CN105358568A - 治疗由opa1单倍剂量不足引起的疾病的人工转录因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人工转录因子，其包含融合至激活性蛋白结构域的特异性靶向OPA1启动子的多指锌指蛋白和核定位序列。针对OPA1启动子的人工转录因子可用于治疗与OPA1单倍剂量不足相关的疾病，诸如常染色体显性视神经萎缩，综合征性常染色体显性视神经萎缩加和正常眼压性青光眼。

Description

治疗由OPA1单倍剂量不足引起的疾病的人工转录因子
发明领域
本发明涉及人工转录因子，其包含融合至激活性结构域的特异性靶向OPA1基因启动子的多指锌指蛋白和核定位序列，以及涉及它们在治疗由导致单倍剂量不足的OPA1突变引起的诸如常染色体显性视神经萎缩(ADOA)或综合征性ADOA+(syndromicADOAplus)的疾病中的用途。
背景技术
提出人工转录因子(AFT)是用于调制基因表达的有用工具(SeraT.,2009,AdvDrugDelivRev61,513-526)。许多天然存在的转录因子，通过抑制或激活基因转录来影响基因表达，具有识别某一DNA序列的复杂的特定结构域。如果技术人员意在修饰它们的特异性和一个或多个靶基因，则这使得它们对于操作而言是无吸引力的目标。然而，某一类转录因子含有几个所谓锌指(ZF)结构域，它们是模块化的，并因此使得它们可以进行遗传工程化。锌指是几乎独立靶向三个DNA碱基对的短的(30个氨基酸)DNA结合基序。含有融合在一起的几个此类锌指的蛋白因此能够识别更长的DNA序列。六聚锌指蛋白(ZFP)识别18个碱基对(bp)的DNA靶标，其在整个人类基因组中几乎是独一无二的。最初认为是完全背景独立的，但更深入的分析显示对于锌指的某些背景特异性(KlugA.,2010,AnnuRevBiochem79,213-231)。突变在锌指识别表面中的某些氨基酸改变ZF模块的结合特异性产生对于大部分的5’-GNN-3’，5’-CNN-3’，5’-ANN-3’和某些5’-TNN-3’密码子的确定的ZF结构单元(例如所谓的Barbas模块，见DreierB.,BarbasC.F.3rd等,2005,JBiolChem280,35588-35597)。尽管关于人工转录因子的早期工作集中于基于组合预先选择的锌指与已知的3bp靶序列的合理设计，但实现锌指的某一背景特异性需要产生大的锌指文库，其使用复杂方法诸如细菌或酵母单杂交、噬菌体展示、区室化核糖体展示(compartmentalizedribosomedisplay)或使用FACS分析的体内选择来询问。
使用此类人工锌指蛋白，可以以高特异性靶向在人类基因组内的DNA基因座。因此，这些锌指蛋白是将具有转录调制活性的蛋白结构域转运至特定启动子序列以产生目标基因表达的调制的理想工具。用于激活基因转录的合适结构域是单纯疱疹病毒VP16(SEQIDNO:1)或VP64(VP16的四聚体重复,SEQIDNO:2)结构域(BeerliR.R.等,1998,ProcNatlAcadSciUSA95,14628-14633)。认为赋予转录激活的其他结构域是CJ7(SEQIDNO:3)、p65-TA1(SEQIDNO:4、SAD(SEQIDNO:5)、NF-1(SEQIDNO:6)、AP-2(SEQIDNO:7)、SP1-A(SEQIDNO:8)、SP1-B(SEQIDNO:9)、Oct-1(SEQIDNO:10)、Oct-2(SEQIDNO:11)、Oct-2_5x(SEQIDNO:12)、MTF-1(SEQIDNO:13)、BTEB-2(SEQIDNO:14)和LKLF(SEQIDNO:15)。此外，认为通过基因本体论GO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term_details？term＝GO:0001071)限定的蛋白的转录活性结构域实现靶蛋白的转录调节。
尽管由于特定特征的高保守性，小分子药物并非总能选择性靶向给定蛋白家族的某一成员，但如基于抗体的新药物所显示出的，生物制剂提供了巨大的特异性。然而，实际上所有生物制剂到目前为止均在细胞外起作用。尤其是上文提及的人工转录因子将适合于以治疗上有用的方式影响基因转录。然而，此类因子向作用位点－细胞核－的递送并不容易实现，因而妨碍了治疗性人工转录因子方法的有效性，例如通过依赖于逆转录病毒递送具有该方法的所有缺点，诸如免疫原性和细胞转化的可能性(LundC.V.等,2005,MolCellBiol25,9082-9091)。
所谓的蛋白转导结构域(PTD)显示促进蛋白经质膜易位至细胞胞质/核质中。短肽诸如HIV来源的TAT肽(SEQIDNO:16)和其他显示出诱导货物蛋白质的不依赖于细胞类型的巨胞饮摄取(WadiaJ.S.etal.,2004,NatMed10,310-315)。当到达细胞胞质中时，此类融合蛋白显示出具有生物活性。有趣的是，在蛋白转导后，即使错误折叠的蛋白也可能变得有功能，这极可能是通过胞内蛋白伴侣的作用。
基因突变为许多遗传性疾病的核心。在一般情况下，这样的突变关于其遗传方式可以分为显性或隐性，其中显性突变能够导致疾病表型，即使只有一个基因拷贝-无论是母系或父系-受到影响，而对于隐性突变引起疾病，母系和父系两者，多个基因拷贝需要突变。显性突变能够通过两个一般机制之一，显性负性作用或单倍剂量不足，导致疾病。在显性负性突变的情况下，基因产物获得新的异常功能，其有毒和导致疾病表型。例子是多聚蛋白复合物的亚基，其基因突变时妨碍所述蛋白复合物的正常功能。以显性方式遗传的疾病也可以由单倍剂量不足引起，其中致病突变使受影响的基因失活，因此降低了有效的基因剂量。在这些情况下，第二完整基因拷贝无法为正常功能提供足够的基因产物。据估计大约12000个人类基因单倍剂量不足(Huangetal.,2010,PLoSGenet.6(10),e1001154)，其中约300个基因已知与疾病相关联。
神经元存活关键取决于线粒体功能，许多神经退行性疾病的核心是线粒体失活(KarbowskiM.，NeutznerA.，2012，ACTANeuropathol123(2)，157-71)。除了它们以ATP形式提供能量的基本功能，线粒体关键性地参与钙缓冲，各种分解以及代谢过程和程序性细胞死亡。线粒体的这一重要功能反映在许多适当的细胞机制中以维持线粒体并防止线粒体失活和随后细胞死亡(NeutznerA.etal.,2012,SeminCellDevBiol23,499-508)。这些过程的中心作用是维护动态线粒体网络与平衡的线粒体形态。这通过在Drp1、Fis1、Mff、MiD49和MiD51的情况下促进线粒体裂变或在Mfn1、Mfn2和OPA1的情况下促进线粒体小管融合的所谓的线粒体形态因子实现。平衡线粒体形态是必要的，因为线粒体融合的损失已知促进ATP产生的损失和使细胞对凋亡刺激敏感，从而将此过程关联到与神经变性疾病相关的神经元细胞死亡。
线粒体融合过程中的关键因素是视神经萎缩1或OPA1。OPA1是由OPA1基因编码的大的GTP酶并且是线粒体融合所必需的。此外，OPA1在维持作为嵴组分的内部线粒体结构中起重要作用。据显示OPA1基因表达的下调由于融合的损失而导致线粒体碎片且使细胞对凋亡刺激敏感。OPA1中的突变被认为是大约70％的Kjer的视神经病变或常染色体显性萎缩(ADOA)的原因。在大多数人群中，ADOA在1/10'000和3/100'000之间盛行，其特征是从幼儿期开始视力的逐渐降低。视觉障碍的范围从轻微到法定失明，是不可逆转的并由视网膜神经节细胞(RGC)的缓慢退化引起。在大多数情况下，ADOA是非综合征型的，然而，大约15％的患者遭遇眼外、神经肌肉临床表现，如感音神经性听力损失。直到现在，还没有这种疾病的可行治疗。有趣的是，某些OPA1等位基因与正常张力，而不是高眼压性青光眼有关，再次凸显OPA1对于维持正常的线粒体生理学的重要性。
