗浄し、回収した。
構築したcrRNAおよびそれらの標的の配列は以下であった:
NK-92細胞中でゲノム編集を実施して、内在性NKG2A遺伝子の不活化が、NK-92細胞の細胞傷害性を高めるかどうかを評価した。手短に説明すると、百万個のNK-92細胞を、NKG2A遺伝子を標的とするCpf1-NLS(1.5μM)gRNA複合体、およびFSD23(6μM)と共に90秒間インキュベートした。形質導入後、細胞を、完全培地中でIL2(20ng/mL)と共に37℃で48時間インキュベートした。その後、NK-92細胞を、製造業者の推奨条件に従って、フィコエリトリン(PE)標識抗NKG2A抗体(Miltenyi Biotec #CD159a)で免疫標識した。次いで、NK-92細胞をFACSで分析し、それらの抗NKG2A検出(PE蛍光)レベルの関数としてスコア化した。結果を図57Aに示す。対照として、非標識野生型NK-92細胞(「非標識WT細胞」)は、抗体シグナルがなく、標識野生型NK-92細胞(「標識WT細胞」)は、完全な免疫標識シグナルを有した。NKG2A-KO NK-92細胞の場合、2つの細胞集団(ピーク):1つは、細胞表面上のNKG2A受容体発現の完全なノックアウトを有するもの(「完全NKG2A KO細胞」)、およびもう1つは、発現の部分的欠如を有するもの(「部分的なNKG2A KO細胞」)が観察された。
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製された。実施例3.1aに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Cpf1-NLS組換えタンパク質と、B2MまたはNKG2A遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドcrRNA(下記参照)とから構成される混合物を、20μMまたは6μMの示したペプチドと同時インキュベートし、さらに、HeLaまたはNK-92細胞と共にPBS中で1分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、回収して、実施例13.4に記載されるようなT7E1プロトコルアッセイを進めた。
構築したcrRNAおよびそれらの標的は:B2M crRNA-G(配列番号168)およびNKG2A crRNA(配列番号165)であった。
ヒトHOXB4組換えタンパク質(実施例14.1)を構築し、実施例1.4に記載の細菌発現系から発現させ、精製した。THP-1細胞を培養し、実施例3.1bに一般的に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、形質導入の1日前にTHP-1細胞を、30000個細胞/ウェルで播種した。HOXB4-WT組換えタンパク質(300nMまたは50nM)を、FSD10またはFSD18(1μM)と同時インキュベートした後、血清の存在下でTHP-1細胞に30分間曝露した。HOXB4活性のマーカーとして標的遺伝子のmRNAレベルを測定するために、細胞を実施例14.2に記載されるようなリアルタイムPCR解析に供し、次いで、陰性対照細胞(処理なし)において検出された標的遺伝子mRNAレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全RNAレベル(ng/μL)も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果を下に示す。
本明細書に記載のドメインベースおよび合理的に設計されたペプチドシャトル剤の、2つの異なるポリペプチドカーゴを同時形質導入する能力を実施例9.6に(すなわち、蛍光タンパク質GFP-NLSおよびmCherry-NLS)および実施例G.6(すなわち、ゲノム編集複合体CRISPR/Cas9およびCRISPR/Cpf1の同時形質導入)に示す。
Cpf1-NLS組換えタンパク質は、実施例G.2に記載のようにして調製され、GFP-NLS組換えタンパク質は実施例5.1に記載のように調製された。
実施例I.1に記載の実験を、12μMまたは15μMのペプチドFSD18を用いて、活性化T細胞に対し繰り返した。FSD18の両方の濃度は類似の結果をもたらしたので、15μMのFSD18を用いた結果のみを本明細書で示す。それぞれに前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)パラメーターを用いた細胞サイズおよび粒状度を基準にしたフローサイトメトリー結果は、GFP-NLSおよびCRISPR/Cpf1系の試験条件下での同時送達が、形質導入T細胞の生存率に大きな影響を与えなかったことを示した(データは示さず)。
実施例I.1およびI.2で実施した実験をTHP-1細胞で再現し、類似の結果を得た。CRISPR/Cpf1-NLSおよびGFP-NLSの2μMのFSD18の存在下での同時形質導入と、これに続く、GFP陽性細胞の蛍光標識細胞分取により、ゲノム編集細胞が大きく濃縮された(データは示さず)。
この実施例は、ペプチドシャトル剤による第1ラウンドの形質導入後に形質導入されなかった細胞が、その後の形質導入に不応性とは限らないことを示している。
Andreu,D.,Ubach,J.,Boman,A.,Wahlin,B.,Wade,D.,Merrifield,R.B.,and Boman,H.G.(1992)Shortened cecropin A-melittin hybrids.Significant size reduction retains potent antibiotic activity.FEBS letters 296,190-194
Aguila,J.R.,W.Liao,J.Yang,C.Avila,N.Hagag,L.Senzel and Y.Ma(2011).”SALL4 is a robust stimulator for the expansion of hematopoietic stem cells.” Blood 118(3):576-585.
Akinci,E.,A.Banga,L.V.Greder,J.R.Dutton and J.M.Slack(2012).”Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta(beta)cell character using Pdx1,Ngn3 and MafA.” Biochem J 442(3):539-550.
Alford et al.,(2009).“Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging:literature review.” Mol Imaging.8(6):341-54.
Amand,H.L.,B.Norden and K.Fant(2012).”Functionalization with C-terminal cysteine enhances transfection efficiency of cell-penetrating peptides through dimer formation.” Biochem Biophys Res Commun 418(3):469-474.
Aoukaty,A.& Tan,R.(2005).Role for glycogen synthase kinase-3 in NK cell cytotoxicity and X-linked lymphoproliferative disease.J Immunol 174,4551-8.
Barrangou,R.and Luciano A.Marraffini(2014). ‘’CRISPR-Cas Systems:Prokaryotes Upgrade to Adaptive Immunity’’.Cell Volume 54,Issue 2,p234-244,24 April 2014.
Bejarano,L.A.and C.Gonzalez(1999).”Motif trap:a rapid method to clone motifs that can target proteins to defined subcellular localisations.” J Cell Sci 112( Pt 23):4207-4211.
Bikard et al.,Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system.Nucleic Acids Res.41,7429-7437.
