CN109757100A - 用于向中枢神经系统（cns）递送蛋白质的工程改造的寄生虫 - Google Patents

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Abstract

提供的是核酸构建体，包含其的弓形虫，包含其的药物组合物和使用其用于将目标蛋白质递送至主体的目标组织，例如CNS，并且进一步治疗可通过在主体的中枢神经系统中施用治疗性多肽来治疗的病理状况的方法。

Description

用于向中枢神经系统（CNS）递送蛋白质的工程改造的寄生虫
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及用于分泌与刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）分泌的多肽融合的药物多肽的核酸构建体，以及包含其的弓形虫，并且更具体地但非唯一地，涉及药物组合物和使用其用于治疗主体的方法。
缺乏用于递送蛋白质治疗剂的稳健方法在很大程度上是将它们转化为临床治疗的当前瓶颈。蛋白质经常发挥高度特异性和复杂的功能集合，所述功能无法通过简单的化学化合物进行模拟（（Nat Rev Drug Discov. 2008；7（1）:21-39. Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification. Leader B，Baca QJ，和Golan DE）；然而，由于它们的大分子性质，将治疗性蛋白质递送至体内的靶位点是极具挑战性的。在施用后或在贮存期间的低功能稳定性和快速活性丧失，连同通过生物屏障的低渗透性，限制了活性蛋白质的递送。化学修饰、缀合物和载体系统的持续发展辅助一些治疗性蛋白质的递送，但这些蛋白质仍主要限于“可接近的靶空间”内的靶 – 在血管区室中或在细胞的表面上（Mitragotri 2014，Nat. Rev. Drug. Discov. 13（9）:655-72）。由于血脑屏障（BBB），有效递送在神经疾病领域中特别具有挑战性，所述血脑屏障紧密地调节分子对大脑的转运，而当靶在细胞内时，增加了进一步的复杂性。
为了向CNS内的细胞递送补充蛋白质，有必要开发穿透BBB且可以靶向CNS内的特定细胞的机制。
目前，用于治疗由特定蛋白质缺乏引起的状况的主要方法是基因疗法、干细胞疗法和酶替代疗法。
基因疗法是插入编码治疗性蛋白质的基因的功能性拷贝（Cox，D. B. T.等人，2015），其旨在增加蛋白质功能性拷贝的表达。虽然基因疗法提供了正确的基因序列，但它没有解决由翻译机制或翻译后修饰中的缺陷引起或者伴随翻译机制或翻译后修饰中的缺陷的蛋白质功能丧失的问题。另外，由于插入诱变（Persons，D. A. & Baum，C. 2011）、动员、种系传播、免疫原性和有限的转基因容量（Schambach，A.等人，2013；Al-Dosari等人，2009），它可能具有癌症发展的风险。为了靶向CNS，基因疗法最常通过使用病毒载体来介导，所述病毒载体包括衍生自单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、腺病毒、AAV、慢病毒如HIV-1、猫免疫缺陷病毒或马传染性贫血病毒的病毒载体、以及最近的SV40-AAV和其为那些目前最常见的慢病毒。虽然一些病毒载体比其它病毒载体更安全，但它们没有解决蛋白质加工缺陷的问题，并且临床效率仍是有限的。
干细胞疗法依赖于植入细胞的蛋白质合成机制，其可以补充蛋白质的缺陷性内源合成。尽管在临床上实现该方法的众多努力，但此类治疗的效率通过植入细胞的排斥以及使用患者特异性干细胞的低成本效率而降低。另外，干细胞治疗中涉及的风险包括与减少移植细胞的排斥所需的免疫抑制相关的并发症，以及癌症的发展（Dimmeler，S.等人，2014）。
其中补充蛋白质在外部合成然后递送到CNS内的蛋白质或酶替代疗法（ERT），必须克服BBB的不可渗透性，并且开发精确的靶向以便具有临床相关性。蛋白质递送的一种此类方法是直接注射到大脑或邻近器官内，蛋白质可以由其以低效率扩散。因此，除此类方法的风险之外，以必要量靶向CNS内的特定区域的能力是有限的。此类方法的另一个问题是需要重复给药，这在临床上经常是不切实际的（Abbott，N. J. 2013）。
ERT可以与BBB通透性的增加组合，以允许治疗性蛋白质以更高的效率扩散到CNS内（Malhotra，M. & Prakash，S. 2011）。这通过组成BBB的细胞的收缩或通过BBB转运机制的操纵来实现。然而，由于调理作用，这种方法是无效的，并且具有不需要的物质连同补充的目标蛋白一起扩散到CNS内的风险（Bradbury，M. W. B. 2012）。
另一种方法是治疗性蛋白质与进入CNS的要素的附着，以利用它们穿过BBB的固有能力。可以介导跨越BBB的运输的试剂包括融合蛋白、树枝状聚合物、固体脂质纳米颗粒、脂质体和纳米颗粒（Solaro，R.，2010）。然而，这些方法需要进一步开发并且尚未达到临床试验。
刚地弓形虫是顶复门的单细胞细胞内原生动物寄生虫。它的主要宿主是猫科动物，并且只有在所述猫科动物中，它才能经历其生命周期的性阶段。然而，作为次生宿主，它可以感染许多温血生物，包括人。在人中，如在啮齿动物中，在宿主接触寄生虫后（通常在摄入感染性组织囊肿或卵囊后），寄生虫分化成快速复制的速殖子阶段。刚地弓形虫速殖子通过主动穿透侵入有核宿主细胞并且建立液泡，在所述液泡内它们通过胞内生殖复制。速殖子行进通过肠上皮，并且通过在免疫细胞上的“搭便车（hitch-hiking）”和通过自主动员其自身，它们到达远端组织，破坏血脑屏障并且在脑中扩散[Harker 2015，ParasiteImmunol. 37（3）:141-9]。因此，速殖子进入循环并且传播到次级组织。在感染的急性期过程中，复制对于传播和到达远端组织至关重要。一旦在大脑独特的环境内，刚地弓形虫就穿透大脑中的细胞（主要是神经元，以及较低比例的神经胶质细胞），并且在免疫压力下，它分化为潜在的缓殖子阶段，并且位于细胞质细胞间囊肿中。这表征为慢性感染（Cabral等人2016，PLoS Pathog. 12（2）:e1005447）。具有缓殖子的组织囊肿对于宿主的一生中持续存在，同时非常缓慢地繁殖且具有静止代谢程序（Parasite Immunol. 2015，37（3）:141-9.“Toxoplasma gondii dissemination: a parasite's journey through the infectedhost” ）。
虽然刚地弓形虫感染了估计三分之一的世界人口，但感染在健康人中仍然无症状（Montoya，J. G. & Liesenfeld，O. 2004），并且主要仅对于具有不规则受损的免疫系统的个体具有风险。最重要的是，在感染期间，刚地弓形虫在细胞入侵期间和细胞内时均将蛋白质分泌到宿主的细胞内。刚地弓形虫具有三种类型的电子致密的分泌细胞器：微线体、棒状体和致密颗粒。宿主细胞入侵由所有三种细胞器的内容物的序贯分泌介导，当寄生虫侵入宿主细胞时以及当它位于其内时，所述三种细胞器从顶端区域被胞吐（Dlugonska，H.2008）。微线体涉及刚地弓形虫的附着和穿透，而棒状体是创建瞬态结构、移动连接然后建立PV所必需的。在称为“亲吻和吐痰（kiss and spit）”的过程中，棒状体蛋白质在与宿主初次接触时分泌（Boothroyd，J. C.等人，2008）。致密颗粒在大多数寄生虫阶段自始至终分泌蛋白质。分泌过程与液泡内网络的形成一致，并且在刚地弓形虫的细胞内停留期间持续（Dlugonska，H. 2008；Carruthers，V. B. & Sibley，L. D. 1997）。
另外的背景技术包括Koshy，A. A.等人2010；US8673289；US20120045477 A1；Lodoen M.B.,等人2010. Cellular Microbiology，12: 55–66。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含异源多核苷酸的核酸构建体，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是启动子不是Toxofilin启动子。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含至少两种核酸构建体的核酸构建体系统，其中所述至少两种核酸构建体的第一核酸构建体是本发明的一些实施方案的核酸构建体，并且所述至少两种核酸构建体的第二核酸构建体包含编码可选择标记物的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用本发明的一些实施方案的核酸构建体或本发明的一些实施方案的核酸构建体系统转化的弓形虫。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，其包含本发明的一些实施方案的弓形虫和药学可接受的载体。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了将目标蛋白质施用到主体的中枢神经系统内的方法，该方法包括：向主体施用本发明的一些实施方案的弓形虫或本发明的一些实施方案的药物组合物，从而将目标蛋白质施用于主体的中枢神经系统。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有此需要的主体的方法，其包括向主体施用本发明的一些实施方案的弓形虫或本发明的一些实施方案的药物组合物，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有此需要的主体的方法，其包括向主体施用包含核酸构建体的弓形虫，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
根据本发明的一些实施方案，启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是启动子不是Toxofilin启动子。
根据本发明的一些实施方案，内源性启动子不是棒状体蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫是未减毒的。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的棒状体分泌。
根据本发明的一些实施方案，由棒状体分泌的弓形虫分泌的蛋白质包括Toxofilin和/或ROP1。
根据本发明的一些实施方案，由棒状体分泌的弓形虫分泌的蛋白质包含选自SEQID NO：344-465的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质是非棒状体蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质选自微线体蛋白质和致密颗粒蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的致密颗粒分泌。