发明概述
本发明涉及人工转录因子，其包含融合至激活性蛋白结构域的靶向OPA1启动子的多指锌指蛋白和核定位序列，并且涉及包含此类人工转录因子的药物组合物。
此外，本发明涉及一种人工转录因子，其包含融合至激活性蛋白结构域的、靶向OPA1启动子的多指锌指蛋白，核定位序列和蛋白转导结构域，以及涉及包含这种人工转录因子的药物组合物。
本发明还涉及这种人工转录因子在提高OPA1基因的表达和改进OPA1基因产物的产生中的用途。
此外，本发明还涉及这样的人工转录因子在治疗由低OPA1水平引起或修饰的疾病中的用途，尤其是用于治疗眼部疾病，如ADOA和ADOA+。同样地，本发明涉及一种治疗由低OPA1水平影响的疾病的方法，其包括对需要其的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。
附图简述
图1：使用可转导人工转录因子减轻单倍剂量不足的治疗方法
(A)相比于野生型情况(WT)，单倍剂量不足突变(HM)导致在启动子(P)的控制下的来自基因(G)的基因产物产生(GP)的减少。
(B)通过蛋白转导结构域(PTD)如TAT或其他的作用，将包含融合至激活性结构域(RD)的特异性靶向单倍剂量不足基因(G)的启动子(P)区域的六聚锌指(ZF)蛋白以及核定位序列(NLS)的人工转录因子转运至细胞内。结合至突变(HM)的启动子和野生型基因(G)之后，来自野生型基因拷贝的基因产物的产生增加以替代来自突变基因拷贝的基因产物的损失。
(C)在编码这种人工转录因子的cDNA的病毒转导之后，通过细胞表达包含融合至激活性结构域(RD)的特异性靶向单倍剂量不足基因(G)的启动子(P)区域的六聚锌指(ZF)以及核定位序列(NLS)的人工转录因子。结合至突变(HM)的启动子和野生型基因(G)之后，来自野生型基因拷贝的基因产物的产生增加以替代来自突变基因拷贝的基因产物的损失。
图2：OPA1启动子区域
示出的是含有OPA1启动子(SEQIDNO：17)的OPA1的5'非翻译区。突出显示的是本发明的人工转录因子的结合位点(下划线，从位置85至102和91至108，从位置834至853，和从位置983至1000的重叠位点)，和用于转录起始的位置846(黑体)。
图3：荧光素酶报道基因测定以评估OPA1特异性人工转录因子的活性
用OPA1_akt1到OPA1_akt5(图A，标记为A1至A5)或OPA1_akt6到OPA1_akt10(图B，标记为A6至A10)的表达质粒和含有在人类OPA1启动子控制下的Gaussia荧光素酶和在CMV启动子控制下的分泌型碱性磷酸酶的报道基因质粒共转染HeLa细胞。用失活的(修饰的)OPA1_akt1(图A)或失活的(修饰的)OPA1_akt6(图B)转染，其中，锌指蛋白中的所有锌配位的半胱氨酸残基被更换为丝氨酸残基，作为对照(标记为C)。共转染后48小时测定荧光素酶和分泌型碱性磷酸酶活性。将荧光素酶活性相对于分泌型碱性磷酸酶活性进行标准化并表示为对照的百分数(相对于荧光素酶活性-RLA)。示出的是三个独立实验的平均值以及误差棒表示SD。
发明详述
本发明涉及一种人工转录因子(ATF)，其包含融合至激活性蛋白结构域的、特异性靶向OPA1启动子(SEQIDNO:17)的多指锌指蛋白(ZFP)，核定位序列(NLS)以及任选的蛋白转导结构域(PTD)，以及涉及包含这种人工转录因子的药物组合物(图1)。
在本发明的上下文中，将启动子定义为基因的调节区。该定义符合本领域的一般定义。另外，在本发明的上下文中，将单倍剂量不足启动子定义为仅当两个功能基因拷贝存在于基因组中时能够在所有情况下在所有的细胞类型中导致足够的基因产物产生的启动子。因此，单倍剂量不足基因的一个基因拷贝的突变在一些或者所有的生理情况下在生物体的一些或者所有的细胞中导致不足的基因产物产生。在本发明的上下文中，将基因定义为含有调节序列以及导致蛋白质或RNA产生的基因产物的序列的基因组区域。这个定义也符合本领域中的一般定义。
人工转录因子的蛋白转导域(PTD)介导的胞内递送是以新方式利用生物制剂的高选择性靶向病理生理学相关的分子的新方法。例如，对于由OPA1的单倍剂量不足引起的疾病，如ADOA或ADOA+，无法想象使用当前的方法例如小分子药物的治疗，因为基因表达不足是这种疾病的根本原因。然而，通过用人工转录因子技术配合以蛋白质转导结构域(PTD)的形式靶向的先进的药物，可以通过转运激活的人工转录因子和提高剩余的功能基因拷贝的转录到两个基因拷贝都是功能性所达到的水平直接在分子水平克服OPA1的单倍剂量不足。
考虑的蛋白转导结构域是HIVTAT，肽mT02(SEQIDNO：18)，肽mT03(SEQIDNO：19)，R9肽(SEQIDNO：20)，ANTP结构域(SEQIDNO：21)或能够跨越质膜转运货物的其它肽。
此外，考虑用聚乙二醇修饰本发明的人工转录因子以降低免疫原性。此外，应用本发明的人工转录因子到免疫特权器官如眼睛和大脑将避免任何免疫反应，并诱发对人工转录因子的全身耐受性。为了治疗免疫特权器官外的慢性疾病，考虑通过预先眼内注射诱导免疫耐受。
显性视神经萎缩由导致单倍剂量不足的OPA1基因的突变引起。由于形成视神经的视网膜神经节细胞的逐渐丧失，显性视神经萎缩患者遭受最终导致失明的进行性视力减退。有趣的是，大多数的视神经萎缩患者不存在眼部外症状。只有一小部分的患者遭受所谓的显性视神经萎缩附加表型伴有额外眼外神经症状如痉挛性截瘫和听力损伤的表型。OPA1通过稳定内部线粒体嵴的结构和促进线粒体小管之间的融合而在结构水平上参与维持线粒体功能。因为线粒体是ATP形式的细胞能量的主要生产者，OPA1对于保持细胞能量水平是必需的。OPA1功能的丧失已知通过细胞凋亡机制促使细胞死亡。在几乎所有的人体细胞中，OPA1基因的一个功能拷贝足以产生足够的OPA1蛋白质来以足够的水平维持线粒体功能。然而，特别耗能的视网膜神经节细胞具有对于它们的线粒体的状态的特殊需要，并因此依赖于不能由一个OPA1基因拷贝产生的OPA1的水平，因此，单倍剂量不足OPA1突变与视网膜神经节细胞死亡相关并导致视力减退和失明。使用本发明的人工转录因子，可以通过增强OPA1蛋白从剩余的功能性OPA1基因产生至高于正常水平而在视网膜神经节细胞中增加OPA1蛋白水平，从而恢复线粒体功能，预防视网膜神经节细胞死亡和相关的视觉丧失。
通过依靠病毒转移来供应突变OPA1基因的额外的功能性拷贝，从而增加基因剂量的经典基因治疗方法可以在理论上治疗OPA1的单倍剂量不足。然而，被视为对基因治疗安全的目前可用的病毒载体不能够转运大于约5至8千碱基的基因。虽然这对于某些基因足够，然而OPA1基因显著大于8千碱基，因此对于使用目前可用的载体的基因治疗不是候选的。此外，使用可能递送基因严重过表达和具有相关的毒性副作用的基因疗法不能实现基因表达的精确调控。
病毒转移的这一限制不适用于本发明的人工转录因子。单倍剂量不足基因的大小与本发明中描述的治疗方法不相关(图1)，而且甚至最大的基因可接受人工转录因子的调制。此外，通过相应地给予人工转录因子或通过使用在转录调制方面具有更高或更低活性的替代激活结构域可调制本发明的人工转录因子增加基因表达的程度。此外，OPA1mRNA进行广泛的可变剪接，造成几种OPA1同种型的产生，这些对于OPA1执行其功能都是必要的。特别是，各种OPA1同种型的差异蛋白酶解加工对于OPA1执行其功能是必不可少的机械前提。