Boman,H.G.,Wade,D.,Boman,I.A.,Wahlin,B.,and Merrifield,R.B.(1989)Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids.FEBS letters 259,103-106.
Braud,V.M.,Allan,D.S.,O’Callaghan,C.A.,Soderstrom,K.,D’Andrea,A.,Ogg,G.S.,Lazetic,S.,Young,N.T.,Bell,J.I.,Phillips,J.H.,Lanier,L.L.& McMichael,A.J.(1998).HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A,B and C.Nature 391,795-9.
Buganim et al.,(2014)“The Developmental Potential of iPSCs Is Greatly Influenced by Reprogramming Factor Selection”.Cell stem cell.15,295-309.
Burstein et al.,(2017),“New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.” Nature.542(7640):237-241.
Chan,C.K.and D.A.Jans(1999).”Enhancement of polylysine-mediated transferrinfection by nuclear localization sequences:polylysine does not function as a nuclear localization sequence.” Hum Gene Ther 10(10):1695-1702.
Chan,C.K.and D.A.Jans(2001).”Enhancement of MSH receptor- and GAL4-mediated gene transfer by switching the nuclear import pathway.” Gene Ther 8(2):166-171.
Cong et al.,(2013).Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823.
Cooper,M.A.,Fehniger,T.A.& Caligiuri,M.A.(2001).The biology of human natural killer-cell subsets.Trends Immunol 22,633-40.
Cox et al.(2015).“Therapeutic genome editing:prospects and challenges”.Nature medicine,21:121-131.
de Kruijf,E.M.,Sajet,A.,van Nes,J.G.,Natanov,R.,Putter,H.,Smit,V.T.,Liefers,G.J.,van den Elsen,P.J.,van de Velde,C.J.& Kuppen,P.J.(2010).HLA-E and HLA-G expression in classical HLA class I-negative tumors is of prognostic value for clinical outcome of early breast cancer patients.J Immunol 185,7452-9.
Delconte,R.B.,Kolesnik,T.B.,Dagley,L.F.,Rautela,J.,Shi,W.,Putz,E.M.,Stannard,K.,Zhang,J.G.,Teh,C.,Firth,M.,Ushiki,T.,Andoniou,C.E.,Degli-Esposti,M.A.,Sharp,P.P.,Sanvitale,C.E.,Infusini,G.,Liau,N.P.,Linossi,E.M.,Burns,C.J.,Carotta,S.,Gray,D.H.,Seillet,C.,Hutchinson,D.S.,Belz,G.T.,Webb,A.I.,Alexander,W.S.,Li,S.S.,Bullock,A.N.,Babon,J.J.,Smyth,M.J.,Nicholson,S.E.& Huntington,N.D.(2016).CIS is a potent checkpoint in NK cell-mediated tumor immunity.Nat Immunol 17,816-24.
Denman,C.J.,Senyukov,V.V.,Somanchi,S.S.,Phatarpekar,P.V.,Kopp,L.M.,Johnson,J.L.,Singh,H.,Hurton,L.,Maiti,S.N.,Huls,M.H.,Champlin,R.E.,Cooper,L.J.& Lee,D.A.(2012).Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells.PLoS ONE 7,e30264.
Dolfini,D.,M.Minuzzo,G.Pavesi and R.Mantovani(2012).”The short isoform of NF-YA belongs to the embryonic stem cell transcription factor circuitry.” Stem Cells 30(11):2450-2459.
Drin,G.,S.Cottin,E.Blanc,A.R.Rees and J.Temsamani(2003).”Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides.” J Biol Chem 278(33):31192-31201.
Eisenberg et al.,(1982).“The helical hydrophobic moment:a measure of the amphiphilicity of a helix”.Nature 299,371-374.
El-Andaloussi,S.,H.J.Johansson,T.Holm and U.Langel(2007).”A novel cell-penetrating peptide,M918,for efficient delivery of proteins and peptide nucleic acids.” Mol Ther 15(10):1820-1826.
El-Sayed,A.,S.Futaki and H.Harashima(2009).”Delivery of macromolecules using arginine-rich cell-penetrating peptides:ways to overcome endosomal entrapment.” AAPS J 11(1):13-22.
Elmquist,A.,M.Lindgren,T.Bartfai and U.Langel(2001).”VE-cadherin-derived cell-penetrating peptide,pVEC,with carrier functions.” Exp Cell Res 269(2):237-244.
Erazo-Oliveras et al.,(2014)“Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.” Nat Methods.(8):861-7.
Fanara,P.,M.R.Hodel,A.H.Corbett and A.E.Hodel(2000).”Quantitative analysis of nuclear localization signal(NLS)-importin alpha interaction through fluorescence depolarization.Evidence for auto-inhibitory regulation of NLS binding.” J Biol Chem 275(28):21218-21223.
Fasoli A et al.,(2014)“Mechanistic insight into CM18-Tat11 peptide membrane-perturbing action by whole-cell patch-clamp recording.” Molecules.19(7):9228-39.
Fawell,S.,J.Seery,Y.Daikh,C.Moore,L.L.Chen,B.Pepinsky and J.Barsoum(1994).”Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells.” Proc Natl Acad Sci U S A 91(2):664-668.
Fominaya,J.,C.Uherek and W.Wels(1998).”A chimeric fusion protein containing transforming growth factor-alpha mediates gene transfer via binding to the EGF receptor.” Gene Ther 5(4):521-530.
Fominaya,J.and W.Wels(1996).”Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein.Novel non-viral gene delivery system.” J Biol Chem 271(18):10560-10568.
Fonoudi,H.,M.Yeganeh,F.Fattahi,Z.Ghazizadeh,H.Rassouli,M.Alikhani,B.A.Mojarad,H.Baharvand,G.H.Salekdeh and N.Aghdami(2013).”ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells.” PLoS One 8(1):e55577.
Gao et al.,(2016)DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute.Nature Biotechnology 34,768-773.
Giguere et al.,Machine learning assisted design of highly active peptides for drug discovery.PLoS Comput Biol.2015 Apr 7;11(4):e1004074.
Gilbert et al.,CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.Cell 154,442-451.
