KR102513120B1 - 중추신경계(cns)에 단백질을 전달하기 위한 조작된 기생충 - Google Patents

중추신경계(cns)에 단백질을 전달하기 위한 조작된 기생충 Download PDF

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Abstract

CNS와 같은 개체의 목적조직(tissue-of-interest)에 목적단백질을 전달하고, 나아가 개체의 중추신경계 내 치료용 폴리펩티드의 투여에 의해 치료가능한 병리를 치료하기 위한, 핵산 구조물, 이를 포함하는 톡소플라즈마, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 방법이 제공된다.

Description

중추신경계(CNS)에 단백질을 전달하기 위한 조작된 기생충
본 발명은 이의 일부 구현예에서, 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 분비 폴리펩티드에 융합된 약학적 폴리펩티드의 분비를 위한 핵산 구조물, 및 이를 포함하는 톡소플라즈마에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 배타적인 것은 아니나, 개체를 치료하기 위해 이를 이용한 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
단백질 치료제의 전달을 위한 확실한 방법의 부족은 그의 임상 치료로의 번역에서 현재의 병목 현상을 크게 약화시킨다. 단백질은 종종 단순한 화합물에 의해 모방할 수 없는, 고도로 특이적이고 복잡한 일련의 기능을 제공한다(Nat Rev Drug Discov. 2008; 7(1):21-39. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Leader B, Baca QJ, and Golan DE); 그러나, 그의 거대분자 본성으로 인해, 치료용 단백질의 신체 내 표적 부위에의 전달은 매우 어렵다. 생물학적 장벽에 의한 낮은 침투성과 함께, 투여 후 또는 저장 중의 낮은 기능적 안정성 및 활성의 급격한 감소는 활성 단백질의 전달을 제한한다. 화학적 변형체, 접합체 및 담체 시스템의 개발의 진행으로 일부 치료용 단백질의 전달을 도왔으나, 대부분이 여전히 "접근가능한 표적 공간" 내 - 혈관 구역 내 또는 세포 표면 상의 표적에 제한되어 있다(Mitragotri 2014, Nat. Rev. Drug. Discov. 13(9):655-72). 효율적인 전달은, 뇌로의 분자의 수송은 엄격히 조절하는 반면, 표적이 세포 내에 있는 경우 더욱 복잡해지는, 혈뇌 장벽(BBB)에 의한 신경질환 분야에서 특히 어렵다.
CNS 내 세포에 보충 단백질을 전달하기 위하여, BBB를 관통하고 CNS 내로 특정 세포를 표적으로 하는 메커니즘을 개발할 필요가 있다.
현재, 특정 단백질의 결핍으로 인한 상태를 치료하기 위한 주요 접근법은 유전자 치료법, 줄기세포 치료법 및 효소 대체요법이 있다.
유전자 치료법은 단백질의 기능적 복사체의 발현을 증가시키기 위한, 치료용 단백질을 코딩하는 유전자의 기능적 복사체를 삽입하는 것이다(Cox, D. B. T., et al., 2015). 유전자 치료법은 유전자의 정확한 서열을 제공하는 반면, 번역 메커니즘 또는 번역 후 변형에서의 결함에 의해 유발되거나 동반되는 단백질 기능의 상실은 다루지 않는다. 게다가, 삽입 돌연변이 유발(Persons, D. A. & Baum, C. 2011), 동원, 생식선 전염, 면역원성 및 제한된 전이유전자 능력(Schambach, A., et al., 2013; Al-Dosari et al., 2009)에 의한 암 발병의 위험을 부담한다. CNS를 표적으로 하기 위하여, 유전자 치료법은 가장 일반적으로 헤르페스 단클론 바이러스 1형(HSV-1), 아데노바이러스, AAV, HIV-1과 같은 렌티바이러스, 고양이 면역결핍성 바이러스 또는 말 전염성 빈혈 바이러스로부터 유래된 것을 포함하는 바이러스 벡터의 사용으로 매개되며, 최근에는 SV40-AAV 및 렌티바이러스가 가장 많이 사용된다. 일부 바이러스 벡터는 다른 것들 보다 안전하지만, 그것들은 단백질 조작 결함을 다루지 않으며, 임상 효율이 제한적이다.
줄기세포 치료법은 단백질의 결함있는 내인성 합성을 보충할 수 있는 이식 세포의 단백질 합성 메커니즘에 의존한다. 이러한 접근법을 임상적으로 구현하기 위한 수많은 노력에도 불구하고, 이러한 치료법의 효율성은 이식된 세포의 거부 및 환자-특이적 줄기세포의 이용의 낮은 비용-효율성에 의해 감소한다. 아울러, 줄기세포 치료에 관련된 위험은 이식된 세포의 거부를 줄이기 위해 요구되는 면역억제와 관련된 합병증, 및 암의 발생을 포함한다(Dimmeler, S., et al., 2014).
보충 단백질이 외부에서 합성된 후 CNS로 전달되는, 단백질- 또는 효소 대체요법(ERT)은 임상적으로 적합하도록 BBB의 불침투성을 극복하고 정밀한 표적을 개발하여야만 한다. 단백질 전달에 대한 이러한 접근법 중 하나는 단백질이 낮은 효율성으로 확산되는, 뇌 또는 인접 기관에 직접적으로 주입하는 것이다. 따라서, 이러한 접근법의 위험 외에도, 필요한 양으로 CNS 내 특정 부위를 표적으로 하는 능력이 제한적이다. 이러한 접근법의 또 다른 문제는 반복적 투약의 필요이며, 이는 보통 임상적으로 비실용적이다(Abbott, N. J. 2013).
ERT는 치료용 단백질이 보다 효율적으로 CNS로 확산되도록, BBB 투과성 증가와 결합될 수 있다(Malhotra, M. & Prakash, S. 2011). 이는 BBB를 구성하는 세포의 축소 또는 BBB를 통한 수송 메커니즘의 조작을 통해 이루어진다. 그러나, 이러한 접근법은 옵소닌작용으로 인해 효율적이지 않으며, 원하지 않는 물질이 관심 보충 단백질과 함께 CNS로 확산되는 위험을 부담한다(Bradbury, M. W. B. 2012).
대안적인 접근법은 BBB를 통과하는 고유의 능력을 이용하기 위해 CNS로 들어가는 요소에 치료용 단백질을 부착하는 것이다. BBB를 통한 운행을 매개할 수 있는 제제는 융합 단백질, 덴드리머, 고체 지질 나노입자, 리포좀 및 나노입자를 포함한다(Solaro, R., 2010). 그러나, 이러한 접근법은 추가 개발이 필요하며, 임상시험에도 도달하지 못하였다.
톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)는 첨복포자충문(phylum apicomplexa)의 단일세포 세포내 원생 기생충이다. 이의 일차적인 숙주는 고양이과이고, 그것에서만 그 생활주기의 유성단계를 밟을 수 있다. 그러나, 이차적인 숙주로서 인간을 포함한, 많은 온혈 유기체를 감염시킬 수 있다. 설치류에서와 같이, 인간에서, 숙주가 기생충과 접촉한 후(일반적으로 감염성 조직 낭포 또는 접합자 섭취 후), 기생충은 빠르게 번식하는 급분열소체(tachyzoite) 단계로 분화한다. 톡소플라즈마 곤디 급분열소체는 활성 침투에 의해 유핵 숙주세포에 침입하고, 내부이분(endodyogeny)에 의해 복제하는 액포를 형성한다. 급분열소체는 장 상피를 통해 이동하고, 면역세포에 대한 "히치 하이킹(hitch-hicking)" 및 자율적 동원에 의해, 원위 조직에 도착하고, 혈뇌 장벽을 파괴하며, 뇌에 퍼진다[Harker 2015, Parasite Immunol. 37(3):141-9]. 따라서, 급분열소체는 순환계로 들어가 이차 조직으로 전파된다. 복제는 전파, 및 감염의 급성 단계에서 원위 조직에의 도달에 있어서 중요하다. 일단 뇌의 독특한 환경으로 들어가면, T. 곤디는 뇌에서 세포로 침투하여(주로 뉴런 뿐만 아니라, 낮은 비율의 신경교세포), 면역 압력을 가하면, 잠복 느린분열소체(bradyzoite) 단계와 구별되며, 세포질 세포간 낭포에 존재한다. 이는 만성 감염을 특징으로 한다(Cabral et al. 2016, PLoS Pathog. 12(2):e1005447). 느린분열세포를 보유하고 있는 조직 낭포는 숙주의 평생동안 지속되며, 매우 천천히 번식하고 휴지기의 대사 과정을 가진다(Parasite Immunol. 2015, 37(3):141-9. "Toxoplasma gondii dissemination: a parasite's journey through the infected host").
비록 T. 곤디가 세계 인구의 약 3분의 1을 감염시키지만, 건강한 사람에게는 감염이 증상이 없으며(Montoya, J. G. & Liesenfeld, O. 2004), 면역체계가 불규칙적으로 손상된 사람들에게만 주로 위험하다. 가장 중요한 것은, 감염 시 T. 곤디가 세포 침입 동안 및 세포내 T. 곤디가 세 가지 유형의 전자고밀도(electrodense) 분비성 세포 기관: 미세간상체(micronemes), 곤봉체(rhoptries) 및 밀집 과립(dense granules)을 가지면서, 숙주 세포로 단백질을 분비한다는 것이다. 숙주세포 침입은 기생충이 숙주세포를 침입할 때와 그 내부에 머무를 때 정점 영역으로부터 세포외유출되는, 세 개의 세포 기관의 내용물을 순차적으로 분비함으로써 매개된다(Dlugonska, H. 2008). 미세간상체는 T. 곤디의 부착 및 침투에 관여하는 반면, 곤봉체는 일시적인 구조의 형성, 접합부 이동 및 PV의 형성에 필요하다. 곤봉체 단백질은 "키스와 침(kiss and spit)"이라고 불리는 과정에서 숙주와의 초기 접촉시 분비된다(Boothroyd, J. C. et al., 2008). 밀집 과립은 대부분의 기생충 단계에 걸쳐 단백질을 분비한다. 분비 과정은 액포내 네트워크의 형성과 일치하고, T. 곤디의 세포내 거주 동안 계속된다(Dlugonska, H. 2008; Carruthers, V. B. & Sibley, L. D. 1997).
추가적인 배경 기술은 Koshy, A. A. et al. 2010; US8673289; US20120045477 A1; Lodoen M.B., et al. 2010. Cellular Microbiology, 12: 55-66; WO 2016/046321 A1; Sibley L.D., 2011 (Immunological Reviews 240: 72-91; Invasion and intracellular survival by protozoan parasites); Stanislaus MS and Cheng CL 2002 (Genetically engineered self-destruction: an alternative to herbicides for cover crop systems. Weed Science 50: 794-801)을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마(Toxoplasma) 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 전신발현 프로모터(constitutive promoter), 유도 프로모터(inducible promoter), 잠복기-특이적 프로모터(latent period-specific promoter), 및 톡소필린(Toxofilin) 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터(Toxoplasma endogenous promoter)로 구성된 군에서 선택된, 핵산 구조물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 적어도 2개의 핵산 구조물을 포함하는 핵산 구조물 시스템으로서, 상기 적어도 2개의 핵산 구조물의 제1 핵산 구조물은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산 구조물이고, 상기 적어도 2개의 핵산 구조물의 제2 핵산 구조물은 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 핵산 구조물 시스템이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물 또는 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물 시스템으로 형질전환된 톡소플라즈마가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 개체의 중추신경계에 목적단백질(protein-of-interest)을 투여하는 방법으로서, 상기 방법은: 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마, 또는 본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물을 투여하여, 개체의 중추신경계에 목적단백질을 투여하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마, 또는 본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물을 투여하여 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 개체는 개체의 중추신경계에 상기 약학적 폴리펩티드를 투여하여 치료가능한 병리로 진단된, 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 톡소플라즈마를 개체에 투여하여 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 개체는 개체의 중추신경계에 상기 약학적 폴리펩티드를 투여하여 치료가능한 병리로 진단된, 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 유도 프로모터, 잠복기-특이적 프로모터, 및 톡소필린(Toxofilin) 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터:로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 내인성 프로모터는 곤봉체(rhoptry) 단백질의 것이 아니다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마는 약독화되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 상기 톡소플라즈마의 곤봉체로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 곤봉체로부터 분비되는 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소필린(Toxofilin) 및/또는 ROP1을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 곤봉체로부터 분비되는 톡소플라즈마 분비 단백질은 서열번호 344 내지 465로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 비-곤봉체 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 미세간상체(microneme) 단백질 및 밀집 과립 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마의 밀집 과립(dense granule)으로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 밀집 과립으로부터 분비되는 토곳플라즈마 분비 단백질은 GRA16 및/또는 GRA24를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마의 미세간상체로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미세간상체로부터 분비되는 단백질은 서열번호 280 내지 322로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 밀집 과립으로부터 분비되는 단백질은 서열번호 234 내지 279로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마 곤디 대식세포 이동 저해 인자(TgMIF)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마 분비 단백질 개방형 해독 프레임의 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열 상류 및/또는 하류를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 5'-비번역 부위(5'-UTR)는 톡소플라즈마 분비 단백질 개방형 해독 프레임의 상류에 위치한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 3'-비번역 부위(3'-UTR)는 톡소플라즈마 분비 단백질 개방형 해독 프레임의 하류에 위치한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 3'-비번역 부위(3'-UTR) 핵산 서열은 3'-UTR GRA2 3'-UTR, GRA16 3'-UTR, GRA24 3'-UTR, SAG1 3'-UTR, 또는 DHFR이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 5'-비번역 부위(5'-UTR) 핵산 서열은 GRA2 5'-UTR, GRA16 5'-UTR, GRA24 5'-UTR, SAG1 5'-UTR, or the DHFR 5'-UTR이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 GRA2 프로모터, GRA16 프로모터, GRA24 프로모터, SAG1 프로모터, 또는 DHFR 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열은 톡소필린 3'-UTR이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 핵산 구조물은 유도성 자기-파괴 요소(inducible self-destruction element)를 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열은 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 핵산 구조물 내에 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열은 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물과 별개의 핵산 구조물 내에 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 핵산 구조물은 Cre-재조합효소 코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 핵산 구조물은 베타 (b)-락타마제 (BLA) 코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 핵산 구조물은 톡소플라즈마의 게놈에 통합하기에 적합하다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 유도성 자기-파괴 요소는 약물에 반응하여 활성이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약물은 항생제를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 핵산 구조물은 소플라즈마 분비 단백질로부터 상기 약학적 폴리펩티드의 분리를 허용하는 적어도 하나의 프레임 내 절단 부위를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마는 숙주 세포에서 상기 톡소플라즈마의 증식을 촉진시키는 요소가 없다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마는 개체의 CNS로의 목적단백질의 전달에 필요하지 않은 독성 유전자가 없다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸전달효소(CAT), DHFR-TS, BLE, HXGPRT, UPRT, TK, CD, 형광 단백질(GFP, YFP, RFP, mCherry 또는 그 외와 같은) 또는 에피토프 태그(HA, Myc, Ty-1, FLAG 또는 그 외와 같은)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 개체의 중추신경계 내 결함있는 내인성 단백질을 특징으로 하는 병리로 진단된 개체를 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 개체의 중추신경계 내 상기 약학적 폴리펩티드의 투여에 의해 치료가능한 병리로 진단된 개체를 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 면역억제제를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 상기 톡소플라즈마의 투여 전 및/또는 상기 톡소플라즈마의 투여 후 및/또는 상기 톡소플라즈마의 투여와 동시에, 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 상기 톡소플라즈마의 투여 전에 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 상기 톡소플라즈마의 투여 후에 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 상기 톡소플라즈마의 투여와 동시에, 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 상기 내인성 단백질에 상응하는 야생형 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 항체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 항원을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 독소를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 효소, 구조 폴리펩티드, 운동성 폴리펩티드, 조절 폴리펩티드, 저장 폴리펩티드, 신호/리간드 폴리펩티드, 수용체 폴리펩티드, 감각 폴리펩티드, 항체, 단백질 채널 및/또는 수송 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 말초 투여에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 정맥 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 경구 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 중추신경계로의 직접 투여에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍 내인성 단백질은 내인성 단백질의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 적어도 하나의 내인성 단백질의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍 내인성 단백질은 병리가 없는 건강한 개체 내 내인성 단백질의 수준과 비교할 때, 감소된 수준의 내인성 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍 내인성 단백질은 병리로 진단된 개체 내의 내인성 단백질이 없다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 갈락토세레브로시다제(Galactocerebrosidase, GALC)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 갈락토세레브로시다제(GLAC) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4 또는 이소폼 5이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 이소폼 1 또는 MECP2 이소폼 2이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 신경교세포 유도 신경영양 인자(Glial Cell Derived Neurotrophic Factor, GDNF)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 신경교세포 유도 신경영양 인자(GDNF) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4 또는 이소폼 5이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 아스파르토아실라제(Aspartoacylase, ASPA)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 생존 운동 신경원 단백질(Survival Motor Neuron Protien, SMN1)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 생존 운동 신경원 단백질 SMN, 이소폼 SMN-델타5, 이소폼 SMN-델타7 또는 이소폼 SMN-델타57이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 파킨(Parkin, PARK2)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 파킨(PARK2) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4, 이소폼 5, 이소폼 6, 이소폼 7 또는 이소폼 8이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 전사 인자 EB(Transcription Factor EB, TFEB)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 전사 인자 EB(TFEB) 이소폼 1 또는 이소폼 2이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 TALEN(TALE 뉴클레아제)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 TALE TF(TALE 전사 인자)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 크라베 질환으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 레트 증후군으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 카나반 질환으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 척수근위축증으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 파킨슨병으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 저산소/허혈성 또는 신경염증성 CNS 장애로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 알츠하이머병으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 근위축성 측색 경화증으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 헌팅턴병으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 리소좀 축적병으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 개체는 MECP2-중복 증후군으로 진단된 개체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 자기-파괴 요소를 유도할 수 있는 약물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체에 숙주세포 및/또는 신체 내 톡소플라즈마를 지속시키는데 필요한 분자를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마를 지속시키는데 필요한 분자는 항생제이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마를 지속시키는데 필요한 분자는 소분자이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 톡소플라즈마를 지속시키는데 필요한 분자는 대사물질이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예를 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있으나, 예시적인 방법 및/또는 물질을 후술한다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다. 아울러, 물질, 방법 및 실시예는 오로지 예시적인 것이며, 반드시 제한하려는 의도는 없다.