使用本发明的人工转录因子的病毒递送增加功能性基因拷贝中的OPA1mRNA产生将允许发生该必要过程，从而为OPA1单倍剂量不足引起的疾病提供功能性治疗。
传统上用作治疗剂库的小分子类不适于基因表达的靶向调制。因此，经典的药物方法不适合用于许多有希望的药物靶标和相关疾病。相反，本发明的人工转录因子均属于同一物质种类，具有高度确定的总体组成。靶向两条非常不同的启动子序列的两个基于六聚锌指蛋白的人工转录因子仍具有85％的最小氨基酸序列同一性和总体相似的三级结构，并且能够经标准化方法(如下文所述)以快速且经济的方式来生成。因此，本发明的人工转录因子在一类分子中组合了对非常广泛且不同的组的靶标格外高的特异性与总体相似的组成。此外，可以依靠以往的经验将本发明的人工转录因子配制入药物，进一步加快药物开发过程。
本发明还涉及这样的人工转录因子在治疗由导致OPA1的单倍剂量不足的OPA1突变引起的疾病中的用途，其多指锌指蛋白特异性靶向OPA1启动子区域。同样地，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括对需要其的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子，其中，待治疗的疾病由OPA1基因的单倍剂量不足引起，而且其多指锌指蛋白特异性靶向OPA1启动子。
考虑的多指锌指蛋白是四聚、五聚、六聚、七聚或八聚锌指蛋白。“四聚”、“五聚”、“六聚”、“七聚”和“八聚”是指锌指蛋白分别由四、五、六、七、八个部分蛋白结构组成，其每一个对特定核苷酸三联体都具有结合特异性。优选地，人工转录因子包括六聚锌指蛋白。
在OPA1启动子区内选择靶位点
靶位点选择对于成功产生有功能的人工转录因子是至关重要的。为使人工转录因子体内调制OPA1基因表达，它必须在OPA1基因的基因组背景中结合它的靶位点。这需要DNA靶位点的可接近性，意味着该区域中的染色体DNA并未被围绕组蛋白紧密包装成核小体，并且没有DNA修饰诸如甲基化干扰人工转录因子结合。尽管大部分的人类基因组被紧密包装并且是无转录活性的，但活跃转录基因的转录起始位点的紧挨的附近(-1000至+200bp)对于内源转录因子和转录机诸如RNA聚合酶必须是可接近的。因此，在任何给定靶基因的该区域中选择靶位点将允许成功产生具有期望的体内功能的人工转录因子。
在人OPA1基因启动子内选择靶位点
分析人类OPA1开放阅读框的起始密码子的上游1000bp区域(图2)中具有一般组成(G/C/ANN)6的潜在18bp靶位点的存在，其中G是核苷酸鸟嘌呤，C是核苷酸胞嘧啶，A是核苷酸腺嘌呤且N可以替代四种核苷酸鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶中的每一种。选择四个靶位点，OPA_TS1(SEQIDNO：22)，OPA_TS2(SEQIDNO：23)，OPA_TS3(SEQIDNO：24)和OPA_TS-165(SEQIDNO：25)。
靶向OPA1基因启动子的可转导人工转录因子
特异性六聚锌指蛋白由使用ZiFit软件v3.3(SanderJ.D.,NucleicAcidsResearch35,599-605)产生的所谓的Barbas锌指模块集(GonzalezB.,2010,NatProtoc5,791-810)组成或使用酵母单杂交技术从锌指蛋白库中选择。为了生成靶向OPA1基因启动子的激活的可转导人工转录因子，将六聚锌指蛋白ZFP_OPA1_1(SEQIDNO:1)、ZFP_OPA1_2(SEQIDNO:2)、ZFP_OPA1_3(SEQIDNO:3)、ZFP_OPA1_4(SEQIDNO:4)、ZFP_OPA1_5(SEQIDNO:5)、ZFP_OPA1_6(SEQIDNO:6)、ZFP_OPA1_7(SEQIDNO:7)、ZFP_OPA1_8(SEQIDNO:8)、ZFP_OPA1_9(SEQIDNO:9)、ZFP_OPA1_10(SEQIDNO:10)、ZFP_OPA1_11(SEQIDNO:11)、ZFP_OPA1_12(SEQIDNO:12)、ZFP_OPA1_13(SEQIDNO:13)、ZFP_OPA1_14(SEQIDNO:14)、ZFP_OPA1_15(SEQIDNO:15)、ZFP_OPA1_16(SEQIDNO:16)、ZFP_OPA1_17(SEQIDNO:17)和ZFP_OPA1_18(SEQIDNO:18)融合至转录激活结构域VP64，产生人工转录因子OPA_akt1(SEQIDNO:19)、OPA_akt2(SEQIDNO:20)、OPA_akt3(SEQIDNO:21)、OPA_akt4(SEQIDNO:22)、OPA_akt5(SEQIDNO:23)、OPA_akt6(SEQIDNO:24)、OPA_akt7(SEQIDNO:25)、OPA_akt8(SEQIDNO:26)、OPA_akt9(SEQIDNO:27)、OPA_akt10(SEQIDNO:28)、OPA_akt11(SEQIDNO:29)、OPA_akt12(SEQIDNO:30)、OPA_akt13(SEQIDNO:31)、OPA_akt14(SEQIDNO:32)、OPA_akt15(SEQIDNO:33)、OPA_akt16(SEQIDNO:34)、OPA_akt17(SEQIDNO:35)和OPA_akt18(SEQIDNO:36)，其也包含NLS和3×myc表位标签。
也考虑的是包含五聚、六聚、七聚或八聚锌指蛋白的本发明的人工转录因子，其中更换个别锌指模块以改进对OPA1启动子基因的靶位点的结合亲和力或改变锌指蛋白的免疫学概况以提高耐受性。
根据本发明的靶向OPA1启动子的人工转录因子包括基于如SEQIDNO：26和43所公开的锌指模块组成的锌指蛋白，其中个别氨基酸被更换，以尽量减少潜在的免疫原性，同时保留对预定靶位点的结合亲和力。
本发明的人工转录因子还可能包含如通过基因本体GO:0001071限定的能够增加基因转录的其他蛋白质结构域，诸如VP16、VP64(VP16的四聚体重复)、CJ7、p65-TA1、SAD、NF-1、AP-2、SP1-A、SP1-B、Oct-1、Oct-2、Oct2-5x、MTF-1、BTEB-2和LKLF，优选VP64或AP-2。
此外，本发明的人工转录因子包括核定位序列(NLS)。考虑的核定位序列是通过结合至由基因本体论GO:0008139限定的蛋白而赋予核输入的氨基酸基序，例如碱性氨基酸的簇，其包含赖氨酸残基(k)，随后为赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基，随后为任何氨基酸(X)，随后为赖氨酸或精氨酸残基(K-K/R-X-K/R共有序列,ChelskyD.等,1989MolCellBiol9,2487-2492)或SV40NLS(SEQIDNO:62)，并且SV40NLS是优选的。
针对OPA1基因的启动子区域但没有蛋白转导结构域的人工转录因子也是本发明的主题。它们是如前所定义的本发明的人工转录因子的中间体，或可以这样使用。
考虑本发明的人工转录因子的替代递送方法，所述人工转录因子以通过转染或经由病毒载体进行转移的核酸的形式，所述病毒载体例如基于疱疹病毒，腺病毒和腺相关病毒的载体。
本发明的人工转录因子的结构域可以通过短的柔性接头连接。短的柔性接头具有2-8个氨基酸，优选甘氨酸和丝氨酸。考虑的具体接头是GGSGGS(SEQIDNO:63)。人工转录因子还可以包含标志物以便于它们的检测和加工。
在用靶向OPA1启动子的人工转录因子处理之后评估OPA1上调和改进的线粒体活性