Gilmore,T.D.and H.M.Temin(1988).”v-rel oncoproteins in the nucleus and in the cytoplasm transform chicken spleen cells.” J Virol 62(3):703-714.
Glover,D.J.,S.M.Ng,A.Mechler,L.L.Martin and D.A.Jans(2009).”Multifunctional protein nanocarriers for targeted nuclear gene delivery in nondividing cells.” FASEB J 23(9):2996-3006.
Gordon,S.M.,J.Chaix,L.J.Rupp,J.Wu,S.Madera,J.C.Sun,T.Lindsten and S.L.Reiner(2012).”The transcription factors T-bet and Eomes control key checkpoints of natural killer cell maturation.” Immunity 36(1):55-67.
Gottschalk,S.,J.T.Sparrow,J.Hauer,M.P.Mims,F.E.Leland,S.L.Woo and L.C.Smith(1996).”A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells.” Gene Ther 3(5):448-457.
Gould,S.J.,G.A.Keller,N.Hosken,J.Wilkinson and S.Subramani(1989).”A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes.” J Cell Biol 108(5):1657-1664.
Green,M.and P.M.Loewenstein(1988).”Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.” Cell 55(6):1179-1188.
Grimes,M.L.,J.Zhou,E.C.Beattie,E.C.Yuen,D.E.Hall,J.S.Valletta,K.S.Topp,J.H.LaVail,N.W.Bunnett and W.C.Mobley(1996).”Endocytosis of activated TrkA:evidence that nerve growth factor induces formation of signaling endosomes.” J Neurosci 16(24):7950-7964.
Guo,Z.Y.,Lv,Y.G.,Wang,L.,Shi,S.J.,Yang,F.,Zheng,G.X.,Wen,W.H.& Yang,A.G.(2015).Predictive value of HLA-G and HLA-E in the prognosis of colorectal cancer patients.Cell Immunol 293,10-6.
Hallbrink,M.,A.Floren,A.Elmquist,M.Pooga,T.Bartfai and U.Langel(2001).”Cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides.” Biochim Biophys Acta 1515(2):101-109.
Herce,H.D.and A.E.Garcia(2007).”Molecular dynamics simulations suggest a mechanism for translocation of the HIV-1 TAT peptide across lipid membranes.” Proc Natl Acad Sci U S A 104(52):20805-20810.
Ho et al.,(2001).“Synthetic protein transduction domains:enhanced transduction potential in vivo.” Cancer Research 61:474-477.
Horng,T.,Bezbradica,J.S.& Medzhitov,R.(2007).NKG2D signaling is coupled to the interleukin 15 receptor signaling pathway.Nat Immunol 8,1345-52.
Hurt,E.C.,B.Pesold-Hurt,K.Suda,W.Oppliger and G.Schatz(1985).”The first twelve amino acids(less than half of the pre-sequence)of an imported mitochondrial protein can direct mouse cytosolic dihydrofolate reductase into the yeast mitochondrial matrix.” EMBO J 4(8):2061-2068.
Ichii,H.,A.Sakamoto,Y.Kuroda and T.Tokuhisa(2004).”Bcl6 acts as an amplifier for the generation and proliferative capacity of central memory CD8+ T cells.” J Immunol 173(2):883-891.
Irie,Y.,K.Yamagata,Y.Gan,K.Miyamoto,E.Do,C.H.Kuo,E.Taira and N.Miki(2000).”Molecular cloning and characterization of Amida,a novel protein which interacts with a neuron-specific immediate early gene product arc,contains novel nuclear localization signals,and causes cell death in cultured cells.” J Biol Chem 275(4):2647-2653.
Ishigami,S.,Arigami,T.,Okumura,H.,Uchikado,Y.,Kita,Y.,Kurahara,H.,Maemura,K.,Kijima,Y.,Ishihara,Y.,Sasaki,K.,Uenosono,Y.& Natsugoe,S.(2015).Human leukocyte antigen(HLA)-E and HLA-F expression in gastric cancer.Anticancer Res 35,2279-85.
Kakudo,T.,S.Chaki,S.Futaki,I.Nakase,K.Akaji,T.Kawakami,K.Maruyama,H.Kamiya and H.Harashima(2004).”Transferrin-modified liposomes equipped with a pH-sensitive fusogenic peptide:an artificial viral-like delivery system.” Biochemistry 43(19):5618-5628.
Karniely,S.and O.Pines(2005).”Single translation--dual destination:mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.” EMBO Rep 6(5):420-425.
Kato,G.J.,W.M.Lee,L.L.Chen and C.V.Dang(1992).”Max:functional domains and interaction with c-Myc.” Genes Dev 6(1):81-92.
Kichler,A.,A.J.Mason and B.Bechinger(2006).”Cationic amphipathic histidine-rich peptides for gene delivery.” Biochim Biophys Acta 1758(3):301-307.
Kichler et al.,(2003).“Histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficient delivery of DNA into mammalian cells”.Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Feb 18;100(4):1564-1568.
Kira et al.,(2011).‘’Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems’’.Biol Direct.2011;6:38.
Kirwan,S.E.& Burshtyn,D.N.(2005).Killer cell Ig-like receptor-dependent signaling by Ig-like transcript 2(ILT2/CD85j/LILRB1/LIR-1).J Immunol 175,5006-15.
Kleinschmidt,J.A.and A.Seiter(1988).”Identification of domains involved in nuclear uptake and histone binding of protein N1 of Xenopus laevis.” EMBO J 7(6):1605-1614.
Kohler,M.,D.Gorlich,E.Hartmann and J.Franke(2001).”Adenoviral E1A protein nuclear import is preferentially mediated by importin alpha3 in vitro.” Virology 289(2):186-191.
Kwon,et al.,(2010).“A Truncated HGP Peptide Sequence That Retains Endosomolytic Activity and Improves Gene Delivery Efficiencies”.Mol.Pharmaceutics,7:1260-65.
Lamiable et al.,(2016).“PEP-FOLD3:faster de novo structure prediction for linear peptides in solution and in complex” Nucleic Acids Res.44(W1):W449-54.
Lanford,R.E.,P.Kanda and R.C.Kennedy(1986).”Induction of nuclear transport with a synthetic peptide homologous to the SV40 T antigen transport signal.” Cell 46(4):575-582.