본 발명의 일부 구현예는 첨부된 도면을 참조하여 단지 예시적으로 설명된다. 도면을 상세하게 특정하게 참조하면, 도시된 세부 사항은 예시로서, 그리고 본 발명의 구현예에 대한 설명을 목적으로 한 것이다. 이와 관련하여, 도면과 함께 기재된 설명은 본 발명의 구현예가 실시될 수 있는 방법을 당업자에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 일부 구현예의 임상적 개념의 도식 표현이다. (1) 선택되는 약학적 폴리펩티드 코딩 서열은 톡소플라즈마 곤디 분비가능 폴리펩티드 코팅 서열에 융합된다; (2) 핵산 구조물은 톡소플라즈마로 도입된다; (3) 융합 단백질은 기생충 내에서 발현되고, 기생충의 분비 세포 기관(예로서, 곤봉체)에 위치한다; (4) 기생충은 개체의 CNS로 들어가 병리 부위에 도달한다; (5) 단백질은 개체의 세포로 분비되고 병리학적 표현형을 구출한다.
도 2는 pGRA 백본 기반의 치료용 유전자 이식(transgenic) T. 곤디 주(line)의 발생에 사용되는 구조물의 도식도를 묘사한다. 핵산 구조물은 프레임 내 치료용 폴리펩티드 코딩 서열과 T. 곤디 톡소필린 코딩 서열의 융합, 및 "HA" 태그로 구성된 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함한다. ORF의 상류는 톡소필린 유전자의 내인성 5' UTR(비번역 부위) (프로모터로 작용하는 톡소필린 5'-UTR)이고, ORF의 하류는 풍부한 밀집 과립 단백질 GRA2의 3' UTR (GRA2 3'-UTR)이다. 구조물은 또한, DHFR-TS의 내인성 5' UTR 및 3' UTR 사이에 내포된 HXGPRT 유전자로 구성된 선택 마커 카세트를 포함한다. 또한, 구조물에 선택 항생제 저항을 포함하는 박테리아 발현 카세트가 포함된다.
도 3은 pGRA 백본 기반의 치료용 유전자 이식 T. 곤디 주의 발생에 사용되는 구조물의 도식도를 묘사한다. 핵산 구조물은 프레임 내 치료용 폴리펩티드 코딩 서열과 T. 곤디 톡소필린 코딩 서열의 융합, 및 HA 태그로 구성된 ORF를 포함한다. ORF의 상류는 GRA16 유전자의 내인성 5' UTR(프로모터로 작용하는 GRA16 5'-UTR)이고, ORF의 하류는 풍부한 밀집 과립 단백질 GRA2의 3' UTR (GRA2 3'-UTR)이다. 구조물은 또한, DHFR-TS의 내인성 5' UTR 및 3' UTR 사이에 내포된 HXGPRT 유전자로 구성된 선택 마커 카세트를 포함한다. 또한, 구조물에 선택 항생제 저항을 포함하는 박테리아 발현 카세트가 포함된다.
도 4A 내지 I는 포유류 세포(HFF) 내 신규한 기생충 균주를 묘사한 것으로, 여기서 톡소필린-융합 치료용 단백질 아스파르토아실라제(ASPA), 생존 운동 신경원 단백질(SMN1), 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 및 갈락토세레브로시다제-TAT△43(일반 물질 및 실험 방법 부분에 "변이 GALC-TAT"라고도 함)을 발현하는 기생충 균주가 기생충의 분비 곤봉체 세포 기관에의 특이적 위치를 나타낸다. 도 4A - 곤봉체를 하이라이트한, 세포내 T. 곤디의 도식 구조. 붉은색: 내막 복합체(IMC), 푸른색: DNA(숙주세포 핵 및 T. 곤디 핵), 녹색: 곤봉체 단백질; 도 4B-I - 항-HA 항체(모든 패널에서 초록색)를 이용하여 변이된, 항-IMC1 항체(붉은색) 및 DAPI(푸른색)를 이용하여 내막 복합체 IMC1으로 공-염색된, 또는 세포의 편광 이미지의 상부에 나타낸(흑백), HA-태그 톡소필린-ASPA(도 4B 및 4C), HA-태그 톡소필린-SMN1(도 4D 및 4E), HA-태그 톡소필린-MECP2(도 4F 및 4G) 및 HA-태그 톡소필린-GALC-TAT(도 4H 및 4I)를 내인성으로 발현하는, HFF 세포 상에 성장한 기생충의 형광 현미경 분석. 기생충은 혼합된 집단으로 나타냈지만, 녹색 염색을 보이는 기생충만이 유전자 이식 단백질을 발현한다. 도 4B-I에 나타낸 모든 이미지에서 스케일 바 = 5 μM.
도 5A 내지 I는 포유류 세포(HFF) 내 신규한 기생충 균주를 묘사한 것으로, 여기서 GRA16-융합 치료용 단백질 아스파르토아실라제(ASPA), 생존 운동 신경원 단백질(SMN1) 및 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 발현하는 기생충 균주가 숙주세포 핵 뿐만 아니라 기생충 액포(PV) 공간에의 특이적 위치를 나타낸다. 도 5A - 분비된 밀집 과립 이펙터 단백질의 분포를 하이라이트한, 숙주세포(섬유아세포)의 기생충 액포 내 세포내 T. 곤디 기생충의 도식 표현. 붉은색: 내막 복합체(IMC), 푸른색: DNA(숙주세포 핵 및 T. 곤디 핵), 노란색: 밀집 과립 분비 이펙터 단백질, 주황색: 기생충 액포. 도 5B-I - 항-HA 항체(모든 패널에서 초록색)를 이용하여 변이된, 항-IMC1 항체(붉은색) 및 DAPI(푸른색)를 이용하여 내막 복합체 IMC1으로 공-염색된, 또는 세포의 편광 이미지의 상부에 나타낸, HA-태그 GRA16-ASPA(도 5B 및 5C), HA-태그 GRA16-SMN1(도 5D 및 5E), HA-태그 GRA16-MECP2(100x 확대 도 5B-G 및 40x 확대 도 5H-I)를 내인성으로 발현하는, HFF 세포 상에 성장한 기생충의 형광 현미경 분석. 기생충은 혼합된 집단으로 나타냈지만, 녹색 염색을 보이는 기생충만이 유전자 이식 단백질을 발현한다. 스케일 바 = 5 μM(도 5B-G). 스케일 바 = 20 μM(도 5H-I).
도 6A-B는 "TACGTACG" (서열번호: 4505) 표적 서열의 예로서 설계된, TALE 뉴클레아제(도 6A) 및 TALE 전사 인자(도 6B)의 개략도이다. TALE 반복은 표적 서열 내 뉴클레오티드의 순서에 따라 나타난다. TALE의 본질 때문에, 첫번째 뉴클레오티드는 항상 T이어야만 하며(따라서 TAL N-말단에 통합되고, 주석이 달려있지 않다), 마지막 뉴클레오티드(이 경우 G)는 반-단량체로 나타낸다(따라서 "반 반복(Half repeat)"로 주석을 달았다). 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마에 의해 발현되고 분비되기 위하여, 이들 구조물의 개방형 해독 프레임(ORF)은 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물에 삽입된다. TALE_Nuc(TALE 뉴클레아제)의 경우, ORF는 Fokl 후까지 NLS로부터 유래한다(예를 들어, 서열번호 4506으로 기재된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 2113-4104). TALE-TF(TALE 전사 인자)의 경우, ORF는 EGFP 후 TALE N 말단(N-말단)으로부터 유래한다(예를 들어, 서열번호 4507로 기재된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 2120-5005). "TALE-TF" = TALE 전사 인자; "TALEN" = TALE 뉴클레아제. "NI", "NG", "NN" 및 "HD" = 하기 실시예 5에 기재된 단량체.
도 7은 치료용 유전자 이식 T. 곤디 주의 발생에 사용되는 구조물의 도식도를 묘사한다. 핵산 구조물은 프레임 내 치료용 폴리펩티드 코딩 서열과 T. 곤디 톡소필린 코딩 서열의 융합, 및 "HA" 태그로 구성된 개방형 해독 프레임(ORF)를 포함한다. ORF의 상류는 톡소필린 유전자의 내인성 5' UTR(비번역 부위) ("톡소필린 5'-UTR")이고, ORF의 하류는 풍부한 밀집 과립 단백질 GRA2("GRA2 3-UTR")의 3' UTR이다. 구조물은 또한, DHFR-TS의 내인성 5' UTR 및 3' UTR 사이에 내포된 HXGPRT 유전자, DHFR-TS 유전자 또는 mCherry 유전자로 구성된 선택 마커 카세트를 포함한다. 또한, 구조물에 분자 클로닝에 사용되는 선택 항생제 저항을 포함하는 박테리아 발현 카세트가 포함된다.
도 8은 치료용 유전자 이식 T. 곤디 주의 발생에 사용되는 구조물의 도식도를 묘사한다. 핵산 구조물은 프레임 내 치료용 폴리펩티드 코딩 서열과 T. 곤디 GRA16 코딩 서열의 융합, 및 HA 태그로 구성된 ORF를 포함한다. ORF의 상류는 GRA16 유전자의 내인성 5' UTR(비번역 부위) ("GRA16 5'-UTR")이고, ORF의 하류는 풍부한 밀집 과립 단백질 GRA2("GRA2 3-UTR")의 3' UTR이다. 구조물은 또한, DHFR-TS의 내인성 5' UTR 및 3' UTR 사이에 내포된 HXGPRT 유전자, DHFR-TS 유전자 또는 mCherry 유전자로 구성된 선택 마커 카세트를 포함한다. 또한, 구조물에 분자 클로닝에 사용되는 선택 항생제 저항을 포함하는 박테리아 발현 카세트가 포함된다.
도 9A-N은 포유류 세포(HFF) 내 유전자 이식 기생충 균주를 묘사한 것으로, 여기서 기생충 균주는 12개의 신규한 톡소필린-융합 치료용 단백질을 발현시킨다. 도 9A- 곤봉체를 하이라이트한, 세포내 T. 곤디의 도식 구조. 자홍색: 내막 복합체(IMC), 청록색: DNA(숙주세포 핵 및 T. 곤디 핵), 노란색: 곤봉체 단백질; 도 9B- 곤봉체 마커 ROP2/4로 면역염색한(노란색), HFF 세포에서 성장한 T. 곤디의 대표적인 형광 현미경 이미지. 왼쪽: DAPI(청록색)으로 공-염색, 오른쪽: 세포의 편광 이미지의 상부에 덮어씌움(흑백). 도 9C-N- HA-태그 톡소필린-융합 치료용 단백질을 발현시키는 유전자 이식 기생충의 이미지: 도 9C: 아스파르토아실라제(ASPA), 도 9D- 코돈-최적화된 아스파르토아실라제(ASPAopt), 도 9E- 갈락토세레브로시다제(GALC), 도 9F- 코돈-최적화된 갈락토세레브로시다제(GALCopt), 도 9G- 갈락토세레브로시다제-TAT(GLAC-TAT), 도 9H- 갈락토세레브로시다제-TAT△43(GALC-TAT△43- 일반 물질 및 실험 방법 부분에 "변이 GALC-TAT"라고도 함). 도 9I- 신경아세포 유도 신경영양 인자(GDNF), 도 9J- 메틸-CpG 결합 단백질(SMN1) 및 도 9N- 코돈-최적화된 전사 인자 EB(TFEBopt). 톡소필린-ASPAopt, 톡소필린-GALC-TAT△43, 톡소필린-GDNF, 톡소필린-MeCP2opt, 톡소필린-PARK2, 톡소필린-SMN1 및 톡소필린-TFEB를 발현하는 기생충의 예시적 이미지는 기생충의 분비 곤봉체 세포 기관으로의 위치화를 나타낸다. 톡소필린 융합 단백질은 항-HA 항체를 이용하여 면역염색한다(노란색). 왼쪽: DAPI(청록색) 및 기생충 마커 항-IMC-1(자홍색)으로 공-염색, 오른쪽: 세포의 편광 이미지의 상부에 덮어씌움(흑백). 기생충은 혼합된 집단으로 나타냈지만, 노란색 염색을 보이는 기생충만이 유전자 이식 단백질을 발현한다. 스케일 바 = 5 μM.
도 10A-J는 포유류 세포(HFF) 내 유전자 이식 기생충 균주를 묘사한 것으로, 여기서 기생충 균주는 8개의 신규한 GRA16-융합 치료용 단백질을 발현시킨다. 도 10A- 분비된 밀집 과립 이펙터 단백질의 분포를 하이라이트한, 숙주세포에서 기생충 액포 내 세포내 T. 곤디 기생충의 도식 표현. 자홍색: 내막 복합체(IMC), 청록색: DNA(숙주세포 핵 및 T. 곤디 핵), 노란색: 밀집 과립 분비 이펙터 단백질, 주황색: 기생충 액포; 도 10B- HA-태그 GRA16 단백질을 발현시키고, 항-HA로 면역염색한(노란색), HFF 세포에서 성장한 T. 곤디의 대표적인 형광 현미경 이미지. 왼쪽: DAPI(청록색)으로 공-염색, 오른쪽: 세포의 편광 이미지의 상부에 덮어씌움(흑백). 도 10C-J- HA-태그 GRA16-융합 치료용 단백질을 발현시키는 유전자 이식 기생충의 이미지: 도 10C: 아스파르토아실라제(ASPA), 도 10D- 생존 운동 신경원 단백질(SMN1), 도 10E- 갈락토세레브로시다제(GALC), 도 10F- 갈락토세레브로시다제-TAT(GLAC-TAT), 도 10G- 코돈-최적화된 아스파르토아실라제(ASPAopt), 도 10H- 코돈-최적화된 갈락토세레브로시다제(GALCopt), 도 10I- 코돈-최적화된 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2opt) 및 도 10J- 코돈-최적화된 전사 인자 EB(TFEBopt). GRA16-ASPA, GRA16-SMN1, GRA16-ASPAopt, GRA16-MeCP2opt 및 GRA16-TFEBopt는 기생충 액포로의 위치화를 나타낸다. GRA16-MECP2opt 및 GRA16-TFEBopt는 또한 숙주세포 핵으로의 위치화를 나타낸다. GRA16 융합 단백질은 항-HA 항체를 이용하여 면역염색한다(노란색). 왼쪽: DAPI(청록색) 및 기생충 마커 항-IMC-1(자홍색)으로 공-염색, 오른쪽: 세포의 편광 이미지의 상부에 덮어씌움(흑백). 기생충은 혼합된 집단으로 나타냈지만, 노란색 염색을 보이는 기생충만이 유전자 이식 단백질을 발현한다. 스케일 바 = 5 μM.
도 11A-C- 시간의 흐름에 따른 균주 RH GRA16-HAstop, GRA16-MECP2opt 및 GRA16-TFEBopt의 급분열소체에 의한 HFF 세포의 핵으로의 단백질 전달의 동역학 미 감염의 다양성(MOI). 감염된 세포 및 핵 전달은 GE IN Cell Investigator 소프트웨어(GE 헬스케어, 시카고, IL, USA)를 이용한 자동화된 이미지 분석에 의해 계산하였다. 그래프는 3개의 균주로부터의 결과를 함께 종합하여 나타낸다.
도 12A-C- T. 곤디 균주 RH GRA16-HAstop(도 12A), GRA16-MECP2opt(도 12B) 및 GRA16-TFEBopt(도 12C)의 급분열소체에 의한 감염 16-22시간 후 시험관 내-분화된 LUHMES 인간 신경세포의 대표적 이미지. GRA16 융합 단백질은 항-HA 항체를 이용하여 면역염색하고(노란색), DAPI(청록색) 및 성숙 뉴런 항-NeuN 마커(자홍색)으로 공-염색한다. 각 도면의 왼쪽의 삽입은 항-HA 단독(위, 노란색), 항-HA 및 DAPI(중간, 노란색 및 청록색) 및 항-HA 및 NeuN(아래, 노란색 및 자홍색)으로 가시화한 감염된 세포를 나타낸다. 모든 균주는 인간 뉴런의 핵에 대한 융합 단백질의 명확한 분비 및 표적화를 나타낸다.
도 13A-D- 유전자 이식 주 RH GRA16-MECP2opt의 급분열소체에 의한 감염 12시간 후, P1 새끼 쥐의 피질 및 해마 유래의 면역조직학적으로 염색된 뉴런-풍부 일차 배양물의 대표적인 이미지. GRA16 융합 단백질은 항-HA 항체를 이용하여 면역염색한다(노란색). 도 13A- GRA16-MeCP2 단독(노란색). 13B- DAPI 단독(청록색). 도 13C- GRA16-MeCP2 및 DAPI 염색의 병합. 도 13D- 세포의 편광 이미지의 상부에덮어씌운(흑백), GRA16-MeCP2(노란색), DAPI(청록색) 및 NeuN(자홍색)의 병합. 전달된 GRA16-MeCP2opt는 신경의 핵 내 응축된 이질염색질(heterochromatic) DNA의 영역과 함께 공동-위치화하는 특징적 패턴을 나타내는데, 이는 전달된 MeCP2의 이질염색질(heterochromatin)에의 효과적인 결합을 시사한다.