用OPA1启动子特异性人工转录因子处理HeLa细胞将与缓冲对照处理的细胞进行比较，并且将通过基于使用特异性抗OPA1抗体的Western印迹的定量红外荧光评估OPA1的蛋白水平。OPA1蛋白水平的增加指示在用人工转录因子治疗之后OPA1的产量增加。为了测定用OPA1特异性人工转录因子处理的有益效果，评估线粒体保真度和细胞存活。为此，在用具有线粒体毒性的鱼藤酮处理引发氧化损伤之后在线粒体活性氧产生方面比较用OPA1特异性人工转录因子处理的细胞和对照处理的细胞。使用流式细胞术和反应性氧特定染料MitoSox测定线粒体活性氧产生。此外，通过电位敏感TMRE荧光的流式细胞术检测测定作为线粒体健康的参数的线粒体膜电位。与对照细胞比较的人工转录因子处理过的细胞中的活性氧产量的降低或线粒体膜电位的增加指示靶向OPA1的人工转录因子的有益活性。此外，测定用靶向OPA1的人工转录因子处理的细胞或对照处理的细胞的对于由星形孢菌素，鱼藤酮和放线菌素D诱导的凋亡的敏感性。为此目的，使用经处理的细胞的荧光显微镜检查测定作为凋亡性细胞死亡的指标的细胞色素c的释放并与对照细胞比较。
聚乙二醇残基的附接
据认为聚乙二醇残基与本发明的人工转录因子的共价连接(聚乙二醇化)可增加人工转录因子的溶解度，降低其肾清除率，并控制其免疫原性。考虑胺以及大小为1至40千道尔顿的硫醇反应性聚乙二醇。使用硫醇反应性聚乙二醇，实现人工转录因子的位点特异性聚乙二醇化。本发明的人工转录因子中的唯一必不可少的含硫醇基氨基酸是位于锌指模块中的锌配位所必需的半胱氨酸残基。这些硫醇基由于其锌配位，对于聚乙二醇化是不可利用的，因此，将一个或几个半胱氨酸残基纳入到本发明的人工转录因子中为使用硫醇特异性聚乙二醇试剂的聚乙二醇化提供游离的硫醇基。
药物组合物
本发明还涉及包含如上定义的人工转录因子的药物组合物。考虑的药物组合物是向温血动物尤其是人类肠胃外全身施用的组合物，尤其是静脉内施用的组合物，吸入的组合物，和局部施用的组合物，尤其是眼局部使用，例如作为滴眼剂，或玻璃体内、结膜下、眼球侧(parabulbar)或眼球后施用。尤其优选的是滴眼剂和玻璃体内、结膜下、眼球侧或眼球后施用的组合物。组合物包含单独的活性组分，或者优选与药学上可接受的载体一同的活性组分。进一步考虑的是缓释制剂。活性组分的剂量依赖于待治疗的疾病并依赖于物种、它的年龄、体重和个体状况、个体药代动力学数据以及施用方式。
进一步考虑的是用于口腔递送的药物组合物，尤其是包含被合适地封装(或者以另外的方式防止其被消化道降解)的活性组分的组合物。例如，此类药物组合物可以包含膜透性增强剂、蛋白酶抑制剂，并且由肠溶包衣包封。
药物组合物包含大约1％至大约95％的活性成分。单位剂量形式例如是安瓿、药瓶、吸入器、滴眼剂等。
本发明的药物组合物以本身已知的方式制备，例如通过常规混合、溶解或冷冻干燥方法。
优选使用活性组分的溶液、以及悬浮液或分散液，尤其是等渗水溶液、分散液或悬浮液，其例如在含有单独的活性组分或者与载体例如甘露醇一同的活性组分的冷冻干燥的组合物的情况下，可以在使用前配制。药物组合物可以进行灭菌和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐类和/或缓冲液，并且以本身已知的方式制备，例如通过常规溶解和冷冻干燥方法。所述溶液或悬浮液可以包含增粘剂，典型地为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯酮或明胶、或还有增溶剂，例如Tween80TM(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯)。
油中悬浮液包含习惯用于注射目的的植物油、合成油或半合成油作为油组分。关于这一点，可以特别提及液体脂肪酸酯，其包含具有8-22个、尤其12-22个碳原子的长链脂肪酸作为酸组分。这些脂肪酸酯的醇组分具有最多6个碳原子，并且是一价醇或多价醇，例如一价、二价或三价醇，尤其是乙二醇和丙三醇。作为脂肪酸酯的混合物，植物油诸如棉子油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油尤其有用。
可注射制剂的制造通常在无菌条件下进行，其例如装入安瓿或药瓶和容器的密封。
对于肠胃外施用，以水可溶性形式的活性组分的水溶液，例如水可溶性盐的水溶液，或者含有增粘物质例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖(并且如需要的话含有稳定剂)的含水注射悬浮液，是尤其合适的。活性组分任选与赋形剂一同还可以以冷冻干燥剂的形式，并且可以在肠胃外施用前通过加入合适的溶剂配制入溶液中。
用于吸入的组合物可以以气溶胶形式如喷雾剂、雾或以滴剂的形式施用。气溶胶由溶液或悬浮液制备，其可以用剂量测定的吸入器或雾化器(即使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体向呼吸道或肺递送特定量的药剂的装置)以由患者吸入的气溶胶化的药物的短爆发(shortburst)的形式来递送。还可以提供具有合适粉末基质(base)诸如乳糖或淀粉的用于吸入的粉末喷剂。
滴眼剂优选是含有合适的试剂以使组合物与泪液等渗(295-305mOsm/l)的活性组分的等渗水溶液。考虑的试剂是NaCl、柠檬酸、甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙二醇、葡萄糖等。此外，组合物包含缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂或Tris缓冲剂(三(羟甲基)氨基甲烷)，以保持5-8的pH，优选7.0-7.4。组合物还可以含有抗菌性防腐剂，例如对羟基苯甲酸酯类、季铵盐类、诸如苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(PHMB)等。滴眼剂还可以含有黄原胶以产生凝胶样滴眼剂，和/或其他增粘剂，诸如透明质酸、甲基纤维素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。
人工转录因子在治疗方法中的用途
此外，本发明涉及如上所述的针对OPA1启动子的人工转录因子，其用于增加OPA1生产，和用于治疗受OPA1影响的疾病，尤其是用于治疗这样的眼病。由OPA1调制的疾病是常染色体显性遗传性视神经萎缩、常染色体显性视神经萎缩加以及正常眼压性青光眼。
同样，本发明涉及治疗受OPA1影响的疾病的方法，其包括对需要其的患者施用治疗有效量的本发明的人工转录因子。特别地，本发明涉及治疗与正常眼压性青光眼或显性视神经萎缩相关的神经变性的方法。本发明的人工转录因子的有效量取决于待治疗的疾病的具体类型以及种族、其年龄、体重和个体状况、个体药动学数据和施用方式。对于向眼中施用，优选0.5-1mg的每月玻璃体注射。对于全身应用，优选10mg/kg的每月注射。此外，还优选将缓释储库制剂植入眼的玻璃体中。
人工转录因子在动物中的用途
此外，本发明涉及靶向动物OPA1启动子以提高基因产物产生的人工转录因子的用途。优选地，将人工转录因子以用于向动物局部施用的合适组合物直接施用。
实施例
DNA质粒的克隆
对于所有克隆步骤，限制性内切核酸酶和T4DNA连接酶均购自NewEnglandBiolabs。虾碱性磷酸酶(SAP)来自Promega。将高保真PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)用于所有标准PCR反应中。DNA片段和质粒按照制造商说明书使用NucleoSpinGel和PCRClean-up试剂盒、NucleoSpinPlasmid试剂盒或NucleoBondXtraMidiPlus试剂盒(Macherey-Nagel)来分离。寡核苷酸购自Sigma-Aldrich。新产生质粒的所有相关DNA序列通过测序(Microsynth)来验证。