根据本发明的一些实施方案，由致密颗粒分泌的弓形虫分泌的蛋白质包含GRA16和/或GRA24。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的微线体分泌。
根据本发明的一些实施方案，由微线体的蛋白质包含选自SEQ ID NO：280-322的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，由致密颗粒分泌的蛋白质包含选自SEQ ID NO：234-279的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质包含刚地弓形虫巨噬细胞移动抑制因子（TgMIF）。
根据本发明的一些实施方案，异源多核苷酸进一步包含弓形虫分泌的蛋白质开放读码框上游和/或下游的弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫5'-非翻译区（5'-UTR）置于弓形虫分泌的蛋白质开放读码框的上游。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫3'-非翻译区（3'-UTR）置于弓形虫分泌的蛋白质开放读码框的下游。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫3'非翻译区（3'-UTR）核酸序列是GRA2 3'-UTR、GRA16 3'-UTR、GRA24 3'-UTR、SAG1 3'-UTR或DHFR 3'-UTR。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫5'非翻译区（5'-UTR）核酸序列是GRA2 5'-UTR、GRA16 5'-UTR、GRA24 5'-UTR、SAG1 5'-UTR或DHFR 5'-UTR。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是GRA2启动子、GRA16启动子、GRA24启动子、SAG1启动子或DHFR启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列是Toxofilin 3'-UTR。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体进一步包含编码诱导型自毁元件的第三核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，编码诱导型自毁元件的第三核酸序列包含在相同的核酸构建体中，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，编码诱导型自毁元件的第三核酸序列包含在关于核酸构建体的分开的核酸构建体中，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体不包含Cre重组酶编码序列。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体不包含beta（β）-内酰胺酶（BLA）编码序列。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体适合于整合到弓形虫的基因组内。
根据本发明的一些实施方案，诱导型自毁元件对药物具有活性。
根据本发明的一些实施方案，药物包含抗生素。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体进一步包含至少一个框内切割位点，其允许药物多肽与弓形虫分泌的蛋白质的脱离。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫缺乏促进弓形虫在宿主细胞中繁殖的元件。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫缺乏毒力基因，其对于将目标蛋白质递送到主体的CNS内不是必需的。
根据本发明的一些实施方案，异源多核苷酸进一步包含编码可选择标记物的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，可选择标记物包含氯霉素乙酰转移酶（CAT）、DHFR-TS、BLE、HXGPRT、UPRT、TK、CD、荧光蛋白（例如GFP、YFP、RFP、mCherry或其它）或表位标签（例如HA、Myc、Ty-1、FLAG或其它）。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物用于治疗被诊断有病理状况的主体，所述病理状况的特征在于主体的中枢神经系统中的缺陷型内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物用于治疗被诊断有病理状况的主体，所述病理状况可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽来治疗。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物进一步包含免疫抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫之前和/或在施用弓形虫之后和/或在施用弓形虫同时，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫之前，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫之后，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫的同时，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含对应于能够治疗病理状况的内源性蛋白质的野生型氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的抗体。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的抗原。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的毒素。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含酶、结构多肽、运动多肽、调节多肽、贮存多肽、信号传导/配体多肽、受体多肽、感觉多肽、抗体、蛋白质通道和/或转运多肽。
根据本发明的一些实施方案，施用通过外周施用来执行。
根据本发明的一些实施方案，外周施用包括静脉内施用。
根据本发明的一些实施方案，外周施用包括经口施用。
根据本发明的一些实施方案，施用通过对中枢神经系统的直接施用来执行。
根据本发明的一些实施方案，与内源性蛋白质的野生型氨基酸序列相比，缺陷型内源性蛋白质包含内源性蛋白质的至少一个氨基酸的缺失、插入和/或取代。
根据本发明的一些实施方案，与缺乏病理状况的健康主体中的内源性蛋白质水平相比，缺陷型内源性蛋白质包含降低水平的内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，缺陷型内源性蛋白质在诊断有病理状况的主体中不存在内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是半乳糖脑苷脂酶（GALC）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是半乳糖脑苷脂酶（GALC）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4或同种型5。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）同种型1或MECP2同种型2。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4或同种型5。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是天冬酰转移酶（ASPA）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是存活运动神经元蛋白（SMN1）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是存活运动神经元蛋白质同种型SMN、同种型SMN-δ5、同种型SMN-δ7或同种型SMN-δ57。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是Parkin（PARK2）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是Parkin（PARK2）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4、同种型5、同种型6、同种型7或同种型8。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是转录因子EB（TFEB）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是转录因子EB（TFEB）同种型1或同种型2。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是TALEN（TALE核酸酶）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是TALE TF（TALE转录因子）。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有克拉伯病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有雷特综合征。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有卡纳万病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有脊髓性肌萎缩。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有帕金森氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有缺氧/缺血性或神经炎性CNS病症。