도 14는 RH GRA16-MeCP2opt 유전자 이식 T. 곤디 균주의 MOI=1로 감염된, MeCP2-특이적 항체로 면역침전되고 블롯팅된, R306C MeCP2-변이 인간 LUHMES 뉴런의 핵 추출물의 웨스턴 블롯이다. 블록은 내인성 변이된 MeCP2 및 T. 곤디-전달 MeCP2와 일치하는 두 개의 밴드를 나타낸다. T. 곤디-전달된 MeCP2는 GRA16에의 융합으로 인해 더 큰 분자량을 가진다.
도 15A-C는 HFF 세포 내 유전자 이식 T. 곤디 균주 Pru GRA16-MECP2opt의, 시험관 내 분화된 느린분열소체의 예시적 이미지를 나타낸다. GRA16 융합 단백질은 항-HA 항체를 이용하여 면역염색한다(붉은색). 도 15A- GRA16-MeCP2 단독. 도 15B- 느린분열소체 낭포-벽 마커 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos Biflorus Agglutinin, DBA) (초록색) 및 DAPI(청록색)으로 공-염색, 낭포를 포함하는 숙주 섬유아세포의 핵 내 HA-염색된(붉은색) GRA16-MeCP2 융합 단백질과 함께, 기생충 낭포를 초록색으로, 숙주 섬유아세포(HFF)의 핵을 푸른색으로 나타냄. 도 15C- DBA로 공-염색하고, 세포의 편광 이미지의 상부에 덮어씌움(흑백). 표시된 낭포는 느린분열소체 단계에서, 연속된 GRA16-MeCP2의 발현, 숙주세포의 핵으로의 융합 단백질의 분비 및 표적화를 나타낸다. 하얀색 화살촉은 느린분열소체 낭포를 포함하는 세포의 핵을 가리키며, 이는 전달된 단백질 GRA16-MeCP2를 포함한다.
본 발명은, 그 일부 구현예에서, 약학적 폴리펩티드에 융합된 톡소플라즈마 분비 단백질의 분비를 위한 핵산 구조물, 및 이를 포함하는 톡소플라즈마, 및, 보다 구체적으로, 배타적인 것은 아니나, 개체를 치료하기 위해 이를 사용한 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용에 있어서 하기 설명에 기재되거나 실시예에 의해 예시된 세부 사항으로 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하고, 또는 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다.
본 발명자들은 이종 폴리펩티드를 코딩하는 유전적 구조물로 형질전환된 톡소플라즈마 기생충이 이종 폴리펩티드를 포유류 세포로 합성하고 전달한다는 것을 밝혀내었다(도 4B-I, 5B-I, 9B-N, 10B-J, 11A-C, 12A-C, 13A-D, 14 및 15A-C 및 하기 실시예 부분). 포유류 세포 내에서, 이종 폴리펩ㅌ티드는 세포 내 활성 영역으로 이동하는데, 여기서 내인성 약학적 단백질의 알려진 기능에 관련된 세포 과정을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 포유류 단백질 MeCP2 및 TFEB를 발현시키고 전달하는, 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ 톡소플라즈마 균주를 생성시키고, 톡소플라즈마 분비 단백질 GRA16에 번역으로 융합시키고, 톡소플라즈마로 생체외 처리된 포유류 세포 내에서 바람직한 세포 위치(핵)로 융합된 치료용 단백질을 분비하여, 개체에의 치료용 폴리펩티드의 특이적 전달 및 개체의 치료를 위한, 구조물, 톡소플라즈마 및 방법의 타당성을 증명하였다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 유도 프로모터, 잠복기-특이적 프로모터, 및 톡소필린 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터로 구성된 군에서 선택된, 핵산 구조물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 톡소플라즈마 내 발현에 적합하다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 Cre-재조합효소 코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 베타 (b)-락타마제(BLA) 코딩 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 톡소플라즈마의 게놈에의 통합에 적합하다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마는 내인성 기능적 CPSII를 포함하는, 숙주세포 내 톡소플라즈마의 증식을 촉진시키는 효소가 없다(예를 들어, 숙주의 면역 체계를 피하는데 중요한 요소, 특정한 대사물질의 생성 또는 이용에 필수적인 요소, 특정한 독소 또는 항생제를 제거하는데 중요한 요소).
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마는 개체의 CNS로의 목적단백질의 전달에 필수적이지 않은 독성 유전자가 없다.
핵산 구조물은 톡소플라즈마 세포 내 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 항시적, 일시적, 규칙적 또는 유도적 방식으로 지시하는 프로모터 서열을 포함한다.
기술한 바와 같이, 이종 폴리뉴클레오티는 톡소플라즈마 내 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
코딩 핵산 서열은 조절 서열이 그에 연결된 코딩 서열에 조절 효과를 미칠 수 있다면, 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 "작동가능하게 연결된"다.
본원에서 사용된, 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 RNA의 전사를 개시하기 위하여 결합한 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 높인 DNA 영역을 말한다. 프로모터는 유전자의 발현의 시기 및 강도, 예를 들어, 유전자가 발현되는 기생충 및/또는 숙주세포의 일생의 단계 또는 상태,를 조절한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 핵산 구조물의 발현에 사용되는 톡소플라즈마에 이종이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 전신발현 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 유도 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 잠복기-특이적 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 톡소필린 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 프로모터는 톡소필린 내인성 프로모터가 아니다. 이는 예상되는 톡소필린 프로모터(예상되는 유전자 ID=TGME49_214080의 프로모터; 서열번호 3689)가 실시예 부분의 일부 실험에서 사용되는 톡소필린 프로모터(서열번호 4482) 및 추가 뉴클레오티드 상류를 포함한다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 프로모터는 서열번호 3689 및/또는 서열번호 4482로 기재된 핵산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 내인성 프로모터는 곤봉체 단백질의 것이 아니다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 GRA2 프로모터, GRA16 프로모터, GRA24 프로모터, SAG1 프로모터, 또는 DHFR 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 GRA2 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 GRA16 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 GRA24 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 SAG1 프로모터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 내인성 프로모터는 DHFR 프로모터이다.
하기 본원의 표 1은 톡소플라즈마 내 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위하여, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물로 클로닝될 수 있는 적합한 내인성 프로모터를 열거한 것이다.
[표1] 적합한 내인성 프로모터
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표 1. 본 발명의 일부 구현예의 구조물과 함께 사용될 수 있는 내인성 프로모터의 비-제한적인 예시를 제공한다. 예상되는 프로모터 서열은 유전자 주변 히스톤 마크 데이터를 기반으로 얻었다.
표 2는 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물로 클로닝될 수 있는 적합한 전신발현 및 유도 프로모터를 열거한 것이다.
[표 2] 전신발현 및 유도 프로모터
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기술한 바와 같이, 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 구 "톡소플라즈마 분비 단백질(Toxoplasma secreted protein)"은 톡소플라즈마에 의해 시험관 내 감염될 때 숙주세포로 분비되기 위하여 충분한 톡소플라즈마 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 단편(아미노산 서열)을 말한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질 또는 그의 기능적 단편은 톡소플라즈마에 의해 생체내 감염될 때 숙주세포로 분비될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 제1 핵산 서열은 톡소플라즈마 분비 단백질의 기능적 단편을 코딩한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 제1 핵산 서열은 톡소플라즈마 분비 단백질의 전장 개방형 해독 프레임(ORF)을 코딩한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마의 곤봉체로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 곤봉체로부터 분비되는 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소필린 및/또는 ROP1을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 곤봉체로부터 분비되는 톡소플라즈마 분비 단백질은 서열번호 344 내지 465로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 비-곤봉체 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 미세간상체 단백질 및 밀집 과립 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마의 밀집 과립으로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 밀집 과립으로부터 분비된 톡소플라즈마 분비 단백질은 GRA16 및/또는 GRA24를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마의 미세간상체로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 미세간상체로부터 분비된 단백질은 서열번호 280 내지 322로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 밀집 과립으로부터 분비된 단백질은 서열번호 234 내지 279로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 분비 단백질은 톡소플라즈마 곤디 대식세포 이동 저해 인자(TgMIF)를 포함한다.
하기 표 3은 단백질이 위치하거나 위치할 것으로 예상되는 세포 기관에 따라 정리된, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물로 클로닝될 수 있는 톡소플라즈마-분비 단백질을 열거한 것이다.
[표3] 톡소플라즈마 단백질
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표 3. "polyn." = 폴리뉴클레오티드; "polyp" = 폴리펩티드.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열은 이종 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 약학적 폴리펩티드와 프레임 내 융합된 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 것)의 개방형 해독 프레임의 상류 및/또는 하류이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 5'-비번역 부위(5'-UTR)는 톡소플라즈마 분비 단백질 개방형 해독 프레임의 상류에 위치한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 3'-비번역 부위(3'-UTR)는 약학적 폴리펩티드와 프레임 내 융합된 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 개방형 해독 프레임의 하류에 위치한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 3'-비번역 부위(3'-UTR) 핵산 서열은 GRA2 3'-UTR, GRA16 3'-UTR, GRA24 3'-UTR, SAG1 3'-UTR 또는 DHFR 3'-UTR이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 5'-비번역 부위(5'-UTR) 핵산 서열은 GRA2 5'-UTR, GRA16 5'-UTR, GRA24 5'-UTR, SAG1 5'-UTR 또는 DHFR 5'-UTR이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열은 톡소필린 3'-UTR이다.
기술한 바와 같이, 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마 분비 단백질의 하류 프레임 내 융합된 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 구 "약학적 폴리펩티드"는 치료 효과, 예를 들어, 이를 필요로 하는 개체의 세포에 도입될 때, 병리를 치료할 수 있는, 폴리펩티드를 말한다.
특정 질환에 대해서, 약학적 폴리펩티드는 개체 내 특정한 기관, 조직, 세포, 세포 구획 또는 세포 위치에 도달할 때 효과적일 수 있다는 점을 알아야 한다. 예를 들어, 신경질환 치료에 있어서, 약학적 조성물은 바람직하게는 신경계, 예를 들어, 뉴런, 교세포(glia) 또는 다른 세포를 표적화한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 특정한 질환에 있어서, 약학적 폴리펩티드는 약학적 조성물의 표적이 세포 핵 내에 위치한(배치된) 경우, 세포 핵과 같은, 특정한 세포 위치에 도달하여야 한다. 예를 들어, MECP2의 경우, 활성 단백질은 핵 내 DNA에 결합하고 유전자 발현을 조절한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 톡소플라즈마 분비 단백질로부터 약학적 폴리펩티드를 분리할 수 있는, 적어도 하나의 프레임 내 절단 부위를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 내인성 단백질에 상응하는 야생형 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 항체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 항원을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 병리를 치료할 수 있는 독소를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 효소, 구조 폴리펩티드, 운동성 폴리펩티드, 조절 폴리펩티드, 저장 폴리펩티드, 신호/리간드 폴리펩티드, 수용체 폴리펩티드, 감각 폴리펩티드, 항체, 단백질 채널 및/또는 수송 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 갈락토세레브로시다제(GALC)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 갈락토세레브로시다제(GALC) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4 또는 이소폼 5이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 이소폼 1 또는 이소폼 2이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 신경아세포 유래 신경영양 인자(GDNF)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 폴리펩티드는 신경아세포 유래 신경영양 인자(GDNF) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4 또는 이소폼 5이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 아스파르토아실라제(Aspartoacylase, ASPA)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 생존 운동 신경원 단백질(Survival Motor Neuron Protien, SMN1)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 생존 운동 신경원 단백질 SMN, 이소폼 SMN-델타5, 이소폼 SMN-델타7 또는 이소폼 SMN-델타57이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 파킨(Parkin, PARK2)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 파킨(PARK2) 이소폼 1, 이소폼 2, 이소폼 3, 이소폼 4, 이소폼 5, 이소폼 6, 이소폼 7 또는 이소폼 8이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 전사 인자 EB(Transcription Factor EB, TFEB)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 전사 인자 EB(TFEB) 이소폼 1 또는 이소폼 2이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 TALEN(TALE 뉴클레아제)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 약학적 폴리펩티드는 TALE TF(TALE 전사 인자)이다.
본원에서 하기 표 4는 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마에 의해 개체로 분비될 수 있는 예시적 치료용 단백질을 열거한 것이다.
[표4] 전형적 의약 단백질
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본원에 기재된 임의의 서열(예를 들어, 톡소플라즈마 분비 단백질 및/또는 치료용 폴리펩티드)은 표적 세포(예를 들어, 톡소플라즈마) 내 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다는 것을 알아야 한다. 이러한 서열 변형의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 관심 표적 세포 종에서 전형적으로 발견되는 것에 보다 근접하게 접그하도록 변화된 G/C 함량, 및 일반적으로 코돈 최적화로 불리는, 표적 세포 종에서 이례적으로 발견된 코돈의 제거를 포함한다.
구 "코돈 최적화"는 관심 표적 세포 내 코돈 사용량에 접근하는 이의 구조 유전자 또는 단편 내 사용을 위한 적절한 DNA 뉴클레오티드의 선택을 말한다. 그러므로, 최적화된 유전자 또는 핵산 서열은 표적 세포에서 통계학적으로-바람직한 또는 통계학적으로-선호되는 코돈을 사용하기 위하여, 자연 또는 자연적으로 발생된 유전자의 뉴클레오티드 서열이 변형된 유전자를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 DNA 수준에서 검사되고, 표적 세포 종에서의 발현을 위해 최적화된 코딩 영역은 임의의 적합한 과정을 이용하여 확인된다. 이러한 방법에서, 코돈 사용량의 표준 편차, 코돈 사용량 바이어스의 측정은 고도로 발현된 표적 세포 유전자와 관련된 자연 유전자의 각 코돈의 사용량의 제곱 비례 편차를 찾아내어, 평균 제곱 편차를 계산함으로써 계산될 수 있다. 사용된 식: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, 여기서, Xn은 고도로 발현된 표적 세포 유전자 내 코돈 n의 사용량의 빈도를 말하고, 여기서 Yn은 관심 유전자 내 코돈 n의 사용량의 빈도를 말하며, N은 관심 유전자 내 코돈의 총수를 말한다.
특별한 표적 세포 유형에 대한 바람직한 코돈 사용량에 일치하는 핵산 서열을 최적화하는 하나의 방법은 세계적인 DNA 서열 데이터베이스: 2000년 상황,으로부터 표로 만들어진 코돈 사용량을 통한 코돈 사용량 데이터베이스(Codon Usage Database)에서 온라인상 제공되는 것과 같은 코돈 최적화 테이블의, 추가의 통계학적 계산의 수행 없이, 직접적인 사용에 근거한 것이다. Y Nakamura, T Gojobori, T Ikemura - Nucleic acids research, 2000 - Oxford Univ Press. 코돈 사용량 데이터베이스는 젠뱅크(Genbank)에 존재하는 데이터를 근거로 통계학적으로 결정된 각 코돈 사용량 표와 함께, 다수의 상이한 종에 대한 코돈 사용량 표를 포함한다.
특별한 종(예를 들어, 톡소플라즈마 곤디) 내 각 아미노산에 대한 가장 바람직한 또는 가장 선호하는 코돈을 확인하기 위하여 상기 표를 사용하여, 목적단백질을 코딩하는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드 서열을 특별한 표적 세포 종에 대하여 코돈 최적화할 수 있다. 이는 특별한 종 게놈에서 통계적으로 낮은 발생빈도를 갖는 코돈을, 통계적으로 더 선호되는 아미노산과 관련된 상응하는 코돈으로 대체함으로써 이루어진다. 그러나, 하나 이상의 덜 선호되는 코돈은 존재하는 제한 부위를 제거하기 위하여, 잠재적으로 유용한 접합부(신호 펩티드 또는 종결 카세트를 추가하는 5' 및 3' 말단, 적절한 전장 서열을 생성하는 것과 함께 세그먼트를 절단하고 붙이는데 사용되는 내부 부위)에서 새로운 것들을 만들기 위하여, 또는 mRNA 안정성 또는 발현에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제거하기 위하여, 선택될 수 있다.
자연적으로 발생한 코딩 뉴클레오티드 서열은 이미, 임의의 변형 전에, 특별한 표적 세포 종 내 통계적으로-선호되는 코돈에 상응하는 다수의 코돈을 포함한다. 그러므로, 자연적 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 자연적 뉴클레오티드 서열 내 어떠한 코돈이 특별한 표적 세포와 관련하여 통계적으로-선호되지 않는지를 결정하고, 코돈 최적화된 유도체를 생성하기 위하여 특별한 표적 세포의 코돈 사용량 표에 부합되게 이들 코돈을 변형하는 것을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질이 상응하는 자연적으로 발생하거나 자연적 유전자에 의해 코딩된 단백질 보다 더 높은 수준에서 생성된다면, 변형된 뉴클레오티드 서열은 표적 세포 코돈 사용량에 대하여 완전히 또는 부분적으로 최적화될 수 있다. 추가적으로 또는 대체적으로, 코돈 최적화된/사용량 서열은 상응하는 자연적으로 발생하거나 자연적 유전자에 의해 코딩된 단백질 보다 더 잘 접힌다. 추가적으로 또는 대체적으로, 코돈 최적화된/사용량 서열은 상응하는 자연적으로 발생하거나 자연적 유전자 보다 표적 세포 기관에 더 잘 표적화된다. 추가적으로 또는 대체적으로, 코돈 최적화된/사용량 서열은 상응하는 자연적으로 발생하거나 또는 자연적 유전자에 의해 코딩된 단백질 보다 덜 분해된다.
예를 들어, 하기 표 5의 톡소플라즈마 코돈 사용량이 사용될 수 있다.