用于酵母单杂交的六聚锌指蛋白文库的克隆
按照GonzalezB.等,.2010,NatProtoc5,791-810并具有以下改进来克隆含有结合GNN和/或CNN和/或ANN的锌指(ZF)模块的六聚锌指蛋白文库。合成编码GNN，CNN和ANNZF模块的DNA序列并将其插入pUC57(GenScript)中，分别产生pAN1049(SEQIDNO:64)，pAN1073(SEQIDNO:65)和pAN1670(SEQIDNO:66)。在pBluescriptSK(+)载体中完成锌指蛋白(ZFP)文库的逐步装配。为了避免在每一单独克隆步骤中插入多个ZF模块导致无功能的蛋白，将pBluescript(及其含有1ZFP、2ZFP或3ZFP的衍生产物)和pAN1049，pAN1073或pAN1670首先与一种限制酶孵育，并随后用SAP处理。在加入第二种限制性内切核酸酶之前，使用NucleoSpinGel和PCRClean-up试剂盒将酶去除。
通过用XhoI、SAP并随后用SpeI处理5μgpBluescript完成pBluescript-1ZFPL的克隆。通过将10μgpAN1049(释放16种不同的GNNZF模块)或pAN1073(释放15种不同的CNNZF模块)或pAN1670(释放15种不同的CNNZF模块)与SpeI、SAP并随后与XhoI孵育来产生插入片段。为了产生pBluescript-2ZFPL和pBluescript-3ZFPL，将7μgpBluescript-1ZFPL或pBluescript-2ZFPL用AgeI切割，去磷酸化，并用SpeI切割。通过分别向10μgpAN1049或pAN1073或pAN1670应用SpeI、SAP和随后XmaI来获得插入片段。通过用AgeI、SAP并随后用SpeI处理14μg的pBluescript-3ZFPL以获得切割后的载体，来完成pBluescript-6ZFPL的克隆。通过用SpeI、SAP和随后XmaI孵育从20μg的pBluescript-3ZFPL释放3ZFPL插入片段。
使用200ng切割后的载体、400UT4DNA连接酶在20μl总体积中并以3:1摩尔比的插入片段:载体设定含有一个、两个和三个ZFP的文库的连接反应，在RT(室温)下过夜。六聚锌指蛋白文库的连接反应包括在200μl总体积中的2000ngpBluescript-3ZFPL、500ng3ZFPL插入片段、4000UT4DNA连接酶，将所述总体积分为10个20μl，并分别在RT下孵育过夜。根据每一文库所需的克隆数通过几种方法将连接反应的部分转化入大肠杆菌(Escherichiacoli)中。为了产生pBluescript-1ZFPL和pBluescript-2ZFPL，将3μl的连接反应物直接用于大肠杆菌NEB5-α的热激转化。pBluescript-3ZFPL的连接反应的质粒DNA使用NucleoSpinGel和PCRClean-up试剂盒纯化并转化入电感受态大肠杆菌NEB5-α(来自EquiBio的EasyjecTPlus电穿孔仪或来自Eppendorf的多功能细胞电穿孔仪,2.5kV和25μF,来自Bio-Rad的2mm电穿孔杯)。将pBluescript-6ZFP文库的连接反应物应用于NucleoSpinGel和PCRClean-up试剂盒，并将DNA洗脱在15μl去离子水中。将约60ng脱盐的DNA与50μlNEB10-β电感受态大肠杆菌(NewEnglandBiolabs)混合，并如制造商建议使用EasyjecTPlus或多功能细胞电穿孔仪、2.5kV、25μF和2mm电穿孔杯进行电穿孔。对每一文库进行多次电穿孔，并随后直接合并细胞以提高文库大小。热激转化或电穿孔后，向细菌应用SOC培养基，并在37℃和250rpm下孵育1小时后，将30μl的SOC培养物用于连续稀释，并铺至含有氨苄青霉素的LB平板上。第二天，测定获得的文库克隆的总数。此外，选择每一文库的十个克隆以分离质粒DNA并通过限制酶消化检查插入片段的整合。对这些质粒中的至少三个进行测序以验证文库的多样性。将剩余的SOC培养物转移至100ml含氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃和250rpm下培养过夜。将那些细胞用于制备每一文库的质粒MidiDNA。
对于酵母单杂交筛选，将六聚锌指蛋白文库转移到相容的猎物载体中。为此目的，通过用XhoI/EcoRI切割载体并插入退火的寡核苷酸OAN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC,SEQIDNO:67)和OAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG,SEQIDNO:68)来修改pGAD10(Clontech)的多克隆位点。将获得的载体pAN1025(SEQIDNO:69)切割并去磷酸化，6ZFP文库插入片段通过XhoI/SpeI从pBluescript-6ZFPL中释放。如上所述对pBluescript-6ZFP文库完成连接反应和电穿孔入NEB10-β电感受态大肠杆菌中。
对于改进的酵母单杂交筛选，将六聚锌指文库转移到改进的猎物载体pAN1375(SEQIDNO:70)中。该猎物载体如下构建：将pRS315(SEQIDNO:71)用ApaI/NarI切割并插入退火的OAN1143(CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC，SEQIDNO:72)和OAN1144(TGCATGAATGCATGCGG，SEQIDNO:73)，产生pAN1373(SEQIDNO:74)。将来自pAN1025的SphI插入片段连接至用SphI切割的pAN1373内以获得pAN1375。
为进一步改善酵母单杂交筛选，也将六聚锌指文库转移到改进的猎物载体pAN1920(SEQIDNO：75)中。
为了进一步改善酵母单杂交筛选，将六聚体锌指文库插入猎物载体pAN1992(SEQIDNO：76)中。
用于酵母单杂交筛选的诱饵质粒的克隆
对于每一诱饵质粒，选择在中心包含18bp的潜在人工转录因子靶位点的60bp序列并且包括NcoI位点用于限制性分析。以这样的方式设计寡核苷酸并进行退火，以产生允许直接连入用HindIII/XhoI切割的pAbAi(Clontech)中的5'HindIII和3'XhoI位点。
酵母菌株和培养基
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y1HGold购自Clontech，YPD培养基和YPD琼脂购自CarlRoth。合成缺陷型(SD)培养基含有20g/l葡萄糖、6.8g/lNa2HPO4·2H2O、9.7g/lNaH2PO4·2H2O(均来自CarlRoth)、1.4g/l酵母合成缺陷型培养基添加物、6.7g/l酵母氮源基础、0.1g/lL-色氨酸、0.1g/lL-亮氨酸、0.05g/lL-腺嘌呤、0.05g/lL-组氨酸、0.05g/l尿嘧啶(均来自Sigma-Aldrich)。SD-U培养基含有除了尿嘧啶之外的所有组分，制备不含L-亮氨酸的SD-L。SD琼脂板不含有磷酸钠，但含有16g/lBacto琼脂(BD)。金担子素A(AbA)购自Clontech。