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有阿尔茨海默氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有肌萎缩侧索硬化。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有亨廷顿氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有溶酶体贮积病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有MECP2重复综合征。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括向主体施用能够诱导自毁元件的药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括向主体施用维持宿主细胞和/或体内的弓形虫所必需的分子。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是抗生素。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是小分子。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是代谢产物。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性方法和/或材料，但与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试。在冲突的情况下，专利说明书（其包括定义）为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在必需是限制性的。
附图的几个视图的简述
仅作为例子，本发明的一些实施例在本文中关于附图进行描述。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示的细节是作为例子并且出于说明性讨论本发明的实施例的目的。在这方面，与附图结合的描述使得可以如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员显而易见。
在图中：
图1是本发明的一些实施方案的临床概念的图示。（1）将选择的药物多肽编码序列与刚地弓形虫可分泌的多肽编码序列融合；（2）将核酸构建体引入弓形虫内；（3）融合蛋白在寄生虫内部表达，并且定位至寄生虫的分泌细胞器（此处显示棒状体作为例子）；（4）寄生虫进入主体的CNS，并且到达病理状况部位；（5）蛋白质分泌到主体的细胞内，并且拯救病理表型。
图2描绘了用于基于pGRA主链生成治疗性转基因刚地弓形虫系的构建体的示意图。核酸构建体包含开放读码框（ORF），其由治疗性多肽编码序列与刚地弓形虫Toxofilin编码序列和“HA”标签的框内融合物组成。ORF的上游是Toxofilin基因的内源性5’ UTR（非翻译区）（充当启动子的Toxofilin 5'-UTR），并且ORF的下游是丰富的致密颗粒蛋白质GRA2的3’ UTR（GRA2 3'-UTR）。该构建体还含有由HXGPRT基因组成的可选择标记物盒，所述HXGPRT基因嵌套在DHFR-TS的内源性5’ UTR和3’ UTR之间。构建体中还包括的是细菌表达盒，其包括可选择的抗生素抗性。
图3描绘了用于基于pGRA主链生成治疗性转基因刚地弓形虫系的构建体的示意图。核酸构建体包含ORF，其由治疗性多肽编码序列与刚地弓形虫GRA16编码序列和“HA”标签的框内融合物组成。ORF的上游是GRA16基因的内源性5’ UTR（充当启动子的GRA16 5'-UTR），并且ORF的下游是丰富的致密颗粒蛋白质GRA2的3'UTR（GRA2 3'-UTR）。该构建体还含有由HXGPRT基因组成的可选择标记物盒，所述HXGPRT基因嵌套在DHFR-TS的内源性5'UTR和3'UTR之间。构建体中还包括的是细菌表达盒，其包括可选择的抗生素抗性。
图4A-I描绘了哺乳动物细胞（HFF）内的新型寄生虫品系，其中所述寄生虫品系表达Toxofilin融合的治疗性蛋白质天冬酰转移酶（ASPA）、存活运动神经元蛋白（SMN1）、甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）和半乳糖脑苷脂酶- TAT Δ43（在一般材料和实验方法节段中也称为“突变的GALC-TAT”），呈现对寄生虫的分泌性棒状体细胞器的特异性定位。图4A - 细胞内的刚地弓形虫的示意性结构，突出显示了棒状体。红色：内膜复合物（IMC），蓝色：DNA（宿主细胞核和刚地弓形虫核），绿色：棒状体蛋白质；图4B-I - 在HFF细胞上生长的寄生虫的荧光显微镜检查分析，表达内源性加上HA标签的Toxofilin-ASPA（图4B和4C）、加上HA标签的Toxofilin-SMN1（图4D和4E）、加上HA标签的Toxofilin-MECP2（图4F和4G）、以及使用抗HA抗体（所有实验对象组中的绿色）突变的加上HA标签的Toxofilin-GALC-TAT（图4H和4I），使用抗IMC1抗体（红色）和DAPI（蓝色）与内膜复合物IMC1共染色，或显示在细胞的偏振光图像（灰度）之上。寄生虫显示在混合群体中，而只有显示绿色染色的寄生虫表达转基因蛋白质。在图4B-I中所示的所有图像中，比例尺= 5 μM。
图5A-I描绘了哺乳动物细胞（HFF）内的新型寄生虫品系，其中所述寄生虫品系表达GRA16融合的治疗性蛋白质天冬酰转移酶（ASPA）、存活运动神经元蛋白（SMN1）和甲基-CpG结合蛋白2（MECP2），呈现对寄生泡（PV）空间以及宿主细胞核的特异性定位。图5A - 宿主细胞（成纤维细胞）内寄生泡中的细胞内的刚地弓形虫寄生虫的图示，突出显示了分泌的致密颗粒效应蛋白的分布。红色：内膜复合物（IMC），蓝色：DNA（宿主细胞核和刚地弓形虫核），黄色：致密颗粒分泌的效应蛋白，橙色：寄生泡。图5B-I - 在HFF细胞上生长的寄生虫的荧光显微镜检查分析，表达内源性加上HA标签的GRA16-ASPA（图5B和5C）、加上HA标签的GRA16-SMN1（图5D和5E）、以及使用抗HA抗体（所有组中的绿色）加上HA标签的GRA16-MECP2（图5B-G中为100x放大率且图5H-I中为40x放大率），使用抗IMC1抗体（红色）和DAPI（蓝色）与内膜复合物IMC1共染色，或显示在细胞的偏振光图像之上。寄生虫显示在混合群体中，而只有显示绿色染色的寄生虫表达转基因蛋白质。比例尺= 5 μM（对于图5B-G）。比例尺= 20μM（对于图5H-I）。
图6A-B是TALE核酸酶（图6A）和TALE转录因子（图6B）的图示，作为例子，其设计为“TACGTACG”（SEQ ID NO：4505）靶序列。根据靶序列中核苷酸的次序，呈现了TALE重复。应注意，由于TALE的性质，第一个核苷酸总是必须是T（因此它整合在TAL N末端中并且未注释），并且最后一个核苷酸（在这种情况下为G）表示为半单体（因此它注释为“半重复”）。为了由本发明的一些实施方案的弓形虫表达且分泌，将这些构建体的开放读码框（ORF）插入本发明的一些实施方案的核酸构建体中。对于TALE_Nuc（TALE核酸酶），ORF来自NLS直至FokI之后（例如，由SEQ ID NO：4506所示的多核苷酸的核苷酸2113-4104）。对于TALE-TF（TALE转录因子），ORF来自EGFP后的TALE N末端（N末端）（例如，由SEQ ID NO：4507所示的多核苷酸的核苷酸2120-5005）。“TALE-TF”= TALE转录因子；“TALEN”= TALE核酸酶。“NI”、“NG”、“NN”和“HD”= 如下文实施例5中所述的单体。
图7描绘了用于生成治疗性转基因刚地弓形虫系的构建体的示意图。核酸构建体包含开放读码框（ORF），其由治疗性多肽编码序列与刚地弓形虫Toxofilin编码序列和“HA”标签的框内融合物组成。ORF的上游是Toxofilin基因的内源性5’ UTR（非翻译区）（“Toxofilin 5'-UTR”），并且ORF的下游是丰富的致密颗粒蛋白质GRA2的3’ UTR（“GRA23'-UTR”）。该构建体还含有由HXGPRT基因、DHFR-TS基因或mCherry基因组成的可选择标记物盒，所述基因嵌套在DHFR-TS的内源性5’ UTR和3’ UTR之间。构建体中还包括的是细菌表达盒，其包括可选择的抗生素抗性，用于分子克隆。
图8描绘了用于生成治疗性转基因刚地弓形虫系的构建体的示意图。核酸构建体包含ORF，其由治疗性多肽编码序列与刚地弓形虫GRA16编码序列和HA标签的框内融合物组成。ORF的上游是GRA16基因的内源性5’ UTR（“GRA16 5'-UTR”），并且ORF的下游是丰富的致密颗粒蛋白质GRA2的3’ UTR（“GRA2 3'-UTR”）。该构建体还含有由HXGPRT基因、DHFR-TS基因或mCherry基因组成的可选择标记物盒，所述基因嵌套在DHFR-TS的内源性5’ UTR和3’UTR之间。构建体中还包括的是细菌表达盒，其包括可选择的抗生素抗性，用于分子克隆。
图9A-N描绘了哺乳动物细胞（HFF）内的转基因寄生虫的图像，其中所述寄生虫品系表达12种新型Toxofilin融合的治疗性蛋白质。图9A-细胞内的刚地弓形虫的示意性结构，突出显示了棒状体。品红色：内膜复合物（IMC），青色：DNA（宿主细胞核和刚地弓形虫核），黄色：棒状体蛋白质；图9B- 在HFF细胞中生长的刚地弓形虫的代表性荧光显微镜检查图像，对于棒状体标记物ROP2/4（黄色）进行免疫染色。左：用DAPI（青色）共染色，右：覆盖在偏振光图像（灰度）上。图9C-N- 表达加上HA标签的Toxofilin融合的治疗性蛋白质的转基因寄生虫的图像：图9C - 天冬酰转移酶（ASPA），图9D - 天冬酰转移酶密码子优化的（ASPAopt），图9E - 半乳糖脑苷脂酶（GALC），图9F - 半乳糖脑苷脂酶密码子优化的（GALCopt），图9G - 半乳糖脑苷脂酶-TAT（GALC-TAT），图9H - 半乳糖脑苷脂酶- TAT Δ43（GALC- TAT Δ43-在一般材料和实验方法节段中也称为“突变的GALC-TAT”），图9I –神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF），图9J - 甲基-CpG结合蛋白2（MECP2），图9K -甲基-CpG结合蛋白2密码子优化的（MECP2opt），图9L - Parkin（PARK2），图9M - 存活运动神经元蛋白（SMN1）和图9N - 转录因子EB密码子优化的（TFEBopt）。表达Toxofilin-ASPAopt、Toxofilin-GALC-TAT Δ43、Toxofilin-GDNF、Toxofilin-MeCP2opt、Toxofilin-PARK2、Toxofilin-SMN1和Toxofilin-TFEB的寄生虫的示例性图像显示定位至寄生虫的分泌性棒状体细胞器。使用抗HA抗体（黄色）对Toxofilin融合蛋白进行免疫染色。左：用DAPI（青色）和寄生虫标记物抗IMC-1（品红色）共染色，右：覆盖在偏振光图像（灰度）上。寄生虫显示在混合群体中，而只有显示黄色染色的寄生虫表达转基因蛋白质。比例尺 = 5 μM。