Lee,N.,Llano,M.,Carretero,M.,Ishitani,A.,Navarro,F.,Lopez-Botet,M.& Geraghty,D.E.(1998).HLA-E is a major ligand for the natural killer inhibitory receptor CD94/NKG2A.Proc Natl Acad Sci U S A 95,5199-204.
Levy,E.M.,Bianchini,M.,Von Euw,E.M.,Barrio,M.M.,Bravo,A.I.,Furman,D.,Domenichini,E.,Macagno,C.,Pinsky,V.,Zucchini,C.,Valvassori,L.& Mordoh,J.(2008).Human leukocyte antigen-E protein is overexpressed in primary human colorectal cancer.Int J Oncol 32,633-41.
Li,W.,F.Nicol and F.C.Szoka,Jr.(2004).”GALA:a designed synthetic pH-responsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery.” Adv Drug Deliv Rev 56(7):967-985.
Lin,M.H.,F.C.Chou,L.T.Yeh,S.H.Fu,H.Y.Chiou,K.I.Lin,D.M.Chang and H.K.Sytwu(2013).”B lymphocyte-induced maturation protein 1(BLIMP-1)attenuates autoimmune diabetes in NOD mice by suppressing Th1 and Th17 cells.” Diabetologia 56(1):136-146.
Liu,X.,P.K.Tian,D.W.Ju,M.H.Zhang,M.Yao,X.T.Cao and J.R.Gu(2003).”Systemic genetic transfer of p21WAF-1 and GM-CSF utilizing of a novel oligopeptide-based EGF receptor targeting polyplex.” Cancer Gene Ther 10(7):529-539.
Loeser,S.,Loser,K.,Bijker,M.S.,Rangachari,M.,van der Burg,S.H.,Wada,T.,Beissert,S.,Melief,C.J.& Penninger,J.M.(2007).Spontaneous tumor rejection by cbl-b-deficient CD8+ T cells.J Exp Med 204,879-91.
London,E.(1992).”Diphtheria toxin:membrane interaction and membrane translocation.” Biochim Biophys Acta 1113(1):25-51.
Lord-Dufour et al.,(2009)“Evidence for transcriptional regulation of the glucose-6-phosphate transporter by HIF-1alpha:Targeting G6PT with mumbaistatin analogs in hypoxic mesenchymal stromal cells”.Stem cells 27:489-497.
Lorieau,J.L.,J.M.Louis and A.Bax(2010).”The complete influenza hemagglutinin fusion domain adopts a tight helical hairpin arrangement at the lipid:water interface.” Proc Natl Acad Sci U S A 107(25):11341-11346.
Lin,A.,Yan,W.H.,Xu,H.H.,Gan,M.F.,Cai,J.F.,Zhu,M.& Zhou,M.Y.(2007).HLA-G expression in human ovarian carcinoma counteracts NK cell function.Ann Oncol 18,1804-9.
Liu,Q.,Zhou,H.,Langdon,W.Y.& Zhang,J.(2014).E3 ubiquitin ligase Cbl-b in innate and adaptive immunity.Cell Cycle 13,1875-84.
Lu,S.J.,Q.Feng,Y.Ivanova,C.Luo,T.Li,F.Li,G.R.Honig and R.Lanza(2007).”Recombinant HoxB4 fusion proteins enhance hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.” Stem Cells Dev 16(4):547-559.
Luan et al.,(2015).“Peptide amphiphiles with multifunctional fragments promoting cellular uptake and endosomal escape as efficient gene vectors.” J.Mater.Chem.B,3:1068-1078.
Lutz-Nicoladoni,C.,Wolf,D.& Sopper,S.(2015).Modulation of Immune Cell Functions by the E3 Ligase Cbl-b.Front Oncol 5,58.
Mack,M.,B.Luckow,P.J.Nelson,J.Cihak,G.Simmons,P.R.Clapham,N.Signoret,M.Marsh,M.Stangassinger,F.Borlat,T.N.Wells,D.Schlondorff and A.E.Proudfoot(1998).”Aminooxypentane-RANTES induces CCR5 internalization but inhibits recycling:a novel inhibitory mechanism of HIV infectivity.” J Exp Med 187(8):1215-1224.
Maeng,C.H.,J.H.Yi,J.Lee,J.Y.Hong,M.K.Choi,H.A.Jung,J.O.Park,S.H.Park,Y.S.Park,W.K.Kang and H.Y.Lim(2013).”Effects of single nucleotide polymorphisms on treatment outcomes and toxicity in patients treated with sunitinib.” Anticancer Res 33(10):4619-4626.
Mahlum,E.,D.Mandal,C.Halder,A.Maran,M.J.Yaszemski,R.B.Jenkins,M.E.Bolander and G.Sarkar(2007).”Engineering a noncarrier to a highly efficient carrier peptide for noncovalently delivering biologically active proteins into human cells.” Anal Biochem 365(2):215-221.
Makarova et al.,(2011)“Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems”.Nat Rev Microbiol.9(6):467-77.
Makkerh,J.P.,C.Dingwall and R.A.Laskey(1996).”Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids.” Curr Biol 6(8):1025-1027.
Martinez-Fong,D.,I.Navarro-Quiroga,I.Ochoa,I.Alvarez-Maya,M.A.Meraz,J.Luna and J.A.Arias-Montano(1999).”Neurotensin-SPDP-poly-L-lysine conjugate:a nonviral vector for targeted gene delivery to neural cells.” Brain Res Mol Brain Res 69(2):249-262.
Matalon,O.,Fried,S.,Ben-Shmuel,A.,Pauker,M.H.,Joseph,N.,Keizer,D.,Piterburg,M.& Barda-Saad,M.(2016).Dephosphorylation of the adaptor LAT and phospholipase C-gamma by SHP-1 inhibits natural killer cell cytotoxicity.Sci Signal 9,ra54.
Maurer,M.and E.von Stebut(2004).”Macrophage inflammatory protein-1.” Int J Biochem Cell Biol 36(10):1882-1886.
McKay,T.,P.Reynolds,S.Jezzard,D.Curiel and C.Coutelle(2002).”Secretin-mediated gene delivery,a specific targeting mechanism with potential for treatment of biliary and pancreatic disease in cystic fibrosis.” Mol Ther 5(4):447-454.