诱饵酵母菌株的制备
在20μl的总体积中用BstBI将约5μg的每种诱饵质粒线性化，并将一半的反应混合物直接用于酿酒酵母Y1HGold的热激转化。在转化前一天将酵母细胞用于接种5mlYPD培养基，并在滚瓶机(roller)上在RT下生长过夜。将一毫升该预培养物用新鲜YPD培养基1：20稀释，并在30℃,225rpm下孵育2-3小时。对于每一转化反应，通过离心收获1OD600，将酵母细胞用1ml无菌水洗涤一次并用1mlTE/LiAc(10mMTris/HCl,pH7.5,1mMEDTA,100mM醋酸锂)洗涤一次。最后，将酵母细胞重悬于50μlTE/LiAc中，并与50μg单链鲑鱼精DNA(Sigma-Aldrich)、10ul的BstBI线性化的诱饵质粒(见上文)和300μlPEG/TE/LiAc(10mMTris/HCl,pH7.5,1mMEDTA,100mM醋酸锂,50％(w/v)PEG3350)混合。将细胞和DNA在滚瓶机上在RT下孵育20分钟，随后置于42℃水浴中15分钟。最后，通过离心收集酵母细胞，将其重悬于100μl无菌水中，并涂布在SD-U琼脂板上。在30℃下孵育3天后，选择来自每一转化反应的生长在SD-U上的8个克隆，以分析它们对金担子素A(AbA)的敏感性。预培养物在滚瓶机上在RT下生长过夜。对于每一培养物，测量OD600，并用无菌水调整为OD600＝0.3。从该第一稀释开始，用无菌水制备五个额外的1:10稀释梯级。对于每一克隆，将每一稀释梯级的5μl点在含有SD-U、SD-U100ng/mlAbA、SD-U150ng/mlAbA和SD-U200ng/mlAbA的琼脂板上。在30℃下孵育3天后，选择在SD-U上生长良好并对AbA最敏感的三个克隆用于进一步分析。通过MatchmakerInsertCheckPCRMix1(Clontech)按照制造商说明书验证诱饵质粒稳定整合入酵母基因组中。将三个克隆中的一个用于随后的Y1H筛选。
用六聚锌指蛋白文库转化诱饵酵母菌株
将约500μl的酵母诱饵菌株预培养物稀释至1lYPD培养基中，并在30℃和225rpm下孵育直到OD600＝1.6-2.0(大约20小时)。通过在水平转子(5分钟,1500×g,4℃)中离心收集细胞。根据BenatuilL.等,2010,ProteinEngDesSel23,155-159完成电感受态细胞的制备。对于每一转化反应，将400μl电感受态诱饵酵母细胞与1μg编码6ZFP文库的猎物质粒混合并在冰上孵育3分钟。将细胞-DNA悬浮液转移至预冷的2mm电穿孔杯中。进行多个电穿孔反应(EasyjecTPlus电穿孔仪或多功能细胞电穿孔仪,2.5kV和25μF)直到已经转化所有的酵母细胞悬浮液。电穿孔后，将酵母细胞转移至100ml的YPD:1M山梨醇1:1的混合物中，并在30℃和225rpm下孵育60分钟。通过离心收集细胞，并在1-2ml的SD-L培养基中重悬。将200μl的等分试样涂布在含有1000-4000ng/mlAbA的15cmSD-L琼脂板上。此外，将50μl的细胞悬浮液用于制备1/100和1/1000稀释物，并将50μl未稀释的和稀释的细胞铺板至SD-L上。所有平板在30℃下孵育3天。从具有稀释的转化子的平板上计算获得的克隆的总数。尽管用未稀释细胞的SD-L平板表明所有转化子的生长，但如果猎物6ZFP成功结合到它的诱饵靶位点上，则仅含有AbA的SD-L平板产生菌落形成。
阳性相互作用的验证和编码6ZFP的猎物质粒的回收
对于最初分析，从含有最高AbA浓度的SD-L平板上挑出四十个较大的菌落，并将酵母细胞在含有1000-4000ng/mlAbA的SD-L上重新划线两次，以获得单菌落。对于每一克隆，将一个菌落用于接种5mlSD-L培养基，并将细胞在RT下生长过夜。第二天，用无菌水调节OD600＝0.3，制备五个额外的1/10稀释，并将每一稀释梯级的5μl点在SD-L、SD-L500ng/ml、1000ng/mlAbA、SD-L1500ng/mlAbA、SD-L2000ng/mlAbA、SD-L2500ng/ml、AbASD-L3000ng/mlAbA和SD-L4000ng/mlAbA平板上。按照它们在高AbA浓度上生长的能力将克隆分级。从最佳生长的克隆中，将5ml初始SD-L预培养物用于离心下细胞，并将它们在100μl水或剩余培养基中重悬。加入50U溶细胞酶(Sigma-Aldrich,L2524)后，将细胞在水平振荡器中在37℃和300rpm下孵育几个小时。将产生的球芽通过加入10μl20％(w/v)SDS溶液进行裂解，涡旋剧烈混合1分钟并在20℃下冷冻至少1小时。然后，加入来自NucleoSpinPlasmid试剂盒的250μlA1缓冲液稀释和一匙尖(onespatulatip)玻璃珠(Sigma-Aldrich,G8772)，并将管通过涡旋剧烈混合1分钟。在继续进行标准NucleoSpinPlasmid试剂盒方案之前，通过加入来自NucleoSpinPlasmid试剂盒的250μlA2缓冲液并在RT下孵育至少15分钟进一步改进质粒分离。用30μl洗脱缓冲液洗脱后，通过热激转化将5μl质粒DNA转化入大肠杆菌DH5α中。从含氨苄青霉素的LB平板上挑取两个单独的菌落，分离质粒并对文库插入片段进行测序。对获得结果分析每一靶位点的6ZFP之间的共有序列。
用于组合的分泌型荧光素酶和碱性磷酸酶测定的OPA1基因启动子区的克 隆
将含有OPA1启动子区的DNA片段克隆入pAN1485(NEG-PG04,GeneCopeia)中，产生含有在OPA1基因启动子控制下的分泌型Gaussia荧光素酶和在组成型CMV启动子控制下的分泌型碱性磷酸酶并允许荧光素酶信号相对于碱性磷酸酶信号进行标准化的报道基因质粒pAN1680(SEQIDNO:37)。
用于哺乳动物转染的人工转录因子的克隆
使用AgeI/XhoI的标准程序将通过Gensynthesis(GenScript)产生或通过酵母单杂交选择的编码多指锌指蛋白的DNA片段克隆入哺乳动物表达载体中用于作为所关注的锌指蛋白组，SV40NLS、3xmyc表位标签和N末端KRAB结构域(pAN1255-SEQIDNO：78)、C末端KRAB结构域(pAN1258-SEQIDNO：79)、SID结构域(pAN1257-SEQIDNO：80)或VP64激活结构域(pAN1510-SEQIDNO：81)之间的融合蛋白在哺乳动物细胞中表达。
用于产生稳定转染的，四环素诱导的细胞的质粒的产生如下：使用EcoRV/NotI将编码包含多指锌指结构域、调控结构域(N末端KRAB、C末端KRAB、SID或VP64)、SV40NLS和3xmyc表位标签的人工转录因子的DNA片段克隆入pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen)中。
细胞培养和转染
HeLa细胞在5％CO2和37℃下生长在添加有4.5g/l葡萄糖、10％热失活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠(均来自Sigma-Aldrich)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中。对于荧光素酶报道基因测定，按7000个HeLa细胞/孔接种入96孔板中。第二天，使用Effectene转染试剂(Qiagen)按照制造商说明书进行共转染。编码人工转录因子和编码荧光素酶的质粒中量制备物(midipreparations)以比例3：1使用。转染后6小时和24小时，每孔用100μl新鲜的DMEM更换培养基。
Flp-In Tm T-Rex TM 293表达细胞系的产生和保持