图10A-J描绘了哺乳动物细胞（HFF）内的转基因寄生虫的图像，其中所述寄生虫品系表达8种新型GRA16融合的治疗性蛋白质。图10A- 宿主细胞内的寄生泡中的细胞内弓形虫寄生虫的图示，突出显示了分泌的致密颗粒效应蛋白的分布。品红色：内膜复合物（IMC），青色：DNA（宿主细胞核和刚地弓形虫核），黄色：致密颗粒分泌的效应蛋白，橙色：寄生泡；图10B-在HFF细胞中生长的刚地弓形虫的代表性荧光显微镜检查图像，表达加上HA标签的GRA16蛋白并且用抗HA（黄色）进行免疫染色。左：用DAPI（青色）共染色，右：覆盖在偏振光图像（灰度）上。图10C-J - 表达加上HA标签的GRA16融合的治疗性蛋白质的转基因寄生虫的示例性图像：图10C-天冬酰转移酶（ASPA），图10D - 存活运动神经元蛋白（SMN1），图10E-半乳糖脑苷脂酶（GALC），图10F- 半乳糖脑苷脂酶-TAT（GALC-TAT），图10G- 天冬酰转移酶密码子优化的（ASPAopt）。图10H-半乳糖脑苷脂酶密码子优化的（GALCopt），图10I -甲基-CpG结合蛋白2密码子优化的（MECP2opt）和图10J - 转录因子EB密码子优化的（TFEBopt）。GRA16-ASPA、GRA16-SMN1、GRA16-ASPAopt、GRA16-MECP2opt和GRA16-TFEBopt显示定位至寄生泡。GRA16-MECP2opt和GRA16-TFEBopt也显示定位至宿主细胞核。使用抗HA抗体（黄色）对GRA16融合蛋白进行免疫染色。左：用DAPI（青色）和寄生虫标记物抗IMC-1（品红色）共染色，右：覆盖在偏振光图像（灰度）上。寄生虫显示在混合群体中，而只有显示黄色染色的寄生虫表达转基因蛋白质。比例尺 = 5 μM。
图11A-C-随着时间过去和感染复数（MOI），通过品系RH GRA16-HAstop、GRA16-MECP2opt和GRA16-TFEBopt的速殖子对HFF细胞核的蛋白质递送的动力学。使用GE IN CellInvestigator软件（GE healthcare，Chicago，IL，USA），通过自动图像分析计数感染细胞和核递送。图代表来自总共3种品系的聚集结果。
图12A-C-用刚地弓形虫品系RH GRA16-HAstop（图12A）、GRA16-MECP2opt（图12B）和GRA16-TFEBopt（图12C）感染后16-22小时，体外分化的LUHMES人神经元细胞的代表性图像。使用抗HA抗体（黄色）对GRA16融合蛋白进行免疫染色，并且用DAPI（青色）和成熟神经元抗NeuN的标记物（品红色）共染色。在每个图的左侧上的插图显示仅用抗HA（顶部，黄色）、抗HA和DAPI（中间，黄色和青色）、以及抗HA和NeuN（底部，黄色和品红色）显现的受感染的细胞。所有品系都显示明显的分泌，并且将融合蛋白靶向人神经元的核。
图13A-D- 用转基因系RH GRA16-MECP2opt的速殖子感染后12小时，来自P1小鼠幼仔的皮层和海马的免疫组织化学染色的富含神经元的原代培养物的代表性图像。使用抗HA抗体（黄色）对GRA16-MeCP2融合蛋白进行免疫染色。图13A - 单独的GRA16-MeCP2（黄色）。图13B - 单独的DAPI（青色）。图13C - GRA16-MeCP2和DAPI染色的合并。图13D - 覆盖在偏振光图像（灰度）上的GRA16-MeCP2（黄色）、DAPI（青色）和NeuN（品红色）的合并。递送的GRA16-MeCP2opt证实与神经元的核中浓缩的异染色质DNA区域共定位的特征模式，提示递送的MeCP2与异染色质的有效结合。
图14是用MOI=1的RH GRA16-MECP2opt转基因刚地弓形虫品系感染，免疫沉淀且用MeCP2特异性抗体印迹的R306C MeCP2-突变型人LUHMES神经元的核提取物的蛋白质印迹。印迹显示对应于内源突变的MeCP2和刚地弓形虫递送的MeCP2的两个条带。由于与GRA16的融合，刚地弓形虫递送的MeCP2具有更高的分子量。
图15A-C显示了HFF细胞中的转基因刚地弓形虫品系Pru GRA16-MECP2opt的体外分化的缓殖子的示例性图像。使用抗HA抗体（红色）对GRA16-MeCP2融合蛋白进行免疫染色。图15A - 单独的GRA16-MeCP2。图15B - 与缓殖子囊肿壁标记物双花扁豆（DolichosBiflorus）凝集素（DBA）（绿色）和DAPI（蓝色）共染色，绿色显示寄生虫囊肿，且蓝色显示在含有囊肿的宿主成纤维细胞的核内，用HA染色（红色）的GRA16-MeCP2融合蛋白的宿主成纤维细胞（HFF）的核。图15C - 与DBA共染色且覆盖在偏振光图像（灰度）上。所呈现的囊肿显示GRA16-MeCP2的连续表达，融合蛋白的分泌和靶向至处于缓殖子阶段的宿主细胞的核。白色箭头指向含有缓殖子囊肿的细胞的核，其含有递送的蛋白质GRA16-MeCP2。
本发明的具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及用于分泌与药物多肽融合的弓形虫分泌的蛋白质的核酸构建体，以及包含其的弓形虫，并且更具体地但非唯一地，涉及药物组合物和使用其用于治疗主体的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用中不一定限于下述描述中阐述或通过实施例例证的细节。本发明能够具有以各种方式实践或进行的其它实施例。
本发明人已发现用编码异源多肽的遗传构建体转化的弓形虫寄生虫合成异源多肽且将其递送至哺乳动物细胞（图4B-I、5B-I、9B-N、10B-J、11A-C、12A- C、13A-D、14和15A-C以及下文实施例节段）。在哺乳动物细胞内，异源多肽穿梭至其在细胞中的活性区域，在那里它能够增强与内源药物蛋白质的已知功能相关的细胞过程。例如，本发明人生成了I型和II型弓形虫品系，其表达哺乳动物蛋白质MeCP2和TFEB且将其递送到小鼠和人细胞内，与弓形虫分泌的蛋白质GRA16翻译融合，并且将融合的治疗性蛋白质分泌到用弓形虫离体处理的哺乳动物细胞内的所需细胞定位（核）内（图13A-D），因此证明了构建体、弓形虫和方法用于将治疗性多肽特异性递送到主体内且治疗主体的可行性。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含异源多核苷酸的核酸构建体，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是启动子不是Toxofilin启动子。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体适合于在弓形虫中表达。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体不包含Cre重组酶编码序列。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体不包含beta（β）-内酰胺酶（BLA）编码序列。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体适合于整合到弓形虫的基因组内。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫缺乏促进弓形虫在宿主细胞中繁殖的元件（例如，对于逃避宿主的免疫系统重要的元件、对于某些代谢产物的生产或利用必需的元件、对于抵抗某些毒素或抗生素重要的元件），但包括内源性功能性CPSII。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫缺乏毒力基因，其对于将目标蛋白质递送到主体的CNS内不是必需的。
核酸构建体包括用于以组成型、瞬时、调节或可诱导方式指导多核苷酸序列在弓形虫细胞中的转录的启动子序列。
如所提及的，异源多核苷酸与用于指导异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接。
如果调节序列能够对与其连接的编码序列发挥调节作用，则编码核酸序列与调节序列（例如，启动子）“可操作地连接”。
如本文使用的，术语“启动子”指DNA区域，其位于RNA聚合酶与之结合以起始RNA的转录的基因的转录起始位点的上游。启动子控制基因表达的时机和强度，例如，在其下表达基因的寄生虫和/或宿主细胞的寿命中的阶段或条件。
根据本发明的一些实施方案，启动子对用于表达核酸构建体的弓形虫是异源的。
根据本发明的一些实施方案，启动子是组成型启动子。
根据本发明的一些实施方案，启动子是诱导型启动子。
根据本发明的一些实施方案，启动子是潜伏期特异性启动子。
根据本发明的一些实施方案，启动子是弓形虫内源性启动子，条件是启动子不是Toxofilin启动子。
根据本发明的一些实施方案，启动子不是Toxofillin内源性启动子。应注意，预测的Toxofillin启动子（基因ID ID=TGME49_214080的预测启动子；SEQ ID NO：3689）含有在实施例节段的一些实验中使用的Toxofilin启动子（SEQ ID NO：4482）和上游的另外核苷酸。
根据一些实施方案，启动子不包含由SEQ ID NO：3689和/或SEQ ID NO：4482所示的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，内源性启动子不是棒状体蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是GRA2启动子、GRA16启动子、GRA24启动子、SAG1启动子或DHFR启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是GRA2启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是GRA16启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是GRA24启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是SAG1启动子。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫内源性启动子是DHFR启动子。