Midoux,P.,A.Kichler,V.Boutin,J.C.Maurizot and M.Monsigny(1998).”Membrane permeabilization and efficient gene transfer by a peptide containing several histidines.” Bioconjug Chem 9(2):260-267.
Milenkovic,D.,T.Ramming,J.M.Muller,L.S.Wenz,N.Gebert,A.Schulze-Specking,D.Stojanovski,S.Rospert and A.Chacinska(2009).”Identification of the signal directing Tim9 and Tim10 into the intermembrane space of mitochondria.” Mol Biol Cell 20(10):2530-2539.
Miyoshi,I.,N.Kasai and Y.Hayashizaki(1994).”[Structure and regulation of human thyroid-stimulating hormone(TSH)gene].” Nihon Rinsho 52(4):940-947.
Moede,T.,B.Leibiger,H.G.Pour,P.Berggren and I.B.Leibiger(1999).”Identification of a nuclear localization signal,RRMKWKK,in the homeodomain transcription factor PDX-1.” FEBS Lett 461(3):229-234.
Montrose,K.,Y.Yang,X.Sun,S.Wiles and G.W.Krissansen(2013).”Xentry,a new class of cell-penetrating peptide uniquely equipped for delivery of drugs.” Sci Rep 3:1661.
Moreland,R.B.,G.L.Langevin,R.H.Singer,R.L.Garcea and L.M.Hereford(1987).”Amino acid sequences that determine the nuclear localization of yeast histone 2B.” Mol Cell Biol 7(11):4048-4057.
Morris,M.C.,L.Chaloin,M.Choob,J.Archdeacon,F.Heitz and G.Divita(2004).”Combination of a new generation of PNAs with a peptide-based carrier enables efficient targeting of cell cycle progression.” Gene Ther 11(9):757-764.
Morris,M.C.,J.Depollier,J.Mery,F.Heitz and G.Divita(2001).”A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.” Nat Biotechnol 19(12):1173-1176.
Nakanishi,A.,D.Shum,H.Morioka,E.Otsuka and H.Kasamatsu(2002).”Interaction of the Vp3 nuclear localization signal with the importin alpha 2/beta heterodimer directs nuclear entry of infecting simian virus 40.” J Virol 76(18):9368-9377.
O’Keefe,D.O.(1992).”Characterization of a full-length,active-site mutant of diphtheria toxin.” Arch Biochem Biophys 296(2):678-684.
Paolino,M.,Choidas,A.,Wallner,S.,Pranjic,B.,Uribesalgo,I.,Loeser,S.,Jamieson,A.M.,Langdon,W.Y.,Ikeda,F.,Fededa,J.P.,Cronin,S.J.,Nitsch,R.,Schultz-Fademrecht,C.,Eickhoff,J.,Menninger,S.,Unger,A.,Torka,R.,Gruber,T.,Hinterleitner,R.,Baier,G.,Wolf,D.,Ullrich,A.,Klebl,B.M.& Penninger,J.M.(2014).The E3 ligase Cbl-b and TAM receptors regulate cancer metastasis via natural killer cells.Nature 507,508-12.
Parente,R.A.,S.Nir and F.C.Szoka,Jr.(1990).”Mechanism of leakage of phospholipid vesicle contents induced by the peptide GALA.” Biochemistry 29(37):8720-8728.
Parameswaran,R.,Ramakrishnan,P.,Moreton,S.A.,Xia,Z.,Hou,Y.,Lee,D.A.,Gupta,K.,deLima,M.,Beck,R.C.& Wald,D.N.(2016).Repression of GSK3 restores NK cell cytotoxicity in AML patients.Nat Commun 7,11154.
Patel,P.& Woodgett,J.R.(2017).Glycogen Synthase Kinase 3:A Kinase for All Pathways? Curr Top Dev Biol 123,277-302.
Paul,R.W.,K.E.Weisser,A.Loomis,D.L.Sloane,D.LaFoe,E.M.Atkinson and R.W.Overell(1997).”Gene transfer using a novel fusion protein,GAL4/invasin.” Hum Gene Ther 8(10):1253-1262.
Perez,F.,A.Joliot,E.Bloch-Gallego,A.Zahraoui,A.Triller and A.Prochiantz(1992).”Antennapedia homeobox as a signal for the cellular internalization and nuclear addressing of a small exogenous peptide.” J Cell Sci 102(Pt 4):717-722.
Pimenta,D.C.,V.C.Chen,J.Chao,M.A.Juliano and L.Juliano(2000).”Alpha1-antichymotrypsin and kallistatin hydrolysis by human cathepsin D.” J Protein Chem 19(5):411-418.
Poli,A.,Michel,T.,Theresine,M.,Andres,E.,Hentges,F.& Zimmer,J.(2009).CD56bright natural killer(NK)cells:an important NK cell subset.Immunology 126,458-65.
Prieve,M.G.and M.L.Waterman(1999).”Nuclear localization and formation of beta-catenin-lymphoid enhancer factor 1 complexes are not sufficient for activation of gene expression.” Mol Cell Biol 19(6):4503-4515.
Rajagopalan,R.,J.Xavier,N.Rangaraj,N.M.Rao and V.Gopal(2007).”Recombinant fusion proteins TAT-Mu,Mu and Mu-Mu mediate efficient non-viral gene delivery.” J Gene Med 9(4):275-286.
Riddell et al.,(2014)“Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors”.Cell,157:549-564
Salomone,F.,F.Cardarelli,M.Di Luca,C.Boccardi,R.Nifosi,G.Bardi,L.Di Bari,M.Serresi and F.Beltram(2012).”A novel chimeric cell-penetrating peptide with membrane-disruptive properties for efficient endosomal escape.” J Control Release 163(3):293-303.
Salomone F.,Cardarelli F,Signore G,Boccardi C,Beltram F.(2013)“In vitro efficient transfection by CM18-Tat11 hybrid peptide:a new tool for gene-delivery applications.” PLoS One.8(7):e70108.
Schneider,H.,R.P.Harbottle,Y.Yokosaki,J.Kunde,D.Sheppard and C.Coutelle(1998).”A novel peptide,PLAEIDGIELTY,for the targeting of alpha9beta1-integrins.” FEBS Lett 429(3):269-273.