[표 5]
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본 발명의 일부 구현예에 따르면, 이종 폴리뉴클레오티드는 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸전달효소(CAT), DHFR-TS, BLE, HXGPRT, UPRT, TK, CD, 형광 단백질(GFP, YFP, RFP, mCherry 또는 그 외와 같은) 또는 에피토프 태그(HA, Myc, Ty-1, FLAG 또는 그 외와 같은)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 선택 마커는 HXGPRT를 포함한다.
HXGPRT 활성이 결핍된 톡소플라즈마 급분열소체는 6-티오잔틴(6-TX)의 존재 시 선택될 수 있는 반면, HXGPRT 활성을 발현시키는 균주는 마이코페놀릭산(MPA) 및/또는 잔틴에서 선택될 수 있다(Pfefferkorn and Borotz, 1994, Pfefferkorn E. R., Borotz S. (1994) Exp. Parasitol. 79, 374-382).
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸전달효소(CAT) (클로람페니콜을 사용하는 양성 선택용), DHFR-TS(피리메타민을 이용한 양성 선택용), HXGPRT(마이코페놀릭산+잔틴을 이용한 양성 선택 또는 6-티오잔틴을 사용한 음성 선택용), UPRT(5'-플루오-2'-데옥시유리딘을 사용한 음성 선택용), TK(간시클로비르를 이용한 양성 선택용), CD(5-플루오로시토신을 이용한 양성 선택용), 형광 단백질(GFP, YFP, RFP, mCherry 또는 그 외와 같은) 또는 에피토프 태그(HA, Myc, Ty-1, FLAG 또는 그 외와 같은)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 핵산 구조물은 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 유도성 자기-파괴 요소는 치료용 카세트와 동일한 프레임 내에 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 유도성 자기-파괴 요소는 상이한 조절 요소에 의해 조절된, 별개의 해독 프레임 내에 있다. 예를 들어, 치료용 카세트는 잠복기 프로모터에 의해 유도될 수 있는 반면, 자기-파괴 카세트는 약물-유도 프롬모터에 의해 유도될 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 유도성 자기-파괴 요소는 약물에 반응하여 활성이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약물은 항생제를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열은 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 핵산 구조물 내에 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열은 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물과 별개의 핵산 구조물 내에 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마 비번역 부위(UTR) 핵산 서열은 선택 마커 및/또는 자기-파괴 요소의 개방형 해독 프레임의 상류 및/또는 하류이다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 적어도 2개의 핵산 구조물을 포함하는 핵산 구조물 시스템으로서, 상기 적어도 2개의 핵산 구조물의 제1 핵산 구조물은 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물이고, 상기 적어도 2개의 핵산 구조물의 제2 핵산 구조물은 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
전형적인 클로닝 벡터는 또한 전사 및 번역 개시 서열, 전사 및 번역 종결체 및 아데닐산중합반응 신호를 포함한다.
하기는 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물을 생성하기 위한 백본으로 사용될 수 있는 톡소플라즈마 핵산 구조물의 비-제한적인 리스트이다: pGRA, pUPRT, pROP1, pTUB1, pTUB8, pLIC, pTOXO, pMIC2, pHX, pCAT, pDHFR,　pBlueScript, pTetO7SAG1, pTetO7SAG4, pSAG1, pSAG4, pHTU, pTKO, pLoxP-DHFR, pminCAT/HXGPRT+, pminCAT/HXGPRT-, pDHFR-TSc3/M3, pDHFR-TSc3/M2M3, pminiHXGPRT, 및 pUC19. 이들 벡터는 비영리 플라스미드 저장소 "애드진(addgene)"; NIH AIDS Reagent Program; Agilent Technologies; NEB; Thermo Fisher Scientific; Sigma Aldrich; GenScript; 및 MoBiTec GmbH과 같은, 다양한 출처로부터 얻을 수 있다.
본원에서 하기 표 6은 비-제한적인 예시적 벡터 및 카탈로그 번호를 제공한다.
[표 6] 벡터 백본
Figure 112019005676468-pct00212
Figure 112019005676468-pct00213
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물 또는 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물 시스템으로 형질전환된 톡소플라즈마가 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "톡소플라즈마"는 세포내, 기생충 원생동물 톡소플라즈마 곤디를 말한다.
본 발명의 일부 구현예의 구조물 및 방법에 사용될 수 있는 톡소플라즈마 곤디 균주의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다:
(i) 유형 Ⅰ- 제한되는 것은 아니나, GT1, RH, ENT, VEL, TgCatCo1 및 CAST를 포함.
(ii) 유형 Ⅱ- 제한되는 것은 아니나, ME49, Beverly, PDS, PLK, PTG, DEG, PIH, TgNmBr1 및 PRU를 포함.
(iii) 유형 Ⅲ- 제한되는 것은 아니나, VEG, C56, CTG, CEP, TgGoatUS4 및 STRL를 포함.
(iv) 유형 Ⅳ- 제한되는 것은 아니나, TgCTPrC3, TgBbUS1, TgRabbitBr1 및 TgPigUS15를 포함.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마는 약독화되지 않는다.
종래 기술에서와 같이, 용어 "약독화된(attenuated)"은 비-유전적으로 변형된 자연(야생형) T. 곤디와 비교할 때 약화되고/거나 덜 활발한 T. 곤디 균주를 말한다. 대개, T. 곤디의 약독화된 변이체는 면역 반응을 자극하고 면역력을 생성할 수 있으나, 병을 유발하지는 않는다. 약독화는 제한되는 것은 아니나, γ-조사 또는 피리미딘 영양요구체 생성을 포함하는 종래 방법들에 의해 이루어질 수 있다.
약독화된 톡소플라즈마의 비-제한적인 예는 US 20120045477 A1 및 US 8673289 B2에 설명되어 있고, 이는 본원에 참고로서 완전히 원용된다.
T. 곤디 복제가 감염의 급성 단계에서 신체에 전파하고 원위 조직에 도달하기 위한 능력, 감염된 세포 내 지속되는 능력 및 숙주 내 만성 낭포를 형성하는 능력에 있어서 필수적이라는 것을 알아야 한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 약독화된 톡소플라즈마의 증식 속도와 비교하여 더 높은 증식 속도로 특징지어진다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 영양 요구체가 아니다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 피리미딘의 데-노보(de-novo) 생합성에 적합한 기능적 내인성 경로를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 느린분열소체 단계로 분화할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 RNA 합성 및/또는 DNA 복제할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 RNA 합성할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 RNA 복제할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 내인성 기능적 카르바모일 인산 합성효소 II (CPSII) 효소(US8673289에 설명된 것과 같음), 예를 들어, 서열번호 4612 내지 4617 중 임의로 제공되는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 구조물 및 톡소플라즈마는 개체 내로, 예를 들어, 새체의 특정한 조직 또는 세포 유형으로, 목적단백질을 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 개체의 목적조직(tissue-of-interest)에 목적단백질을 투여하는 방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마, 또는 본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물을 투여하여, 개체의 목적조직에 목적단백질을 투여하는 것을 포함한다.
목적조직의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 중추신경계, 근육, 안구 부분, 혈액, 림프절, 지라, 백혈구, 소화계 및 점막 고유판을 포함한다.
톡소플라즈마는 혈뇌를 가로지를 수 있기 때문에, 이를 필요로 하는 개체의 중추신경계에 목적단백질을 전달할 수 있다는 것을 알아야 한다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 개체의 중추신경계에 목적단백질을 투여하는 방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마 또는 본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물을 개체에 투여하여, 목적단백질을 개체의 중추신경계에 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마는 새체를 치료할수 있는 목적단백질(예를 들어, 치료용 폴리펩티드)를 전달하여, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마 또는 본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물을 개체의 중추신경계 내 약학적 폴리펩티드의 투여에 의해 치료가능한 병리로 진단된 개체에 투여하여, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 톡소플라즈마를 개체에 투여하여, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는 것으로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 개체는 개체의 중추신경계에 약학적 폴리펩티드를 투여하여 치료가능한 병리로 진단된, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
용어 "치료(treating)"는 병리(질병, 장애 또는 상태)의 발달을 억제, 예방또는 저지하고/하거나 병리의 감소, 차도 또는 퇴보를 유발하는 것을 말한다. 당업자는 다양한 방법론 및 분석을 병리의 발달을 평가하기 위해 사용할 수 있고, 마찬가지로, 다양한 방법론 및 분석을 병리의 감소, 차도 또는 퇴보를 평가하기 위해 사용할 수 있음을 이해할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "예방(preventing)"은 질병의 위험에 있으나, 아직 질병에 걸린 것으로 진단받지 않은 개체에서의 질병, 질환 또는 상태를 발생으로부터 유지시키는 것을 말한다.
본원에서 사용된, 용어 "개체(subject)"는 포유류, 바람직하게는 병리를 겪고 있는 임의의 나이의 인간을 포함한다. 바람직하게는, 이 용어는 병리를 발달시킬 위험에 있는 개인을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 개체의 중추신경계 내 결핍된 내인성 단백질에 의해 특징지어진 병리로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍된 내인성 단백질은 내인성 단백질의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 내인성 단백질의 적어도 하나의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍된 내인성 단백질은 병리가 없는 건강한 개체 내 내인성 단백질의 수준과 비교하여, 감소된 수준의 내인성 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 결핍된 내인성 단백질은 병리로 진단된 개체에서 내인성 단백질이 없다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 크라베 질환으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 레트 증후군으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 카나반 질환으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 척수근위축증으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 파킨슨병으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 저산소/허혈성 또는 신경염증성 CNS 장애로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 알츠하이머병으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 근위축성 측색 경화증으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 헌팅턴병으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 리소좀 축적병으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 MECP2-중복 증후군으로 진단된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체는 타협(compromised) 면역 체계를 가지지 않는다. 타협 면역 체계를 가지는 개체의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, AIDS 환자, 화학요법을 받은 개체, 세포, 조직 및/또는 기관 이식과 같은 면역억제 약물을 받은 개체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 자기-파괴 요소를 유도할 수 있는 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 숙주세포 및/또는 신체 내 톡소플라즈마를 지속시키기 위해 필수적인 분자를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마를 지속시키기 위해 필수적인 분자는 항생제이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마를 지속시키기 위해 필수적인 분자는 소분자(small-molecule)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 톡소플라즈마를 지속시키기 위해 필수적인 분자는 대사물질이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 개체에 톡소플라즈마의 투여 전 및/또는 톡소플라즈마의 투여 후 및/또는 톡소플라즈마의 투여와 동시에, 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 개체에 톡소플라즈마의 투여 전에 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 개체에 톡소플라즈마의 투여 후 (또는 이어서) 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 방법은 개체에 톡소플라즈마의 투여와 동시에 면역억제 약물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 말초 투여에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 정맥내 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 경구 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 복강내 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 말초 투여는 근육내 투여를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 에어로졸에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 투여는 중추신경계 또는 그에 근접한 조직에의 직접 투여에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 방법, 예를 들어, 톡소플라즈마 및/또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 의해 치료되는 질환은 위에 표 7에 열거된 질환 중 임의의 것이다.
표 7은 본 발명의 일부 구현예의 치료용 폴리펩티드의 투여에 의해 치료될 수 있는, 내인성 단백질의 결핍된 또는 비정상적인 발현 또는 기능과 관련된 비-제한적인 질환들을 열거한 것이다.
[표 7]
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본 발명의 일부 구현예에 따르면, 질환(병리)은 암이 아니다.
본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물, 핵산 구조물 시스템, 또는 핵산 구조물 또는 핵산 구조물 시스템에 의해 형질전환된 톡소플라즈마는 개체에 그 자체로, 적합한 담체 또는 부형제와 혼합된 약학적 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 일 측면에 따르면, 본 발명의 일부 구현예의 톡소플라즈마를 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 조성물은 본원에서 설명된 병리 중 임의의 것으로 진단된 개체를 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 개체의 중추신경계에 결핍된 내인성 단백질에 의해 특징지어진 병리로 진단된 개체를 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 소어물은 개체의 중추신경계 내 약학적 폴리펩티드의 투여에 의해 치료가능한 병리로 진단된 개체를 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 약학적 조성물은 면역억제제를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 "약학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분들과, 본원에서 설명된 하나 이상의 활성 성분의 제제를 말한다. 약학적 조성물의 목적은 화합물의 개체로의 투여를 촉진하는 것이다.
본원의 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과에 책임이 있는 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물, 핵산 구조물 시스템, 핵산 구조물 또는 핵산 구조물 시스템에 의해 형질전환된 톡소플라즈마를 말한다.
이하, 상호교환적으로 사용될 수 있는, 구 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"는 개체에 유효한 자극(irritation)을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는, 담체 또는 희석제를 말한다. 아쥬번트는 이러한 구에 포함된다.
본원에서 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위한 약학적 조성물에 첨가되는 비활성 물질을 말한다. 제한 없이, 부형제의 예는, 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜 타입을 포함한다.
약물의 제형 및 투여 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 참고로서 통합된다.
투여의 적절한 방법은, 예를 들어, 경구, 직장, 점막경유, 특히 경비, 장, 또는 척수강내, 직접 심실내, 심장내 뿐만 아니라 근육내, 피하 및 척수내 주사를 포함하는 비경구 전달, 예를 들어, 오른쪽 또는 왼쪽 심실 공동, 공통 관상동맥, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 포함한다.
중추신경계(CNS)로의 약물 전달을 위한 종래 접근법은 다음을 포함한다: 신경외과적 전략(예를 들어, 대뇌내 주사 또는 뇌실내 투입); BBB의 내인성 수송 경로 중 하나를 이용하려는 시도에서, 제제의 분자적 조작(예를 들어, 그 자체가 BBB를 가로지를 수 없는 제제와의 조합으로, 내피세포 표면 분자에 대한 친화도를 가지는 수송 단백질을 포함하는 키메라 융합 단백질의 생산); 제제의 지질 용해도를 증가시키기 위해 설계된 약리학적 전략(예를 들어, 지질 또는 콜레스테롤 담체에의 수용성 제제의 접합); 및 고삼투압 분열에 의한 BBB의 완전성의 일시적인 파괴(경동맥으로 만니톨 용액의 투입 또는 안지오텐신 펩티드와 같은 생물학적 활성 제제의 사용에서 기원).
대체적으로, 하나는 전신이 아닌, 국소로, 예를 들어, 환자의 조직 영역으로 약학적 조성물의 직접적 주사를 통해, 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
용어 "조직"은 하나의 기능 또는 기능들을 수행하기 위해 설계된 세포로 구성된 유기체를 말한다. 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌 조직, 망막, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 뼈, 연골, 연결 조직, 혈액 조직, 근육 조직, 심장 조직, 혈관 조직, 신장 조직, 폐 조직, 생식선 조직, 조혈 조직을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물은 당업계에 잘 알려진 공정에 의해, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 배양, 과립화, 드라제(dragee)-생산, 분말화(levigating), 유화, 캡슐화, 포괄(entrapping) 또는 동결건조 공정에 의해 만들어질 수 있다.
따라서 본 발명의 일부 구현에에 부합되게 사용되는 약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성 성분의 조작을 촉진시키는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용한 종래 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 방식에 의존적이다.
주사용으로, 약학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크(Hank's) 용액, 링거(Ringer's) 용액, 또는 생리식염수와 같은 생리학적으로 호환가능한 버퍼로 제형화된다. 점막경유 투여용으로, 침투될 장벽에 적절한 침투물이 제형에 사용된다. 이러한 침투물은 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
경구투여용으로, 약학적 조성물은 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 활성 화합물을 결합하여 미리 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 약학적 조성물을 환자에 의한 경구 섭취를 위해, 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 식품, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화되게 할 수 있다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고체 부형제를 사용하여, 정제 또는 드라제 중심(core)을 얻기 위하여, 바람직한 경우 적합한 보조제를 추가한 후, 선택적으로 결과 혼합물을 갈고, 과립 혼합물을 조작하여 만들어질 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류와 같은 필러; 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 카르보메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리딘(PVP)와 같은 생리학적으로 허용가능한 고분자이다. 바람직할 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
드라제 중심은 적합한 코팅으로 제공된다. 이러한 목적을 위해, 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄, 라커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 포함하는, 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료를 식별 또는 활성 화합물 투여량의 상이한 조합을 특징짓기 위하여, 정제 또는 드라제 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약학적 조성물은 글리세롤 또는 소르비톨과 같은, 젤라틴 및 가소제로 구성된 부드러운, 밀봉된 캡슐 뿐만 아니라, 젤라틴으로 구성된 밀어-맞춘(push-fit) 캡슐을 포함한다. 밀어-맞춘 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 전분과 같은 바인더, 활석 또는 스테아르산염 마그네슘과 같은 윤활제 및, 선택적으로 안정제를 포함한다. 부드러운 캡슐에서, 활성 성분은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에서 용해되거나 부유될 수 있다. 게다가, 안정제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용 모든 제형은 선택된 투여 방식에 적합한 투여량이어야만 한다.
구강(buccal) 투여용으로, 조성물은 종래 방식으로 제형화된 정제 또는 마름모(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.
비강 흡입에 의한 투여용으로, 본 발명의 일부 구현예에 따른 사용을 위한 활성 성분은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소의 사용과 함께 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 방식의 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위가 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 확인될 수 있다. 디스펜서에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 포함하여 제형화될 수 있다.
본원에서 설명된 약학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 식괴(bolus) 주사 또는 연속 투입용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여량 형태, 예를 들어, 선택적으로, 첨가된 보존제와 함께, 앰플 또는 다중투여 용기일 수 있다. 조성물은 기름기있는 또는 수용성 운반체 내 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁, 안정화 및/또는 분산 제제와 같은 제형화 제제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 약학적 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 성분의 현탁액은 적절한 기름기있는 또는 물 기반 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반체는 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레산염, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수용성 주사 현탁액은 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 또는 텍스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는, 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농축액의 제제를 허용하는 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 포함할 수 있다.