本文下表1列出了合适的内源性启动子，其可以克隆到本发明的一些实施方案的核酸构建体内，以便驱动异源多核苷酸在弓形虫中的表达。
表1
合适的内源性启动子
表1. 提供的是内源性启动子的非限制性实例，所述内源性启动子可以连同本发明的一些实施方案的构建体一起使用。基于基因周围的组蛋白标记物数据获得预测的启动子序列。
表2列出了合适的组成型和诱导型启动子，其可以克隆到本发明的一些实施方案的核酸构建体内。
表2，组成型和诱导型启动子
<i>启动子名称</i> <i>模式</i> <i>启动子SEQ ID NO:</i>
5RT70 组成型启动子 4031
DHFR 组成型启动子 4032
MIC2 组成型启动子 4033
MIC8 组成型启动子 4034
SAG1 组成型启动子 4035
TetO7SAG1 诱导型启动子 4036
TetO7SAG4 诱导型启动子 4037
TUB1 组成型启动子 4038
TUB8 组成型启动子 4039
表2。
如所提及的，异源多核苷酸包含编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列。
如本文使用的，短语“弓形虫分泌的蛋白质”指弓形虫多肽的至少一种功能片段（氨基酸序列），其在被弓形虫体外感染时足以分泌到宿主细胞内。
根据本发明的一些实施方案，当被弓形虫体内感染时，弓形虫分泌的蛋白质或其功能片段能够分泌到宿主细胞中。
根据本发明的一些实施方案，第一核酸序列编码弓形虫分泌的蛋白质的功能片段。
根据本发明的一些实施方案，第一核酸序列编码弓形虫分泌的蛋白质的全长开放读码框（ORF）。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的棒状体分泌。
根据本发明的一些实施方案，由棒状体分泌的弓形虫分泌的蛋白质包含Toxofilin和/或ROP1。
根据本发明的一些实施方案，由棒状体分泌的弓形虫分泌的蛋白质包含选自SEQID NO：344-465的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质是非棒状体蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质选自微线体蛋白质和致密颗粒蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的致密颗粒分泌。
根据本发明的一些实施方案，由致密颗粒分泌的弓形虫分泌的蛋白质包含GRA16和/或GRA24。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质由弓形虫的微线体分泌。
根据本发明的一些实施方案，由微线体分泌的蛋白质包含选自SEQ ID NO：280-322的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，由致密颗粒分泌的蛋白质包含选自SEQ ID NO：234-279的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫分泌的蛋白质包含刚地弓形虫巨噬细胞移动抑制因子（TgMIF）。
下表3列出了可以克隆到本发明的一些实施方案的核酸构建体内的弓形虫分泌的蛋白质，其根据蛋白质定位或预测定位至其的细胞器进行组构。
表3，弓形虫蛋白质
<i>基因ID</i> <i>基因产物描述</i> <i>生物</i> <i>细胞器</i> <i>Polyn. SEQ ID</i> <i>Polyp. SEQ ID</i>
TGME49_289620 组织蛋白酶CPC1（CPC1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 1 234
TGME49_276130 组织蛋白酶CPC2（CPC2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 2 235
TGME49_268900 致密颗粒蛋白质GRA10（GRA10） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 3 236
TGME49_297880 致密颗粒蛋白质DG32 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 4 237
TGME49_270250 致密颗粒蛋白质GRA1（GRA1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 5 238
TGME49_212410 致密颗粒蛋白质GRA11 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 6 239
TGME49_237800 致密颗粒蛋白质GRA11 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 7 240
TGME49_275850 致密颗粒蛋白质GRA12（GRA12） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 8 241
TGME49_288650 致密颗粒蛋白质GRA12（GRA12） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 9 242
TGME49_239740 致密颗粒蛋白质GRA14（GRA14） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 10 243
TGME49_275470 致密颗粒蛋白质GRA15（GRA15） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 11 244
TGME49_227620 致密颗粒蛋白质GRA2（GRA2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 12 245
TGME49_227280 致密颗粒蛋白质GRA3（GRA3） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 13 246
TGME49_310780 致密颗粒蛋白质GRA4（GRA4） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 14 247
TGME49_286450 致密颗粒蛋白质GRA5（GRA5） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 15 248
TGME49_275440 致密颗粒蛋白质GRA6（GRA6） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 16 249
TGME49_203310 致密颗粒蛋白质GRA7（GRA7） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 17 250
TGME49_254720 致密颗粒蛋白质GRA8（GRA8） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 18 251
TGME49_251540 致密颗粒蛋白质GRA9（GRA9） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 19 252
TGME49_222170 致密颗粒抗原DG32 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 20 253
TGME49_208830 GRA16 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 21 254
TGME49_200010 GRA20 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 22 255
TGME49_241610 GRA21 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 23 256
TGME49_230180 GRA24 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 24 257
TGME49_290700 GRA25 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 25 258
TGME49_231960 GRA28 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 26 259
TGME49_269690 GRA29 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 27 260
TGME49_232000 GRA30 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 28 261
TGME49_220240 GRA31 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 29 262
TGME49_212300 GRA32 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 30 263
TGME49_247440 GRA33 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 31 264
TGME49_226380 GRA35 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 32 265
TGME49_213067 GRA36 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 33 266
TGME49_236890 GRA37 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 34 267
TGME49_312420 GRA38 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 35 268
TGME49_289380 GRA39 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 36 269