通过FLP重组酶介导的整合产生稳定的，四环素诱导的Flp-InTmT-RexTM293表达细胞系。使用Flp-InTmT-RexTMCoreKit，通过转染pFRT/lacZeo靶位点载体和pcDNA6/TR载体产生Flp-InTmT-RexTM宿主细胞系。为了产生诱导的293表达细胞系，通过Flp重组酶介导的DNA重组在Flp-InTmT-RexTM宿主细胞系中的FRT位点处整合包含所关注的基因的pcDNA5/FRT/TO表达载体。稳定的Flp-InTmT-RexTM表达细胞系在含(DMEM；10％Tet-FBS；2mM谷氨酰胺；15μg/ml杀稻瘟素和100μg/ml潮霉素)的选择培养基中维持培养。为了诱导基因表达，加入四环素到1μg/ml的最终浓度。
组合的荧光素酶/SEAP启动子活性测定
用人工转录因子表达构建体和携带有在OPA1启动子控制下的分泌型Gaussia荧光素酶和在组成型CMV启动子控制下的分泌型碱性磷酸酶(GaussialuciferaseGlowAssayKit,Pierce；SEAPReporterGeneAssaychemiluminscent,Roche)的质粒共转染HeLa细胞。转染后两天，收集细胞培养物上清液，并使用GaussiaLuciferaseGlow测定试剂盒(ThermoScientific)和SEAP报道基因分别测定(Roche)测量荧光素酶活性和SEAP活性。将其中锌指结构域中的所有半胱氨酸残基被更换为丝氨酸残基的失活的人工转录因子的表达质粒的共转染用作对照。将荧光素酶活性相对于SEAP活性标准化，并表示为对照的百分比。
通过定量RT-PCR测定基因表达水平
根据制造商的说明使用RNeasyPlusMini试剂盒(Qiagen,Hilden，德国)从细胞分离总RNA。将冷冻的细胞团重新悬浮于含有10μl/ml的β巯基乙醇的RLTPlusLysis缓冲液中。在使用QIAshredder离心柱均化后，将总裂解物转移到gDNA消除离心柱以消除基因组DNA。加入一个体积的70％乙醇并将总裂解物转移至RNeasy离心柱。经过多个洗涤步骤后，以30μl最终体积的无RNase水洗脱RNA。在-80℃下储存RNA直至进一步使用。根据制造商的说明使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems，Branchburg，新泽西州，美国)进行cDNA的合成。在含有2μl的10x缓冲液，0.8μl的25×dNTP混合物，2μl的10xRT随机引物，1μl的Multiscribe逆转录酶和4.2μl的H2O的20μl的总反应体积中进行cDNA合成。加入10μl最终体积的RNA并在下面的条件下进行反应：在25℃下10分钟，接着在37℃下2个小时和在85℃下5分钟的最终步骤。在含1μl20×TaqManGeneExpressionMasterMix、10.0μl的UniversalPCRMasterMix(二者都来自AppliedBiosystems，Branchburg，新泽西州，美国)和8μlH2O的20μl的总反应体积中进行定量PCR。对于每个反应加入1μl的cDNA。使用ABIPRISM7000序列检测系统(AppliedBiosystems，Branchburg，新泽西州，美国)在下列条件下进行qPCR：在50℃下2分钟的起始步骤，之后是在95℃下10分钟的第一变性和由40个循环的在95℃下15秒和在60℃下1分钟组成的进一步步骤。
用于细菌表达的人工转录因子的克隆
使用标准程序利用EcoRV/NotI将编码人工转录因子的DNA片段克隆至基于pET41a+(Novagen)的细菌表达载体pAN983(SEQIDNO:38)中，以便在大肠杆菌中表达为人工转录因子和TAT蛋白转导结构域之间的His6标记的融合蛋白。
用于在合适的大肠杆菌宿主细胞诸如BL21(DE3)中细菌性生产靶向OPA1的可转导人工转录因子的表达构建体是pAN1964(SEQIDNO:39)，pAN2053(SEQIDNO:40)，pAN2055(SEQIDNO:41)，pAN2057(SEQIDNO:42)，pAN2059(SEQIDNO:43)，pAN2061(SEQIDNO:44)和pAN2063(SEQIDNO:45)。
人工转录因子蛋白的产生
将用给定的人工转录因子的表达质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)生长在添加有100μMZnCl2的1lLB培养基中，直至达到0.8-1的OD600，并用1mMIPTG诱导两小时。通过离心收集细菌，通过超声处理制备细菌裂解物，并纯化包涵体。为此目的，通过离心(5000g,4℃,15分钟)收集包涵体，并在20ml的结合缓冲液(50mMHEPES,500mMNaCl,10mM咪唑；pH7.5)中洗涤三次。将纯化的包涵体在冰上于30ml结合缓冲液A(50mMHEPES,500mMNaCl,10mM咪唑,6MGuHCl；pH7.5)中溶解一小时。将溶解的包涵体在4℃和13'000g下离心40分钟，并通过0.45μmPVDF滤器过滤。使用His-Trap柱在FPLC(GeHealthcare)上用结合缓冲液A和洗脱缓冲液B(50mMHEPES,500mMNaCl,500mM咪唑,6MGuHCl；pH7.5)纯化His标记的人工转录因子。将含有纯化的人工转录因子的级分合并，并在4℃下透析过夜，在人工转录因子含有SID结构域的情况下，对缓冲液S(50mMTris-HCl,500mMNaCl,200mM精氨酸,100μMZnCl2,5mMGSH,0.5mMGSSG,50％甘油；pH7.5)透析，或者对于含有KRAB结构域的人工转录因子，则对缓冲液K(50mMTris-HCl,300mMNaCl,500mM精氨酸,100μMZnCl2,5mMGSH,0.5mMGSSG,50％甘油；pH8.5)透析。透析后，将蛋白样品在4℃下以14'000rpm离心30分钟，并使用0.22μmMillex-GV针头式滤器(filtertips)(Millipore)无菌过滤。对于包含VP64激活结构域的人工转录因子，根据制造商的说明使用His-BondNi-NTA树脂(Novagen)从可溶级分(结合缓冲液：50mMNaPO4pH7.5，500mMNaCl，10mM咪唑；洗脱缓冲液50mMHEPESpH7.5，500mMNaCl，500mM咪唑)产生该蛋白。对VP64-缓冲液(550mMNaClpH7.4，400mM精氨酸，100μMZnCl2)透析蛋白。
使用ELDIA(酶联DNA相互作用测定)测定人工转录因子的DNA结合活 性
用洗涤缓冲液(25mMTris/HClpH7.5,150mMNaCl,0.1％BSA,0.05％Tween-20)洗涤BSA预封闭镍包被的板(Pierce)三次。在储存缓冲液中在饱和条件(50pmol/孔)下以纯化的人工转录因子涂覆板并伴随着轻微摇动在RT下孵育1h。在3个洗涤步骤之后，包含60bp启动子序列的1x10-12至5x10-7M的退火的生物素化的寡核苷酸在非特异性竞争剂(0.1mg/ml的来自鲑鱼精子的ssDNA，Sigma)的存在下连同所结合的人工转录因子在结合缓冲液(10mMTris/HClpH7.5，60mMKCl，1mMDTT，2％甘油,5mMMgCl2和100μMZnCl2)中在RT下孵育1小时。洗涤(5次)后，用3％的BSA在室温下封闭孔30分钟。在结合缓冲液中在RT下加入抗链霉亲和素-HRP保持1小时。在5个洗涤步骤之后，加入TMB底物(Sigma)并在RT下孵育2至30分钟。通过加入TMB终止溶液(Sigma)停止反应并在450nm读取样品消光。根据Hill利用SigmaPlotV8.1进行配体结合动力学的数据分析。