대체적으로, 활성 성분은 사용 전에, 적합한 운반체, 예를 들어, 멸균의, 발열물질이 없는 물 기반 용액으로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 약학적 조성물은 또한 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 베이스를 사용하여, 좌약 또는 정체관장과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 맥락에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분이 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 포함된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료적으로 유효한 양은 장애(개체의 중추신경계에 영향을 미치는 장애)의 증상을 막고, 경감하고 또는 개선하거나, 치료되는 개체의 생존을 연장시키기에 유효한 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 일부 구현예의 핵산 구조물, 핵산 구조물 시스템, 또는 핵산 구조물 또는 핵산 구조물 시스템으로 형질전환된 톡소플라즈마)의 양을 의미한다.
치료적으로 유효한 양의 결정은 특히 본원에서 제공된 상세한 설명에 비추어, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 임의의 제제에 있어서, 치료적으로 유효한 양 또는 투여량은 시험관내 분석, 생체외 분석, 세포 배양 분석, 및/또는 동물 모델로부터 처음 추정될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 바람직한 농도 또는 역가를 달성하기 위하여 동물 모델에서 만들어질 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 투여량을 보다 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관내, 세포 배양물 내 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 시험관 내 및 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용을 위한 투여량의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 투여량은 이용된 투여 형태 및 활용된 투여 방식에 따라 다양할 수 있다. 정확한 제형, 투여 방식 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1 참조).
투여량 및 간격은 생물학적 효과를 유도하거나 억제하기에 충분한 활성 성분의 조직 수준(예를 들어, 뇌 수준)을 제공하여 개별적으로 조정될 수 있다(최소유효량, MEC). MEC는 각 제제에 대하여 다양하나, 시험관 내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC에 도달하는데 필수적인 투여량은 개별 특징 및 투여 방식에 의존할 것이다. 검출 분석은 혈장, 조직 또는 CSF(cerebro-spinal fluid) 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
처리될 조건의 심각성 및 민감성에 따라, 투여는 며칠에서 몇주간 또는 예를 들어, 만성 질환의 경우 평생, 또는 치료에 효과가 있을 때까지, 또는 질병 상태의 축소가 달성될 때까지, 지속되는 치료 과정으로, 단일 또는 다수의 투여일 수 있다.
예를 들어, 만성 질환의 경우, 투여는 증상이 관리되고, 안정화되고, 및/또는 개선될 때까지 조절될 수 있다.
투여될 조성물의 양은, 물론, 치료받는 개체, 고통의 심각성, 투여 방식, 개체의 면역 상태, 처방하는 의사의 판단, 등에 의존적일 것이다.
본 발명의 일부 구현예의 조성물은, 바람직하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여량 형탸를 포함하는, FDA 승인 키드와 같은, 팩 또는 디스펜서 장치로 주어질 수 있다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은, 금속 또는 플라스틱 포일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명에 동봉될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 의걍품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태로 용기와 관련된 주의 사항에 의해 맞춰질 수 있는데, 주의 사항은 조성물 또는 인간 또는 수의학 투여의 형태의 기관에 의한 승인을 반영하는 것이다. 이러한 주의 사항은, 예를 들어, 처방약으로 미국 식품 의약국의 승인을 받아 표지된 것 또는 승인된 제품 삽입물의 것일 수 있다. 호환가능한 약학적 담체에서 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 상기 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 제조되고, 적절한 용기에 담기고, 지시된 조건의 치료를 위해 표지될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 ±10%를 말한다.
용어 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함한다(includes)", "포함하는(including)", "가지는(having)" 및 이의 활용형태들은 "포함하나 제한되는 것은 아닌"을 의미한다.
용어 "구성된"은 "포함하고 제한되는"을 의미한다.
용어 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 조성물, 방법 또는 구조물이 추가적인 성분, 단계 및/또는 부분을 포함하나, 추가적인 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 청구항, 방법 또는 구조물의 기본적이고 신규한 특성을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에 한한다.
본원에서 사용된, 단수 형태 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 명확히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상도 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 그 혼합물을 포함하여, 복수의 화합물들을 포함할 것이다.
본원에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예가 범위 형식으로 제공될 수 있다. 범위 형식에서의 설명은 단지 편의 및 간결을 위한 것임을 이해하여야만 하며, 본 발명의 범위가 융통성없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해하여야만 한다. 따라서, 범위의 설명은 범위 내의 개별적인 수치 뿐만 아니라 모든 가능한 하위 범위를 개시한 것으로 간주되어야만 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6과 같은 범위 내의 개별적인 수치 뿐만 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위를 개시한 것으로 간주되어야만 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에서 수치 범위가 지시될 때마다, 지시된 범위 내 임의의 인용된 수치(분수 또는 정수)를 포함한다는 의미이다. 구, 제1 지시 숫자와 제2 지시 숫자 "사이의 범위에 이르는/범위(ranging/ranges between)" 및 제1 지시 숫자 "부터의 범위에 이르는/범위(ranging/ranges from)" 제2 지시 숫자"까지(to)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 제1 및 제2 지시 숫자 및 그 사이의 모든 소수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "방법"은 이에 제한되는 것은 아니나, 알려져 있는 방식, 수단, 기술 및 과정, 또는 알려진 방식, 수단, 기술 및 과정으로부터 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야 전문가에 의해 용이하게 개발된 것을 포함하는, 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 과정을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "치료(treating)"는 상태의 진행을 없애거나, 실질적으로 억제하거나, 느리게 하거나 역전시키는 것, 상태의 임상적 또는 미적 증상을 실질적으로 개선하는 것, 또는 상태의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 막는 것을 포함한다.
특정한 서열 목록이 참조될 때, 이러한 참조는 또한, 이러한 변이의 빈도가 50 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로, 100 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로, 200 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로 500 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로 1000 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로 5,000 뉴클레오티드에서 1 미만, 대체적으로 10,000 뉴클레오티드에서 1 미만이라면, 예를 들어, 대립 유전자 변이, 서열화 오류, 클로닝 오류 또는 염기 치환을 야기하는 다른 변화의 원인이 되는 경미한 서열 변이, 염기 결실 또는 염기 첨가를 포함하는, 그의 상보적 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
명확성을 위해 개별 구현예의 문맥으로 설명된 본 발명의 특정한 특징들은 단일의 구현예로 조합되어 제공될 수도 있음을 이해할 것이다. 반대로, 간결성을 위해 단일의 구현예의 문맥으로 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구현에에 적합하게도 제공될 수 있다. 구현예가 이들 요소들 없이 동작하지 않는 것이 아닌 한, 다양한 구현예의 문맥에서 설명된 특정한 특징들은 구현예의 필수적인 특징으로 간주되어서는 안된다.
상술한 바 및 하기 청구범위 부분에 청구한 바와 같이 본 발명의 다양한 구현예 및 측면은 하기 실시예에서 실험적인 지지를 발견한다.
실시예
상술한 설명과 함께 비제한적으로 본 발명의 일부 구현예를 설명하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 사용된 실험 과정은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술들은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980) 참조; 이용가능한 면역분석은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기재되어 있다, 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) 참조; 이들 모두는 본원에서 완전히 설명된 것처럼 참고로서 포함된다. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan - Perspectives and methods. LM Weiss, K Kim, 2011. 다른 일반적인 참고는 이 문헌을 통해 제공된다. 그 안의 과정은 당업계에 잘 알려진 것으로 생각되며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 그 안에 포함된 모든 정보는 본원에 참조로서 통합된다.
일반 물질 및 실험 방법
톡소플라즈마 곤디 배양물
기생충을 2 mM L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신 또는 젠타마이신 항생제 믹스 및 10% 소태아혈청(FBS)로 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 내 인간 포피 섬유아세포(HFF)에서 성장시켜, "완전 DMEM 배지"로 나타내었다. 배양물을 매일 모니터하고, 용해된 접시의 상청액 한 방울 또는 주사기에서 방출된 세포내 기생충 한 방울을 HFF가 있는 신선한 접시에 옮겨, 기생충을 계대시켰다.
목적 약학적 폴리펩티드(pharmaceutical polypeptide-of-interest)에 융합된 톡소플라즈마 분비 단백질을 구성하는 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 T. 곤디 발현 벡터의 생성
특정한 치료용 단백질을 발현시키는 T. 곤디의 안정한 유전자 이식 주를 생성시키기 위하여, 본 발명자들은 우선 분자 클로닝에 의해 T. 곤디 발현 구조물을 생성하였다. 구조물은 긴 개방형 해독 프레임(ORF)을 포함하는데, 이는 톡소필린 cDNA [서열번호 4481] 또는 GRA16 cDNA [서열번호 4472]에 이어지는 HA 태그 코딩 서열(서열번호 4474)에 이어지는, 쥐 MeCP2 이소폼 1 [서열번호 4476]; 인간 ASPA [서열번호 4483], 인간 SMN1 [서열번호 4479]; 인간 PARK2 [서열번호 4478]; 인간 GDNF [서열번호 4489]; 인간 TFEB (전사 인자 EB) 이소폼 1 [서열번호 4600] 서열; 인간 GALC 이소폼 1 [서열번호 4486 또는 서열번호 4601 (GALC version 2); 글리신 유연 링커(Glycine flexible linker, Gly)를 포함하는 GALC-TAT [서열번호 4490]에 이어지는 숙주세포의 리소좀에 GALC를 표적화하는 것을 돕기 위해 막을 가로지른 비고전적 운행을 촉진하는 단백질 형질도입 도메인(TAT) (서열번호 4488) 또는 "변이 GALC-TAT" (결실을 포함한 GALC-TAT) (서열번호 4487)과 같은, 관심 치료용 포유류 cDNA로 구성된다. 관심 cDNA는 또한 T. 곤디 내 이종 폴리펩티드의 발현, 안정성 및 위치화의 효율을 증가시키기 위하여 T. 곤디의 코돈 사용량에 따라 코돈-최적화될 수 있다(T. 곤디 내 발현을 위해 코돈 최적화된, 코돈 최적화된 쥐 MeCP2 이소폼 1 [서열번호 4477], 코돈 최적화된 인간 ASPA [서열번호 4602], 코돈 최적화된 인간 GALC 이소폼 1 [서열번호 4603] 및 코돈 최적화된 인간 TFEB 이소폼 1 [서열번호 4604]과 같이). T. 곤디 발현 벡터는 또한 그 적절한 발현 및 표적화를 보장하는 동일하거나 다른 톡소플라즈마 유전자 유래의 조절 요소를 포함한다. ORF의 상류는 본원에서 "톡소필린 프로모터" 또는 "톡소필린 5'-UTR"로 지칭되는 톡소필린 유전자의 내인성 5' 조절 서열(서열번호 4482) 또는 본원에서 "GRA16 프로모터" 또는 "GRA16 5'-UTR"로 지칭되는 GRA16 유전자의 내인성 5' 조절 서열(서열번호 4473) 중 하나일 수 있는 내인성 5' 조절 서열이다. ORF의 하류는 풍부한 밀집 과립 단백질 GRA2의 3'-UTR(서열번호 4491; 도 3)이다. 발현 벡터는 또한 DHFR-TS의 5' UTR (상류) [서열번호 4492] 및 DHFR-TS의 3' UTR (하류) [서열번호 4493 또는 4609]로 둘러싸인, 선택 마커 HXGPRT [서열번호 4475] 또는 DHFR-TS [서열번호 4484 또는 4606] 또는 mCherry [서열번호 4608]을 포함하는 별개의 ORF를 포함하였다.
유전자 이식 T. 곤디의 생성
타입 Ⅰ 균주 RH 또는 RH△HX, 또는 타입 Ⅱ 균주 Prugniaud,Prugniaud-GFP-Luciferase 또는 Prugniaud △HPT(Prugniaud △HX로도 알려진)의 T. 곤디를 유전자 이식 균주를 생성하기 위해 사용하였다. 세포외 급분열소체를 채취하거나 22-26 게이지 바늘을 이용하여 기계적으로 떼내어, 세포 파편으로부터 여과하고, 펠렛화하고, 각 30 μl(총 360 μl)에 2 mM ATP 및 5 mM GSH이 새롭게 첨가된, 300μl 사이토믹스 버퍼(120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7.6, 25 mM HEPES pH 7.6, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2)에서 재부유하였다. 20-60 μg 플라스미드 DNA 또는 효소 ScaI로 선형화된 DNA를 BTX ECM 전기천공기로 전기천공에 의해 급분열소체로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 몇몇 방울을 IFA 웰(유리 커버슬립에 뿌린 HFF 세포와 24-웰 플레이트의 면역형광 분석 웰)로 옮기고 형질감염 효율 및 일시적인 단백질 발현(플라스미드 DNA로부터의 발현)의 평가를 위해 면역형광염색하였다. 형질감염된 기생충의 나머지를 완전 DMEM 내 HFF를 포함하는 신선한 플라스크에 옮겼다. 약물-저항성 선택 마커를 사용한다면, 다음날 배지를 선택용 약물(DHFR-TS 선택용 1μM 피리메타민 또는 HXGPRT 선택용 25μg/ml 마이코페놀산 + 50μg/ml 잔틴)을 포함하는 신선한 배지로 바꾸었다. 기생충이 HFF로부터 탈출하기 시작한 날로부터, 세포외 기생충을 포함하는 상청액의 방울을 서택 약물을 포함하는 선택 배지 내 HFF의 두번째 플라스크로 1-2일 마다 통과시켰다. 두번째 플라스크의 기생충이 HFF로부터 탈출하기 시작하였을 때, 상청액의 방울을 두번째 플라스크로부터 세번째 플라스크 등으로 1-2일 마다 통과시켰다. 형광 단백질 선택 마커가 사용되었다면, 두번째 플라스크의 기생충이 HFF 세포의 약 50%-90%로 탈출하였을 때, 세포외 기생충을 포함하는 배지를 채취하고, 세포 파편으로부터 여과시키고, FACS 기계를 이용하여 분류하였다. 선택에 사용된 형광 단백질에 상응하는 형광을 방출하는 기생충을 채취하고 완전한 DMEM 배지 내 HFF의 다음 플라스크로 통과시켰다. 3번째-5번째 플라스크가 용해를 시작한 후(약 2-5 주), 기생충을 DNA 구조물을 그 게놈에 통합시킨 기생충을 포함하는 "안정한 풀"로 간주하였다. 안정한 풀의 한 방울을 IFA(면역 형광 분석) 웰로 통과시키고, 풀 내 구조물-양성 기생충의 백분율, 게놈-통합("안정한") 기생충 내 단백질 발현 및 단백질 위치화(게놈 발현)를 평가하기 위하여 면역형광염색하였다. 희석을 제한하거나, 96 웰 플레이트에서 웰 당 하나의 기생충을 FACS 분류하여, 수작업 분류에 의해 클론 주를 마련하였다. 단일 기생충으로부터 유래한 것으로 추정되는 단일 플라크로 웰을 검출하기 위한 명시야 현미경을 이용하여 육안으로 스크리닝한 후, 플레이트를 5-10일 동안 누구도 건드리지 않은 상태를 유지하였다. 단일 플라크를 포함하는 웰을 피펫으로 힘차게 혼합하였고, 그 혼합물의 50μl을 새로운 접시 및 PCR 튜브로 통과시켰다. PCT 튜브에서 채취한 세포를 펠렛화하고, TE 버퍼 내 10% 단백질분해효소 K로 구성된 10μl 용해 버퍼에서 재부유시키고, 60℃에서 60분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안 유전자증폭장치(thermocycler)에서 배양하여, 용해물을 제조하였다. 용해물의 1 마이크로리터(1μl)를 유전자 구조물에 대해 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 스크리닝용 주형으로 사용하였다. PCR-양성 클론을 IFA 벽에 통과시키고, 고정시키고, 면역형광염색하고, 형광 현미경 및 편광 현미경을 이용하여 각 클론 내 단백질 발현 및 단백질 위치를 분석하였다.
항체
사용된 항체 및 각각의 농도는 다음과 같다: 항-HA (Roche, IFA: 1:1000, WB: 1:1000), 항-IMC-1 (gift from Prof. Dominique Soldati-Favre, IFA: 1:1000-1:2000), 항-MeCP2 (Cell Signaling, IFA: 1:200, WB: 1:1000, IP: 1:26), 항-NeuN (Abcam, IFA: 1:500), 항-NCoR1 (Bethyl Laboratories, WB: 1:1000), 항-TBL1 (Abcam, WB: 1:1000), 알렉사 플루오르 항-쥐 488 and 594 (Invitrogen, IFA: 1:1000), 알렉사 플루오르 항-토끼 488 and 594 (Invitrogen, IFA: 1:1000), 알렉사 플루오르 항-생쥐 488 and 594 (Invitrogen, IFA: 1:1000).
실시예 1
발현, 기생충 분비 세포 기관으로의 위치화 및 숙주세포에의 치료용 목적단백질의 분비를 이끄는 T. 곤디 구조물의 생성
실험 과정
구조물을 전기천공법에 의해 RH(RHhxgprt) 또는 Pru(Pruhxgprt) 균주 T. 곤디 기생충으로 형질감염시켰다. 이는 선택 마커를 발현하는 기생충을 선택하거나(아니면 목적구조물로 공동-형질감염시킨, DHFR-TS(서열번호 4484)를 포함하는 구조물에 대한 피리메타민 선택), 또는 HXGPRT(서열번호 4475)의 발현에 기반한 선택을 위해 MPA+잔틴을 이용하는 것, 제한 희석에 의한 클로닝 또는 유동 세포 분석법, 및 PCR-기반 스크리닝의 과정이 뒤따른다. 분비 곤봉체 세포 기관, 밀집 과립 세포 기관, 기생충 액포 공간, 기생충 액포 막 또는 숙주세포 내 HA-태그 치료용 단백질의 발현 및 특이적 위치화를 특징짓기 위하여, 양성 클론을 웨스턴 블롯 분석 및 면역형광 염색에 의해 확인하였다. 확인된 양성 주를 HFF(인간 포피 섬유아세포) 세포에 더 유지시켰다.