TGME49_219810 GRA40 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 37 270
TGME49_200360 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 38 271
TGME49_203290 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 39 272
TGME49_310790 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 40 273
TGME49_277240 NTPase I 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 41 274
TGME49_277270 NTPase II 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 42 275
TGME49_217430 蛋白酶抑制剂PI1（PI1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 43 276
TGME49_208450 蛋白酶抑制剂PI2（PI2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 致密颗粒 44 277
TGGT1_411330 假定致密颗粒蛋白质GRA11 刚地弓形虫<i>GT1</i> 致密颗粒 45 278
TGME49_275860 假定致密颗粒蛋白质GRA12 刚地弓形虫<i>VEG</i> 致密颗粒 46 279
TGME49_261710 含锚蛋白重复的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 47 280
TGME49_300130 含顶端膜抗原1结构域的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 48 281
TGME49_255260 顶端膜抗原AMA1 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 49 282
TGME49_293770 几丁质酶样蛋白质CLP1（CLP1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 50 283
TGME49_204340 GRA34 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 51 284
TGME49_221480 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 52 285
TGME49_289100 MIC18 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 53 286
TGME49_294790 MIC19 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 54 287
TGME49_214940 MIC2相关蛋白质M2AP 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 55 288
TGME49_283540 MIC20 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 56 289
TGME49_291890 微线体蛋白质MIC1（MIC1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 57 290
TGME49_250710 微线体蛋白质MIC10（MIC10） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 58 291
TGME49_204530 微线体蛋白质MIC11（MIC11） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 59 292
TGME49_267680 微线体蛋白质MIC12（MIC12） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 60 293
TGME49_260190 微线体蛋白质MIC13（MIC13） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 61 294
TGME49_218310 微线体蛋白质MIC14（MIC14） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 62 295
TGME49_247195 微线体蛋白质MIC15（MIC15） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 63 296
TGME49_289630 微线体蛋白质MIC16（MIC16） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 64 297
TGME49_200250 微线体蛋白质MIC17A（MIC17A） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 65 298
TGME49_200240 微线体蛋白质MIC17B（MIC17B） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 66 299
TGME49_200230 微线体蛋白质MIC17C（MIC17C） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 67 300
TGME49_201780 微线体蛋白质MIC2（MIC2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 68 301
TGME49_319560 微线体蛋白质MIC3（MIC3） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 69 302
TGME49_208030 微线体蛋白质MIC4（MIC4） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 70 303
TGME49_277080 微线体蛋白质MIC5（MIC5） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 71 304
TGME49_218520 微线体蛋白质MIC6（MIC6） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 72 305
TGME49_261780 微线体蛋白质MIC7（MIC7） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 73 306
TGME49_245490 微线体蛋白质MIC8（MIC8） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 74 307
TGME49_245485 微线体蛋白质MIC9（MIC9） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 75 308
TGME49_208730 微线体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 76 309
TGME49_208740 微线体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 77 310
TGME49_254430 微线体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 78 311
TGME49_275798 微线体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 79 312
TGME49_244180 微线体样蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 80 313
TGME49_286740 微线体样蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 81 314
TGME49_200270 含PAN/Apple结构域的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 82 315
TGME49_286150 含PAN/Apple结构域的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 83 316
TGME49_204130 穿孔素样蛋白质PLP1（PLP1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 84 317
TGVEG_439620 假定的微线体蛋白质 刚地弓形虫<i>VEG</i> 微线体 85 318
TGME49_200290 菱形体蛋白酶ROM1（ROM1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 86 319
TGME49_293900 具有改变的血小板反应素重复的子孢子蛋白质SPATR 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 87 320
TGME49_204050 枯草杆菌蛋白酶SUB1（SUB1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 88 321
TGME49_206510 解毒素TLN4（TLN4） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 微线体 89 322
TGME49_209030 肌动蛋白ACT1（ACT1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 90 323
TGME49_214290 DJ-1家族蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 91 324