Schreiber,V.,M.Molinete,H.Boeuf,G.de Murcia and J.Menissier-de Murcia(1992).”The human poly(ADP-ribose)polymerase nuclear localization signal is a bipartite element functionally separate from DNA binding and catalytic activity.” EMBO J 11(9):3263-3269.
Schuster,M.J.,G.Y.Wu,C.M.Walton and C.H.Wu(1999).”Multicomponent DNA carrier with a vesicular stomatitis virus G-peptide greatly enhances liver-targeted gene expression in mice.” Bioconjug Chem 10(6):1075-1083.
Scott,M.S.,F.M.Boisvert,M.D.McDowall,A.I.Lamond and G.J.Barton(2010).”Characterization and prediction of protein nucleolar localization sequences.” Nucleic Acids Res 38(21):7388-7399.
Shaw,P.A.,I.R.Catchpole,C.A.Goddard and W.H.Colledge(2008).”Comparison of protein transduction domains in mediating cell delivery of a secreted CRE protein.” Biochemistry 47(4):1157-1166.
Shawe-Taylor J,Cristianini N(2004)Kernel methods for pattern analysis.Cambridge university press.
Shen et al.,(2014)“Improved PEP-FOLD approach for peptide and miniprotein structure prediction”.J.Chem.Theor.Comput.10:4745-4758.
Shoya,Y.,T.Kobayashi,T.Koda,K.Ikuta,M.Kakinuma and M.Kishi(1998).”Two proline-rich nuclear localization signals in the amino- and carboxyl-terminal regions of the Borna disease virus phosphoprotein.” J Virol 72(12):9755-9762.
Somasekaram,A.,A.Jarmuz,A.How,J.Scott and N.Navaratnam(1999).”Intracellular localization of human cytidine deaminase.Identification of a functional nuclear localization signal.” J Biol Chem 274(40):28405-28412.
Stojanovski,D.,M.Bohnert,N.Pfanner and M.van der Laan(2012).”Mechanisms of protein sorting in mitochondria.” Cold Spring Harb Perspect Biol 4(10).
Sudbeck,P.and G.Scherer(1997).”Two independent nuclear localization signals are present in the DNA-binding high-mobility group domains of SRY and SOX9.” J Biol Chem 272(44):27848-27852.
Sung,M.S.,J.Y.Mun,O.Kwon,K.S.Kwon and D.B.Oh(2013).”Efficient myogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by the transduction of engineered MyoD protein.” Biochem Biophys Res Commun 437(1):156-161.
Takahashi,K.and S.Yamanaka(2006).”Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.” Cell 126(4):663-676.
Takeda,A.,C.Goolsby and N.R.Yaseen(2006).”NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.” Cancer Res 66(13):6628-6637.
Tan,Y.,Z.Xie,M.Ding,Z.Wang,Q.Yu,L.Meng,H.Zhu,X.Huang,L.Yu,X.Meng and Y.Chen(2010).”Increased levels of FoxA1 transcription factor in pluripotent P19 embryonal carcinoma cells stimulate neural differentiation.” Stem Cells Dev 19(9):1365-1374.
Tan,Y.X.,C.Chen,Y.L.Wang,S.Lin,Y.Wang,S.B.Li,X.P.Jin,H.W.Gao,F.S.Du,F.Gong and S.P.Ji(2012).”Truncated peptides from melittin and its analog with high lytic activity at endosomal pH enhance branched polyethylenimine-mediated gene transfection.” J Gene Med 14(4):241-250.
Thevenet et al.,“PEP-FOLD:an updated de novo structure prediction server for both linear and disulfide bonded cyclic peptides.” Nucleic Acids Res.2012.40,W288-293.
Uherek,C.,J.Fominaya and W.Wels(1998).”A modular DNA carrier protein based on the structure of diphtheria toxin mediates target cell-specific gene delivery.” J Biol Chem 273(15):8835-8841.
Varkouhi,A.K.,M.Scholte,G.Storm and H.J.Haisma(2011).”Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.” J Control Release 151(3):220-228.
Veach,R.A.,D.Liu,S.Yao,Y.Chen,X.Y.Liu,S.Downs and J.Hawiger(2004).”Receptor/transporter-independent targeting of functional peptides across the plasma membrane.” J Biol Chem 279(12):11425-11431.
Vives,E.,P.Brodin and B.Lebleu(1997).”A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.” J Biol Chem 272(25):16010-16017.
Wagstaff,K.M.,D.J.Glover,D.J.Tremethick and D.A.Jans(2007).”Histone-mediated transduction as an efficient means for gene delivery.” Mol Ther 15(4):721-731.
Warr,M.R.,M.Binnewies,J.Flach,D.Reynaud,T.Garg,R.Malhotra,J.Debnath and E.Passegue(2013).”FOXO3A directs a protective autophagy program in haematopoietic stem cells.” Nature 494(7437):323-327.
Welch,K.,J.Franke,M.Kohler and I.G.Macara(1999).”RanBP3 contains an unusual nuclear localization signal that is imported preferentially by importin-alpha3.” Mol Cell Biol 19(12):8400-8411.
Wiedenheft et al.,(2011).RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108,10092-10097.
Witzel,I.,M.Graeser,T.Karn,M.Schmidt,R.Wirtz,D.Schutze,A.Rausch,F.Janicke,K.Milde-Langosch and V.Muller(2013).”Androgen receptor expression is a predictive marker in chemotherapy-treated patients with endocrine receptor-positive primary breast cancers.” J Cancer Res Clin Oncol 139(5):809-816.
Wu,J.,L.Zhou,K.Tonissen,R.Tee and K.Artzt(1999).”The quaking I-5 protein(QKI-5)has a novel nuclear localization signal and shuttles between the nucleus and the cytoplasm.” J Biol Chem 274(41):29202-29210.
Wu,D.,Kuiaste,I.,Moreau,P.,Carosella,E.& Yotnda,P.(2015).Rescuing lymphocytes from HLA-G immunosuppressive effects mediated by the tumor microenvironment.Oncotarget 6,37385-97.
Wyman,T.B.,F.Nicol,O.Zelphati,P.V.Scaria,C.Plank and F.C.Szoka,Jr.(1997).”Design,synthesis,and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers.” Biochemistry 36(10):3008-3017.