실험 결과
치료용 단백질 갈락토세레브로시다제, 갈락토세레브로시다제-TAT, GDNF, 아스파르토아실라제, MeCP2, 생존 운동 신경원 단백질 및 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 파ㅋ킨의 전달을 위한 구조물 및 T. 곤디의 생성 - 결과는 T. 곤디가 기생충의 내인성 다백질에 융합된 이종(포유류, 예를 들어, 인간) 치료용 단백질을 발현시키도록 조작될 수 있다는 것을 증명한다. 이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 일반적인 신경병리학과 관련된 3개의 인간 단백질, 갈락토세레브로시다제-TAT(변이 GALC-TAT 서열번호 4487), MeCP2(코돈 최적화된 서열번호 4477) 및 GDNF(서열번호 4489)를 발현시키는 3개의 신규한 안정한 T. 곤디 유전자 이식 주, 및 일반적인 신경병리학과 관련된 3개의 인간 단백질, 갈락토세레브로시다제(GLAC, 이소폼 1, 서열번호 4486), 갈락토세레브로시다제-TAT(WT GALC-TAT 서열번호 4488), 아스파르토아실라제(ASPA 서열번호 4483) 및 생존 운동 신경원 단백질(SMN1, 서열번호 4479)을 발현시키는 안정한 T. 곤디 유전자 이식 기생충을 포함하는 추가적인 4개의 혼합-집단 풀을 생성하였다.
바이러스성 단백질 형질도입 도메인에 의한 치료용 단백질의 분비 및 흡수 개선 - 이웃하는 세포에 의한 단백질의 흡수 뿐만 아니라, 숙주세포에서 세포외 공간으로의 갈락토세레브로시다제 단백질의 분비를 개선하기 위하여, 본 발명자들은 갈락토세레브로시다제를 바이러스성 단백질 형질도입 도메인(PTD)에 융합시켰다. Tat-PTD는 세포 배양 모델 시스템에서 효소의 분비 및 흡수 모두를 향상시킴으로써, 갈락토세레브로시다제의 교차-수정(cross-corresction) 효율을 현저히(6배까지) 증가시키는 것으로 이전에 나타났다(Meng, X.-L., et al., 2013).
치료용 단백질 갈락토세레브로시다제-TAT, 아스파르토아실라제, MeCP2 및 생존 운동 신경원 단백질의 T. 곤디 곤봉체 분비 세포 기관으로의 위치화 - 결과는 T. 곤디가 이종(포유류, 예를 들어, 인간) 치료용 단백질을 기생충의 곤봉체 분비 세포 기관으로 위치시킬 수 있으며(도 4A), 여기서 잠재적으로 숙주 세포 세포질로 방출될 수 있고, 감염된 세포 내 표적 부위로 위치할 수 있다는 것을 증명한다. 이전의 톡소필린 융합체가 숙주세포로 분명히 진입한 것으로 보고된바 있는 것처럼, 갈락토세레브로시다제-TAT, 아스파르토아실라제, MeCP2 및 생존 운동 신경원 단백질을 포함하는 융합 단백질은 기생충 곤봉체에 위치하였다. 이는 면역형광 염색(IFAs)에 의해 증명되었다(도 4B-I).
따라서, 본 발명자들은 T. 곤디가 기생충의 내인성 단백질에 융합된 이종(포유류, 예를 들어, 인간) 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다는 점, 및 이러한 단백질이 기생충의 곤봉체 분비 세포 기간에 위치할 수 있다는 점을 증명하는데 성공하였다. 본 발명자들은 인간 단백질을 기생충에 의해 숙주세포로 자연적으로 분비되는 내인성 단백질, 톡소필린에 융합되도록 조작하였는데, 이는 목적단백질(예를 들어, 치료용 단백질)의 표적화 및 분비를 위한 기생충의 단백질 분비 기계에 "타는" 것을 허용한다. 이는 T. 곤디를 본 기술의 실현가능한 기반으로 제안하는 과정에서 중요한 이정표이다.
이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 크라베 질환과 관련된 인간 단백질 갈락토세레브로시다제-TAT(변이 GALC-TAT 서열번호 4487)를 발현시키고 곤봉체로 위치시키는 신규하고 안정한 T. 곤디 유전자 이식 주, 및 일반적인 신경병리학과 관련된 3개의 인간 단백질, 갈락토세레브로시다제-TAT(WT GALC-TAT 서열번호 4488), 아스파르토아실라제(ASPA 서열번호 4483), MeCP2(서열번호 4477) 및 생존 운동 신경원 단백질(SMN1, 서열번호 4479)을 발현시키고 곤봉체로 위치시키는 안정한 T. 곤디 유전자 이식 기생충을 포함하는 추가의 4개의 혼합-집단 풀을 생성하였다.
치료용 단백질 아스파르토아실라제, MeCP2 및 생존 운동 신경원 단백질의 T. 곤디 밀집 과립 분비 세포 기관 및 기생충 액포 공간으로의 위치화 - 결과는 T. 곤디가 이종(포유류) 인간 치료용 단백질을 기생충의 밀집 과립 분비 세포 기관 및 기생충 액포 공간으로 위치시킬 수 있다는 것을 증명하는데(도 5A), 여기서 이들은 숙주세포 세포질로 방출될 수 있고 감염된 세포 내 표적 부위에 위치할 수 있다(도 5B-I). 기생충 밀집 과립으로부터 목적단백질의 분비를 유도하는 밀집 과립 단백질 유래 서열을 이용하는 이러한 접근법이 이례적인 것이므로, 이는 첫번째로 밀집 과립 단백질(GRA16)에의 융합에 의한 기생충 액포 공간으로의 분비되는 포유류 단백질을 발견한 것이다. 이는 면역형광 염색(IFAs)에 의해 증명되었다(도 5B-I). 그들이 융합되는, 자연적 GRA16 단백질의 알려진 위치를 기반으로(Bougdour et al. 2013), 융합 단백질이 그 후 기생충 액포 막을 통해 숙주세포로 이동할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명자들은 T. 곤디가 기생충의 내인성 단백질에 융합된 이종 (포유류) 단백질을 발현시키도록 조작될 수 있다는 점, 및 이들 단백질이 기생충의 밀집 과립 분비 세포 기관 및 기생충 액포 공간으로 위치화할 수 있다는 점을 증명하는데 성공하였다. 본 발명자들은 인간 단백질을 기생충에 의해 숙주세포로 자연적으로 분비되는 내인성 단백질인, GRA16에 융합되도록 조작하였는데, 이는 목적단백질(예를 들어, 치료용 단백질)의 표적화 및 분비를 위한 기생충의 단백질 분비 기계에 "타는" 것을 허용한다. 이는 T. 곤디를 본 기술의 실현가능한 기반으로 제안하는 과정에서 중요한 이정표이다.
이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 레트 증후군과 관련된 인간 단백질 MeCP2를 발현시키고 밀집 과립 분비 세포 기관 및 기생충 액포 공간으로 위치시키는, 신규하고 안정한 T. 곤디 유전자 이식 주, 및 일반적인 신경병리학과 관련된 2개의 인간 단백질, 아스파르토아실라제 및 생존 운동 신경원 단백질을 발현시키고 밀집 과립 분비 세포 기관 및 기생충 액포 공간으로 위치시키는 안정한 T. 곤디 유전자 이식 기생충을 포함하는 추가의 2개의 혼합-집단 풀을 생성하였다.
유전자이식 기생충 유래 치료용 단백질 MeCP2의 숙주세포로의 분비, 및 숙주세포, 핵 내 활성 영역에의 위치화 - 결과는 톡소플라즈마 곤디 분비 폴리펩티드에 융합된 약학적 폴리펩티드(및 여기서 특히, T. 곤디 밀집 과립 단백질 GRA16에 융합된 치료용 단백질 MeCP2)로 구성된 단백질 융합물이 기생충으로부터 숙주세포로 방출될 수 있고, 숙주세포 내 치료용 단백질의 표적 부위(여기서, 핵)로 전위될 수 있음을 증명한다. 면역형광 염색(IFAs)에 의해 나타낸 바와 같이 MeCP2를 포함하는 융합 단백질은 숙주세포 핵으로 위치하였다(도 5F-I). 이는 T. 곤디를 본 기술의 실현가능한 기반으로 제안하는 과정에서 중요한 이정표이다.
이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 레트 증후군과 관련된 인간 단백질 MeCP2를 발현시키고 숙주세포 핵으로 위치시키는, 신규하고 안정한 T. 곤디 유전자 이식 주를 생성하였다(도 5F-I).
실시예 2
기생충 전달을 통한 갈락토세레브로시다제 결핍의 구조
6-헥사데카노일아미노-4-메틸엄벨리페릴-베타-D-갈락토시드(6HMU-베타-D-갈락토시드)로 명명된 갈락토세레브로시다제의 합성 형광 물질의 효소적 분해에 기반한 갈락토세레브로시다제 효소 활성 분석은 제조자의 프로토콜에 기초한다[Otto P. van Diggelen. MOSCERDAM SUBSTRATES, Laboratory protocol for enzyme analysis for Krabbe disease; Galactocerebrosidase]. 크라베 환자-유래 섬유아세포를 이용하여, 배양물에서 크라베 질환 표현형을 구조하기 위한 GALC- 및 GALC-TAT-발현 기생충의 능력을 평가하기 위하여 분석을 사용하였다. 치료되지 않은 크라베 질환 세포(크라베 환자-유래 섬유아세포), 허위 벡터(빈 인간 발현 벡터)로 형질감염된 크라베 질환 세포 및/또는 GALC를 발현하지 않는 T. 곤디 기생충에 의해 감염된 크라베 질환 세포를 음성 대조군으로 사용한다. 양성 대조군은 야생형(WT) 세포 주, 또는 시험된 유전자 이식 기생충에 의해 발현된 융합물과 동일한, 독립형 (HA-태그) GALC 또는 GALC-TAT 유전자, 또는 톡소필린/GRA16-융합 GALC 또는 GALC-TAT 유전자 중 하나의 발현을 유도하는 인간 발현 벡터로 형질감염된 크라베 질환 세포이다. 이는 어떠한 부정적 결과가 단백질 그 자체에 충분한 효과가 결여된 것, 또는 치료용 단백질의 N- 말단으로의 톡소필린 또는 GRA16의 융합에 의한 치료용 단백질의 활성의 파괴에 기인할 수 있다는 가능성을 배제하고, 따라서 기생충 전달 시스템의 효율의 정량화할 수 있고 직접적인 추론을 가능하게 한다.
분석은 크라베 질환 환자-유래 섬유아세포에서 나타난 갈락토세레브로시다제-결핍을 구조하기 위한, 갈락토세레브로시다제-발현 기생충의 능력을 특징짓는데 사용된다. 이러한 실험은 배양물에서 보충 단백질을 세포로 전달하여, 크라베 질환을 구조할 수 있는 유전자 이식 기생충의 능력을 증명한다.
실시예 3
기생충 전달을 통한 MECP2 결핍의 구조
MECP2의 변이 또는 결실을 포함하는 레트 증후군 쥐 모델 유래의 신경 및 신경교 세포는 다수의 비정상적 형태학적 및 분자적 특징들을 나타낸다[Percy, A. Rett syndrome: coming to terms with treatment. Adv. Neurosci. (2014), [de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016].
레트 증후군 세포 배양 모델을 이용하여, 배양물 내 레트 증후군 표현형을 구조하는 MeCP2-발현 기생충의 능력을 평가하기 위하여 레트 증후군의 분자적 및 형태학적 특징적 표현형의 정량적 스코어링을 사용한다. 치료되지 않은 레트 증후군 모델 세포, 허위 벡터로 형질감염된 레트 증후군 모델 세포 및/또는 MeCP2를 발현하지 않은 T. 곤디 기생충으로 감염된 레트 증후군 모델 세포를 음성 대조군으로 사용한다. 양성 대조군은 WT 세포 주 및 독립형 (HA-태그) MECP2 코딩 서열, 또는 시험된 유전자 이식 기생충에 의해 발현된 융합물과 동일한, 톡소필린/GRA16-융합 MECP2 코딩 서열 중 하나의 발현을 유도하는 인간 발현 벡터로 형질감염된 레트 증후군 모델 세포이다. 이는 어떠한 부정적 결과가 단백질 그 자체에 충분한 효과가 결여된 것, 또는 치료용 단백질의 N- 말단으로의 톡소필린 또는 GRA16의 융합에 의한 치료용 단백질의 활성의 파괴에 기인할 수 있다는 가능성을 배제하고, 따라서 기생충 전달 시스템의 효율의 정량화할 수 있고 직접적인 추론을 가능하게 한다.
분석은 레트 증후군 세포 배양 모델에서 나타난 MeCP2-결핍을 구조하기 위한, MeCP2-발현 기생충의 능력을 특징짓는데 사용된다. 이러한 실험은 배양물에서 보충 단백질을 세포로 전달하여, 레트 증후군을 구조할 수 있는 유전자 이식 기생충의 능력을 증명한다.
실시예 4
동물 모델에서의 유전자 이식 기생충 주의 치료적 잠재력 시험
전체 유기체의 표현형에 영향을 미치는 능력에 대하여, 기생충의 유전자 이식 주를 시험한다. 쥐에서의 유전자 이식 기생충의 시험은 면역계 및 기능적 혈뇌 장벽(BBB)의 존재 시 시스템의 평가를 가능하게 한다. 유전자 이식 T. 곤디 기생충은 시험될 상태의 개별 동물 모델에 비강내, 경구로 (구강으로와 같이), 피하로, 근육내, 정맥내, 피부내, 복강내, 두개내 또는 대뇌내로 투여된다. 유전자 이식 T. 곤디 기생충은 급분열소체, 느린분열소체 조직 낭포 또는 접합자의 형태로 투여된다.
기생충의 접종에 이어, 연구된 조건과 관련된 표현형(질환의 병리학적 표현에 대하여 동물 모델을 특징짓고 평가한다. 표현형은 행동, 형태학적 및 분자적 표현형을 포함한다. 유전자 이식 기생충의 효과를 치료용 폴리펩티드를 발현시키지 않는 기생충으로 처리된 동물 및 허위-처리된 동물과의 비교로 나타내었다.
예를 들어, 치료용 단백질 MeCP2를 발현시키는 T. 곤디 기생충으로 처리된 레트 증후군의 쥐 모델은 사회적 상호작용 장애, 증가된 냄새 표시, 뒷다리 움켜쥠, 감소된 수명, 불안증, 호흡 문제, 저활동성, 운동 조정력 장애, miRNA-매개 IGF1 결핍, 감소된 BDNF 수준, 외피 가소성 장애, 신경교 기능 장애, GABAergic 신경 기능 장애, 감소된 체세포 크기, 감소된 수지상극 밀도, 감소된 시냅스 수, 감소된 활성(Ca2+ 이미징), 감소된 sEPSC 및 sIPSC 빈도 및 진폭, 감소된 Tuk1+ 세포 수, 감소된 PAX6, SCN1A/1B 발현, 감소된 피질 뉴런 내 수지상돌기 복잡성, 감소된 피질 뉴런 내 AP 빈도, 감소된 피질 뉴런 내 전체 전사, 피질 뉴런 내 신경, 시냅스, 고-발현 유전자, 전초기 유전자(immediate early genes) 및 미토콘드리아 유전자의 감소된 발현, 감소된 피질 뉴런 내 mRNA 전사, 감소된 피질 뉴런으로부터의 BDNF 분비, 감소된 피질 뉴런 내 AKT/mTOR 경로 활성 및 감소된 피질 뉴런 내 산소 소비 및 최대 호흡을 포함하는 알려진 질환의 표현형으로 평가한다[de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016.].
실시예 5
맞춤형 전사 활성체-유사 이펙터(TALEs)의 전달을 위한 구조물 및 T. 곤디 주의 생성
T. 곤디는 맞춤형 전사 활성체-유사 이펙터(TALE)를 발현시키고 분비하도록 하공한다. 맞춤형 TALE는 전사 조절 및 게놈 편집을 포함하는, 다양한 게놈 공학 응용에 사용될 수 있다. TALE의 DNA 인식 및 결합 영역은 인식된 DNA 서열의 서열을 결정하는, 34-aa 서열(단량체)의 탠덤 반복으로 구성된다. 그것들이 인식하는 뉴클레오티드를 결정하는 그들의 반복 가변 이잔기(repeat variable diresidues, RVDs)가 상이한 4개의 유형의 단량체가 있다. "NI"로 칭한 단량체(서열번호 4508)는 "A" 뉴클레오티드에 특이적이다; "HD"로 칭한 단량체(서열번호 4495)는 "C" 뉴클레오티드에 특이적이다; "NG"로 칭한 단량체(서열번호 4509)는 "T" 뉴클레오티드에 특이적이다; 그리고 "NN"로 칭한 단량체(서열번호 4494)는 "G" 또는 "A" 뉴클레오티드에 특이적이다. 더욱 최근에는, 더 높은 G-특이성을 제공하는 추가적인 RVD NH(서열번호 4504)가 나타났다. 탠덤 반복 DNA-결합 도메인은 항상 반신(half-length) 반복(0.5 반복)으로 끝난다. 맞춤형 TALE DNA-결합 도메인은 맞춤 TALE 전사 인자(TALE-TFs)를 생성하고, 합성 VP64 전사 활성체에의 융합에 의해, 게놈 유래 내인성 유전자의 전사를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 맞춤형 TALE DNA-결합 도메인은 또한 맞춤 TALE 뉴클레아제(TALENs)을 생성하기 위해 사용될 수 있고, FokI 엔도뉴클라제의 촉매 도메인에의 융합에 의해, 비상동적 수선 또는 상동 직접 수선을 통한 게놈 편집을 촉진하는 부위-특이적 이중-가닥 파단(break)을 생성하는데 사용될 수 있다. TALE는 TALEN 백본 또는 TALE-TE 백본으로 삽입되는, 단량체 유래 DNA-결합 도메인(서열번호 4508, 4509, 4494, 4495 및 4504)을 제작하여 만들어진다. 백본은 또한 DNA 결합 도메인의 말단에 0.5 반복을 포함하므로, 4개의 TALE-TF 백본(예를 들어, 서열번호 4496, 4497, 4498 및 4499) 뿐만 아니라, 4 유형의 TALEN 백본(예를 들어, 서열번호 4500, 4501, 4502 및 4503)이 있다. 백본은 또한 시토메갈로바이러스 프로모터(CMV), Hax3 TALE 유래 비반복 N 말단(N-term), Hax3 TALE 유래 비반복 C 말단(C-term), 맞춤 TALE DNA-결합 도메인(BsaI와 같은)의 삽입에 사용되는 타입 IIs 제한 부위, ccdB 음성 선택 유전자 및 클로람페니콜 저항 유전자를 포함하는 음성 선택 카세트(ccdB + CmR), 핵 위치화 신호(NLS), 및 FokI 엔도뉴클레제(FokI) 유래 촉매 도메인 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 단백질(VP74) 유래 합성 전사 활성체에 이어진 2A 자기-절단 링커(2A) 및 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 중 어느 하나를 포함한다. 모두 아데닐산중합반응 신호(polyA 신호)가 뒤따른다(Sanjana et al., A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering, 2012). 결과로 생긴 TALE 서열을 상기 일반 물질 및 실험 방법에서 설명한 바와 같이 T. 곤디 내인성 분비 폴리펩티드의 코딩 서열의 하류에 삽입하고, 결과로 생긴 구조물을 TALE를 발현시키고 분비하는 유전자 이식 T. 곤디 균주를 생산하는 T. 곤디로 형질감염시킨다.