TGME49_268850 烯醇酶2 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 92 325
TGME49_236040 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 93 326
TGME49_289690 甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH1（GAPDH1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 94 327
TGME49_290040 巨噬细胞移动抑制因子，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 95 328
TGME49_211680 蛋白质二硫键异构酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 96 329
TGME49_273610 分泌型磷脂酶A2 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 97 330
TGME49_273620 分泌型磷脂酶A2 刚地弓形虫<i>GT1</i> 其它 98 331
TGME49_271570 刚地弓形虫家族D蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 99 332
TGME49_205470 翻译延伸因子2家族蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 100 333
TGME49_288360 色氨酰基-tRNA合成酶（TrpRS2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 101 334
TGME49_208590 液泡ATP合酶亚基54kD，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 102 335
TGME49_256970 液泡ATP合酶亚基A，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 103 336
TGME49_219800 液泡ATP合酶亚基b，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 104 337
TGME49_315620 液泡ATP合酶亚基C，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 105 338
TGME49_259010 液泡ATP合酶亚基d，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 106 339
TGME49_305290 液泡atp合酶亚基e，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 107 340
TGME49_310960 液泡atp合酶亚基f，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 108 341
TGME49_246560 液泡ATP合酶亚基g，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 109 342
TGME49_212310 液泡ATP合成酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 其它 110 343
TGME49_314250 缓殖子棒状体蛋白质BRP1（BRP1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 111 344
TGME49_209985 cAMP-依赖性蛋白质激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 112 345
TGME49_249670 组织蛋白酶B 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 113 346
TGME49_252200 具有含锌指结构域蛋白的细胞周期调节剂 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 114 347
TGME49_210095 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 115 348
TGME49_296015 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 116 349
TGME49_297070 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 117 350
TGME49_311320 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 118 351
TGME49_321700 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 119 352
TGME49_321710 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 120 353
TGME49_322120 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 121 354
TGME49_323320 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 122 355
TGGT1_410610 假定蛋白质 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 123 356
TGME49_242118 肌球蛋白轻链激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 124 357
TGME49_322000 肌球蛋白轻链激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 125 358
TGME49_322010 肌球蛋白轻链激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 126 359
TGME49_322100 肌球蛋白轻链激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 127 360
TGME49_323300 肌球蛋白轻链激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 128 361
TGME49_252500 polo激酶 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 129 362
TGME49_258225 预测的棒状体蛋白质激酶（ROPK） 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 130 363
TGME49_234950 蛋白质激酶（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 131 364
TGME49_274170 蛋白质激酶（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 132 365
TGME49_281675 蛋白质激酶，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 133 366
TGME49_270320 含蛋白质磷酸酶2C结构域的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 134 367
TGME49_282055 蛋白质磷酸酶PP2C-hn（PP2CHN） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 135 368
TGVEG_281675A 假定的蛋白质激酶 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 136 369
TGVEG_281675B 假定的蛋白质激酶 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 137 370
TGME49_289680 Ras调节蛋白质Rab11 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 138 371
TGGT1_411350 棒状体激酶家族（不完全催化三联体）蛋白质 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 139 372
TGGT1_409600 棒状体激酶家族蛋白质 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 140 373
TGGT1_411360 棒状体激酶家族蛋白质 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 141 374
TGVEG_440850 棒状体激酶家族蛋白质 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 142 375
TGVEG_440860 棒状体激酶家族蛋白质 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 143 376
TGVEG_442710 棒状体激酶家族蛋白质 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 144 377
TGME49_308093 棒状体激酶家族蛋白质（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 145 378
TGME49_308096 棒状体激酶家族蛋白质（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 146 379