Ye,S.R.,Yang,H.,Li,K.,Dong,D.D.,Lin,X.M.& Yie,S.M.(2007a).Human leukocyte antigen G expression:as a significant prognostic indicator for patients with colorectal cancer.Mod Pathol 20,375-83.
Yie,S.M.,Yang,H.,Ye,S.R.,Li,K.,Dong,D.D.& Lin,X.M.(2007b).Expression of human leukocyte antigen G(HLA-G)correlates with poor prognosis in gastric carcinoma.Ann Surg Oncol 14,2721-9.
Yie,S.M.,Yang,H.,Ye,S.R.,Li,K.,Dong,D.D.& Lin,X.M.(2007c).Expression of human leucocyte antigen G(HLA-G)is associated with prognosis in non-small cell lung cancer.Lung Cancer 58,267-74.
Yie,S.M.,Yang,H.,Ye,S.R.,Li,K.,Dong,D.D.& Lin,X.M.(2007d).Expression of HLA-G is associated with prognosis in esophageal squamous cell carcinoma.Am J Clin Pathol 128,1002-9.
Yu,Z.,C.H.Lee,C.Chinpaisal and L.N.Wei(1998).”A constitutive nuclear localization signal from the second zinc-finger of orphan nuclear receptor TR2.” J Endocrinol 159(1):53-60.
Zetsche et al.,(2015).“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”.Cell.25.pii:S0092-8674(15)01200-3 [http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038].
Zhen,Z.J.,Ling,J.Y.,Cai,Y.,Luo,W.B.& He,Y.J.(2013).Impact of HLA-E gene polymorphism on HLA-E expression in tumor cells and prognosis in patients with stage III colorectal cancer.Med Oncol 30,482.
Zhou,H.,S.Wu,J.Y.Joo,S.Zhu,D.W.Han,T.Lin,S.Trauger,G.Bien,S.Yao,Y.Zhu,G.Siuzdak,H.R.Scholer,L.Duan and S.Ding(2009).”Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins.” Cell Stem Cell 4(5):381-384.
Claims (31)
- 独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するのに使用するための組成物であって、前記組成物はシャトル剤を含み、前記シャトル剤が、
(1)少なくとも20アミノ酸長であり、
(3)(a)ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも2個の隣接する正に帯電したKおよび/またはR残基、および(b)ヘリカルホイール投影図上に、100度の連続アミノ酸間の回転角度および/もしくはターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、3個から5個のKおよび/もしくはR残基を含む6個の隣接する残基のセグメントを含む、正に帯電した親水性の外面、
(4)ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む疎水性の外面であって、(a)ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも2個の隣接するL残基;ならびに/または(b)ヘリカルホイール投影図上で、100度の連続アミノ酸間の回転角度および/もしくはターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、L、I、F、V、W、およびMから選択される少なくとも5個の疎水性の残基を含む10個の隣接する残基のセグメントを含む、疎水性の外面
を有する
(2)両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター(5)~(15)の内の少なくとも8つが満たされるペプチドであり、
(5)3.5~11の疎水性モーメント(μ)を有する;
(6)生理学的pHで少なくとも+4の予測正味電荷を有する;
(7)8~13の等電点(pI)を有する;
(8)35%~65%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)0%~30%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)35%~85%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)少なくとも5%のLがペプチド中に存在するという条件で、15%~45%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)20%~45%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)0%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)前記ペプチド中のAおよびL残基パーセンテージ(%A+L)と、前記ペプチド中のKとR残基パーセンテージ(K+R)との差異が、10%以下である;
(15)10%~45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される、ならびに、
前記組成物の使用に際して、前記シャトル剤の濃度が、少なくとも2.5μMであって、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記独立したポリペプチドカーゴの、標的真核細胞のサイトゾルおよび/または核への形質導入効率を高めるのに十分である、
組成物。 - 前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性の外面を含み、この親水性の外面が、(a)ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも3個もしくは4個の隣接する正に帯電したKおよび/もしくはR残基を含む、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、この疎水性の外面は、(a)ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも2個の隣接するL残基;ならびに(b)ヘリカルホイール投影図上で、100度の連続アミノ酸間の回転角度および/もしくはターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、L、I、F、V、W、およびMから選択される少なくとも5個の疎水性の残基を含む10個の隣接する残基のセグメント、を含む、請求項1または2に記載の使用のための組成物。
- 前記シャトル剤が、少なくとも9個のパラメーター(5)~(15)を満たす、請求項1~3のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記シャトル剤が、少なくとも10個のパラメーター(5)~(15)を満たす、請求項1~3のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- (i)前記シャトル剤が、20アミノ酸の最小長、および150アミノ酸の最大長を有するペプチドであり、
(ii)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、3.5の下限値と、11.0の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
(iii)前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の12.5%から45%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、および/またはMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
(iv)前記ペプチドが、4.0の下限値と、10.5の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
(v)前記ペプチドが、+4~+15の予測実効電荷を有し、
(vii)前記ペプチドが、10~13の予測pIを有し、または
(vii)(i)~(vi)の内の任意の組み合わせである、請求項1~5のいずれか1項に記載の使用のための組成物。 - 前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも1つを満たす、請求項1~6のいずれか1項に記載の組成物:
(8)前記ペプチドが、36%~64%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、およびVの任意の組み合わせから構成される;
(9)前記ペプチドが、1%~29%のアミノ酸:N、Q、S、およびTの任意の組み合わせから構成される;
(10)前記ペプチドが、36%~80%のアミノ酸:A、L、K、またはRの任意の組み合わせから構成される;
(11)前記ペプチドが、15%~40%のアミノ酸:AおよびLの任意の組み合わせから構成される;
(12)前記ペプチドが、20%~40%のアミノ酸:KおよびRの任意の組み合わせから構成される;
(13)前記ペプチドが、5%~10%のアミノ酸:DおよびEの任意の組み合わせから構成される;
(14)前記ペプチド中のAおよびL残基パーセンテージ(%A+L)と、前記ペプチド中のKおよび/またはR残基のパーセンテージ(K+R)との差異が、9%以下である;ならびに
(15)前記ペプチドが、15~40%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、およびHの任意の組み合わせから構成される。 - 前記ペプチドが、ヒスチジンリッチドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドが、セリンおよび/またはグリシン残基が濃縮されたフレキシブルリンカードメインを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ペプチドが、次記のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項1~9のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
(a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);または
(h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
式中、
[X1]が、次記から選択され:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;および1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]が次記から選択され:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;および-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]が次記から選択され:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;または-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;および-A-1[+]-A-A-A;