蛋白转导
将生长至约80％融合的细胞用0.01至1μM的人工转录因子处理或每24小时在OptiMEM或生长介质中在37℃下用额外添加的人工转录因子模拟处理2小时至120小时。任选地，将10-500μMZnCl2加入到生长培养基中。对于免疫荧光，将细胞在PBS中洗涤一次，胰蛋白酶消化并接种于玻璃盖玻片上做进一步的检测。
免疫荧光
将细胞用4％多聚甲醛固定，用0.15％的TritonX-100处理15分钟，用10％的BSA/PBS封闭并用小鼠抗HA抗体(1:500，H9658，Sigma)或小鼠抗-myc(1：500，M5546，Sigma)孵育过夜。将样品用PBS/1％BSA洗涤三次，并用偶联到AlexaFluor546(1:1000，Invitrogen)的山羊抗小鼠抗体孵育并利用DAPI(的1mg/ml的1:1000稀释物，3分钟，Sigma)复染。利用荧光显微镜分析样品。
免疫印迹
为了测量蛋白水平，用RIPA缓冲液(Pierce)裂解细胞并使蛋白质裂解物与Laemmli样品缓冲液混合。使蛋白根据其尺寸通过SDS-PAGE分离并使用电印迹转移至硝酸纤维素膜。使用在小鼠或兔中产生的特异性一级抗体进行蛋白质的检测。通过偶联至辣根过氧化物酶的二级抗体和基于发光的检测(ECLplus，Pierce)或通过偶联至使用红外线激光扫描仪检测和定量的DyLight700或DyLight800荧光的二级抗体进行一级抗体的检测。
测量线粒体功能
对于流式细胞仪分析，用10mMEDTA/PBS收集处理的细胞。模拟处理的细胞用作对照。为了测量线粒体膜电位，在分析前将细胞重悬浮在FACS缓冲液P(PBS，5mMEDTA，0.5％(w/v)BSA，1μg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，Sigma)，10nM四甲基罗丹明乙酯(TMRE，Sigma))中并在37℃下孵育30分钟。用50μM羰基氰化物-3-氯苯腙(CCCP，Sigma)处理以消散线粒体膜电位作为对照。为了测量线粒体质量，在分析前将细胞重悬浮于FACS缓冲液M(PBS，5mM的EDTA，0.5％(w/v)BSA，1μg/mlDAPI和100nMMitoTrackergreenFM(Invitrogen)中并在37℃下孵育30分钟。对于线粒体ROS测量，将细胞重悬浮在FACS缓冲液R(PBS，5mMEDTA，0.5％BSA，1μg/mlDAPI和5μMMitoSOX(Invitrogen))中，在37℃下孵育10分钟，用PBS洗涤，并重悬浮在FACS缓冲液R2(PBS，5mMEDTA，0.5％(w/v)BSA)中。使用FlowJo软件(TreeStar公司)在CyAnADP(Dako)上进行流式细胞仪分析。
测量凋亡诱导
将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％的EM级多聚甲醛(Pierce，28908)在RT下固定30分钟。然后将细胞在RT下用PBS中的0.15％(v/v)TritonX100通透15分钟，然后在RT下用PBS中的10％(w/v)BSA封闭1小时。在4℃下用在封闭缓冲液中稀释的小鼠抗细胞色素c抗体(BDBiosciences，556432，1:1000)孵育样品过夜。用封闭缓冲液洗涤细胞三次，持续15分钟，然后在RT下用AlexaFluor546缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)孵育1小时。由不知情的观察者通过荧光显微镜分析衡量细胞凋亡的细胞色素c释放。模拟处理的细胞用作对照。

Claims (22)

1.一种人工转录因子，其包含融合至激活性蛋白结构域的特异性靶向OPA1基因启动子的多指锌指蛋白和核定位序列。
2.根据权利要求1所述的人工转录因子，其包括蛋白转导结构域。
3.根据权利要求1或2所述的人工转录因子，其包括六聚锌指蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的人工转录因子，其中，所述激活性蛋白结构域是SEQIDNO:1的VP16、SEQIDNO:2的VP64、SEQIDNO:3的CJ7、SEQIDNO:4的p65TA1、SEQIDNO:5的SAD、SEQIDNO:6的NF-1、SEQIDNO:7的AP-2、SEQIDNO:8的SP1-A、SEQIDNO:9的SP1-B、SEQIDNO:10的Oct-1、SEQIDNO:11的Oct-2、SEQIDNO:12的Oct2-5x、SEQIDNO:13的MTF-1、SEQIDNO:14的BTEB-2或SEQIDNO:15的LKLF。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的人工转录因子，其中，所述核定位序列是包含K-K/R-X-K/R共有序列或SEQIDNO:62的SV40NLS的碱性氨基酸簇。
6.根据权利要求2至5中的任一项所述的人工转录因子，其中，所述蛋白转导结构域是SEQIDNO：16的HIV衍生的TAT肽，SEQIDNO：18的合成肽mT02，SEQIDNO：19的合成肽mT03，SEQIDNO：20的R9肽和SEQIDNO：21的ANTP结构域。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的人工转录因子，其包含选自SEQIDNO：26至43的蛋白序列的锌指蛋白。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的人工转录因子，其还包括聚乙二醇残基。
9.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至8中的任一项所述的人工转录因子。
10.一种核酸，其编码根据权利要求1至7中的任一项所述的人工转录因子。
11.一种载体，其包括根据权利要求10所述的核酸。
12.根据权利要求11所述的载体，其是病毒载体。
13.一种宿主细胞，其包括根据权利要求11或12所述的载体。
14.一种根据权利要求13的大肠杆菌宿主细胞，其含有SEQIDNO：83至89的表达构建体。
15.一种病毒运载体，其包括根据权利要求10所述的核酸。
16.根据权利要求15所述的病毒运载体，其选自腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、假型腺相关病毒、假型逆转录病毒、假型慢病毒和假型腺病毒。
17.一种药物组合物，其包括根据权利要求15或16所述的病毒运载体。
18.根据权利要求1至8中的任一项所述的人工转录因子，其用于增加由OPA1基因启动子驱动的表达。
19.根据权利要求10所述的核酸，其用于增加由OPA1基因启动子驱动的表达。
20.根据权利要求1至8中的任一项所述的人工转录因子，其用于治疗常染色体显性萎缩，常染色体显性萎缩加和青光眼。
21.根据权利要求10所述的核酸，其用于治疗常染色体显性萎缩，常染色体显性萎缩加和青光眼。
22.一种治疗常染色体显性萎缩，常染色体显性萎缩加或青光眼的方法，其包括对需要其的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中的任一项所述的人工转录因子或根据权利要求10所述的核酸。
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