예를 들어, 이를 필요로 하는 개체의 게놈에 TACGTACG(서열번호 4505) 서열을 표적화하기 위하여, TALE 뉴클레아제 구조물 또는 TALE 전사 인자 구조물을 사용할 수 있다. 도 6A(TALE 뉴클레아제) 및 도 6B(TALE 전사 인자)에서 도식적으로 나타낸 바와 같이, 이러한 구조물의 개방형 해독 프레임에서, 예시적인 "표적 서열" (서열번호 4505)를 표적하는데 특이적인 단량체를 교대로 배열한다. 이러한 구조물의 서열 정보는 서열 목록에서 이용가능하다(서열번호 4506 및 4507).
실시예 6
포유류 치료용 단백질을 발현시키고 그것들을 그의 곤봉체 분비 세포 기관으로 위치화하는 T. 곤디 기생충의 생성
포유류 단백질을 발현시키고 그것들을 그의 곤봉체 분비 세포 기관으로 표적화하는 T. 곤디 기생충을 생성시키기 위하여, 본 발명자들은 타입 I RH△HX 급분열소체 또는 RH(pDHFR 선택 플라스미드로 공-형질감염된) T. 곤디를 곤봉체 단백질 톡소필린에 융합된 목적단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드로 형질감염시킨다. 톡소필린 융합 시스템에서 시험된 포유류 단백질은 다음과 같다: 신경아세포 유도 신경영양 인자(GDNF), 파킨(PARK2), 갈락토세레브로시다제(GALC), TAT 단백질 형질도입 도메인에 융합된 갈락토세레브로시다제(GALC-TAT; 서열번호 4487), 메틸 CpG 결합 단백질(MeCP2), 아스파르토아실라제(ASPA) 및 운동 뉴런의 생존(SMN1). 단백질 발현 및 표적화를 개선하기 위한 시도에서, 본 발명자들은 또한 코돈-최적화된 형태의 GALC, MECP2, ASPA를 포함하는 몇몇 단백질, 및 코돈-최적화된 형태로 시험된 추가 유전자 TFEB(서열번호 4604)를 시험하였다.
ASPA(서열번호 4483), 코돈-최적화된 ASPA (서열번호 4602), GALC(서열번호 4486 및 4601), GALC-TAT(서열번호 4488), PARK2(서열번호 4478), SMN1(서열번호 4479), GDNF(서열번호 4489), MeCP2(서열번호 4476) 및 코돈-최적화된 MeCP2(서열번호 4477)는 기생충의 융합 단백질의 가변 표적화를 나타내는데, 이는 곤봉체 표적화 뿐만 아니라, 기생충 내 소포체, 골지체, 핵, 세포질, 아피코플라스트, 미세간상체 및 다른 위치와 유사한, 다른 패턴의 표적화를 포함한다(도 9A-N).
GALC-TAT 변이 형태는 주로 곤봉체-유사 융합 단백질 위치를 생성하였다. 변이된 GALC-TAT로부터, 본 발명자들은 또한 융합 단백질을 강하게 발현시키고 이를 곤봉체에 표적화하는 클론 주를 생성하였다(도 9H).
실시예 7
표유류 치료용 단백질을 발현시키고, 그것들을 그의 밀집 과립 분비 세포 기관에 위치시키고, 그것들을 기생충 액포로 분비하는 T. 곤디 기생충의 생성
포유류 단백질을 발현시키고 그것들을 그의 밀집 과립 분비 세포로 표적화하는 T. 곤디 기생충을 생성시키기 위하여, 타입 I RH△HX T. 곤디를 밀집 과립 단백질 GRA16에 융합된 목적단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다. GRA16 융합 시스템에서 시험된 포유류 단백질-코딩 유전자는 GALC [인간형(서열번호 4486 및 4601) 및 코돈-최적화된(서열번호 4603), GALC-TAT (인간형 서열번호 4488), MECP2(코돈-최적화된, 서열번호 4477), ASPA [인간형 (서열번호 4483) 및 코돈-최적화된(서열번호 4602)], SMN1(인간형, 서열번호 4479) 및 TFEB(코돈-최적화된, 서열번호 4604)이었다.
GALC, 코돈-최적화된 GALC 및 GALC-TAT를 형질감염된 기생충에서 발현시켰다(도 10E, 10F 및 10H). ASPA, 코돈-최적화된 ASPA, SMN1, 코돈-최적화된 MeCP2 및 코돈-최적화된 TFEB를 발현시키고 밀집 과립에 의해 기생충 액포로 분비시켰다(도 10C, 10G, 10D, 10I, 10J).
실시예 8
유전자 이식 T. 곤디를 이용한 포유류 치료용 단백질의 배양물 내 인간 섬유아세포로의 전달
본 발명자들은 융합 단백질을 기생충 액포로 분비할 수 있는 것에 더하여, 그것을 기생충 액포로부터 방출시키고, 면역형광 염색에 의해 검출가능한 양으로 숙주세포의 핵으로 그것을 표적화할 수 있는, 6개의 타입 I 및 타입 II 톡소플라즈마 클론 주를 조작하였다. 이들 클론 주는 다음과 같다: 코돈-최적화된 RH GRA16-MECP2(RH GRA16-MECP2opt), 코돈-최적화된 RH GRA16-TFEB(RH GRA16-TFEBopt), 코돈-최적화된 Prugniaud-GFP-Luciferase DHFR-TS GRA16-MECP2(Pru-GFP-LUC GRA16-MECP2opt), 코돈-최적화된 Prugniaud-GFP-Luciferase DHFR-TS GRA16-TFEB(Pru-GFP-LUC GRA16-TFEBopt), 코돈-최적화된 Prugniaud GRA16-MECP2(Pru GRA16-MECP2opt), 및 코돈-최적화된 Prugniaud GRA16-TFEB(Pru GRA16-TFEBopt). 융합 단백질을 발현시키는 유전자 이식 주에 더하여, 본 발명자들은 또한 HA 에피토프 태그에만 융합된 담체 단백질 GRA16을 발현시키는 2개의 대조군 주를 생성시켰다: RH GRA16-HA(RH GRA16-HAstop) 및 Prugniaud GRA16-HA(Pru GRA16-HAstop). MeCP2 및 TFEB가 모두 핵 단백질이므로, 숙주세포 핵 표적화는 그들이 세포에서 그들의 활성 부위로 표적화되는 것을 의미한다. HFF 인간 섬유아세포에서 각 주의 급분열소체를 포함하는 완전한 DMEM 내 HFF 세포의 감염, 고정, 면역형광 염색, 및 형광 및 편광 현미경에 의한 분석에 의해, 상술한 모든 주에서 단백질의 분비 및 숙주세포 핵 표적화를 검출하였다(도 10B, 10I 및 10J).
시험관 내 GRA16-매개 단백질 전달의 효율 및 동역학을 정량화하기 위하여, 본 발명자들은 도 11A-C에 요약된 바와 같이, 세 가지 타입 I 주, RH GRA16-HAstop, RH GRA16-MECP2opt 및 RH GRA16-TFEBopt의 급분열소체에 대하여 시간의 흐름에 따른 전달 및 감염의 다양성(MOI)을 정량화하였다.
실시예 9
유전자 이식 T. 곤디를 이용한 포유류 치료용 단백질의 배양물 내 인간 뉴런으로의 전달
룬드 인간 중간뇌(Lund Human Mesencephalic, LUHMES) 세포로도 알려진, 불멸화 인간 도파민 신경 선구세포(Immortalized Human Dopaminergic Neuronal Precursor Cells)를 L-글루타민, N-2 무혈청 보충제 및 βFGF(베타-섬유아세포 성장 인자)가 보충된 F12 고급(advanced) DMEM 배지를 함유하는 배지에서 성장시켰다. L-글루타민, N-2 무혈청 보충제, 테트라사이클린, GDNF 및 cAMP(고리형 아데노신 일인산)가 보충된 F12 고급 DMEM 배지를 이용하여 세포를 배양물에서 형태학적으로 그리고 생화학적으로 성숙한 도파민-유사 뉴런으로 분화시켰다. 분화 6-9일차에(세포가 성숙한 뉴런인 시기), 클론 주, RH GRA16-MECP2opt, RH GRA16-TFEBopt 및 RH GRA16-HAstop의 급분열소체를 뉴런을 감염시키기 위해 서용하였다. 감염 16-22 시간 후, 뉴런을 고정시키고 면역형광 염색하고, 형광 및 편광 현미경으로 분석하였다. 시험된 모든 주는 융합 단백질의 명확한 분비를 나타냈는데, 이는 이간 뉴런의 핵을 표적화하였다(표 12A-C).
아울러, 인간 뉴런을 RH GRA16-MECP2opt 급분열소체로 감염시키고, 감염 24시간 후에 채취하였다. 감염된 뉴런을 PBS로 씻어내고, 멸균 세포 스크레이퍼를 이용하여 긁어내고, 원심분리로 펠렛화하였고, 잔여 PBS를 제거하고, 펠렛을 액체 질소에서 스냅-동결하였다. 감염된 뉴런으로부터 추출한 핵 단백질을 MeCP2 항체에 결합된 자성 비드를 이용하여 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 표준 웨스턴 블롯 프로토콜에 따라 동일한 MeCP2 항체로 면역블롯팅하였다. 결과로 생긴 블롯은 대략 75 kDa 및 대략 130 kDa의 2개의 강한 밴드를 나타냈다. ~75 kDa 밴드는 인간 뉴런 유래의 내인성 비절단 MeCP2(예측 크기: 75 kDa)를 나타내고, ~130 kDa 밴드는 기생충-전달 GRA16-MeCP2 융합 단백질(GRA16 예측 크기: 55 kDa. 융합 단백질 예측 크기: 75+55 = 130 kDa)을 나타낸다(도 14).
실시예 10
유전자 이식 T. 곤디를 이용한, 포유류 MECP2의 쥐 1차 피질 및 해마 배양물로의 전달 및 전달된 MECP2의 이질염색질 DNA에의 결합
P1(1일차) 새끼 쥐의 피질 및 해마 유래의 뉴런이 풍부한 일차 배양물을 5일 동안 배양하고, 유전자 이식 주 RH GRA16-MECP2opt의 급분열소체로 감염시켰다. 감염 12, 24 및 48 시간 후, 뉴런을 고정시키고, 면역형광 염색하고, 형광 및 편광 현미경으로 분석하였다. 열거된 시점 모두에서, GRA16-MECP2 융합 단백질을 분비하였고, 뉴런의 핵을 표적화하였으며, 또한 밀집 이질염색질 DNA의 영역에 상응하는 병소(foci)에서 나타났으며, 강한 DAPI 염색으로 인식되었다(도 13A-D). 그것이 이질염색질에 성공적으로 결합한다는 것을 시사하므로, 이는 MeCP2 기능성에 대한 고전적 마커이다. 특히, 배양 시스템에서, T. 곤디는 뉴런, 신경교 및 다른 세포 모두를 감염시킬 수 있다. 일차 배양물은 순수하게 뉴런이 아니기 때문에(NeuN 염색에 따라), 본 발명자들은 유전자 이식 T. 곤디에 의해 감염된 비-신경세포(아마도 대부분 신경교)가 또한 MeCP2 융합 단백질을 받고, 동일한 특징적인 병소 패턴을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 11
T. 곤디 느린분열소체 낭포에서의 GRA16 및 GRA16-MECP2 융합 단백질의 발현
감염의 정상적인 과정 중, 기생충이 급분열소체와 같이 신체 내에서 복제하고 전파하는 초기 급성기 후에, 면역 압력은, T. 곤디 급분열소체가, 조직 내, 및 대개 뇌 내, 오래 지속되는 휴지기 낭포에 있는 느린분열소체로 분화되는 것을 야기한다(Carruthers VB, Suzuki Y, 2007. Schizophr Bull. 33(3):745-51. Effects of Toxoplasma gondii infection on the brain). 그러므로, 본 발명자들은 유전자 이식 T. 곤디가 느린분열소체 형태로 분화된 후에 GRA16-융합 치료용 단백질을 계속해서 발현시키는지를 조사하였다. 시험관 내 유전자 이식 T. 곤디의 느린분열소체로의 분화는 3 내지 5 일 동안의 알칼리성 배지에 의한 스트레스에 의해 유도되었다. 알칼리성 배지는 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 10 mM HEPES 및 1% 소태아혈청을 포함하는 pH 8.1로 조정된 DMEM 배지를 포함한다(Tomita T, Bzik DJ, et al. 2013. PLoS Pathog. 9(12):e1003823. The Toxoplasma gondii cyst wall protein CST1 is critical for cyst wall integrity and promotes bradyzoite persistence). 본 발명자들은 균주 Pru GRA16-HAstop 및 Pru GRA16-MeCP2의 분화를 시험하였다. 낭포 벽의 DBA(Dolichos Biflorus Agglutinin) 염색에 의해 식별된, 느린분열소체 낭포는 GRA16-HAstop(데이터는 나타내지 않음) 및 GRA16-MeCP2 단백질 둘 다를 계속해서 발현하였다(도 15A-C). 이러한 발견은 유전자 이식 기생충이 느린분열소체 단계로 분화한 후에도 GRA16 및 GRA16 융합 단백질을 계속해서 발현시킬 수 있음을 나타내는데, 이는 만성 감염에서, 낭포로부터의 계속적인 분비 및 단백질 전달에 있어서 중요한 것이다.
실시예 12
T. 곤디에 의해 전달된 이종 폴리펩티드 및 수용체 세포 내 내인성 단백질 사이의 분자 상호작용의 조사
감염된 배양물 및 감염된 동물 유래의 세포 용해물 상에서 공동-면역침전을 수행하여, 본 발명자들은 유전자 이식 T. 곤디에 의해 전달된 폴리펩티드, 및 내인성 단백질과 핵산 사이의 분자 상호작용을 해독할 수 있다.
예를 들어, 포유류 세포에서, MeCP2는 SMRT/NCoR 및 SIN3A 공-억제체 복합체 유래의 DNA 및 단백질 모두와 결합한다. DNA에의 결합은 면역형광 염색 및 염색질-면역침전에 의해 해독될 수 있고, 다른 단백질에의 결합은 면역형광 염색 및 단백질 공동-면역침전에 의해 해독될 수 있다. 전달된 융합 단백질 상에 첨가된 에피토프 태그는 숙주세포에 의해 생산된 단백질의 복사체 및 기생충에 의해 전달된 단백질의 복사체를 구별하기 위해 사용되는 반면, 단백질에 대한 항체는 그 자체로서 내인성 및 기생충-전달 단백질 모두를 해독하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 비교 분석).
실시예 13
유전자 이식 T. 곤디의 이종 목적단백질을 계속적으로(/만성적으로) 전달하는 능력의 동물 모델에서의 시험
전체 유기체의 표현형에 영향을 미치는 능력에 대하여, 기생충의 유전자 이식 주를 시험한다. 동물 모델에서의 유전자 이식 기생충의 시험은 면역계 및 기능적 혈뇌 장벽(BBB) 내 시스템의 평가를 가능하게 한다. 이는 유전자 이식 T. 곤디로 쥐를 감염시키는 분야에 확립된 표준 감염 프로토콜에 따라 행하여졌다(Cabral CM et al., 2016, PLoS Pathog. 12(2):e1005447. Neurons are the Primary Target Cell for the Brain-Tropic Intracellular Parasite Toxoplasma gondii; Berenreiterov
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et al., 2011. PLoS One. 6(12):e28925. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis; Tait ED et al. 2010. J. Immunol. 185(3):1502-12. Virulence of Toxoplasma gondii is associated with distinct dendritic cell responses and reduced numbers of activated CD8+ T cells; Koshy AA et al. 2012. PLoS Pathog. 8(7):e1002825. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade; Jensen KD et al. 2015. MBio. 6(2):e02280. Toxoplasma gondii superinfection and virulence during secondary infection correlate with the exact ROP5/ROP18 allelic combination). 유전자 이식 T. 곤디 기생충을 동물 모델에 비강내, 경구로(구강으로와 같이), 피하로, 근육내, 정맥내, 피부내, 복강내, 두개내 또는 대뇌내로 투여한다. 유전자 이식 T. 곤디 기생충을 급분열소체, 느린분열소체 조직 낭포 또는 접합자 형태로 투여한다. 동물 모델은 치료가능한 상태를 가지거나, 또는 그 밖에 유전자 이식 기생충에서 발현되는 목적단백질의 전달에 영향을 받는, 야생형 동물 또는 모델 동물일 수 있다. 급성 감염의 초기 단계 후에, 동물은 만성 느린분열소체 조직 낭포를, 주로 뇌에 발생시킨다. 이러한 전달 모드는 감염의 만성 단계에서 유전자 이식 T. 곤디 유래의 목적 단백질의 계속적인 발현 및 분비에 의존한다.