[X4]が次記から選択され:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];および-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];ならびに
[リンカー]が、次記から選択され:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;および-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
式中、
[Φ]はアミノ酸:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、またはValであり;
[+]は、アミノ酸:LysまたはArgであり;
[ζ]が、アミノ酸:Gln、Asn、Thr、またはSerであり;
Aが、アミノ酸:Alaであり;
Gが、アミノ酸:Glyであり;
Sが、アミノ酸:Serであり;および
nが、1~20の整数である。 - 前記シャトル剤が、前記標的真核細胞により完全に代謝可能である、請求項1~10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを前記シャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも10倍まで高められる、請求項1~11のいずれか1項に記載の組成物。
- 独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するためのインビトロ方法であって、前記方法が、前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で接触させることを含み、前記シャトル剤が、請求項1~12のいずれか1項に定義されるものである、方法。
- 請求項1~12のいずれか1項で定義のシャトル剤および標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核へ送達されるべき独立したポリペプチドカーゴを含む、組成物。
- 前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを欠いている、請求項1~12のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ポリペプチドカーゴが、細胞内ターゲティングドメインを含む、請求項1~12および15のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記細胞内ターゲティングドメインが、
(a)核移行シグナル(NLS);
(b)核小体シグナル配列;
(c)ミトコンドリアシグナル配列;または
(d)ペルオキシソームシグナル配列、である、請求項16に記載の使用のための組成物。 - 前記ポリペプチドカーゴが、DNAおよび/またはRNA分子と複合体化されている、請求項1~12、および、15~17のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記ポリペプチドカーゴが、転写因子、ヌクレアーゼ、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗体、ペプチドカーゴ、酵素、酵素阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項1~12、および、15~18のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- (a)前記転写因子が、HOXB4、NUP98-HOXA9、Oct3/4、Sox2、Sox9、Klf4、c-Myc、MyoD、Pdx1、Ngn3、MafA、Blimp-1、Eomes、T-bet、FOXO3A、NF-YA、SALL4、ISL1、FoxA1、Nanog、Esrrb、Lin28、HIF1-alpha、Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、Prdm5、Bcl-6またはそれらの任意の組合せであり;
(b)前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ:RNA誘導性エンドヌクレアーゼ、CRISPRエンドヌクレアーゼ、I型CRISPRエンドヌクレアーゼ、II型CRISPRエンドヌクレアーゼ、III型CRISPRエンドヌクレアーゼ、IV型CRISPRエンドヌクレアーゼ、V型CRISPRエンドヌクレアーゼ、VI型CRISPRエンドヌクレアーゼ、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、CasY、CasX、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、DNA誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート(NgAgo)、またはそれらの任意の組合せであり;
(c)前記抗体が細胞内抗原を認識し;および/または
(d)前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、請求項19に記載の組成物。 - 前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、T細胞、NK細胞、または樹状細胞である、請求項1~12、および、15~20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドカーゴが、請求項15~20のいずれか1項に定義されたものである、および/または、前記標的真核細胞が、請求項21に定義されたものである、請求項16に記載のインビトロ方法。
- 前記ポリペプチドカーゴが、請求項15~20のいずれか1項に定義されたものである、および/または、前記標的真核細胞が、請求項21に定義されたものである、請求項14に記載の組成物。
- 独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、請求項1~12のいずれか1項に定義のペプチドを合成することを含む方法。
- 独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび/または核に送達するシャトル剤を特定する方法であって、次記を含む方法:
(a)請求項1~12のいずれか1項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること;
(b)前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること;
(c)前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること;および
(d)前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、前記ペプチドを特定すること。 - 前記ポリペプチドカーゴが請求項15~20のいずれか1項で定義の通りである、請求項25に記載の方法。
- 目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法であって、次記を含む方法:
(a)請求項1~12のいずれか1項に定義されるシャトル剤を使用し、目的の独立したポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いて標的真核細胞集団を同時形質導入すること;および
(b)前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、前記目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。 - (i)前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合していない、または前記マーカータンパク質が切断可能リンカーを介して前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している;および/または
(ii)前記マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、または前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、請求項27に記載の方法。 - 前記形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度が、前記目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をする、請求項27または28に記載の方法。
- 前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質を欠く細胞から単離または選別され、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団および/またはマーカータンパク質陰性細胞集団を製造する、請求項27~29のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)および(b)を、前記マーカータンパク質陰性細胞集団、前記マーカータンパク質陽性細胞集団、または前記マーカータンパク質陰性および前記マーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して1回または複数回反復することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
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Citations (1)
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Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030104622A1 (en) * | 1999-09-01 | 2003-06-05 | Robbins Paul D. | Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses |
CN101616928B (zh) * | 2007-01-29 | 2015-04-15 | 株式会社普罗赛尔制药 | 新型大分子转导域及其识别方法和用途 |
JP6659546B2 (ja) * | 2013-09-10 | 2020-03-04 | ザ テキサス エー アンド エム ユニバーシティ システム | 生細胞内への分子の送達のための組成物および方法 |
WO2015057009A1 (ko) * | 2013-10-17 | 2015-04-23 | 서울대학교산학협력단 | 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도 |
AU2014363476A1 (en) * | 2013-12-13 | 2016-06-23 | Cellectis | Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering |
WO2016161516A1 (en) * | 2015-04-10 | 2016-10-13 | Feldan Bio Inc. | Polypeptide-based shuttle agents for improving the transduction efficiency of polypeptide cargos to the cytosol of target eukaryotic cells, uses thereof, methods and kits relating to same |
WO2017175072A1 (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-12 | Feldan Bio Inc. | Peptide shuttle based gene disruption |
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Non-Patent Citations (3)
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Biomaterials (2008) Vol.29, pp.2408-2414 |
Journal of Controlled Release (2012) Vol.163, pp.293-303 |
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