만성 감염의 발달 동안 상이한 단계에서(균주 및 감염 경로에 의존하는, 감염 후 최초 3주 내지 2개월), 뿐만 아니라, 만성 감염이 확립되고 안정화된 후 상이한 시점에서(감염 후 수개월 내지 수년의 시간 척도), 감염된 세포의 백분율, 뇌 및 다른 조직 내 기생충 및 전달된 단백질의 분포를 평가하기 위하여, 그리고 전달된 단백질의 수준을 정량화하기 위하여, 뇌 조직 염색이 사용된다. 공동-면역침전 및 세포 형태학이 전달된 단백질과, 받아들이는(receiving) 세포 내 내인성 대응물 사이의 분자적 상호작용을 확인하기 위하여, 그리고 그들의 기능에 대한 증거를 제공하기 위하여, 사용될 수 있다.
치료로 인한 임의의 잠재적인 독성 뿐만 아니라, 질병 표현형의 징후 및 이를 완화시키는 치료의 효능을 평가하기 위하여, 처리된 동물 모델의 상태를 만성 감염의 상이한 단계 및 생리학적, 행동학적, 세포 및 분자 측정을 이용한 질병 진행의 상이한 단계에서, 모니터하고 특징지었다. 유전자 이식 기생충의 효과를 약학적 폴리펩티드를 발현시키기 않는 기생충이 처리된 동물 및/또는 허위-처리된 동물과의 비교로 평가한다.
예를 들어, 치료용 단백질 MeCP2를 발현시키는 T. 곤디 기생충으로 처리된 레트 증후군의 쥐 모델은 사회적 상호작용 장애, 증가된 냄새 표시, 뒷다리 움켜쥠, 감소된 수명, 불안증, 호흡 문제, 저활동성, 운동 조정력 장애, miRNA-매개 IGF1 결핍, 감소된 BDNF 수준, 외피 가소성 장애, 신경교 기능 장애, GABAergic 신경 기능 장애, 감소된 체세포 크기, 감소된 수지상극 밀도, 감소된 시냅스 수, 감소된 활성(Ca2+ 이미징), 감소된 sEPSC 및 sIPSC 빈도 및 진폭, 감소된 Tuk1+ 세포 수, 감소된 PAX6, SCN1A/1B 발현, 감소된 피질 뉴런 내 수지상돌기 복잡성, 감소된 피질 뉴런 내 AP 빈도, 감소된 피질 뉴런 내 전체 전사, 피질 뉴런 내 신경, 시냅스, 고-발현 유전자, 전초기 유전자(immediate early genes) 및 미토콘드리아 유전자의 감소된 발현, 감소된 피질 뉴런 내 mRNA 전사, 감소된 피질 뉴런으로부터의 BDNF 분비, 감소된 피질 뉴런 내 AKT/mTOR 경로 활성 및 감소된 피질 뉴런 내 산소 소비 및 최대 호흡을 포함하는 알려진 질환의 표현형으로 평가한다[de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016.].
실시예 14
유전자 이식 T. 곤디의 이종 목적단백질을 일시적으로(/급성으로) 전달하는 능력의 동물 모델에서의 시험
상기 실시예 13과 유사하게, 전체 유기체의 표현형에 영향을 미치는 능력에 대하여, 기생충의 유전자 이식 주를 시험하였다. 동물 모델에서의 유전자 이식 기생충의 시험은 면역계 및 기능적 혈뇌 장벽(BBB) 내 시스템의 평가를 가능하게 하고, 이는 급분열소체, 느린분열소체 조직 낭포 또는 접합자 형태의 유전자 이식 T. 곤디의 비강내, 경구(구강과 같이), 피하, 근육내, 정맥내, 피부내, 복강내, 두개내 또는 대뇌내 투여에 의해 수행될 수 있다. 동물 모델은 치료가능한 상태를 가지거나, 또는 그 밖에 유전자 이식 기생충에서 발현되는 목적단백질의 전달에 영향을 받는, 야생형 동물 또는 모델 동물일 수 있다. 이러한 실험 설계는 느린분열소체로의 분화 및 만성 감염 및/또는 만성 낭포의 확립에 의존하지 않는 일시적인 전달의 평가에 초점을 맞춘 것이다. 일부 예는 다음을 포함한다: 느린분열소체로 분화할 수 없는, 복제할 수 없는, 및/또는 몇주 이상 시험관내 지속될 수 없는, 또는 그렇지 않으면 만성 감염을 확립할 수 없는, 약독화된 기생충에 의한 전달; 표적 조직 또는 표적 조직에 근접한 영역에의 국소 투여에 의한 전달에 뒤이은 기생충의 제거 또는 비활성화. 이는 또한 반복 투여를 위해 여러번 반복될 수 있다. 감염을 향상시키고 전에 T. 곤디에 이미 감염된 동물의 재감염을 돕기 위하여, 감염 전, 동시 또는 후에 면역억제제를 투여할 수 있다. 이러한 실험 설계는 또한 만성 감염을 확립할 수 있는 유전자 이식 T. 곤디에 의한 전달을 포함하나, 만성 감염의 확립 전 감염의 급성 단계에서 표본의 수집 또는 분석이 수행된다. 이러한 전달의 형태는 유전자 이식 주의 급분열소체의 목적단백질의 분비에 대부분 의존한다. 급성 감염 동안의 상이한 단계에서(균주 및 감염 경로에 의존하는, 감염 후 최초 수일 내지 약 2 개월), 감염된 세포의 백분율을 평가하고, 뇌 및 다른 조직 내 기생충 및 전달된 단백질의 분포를 특징짓고, 전달된 단백질의 수준을 정량화하기 위하여, 뇌 조직 염색을 사용한다. 공동-면역침전 및 세포 형태학이 전달된 단백질과, 받아들이는 세포 내 내인성 대응물 사이의 분자적 상호작용을 확인하기 위하여, 그리고 그들의 기능에 대한 증거를 제공하기 위하여, 사용될 수 있다.
치료로 인한 임의의 잠재적인 독성 뿐만 아니라, 질병 표현형의 징후 및 이를 완화시키는 치료의 효능을 평가하기 위하여, 처리된 동물 모델의 상태를 치료 개시 후 상이한 시점에서, 및 생리학적, 행동학적, 세포 및 분자 측정을 이용한 질병 진행의 상이한 단계에서, 모니터하고 특징지었다. 유전자 이식 기생충의 효과를 치료용 폴리펩티드를 발현시키기 않는 기생충이 처리된 동물 및/또는 허위-처리된 동물과의 비교로 평가한다.
실시예 15
유전자 이식 T. 곤디의 안전성 및 조절가능성을 증가시킬 추가 변형의 도입
비록 기생충은 일반적으로 건강한 인간에게는 무해한 것으로 간주되나, 나아가 그 병독성을 약독화하기 위하여, 기생충에 대한 추가적인 변형이 치료용 균주에 포함될 수 있다. 그의 문(phylum)의 모델 유기체로서, 기생충을 변형시키기 위한 광범위한 고도로 발달된 유전적 도구가 있는데(Jim
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nez-Ruiz E, Wong EH, Pall GS, Meissner M. Parasitology. 2014, 141:1390-8. "Advantages and disadvantages of conditional systems for characterization of essential genes in Toxoplasma gondii"), 이는 약독화되고, 외인성-조절가능한 기생충을 생성하기 위해 사용될 수 있다(Moe-Behrens GH, Davis R, Haynes KA. Front Microbiol. 2013 4:5. "Preparing synthetic biology for the world"). 하나의 접근법은 조작된 영양요구체를 포함한다. 두번째로, 약독화된 기생충은 단백질 약물을 전달하는 능력에 필수적이지 않은 기생충의 특이적 병독 메커니즘을 표적화하고 방해하여 개발될 수 있다. 또 다른 하나의 접근법은 활성화 분자의 투여 시 기생충을 제거하는 유도성 "자살 스위치(suicide switches)" (자기-파괴 요소)와 같은 조작된 유도 치사(lethality)를 통한 능동적 조절을 포함할 수 있다. 일부 예는 생체 내 기생충에서 치사 또는 세포사멸 경로의 약물-유도 활성화를 위한 널리 사용되는 테트라사이클린-유도 프로모터, 또는 필수적 유전자의 유도 녹-아웃 또는 치사 또는 세포사멸 경로의 유도 활성화를 위한 라파마이신-이량화 diCre 시스템을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 또한 이러한 약물-유도 조절은 조직 또는 세포의 약물에의 차별적인 투과성 및 그의 신체 내 상이한 분포로 인한, 특정한 조직, 영역 또는 세포 타입으로부터의 기생충의 차별적인 제거를 가능하게 할 수 있다.
분석 및 토론
본 발명은 뇌 기생충 T. 곤디의 기계를 사용하는 단백질 전달 플랫폼으로, 이는 혈뇌 장벽을 침투하여 단백질을 세포, 특히 CNS 내 뉴런에 전달하게 한다.
치료용 단백질의 CNS로의 전달을 가능하게 하기 위하여, 본 발명자들은 CNS 내 세포로의 목적단백질의 합성 및 전달을 위한 기생충 톡소플라즈마 곤디를 재전용한다(reappropriate). 따라서 본 발명자들은 단백질의 CNS 내 세포로의 특이적이고 조절된 전달을 위한 다목적 플랫폼을 확립한다.
조작된 기생충은 다음의 신규한 능력을 가진다:
(1) 이는 다양한 치료용 이종 단백질을 합성하고, 그것들을 CNS 내 표적 세포로 특이적으로 분비하기 위하여 쉽게 변형될 수 있다.
(2) 이는 감염된 숙주에 대한 유해한 영향을 매개할 수 있는 기생충의 요소를 감소시키거나 제거하는 변형을 포함할 수 있다.
(3) 이는 숙주에서 한 번 그의 분포 및 시공간적 활성을 조절하게 하는, 조절 및/또는 자기-파괴 요소를 포함할 수 있다.
다음은 본원에서 설명된 기생충 게놈 내 변형의 비-제한적 요약이다:
(i) 선택된 치료용 단백질의, 기생충의 특정한 내인성 분비 단백질에의 융합. 그의 표적화 또는 활성에 더 이상 필요하지 않게 된 후, 내인성 기생충 단백질로부터 치료용 단백질의 분리를 가능하게 할 수 있는 절단 부위와 같은 치료용 융합 단백질의 효율을 증가시키거나, 또는 톡소플라즈마, 및 에피토프 태그 및 형광 단백질과 같은 전달된 단백질의 효율 및 분포의 검출 및 평가를 중재할 수 있는 융합 유전자/단백질에 추가의 부수적 요소 및 변형이 추가될 수 있다.
(ii) 기생충의 치료 역할에 있어서 필수적이지 않은 병독성 유전자의 제거. 이들 변형은 환자에 대한 기생충의 잠재적인 유해한 효과를 감소시키며, 안전한 임상적 사용에 관련된다.
(iii) 기생충이 외부에서 투여된 약물에 대한 반응으로 자기-파괴하거나, 또는 기생충의 활성을 조작하도록 유도할 수 있는 조절 요소의 삽입. 이러한 요소는 본 기술의 안전성 특징을 증가시키며, 또한 시공간적 활성의 증가된 조절을 제공한다.
본 발명의 일부 구현예의 방법으로 개발된 초기 균주는 크라베 질환용 갈락토세레브로시다제 및 갈락토세레브로시다제-TAT 단백질, 다양한 신경퇴행성 질환 및 다른 상태(파킨슨병, 핵상 마비, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성측색경화증, 헌팅턴병, 망막 변성, 외상성 뇌 손상 및 저산소/허혈성 CNS 장애 중)용 GDNF 단백질, 카나반 질환용 아스파르토아실라제 단백질, 레트 증후군용 MeCP2 단백질, 척수근위축증용 SMN 단백질, 파킨슨병용 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 파킨 및 리소좀 저장 질환 및 신경퇴행성 질환용 TFEB를 기반으로 하였다. 본 발명자들이 현재 임상적으로 시험되고 보충적 기능이 알려진 많은 수의 치료용 단백질을 선택하였으나, 플랫폼은 광범위한 단백질에 적용될 수 있다.
본 기술의 가능한 응용분야는 이에 제한되는 것은 아니나, 다음을 포함한다:
1. 치료용 단백질의 전달을 통한 상태의 치료;
2. 뇌 기능 증가 또는 신경-재생 촉진의 목적을 위한 건강한 개인의 뇌에의 단백질의 공급;
3. 단백질 합성을 보충하기 위한 매우 특이적이고 효율적인 표적화된 단백질 전달을 위한 일반적인 해결책.
비록 본 발명은 그의 특정한 구현예와 함께 설명되었으나, 많은 대안, 변경 및 변형이 당업자에게 명백하다는 것은 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범위 내에 있는 모든 대안, 변경 및 변형을 포함하고자 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 본원에 참고로 인용된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 참고로서 전체로서 포함된다. 아울러, 본 출원 내 임의의 참고문헌의 인용 또는 확인은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술로서 이용가능하다는 인정으로 해석되어서는 안된다. 섹션 제목이 사용되는 한, 그들이 반드시 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
[참고문헌]
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Claims (40)

  1. 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마(Toxoplasma) 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물로 형질전환된 톡소플라즈마로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 유도 프로모터, 잠복기-특이적 프로모터, 및 톡소필린(Toxofilin) 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터:로 구성된 군에서 선택되며, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 GRA16 및 GRA24로 구성된 군에서 선택되는 밀집 과립 단백질이고 숙주세포로 분비되며, 중추신경계의 병리의 치료에 사용하기 위한 톡소플라즈마.
  2. 제1항에 있어서, 상기 톡소프라즈마는 감염된 상기 숙주세포에서 지속되는, 톡소플라즈마.
  3. 약학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열의 상류에 융합된 프레임 내 톡소플라즈마(Toxoplasma) 분비 단백질을 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물로 형질전환된 톡소플라즈마로서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 톡소플라즈마에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 유도 프로모터, 잠복기-특이적 프로모터, 및 톡소필린(Toxofilin) 프로모터가 아닌 톡소플라즈마 내인성 프로모터:로 구성된 군에서 선택되며, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 비-곤봉체 단백질이고 숙주세포로 분비되며, 중추신경계의 병리의 치료에 사용하기 위한 톡소플라즈마.
  4. 제3항에 있어서, 상기 톡소프라즈마는 감염된 상기 숙주세포에서 지속되는, 톡소플라즈마.
  5. 제3항에 있어서, 상기 톡소플라즈마 분비 단백질은 미세간상체 단백질 및 톡소플라즈마 곤디 대식세포 이동 저해 인자(TgMIF)로 구성된 군에서 선택되는, 톡소플라즈마.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미세간상체로부터 분비되는 상기 단백질은 서열번호 280 내지 322로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 톡소플라즈마.
  7. 제1항에 있어서, 상기 헥산 구조물은 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함하는, 톡소플라즈마.
  8. 제3항에 있어서, 상기 헥산 구조물은 유도성 자기-파괴 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함하는, 톡소플라즈마.
  9. 제1항에 있어서, 단 상기 핵산 구조물은 Cre-재조합효소 코딩 서열을 포함하지 않는, 톡소플라즈마.
  10. 제7항에 있어서, 상기 유도성 자기-파괴 요소는 약물에 반응하여 활성인, 톡소플라즈마.
  11. 제8항에 있어서, 상기 유도성 자기-파괴 요소는 약물에 반응하여 활성인, 톡소플라즈마.
  12. 제1항에 있어서, 상기 헥산 구조물은 상기 톡소플라즈마 분비 단백질로부터 상기 약학적 폴리펩티드의 분리를 허용하는 적어도 하나의 프레임 내 절단 부위를 추가로 포함하는, 톡소플라즈마.
  13. 제3항에 있어서, 상기 헥산 구조물은 상기 톡소플라즈마 분비 단백질로부터 상기 약학적 폴리펩티드의 분리를 허용하는 적어도 하나의 프레임 내 절단 부위를 추가로 포함하는, 톡소플라즈마.
  14. 제1항에 있어서, 약독화되지 않은, 톡소플라즈마.
  15. 제3항에 있어서, 약독화되지 않은, 톡소플라즈마.
  16. 제1항에 있어서, 숙주 세포에서 상기 톡소플라즈마의 증식을 촉진시키는 톡소플라즈마 요소가 존재하지 않는, 톡소플라즈마.
  17. 제3항에 있어서, 숙주 세포에서 상기 톡소플라즈마의 증식을 촉진시키는 톡소플라즈마 요소가 존재하지 않는, 톡소플라즈마.
  18. 제1항에 있어서, 개체의 중추신경계(CNS)로의 목적단백질(protein-of-interest)의 전달에 필요하지 않은 독성 유전자가 없는, 톡소플라즈마.
  19. 제3항에 있어서, 개체의 중추신경계(CNS)로의 목적단백질(protein-of-interest)의 전달에 필요하지 않은 독성 유전자가 없는, 톡소플라즈마.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 톡소플라즈마 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
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