TGME49_227810 棒状体激酶家族蛋白质 ROP11（不完全催化三联体）（ROP11） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 147 380
TGME49_242240 棒状体激酶家族蛋白质 ROP19A（ROP19A） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 148 381
TGME49_242250 棒状体激酶家族蛋白质 ROP19B（ROP19B） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 149 382
TGME49_258230 棒状体激酶家族蛋白质 ROP20（ROP20） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 150 383
TGME49_263220 棒状体激酶家族蛋白质 ROP21（ROP21） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 151 384
TGME49_207700 棒状体激酶家族蛋白质 ROP22（不完全催化三联体）（ROP22） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 152 385
TGME49_239600 棒状体激酶家族蛋白质 ROP23（不完全催化三联体）（ROP23） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 153 386
TGME49_252360 棒状体激酶家族蛋白质 ROP24（不完全催化三联体）（ROP24） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 154 387
TGME49_202780 棒状体激酶家族蛋白质 ROP25（ROP25） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 155 388
TGME49_211260 棒状体激酶家族蛋白质 ROP26（不完全催化三联体）（ROP26） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 156 389
TGME49_313330 棒状体激酶家族蛋白质 ROP27（ROP27） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 157 390
TGME49_258370 棒状体激酶家族蛋白质 ROP28（ROP28） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 158 391
TGME49_242230 棒状体激酶家族蛋白质 ROP29（ROP29） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 159 392
TGME49_227010 棒状体激酶家族蛋白质 ROP30（ROP30） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 160 393
TGME49_258800 棒状体激酶家族蛋白质 ROP31（ROP31） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 161 394
TGME49_270920 棒状体激酶家族蛋白质 ROP32（ROP32） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 162 395
TGME49_201130 棒状体激酶家族蛋白质 ROP33（ROP33） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 163 396
TGME49_240090 棒状体激酶家族蛋白质 ROP34，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 164 397
TGME49_304740 棒状体激酶家族蛋白质 ROP35（ROP35） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 165 398
TGME49_207610 棒状体激酶家族蛋白质 ROP36（不完全催化三联体）（ROP36） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 166 399
TGME49_294560 棒状体激酶家族蛋白质 ROP37（不完全催化三联体）（ROP37） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 167 400
TGME49_242110 棒状体激酶家族蛋白质 ROP38（ROP38） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 168 401
TGME49_262050 棒状体激酶家族蛋白质 ROP39（ROP39） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 169 402
TGME49_291960 棒状体激酶家族蛋白质 ROP40（不完全催化三联体）（ROP40） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 170 403
TGME49_266100 棒状体激酶家族蛋白质 ROP41（ROP41） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 171 404
TGME49_230470 棒状体激酶家族蛋白质 ROP46，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 172 405
TGME49_249470 棒状体激酶家族蛋白质，截短的（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 173 406
TGME49_253330 棒状体激酶家族蛋白质，截短的（不完全催化三联体） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 174 407
TGVEG_322130 棒状体激酶家族ROP19B 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 175 408
TGVEG_269885A 棒状体金属蛋白酶解毒素TLN1 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 176 409
TGVEG_269885B 棒状体金属蛋白酶解毒素TLN1 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 177 410
TGME49_269885 棒状体金属蛋白酶解毒素TLN1（TLN1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 178 411
TGVEG_310010A 棒状体颈部蛋白RON1 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 179 412
TGVEG_310010B 棒状体颈部蛋白RON1 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 180 413
TGME49_310010 棒状体颈部蛋白RON1（RON1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 181 414
TGME49_261750 棒状体颈部蛋白RON10（RON10） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 182 415
TGME49_300100 棒状体颈部蛋白RON2（RON2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 183 416
TGME49_223920 棒状体颈部蛋白RON3（RON3） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 184 417
TGME49_229010 棒状体颈部蛋白RON4（RON4） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 185 418
TGME49_311470 棒状体颈部蛋白RON5（RON5） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 186 419
TGVEG_297960A 棒状体颈部蛋白RON6 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 187 420
TGVEG_297960B 棒状体颈部蛋白RON6 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 188 421
TGME49_297960 棒状体颈部蛋白RON6（RON6） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 189 422
TGME49_306060 棒状体颈部蛋白RON8（RON8） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 190 423
TGVEG_308810A 棒状体颈部蛋白RON9 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 191 424
TGVEG_308810B 棒状体颈部蛋白RON9 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 192 425
TGME49_308810 棒状体颈部蛋白RON9（RON9） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 193 426
TGME49_265120 棒状体颈部蛋白，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 194 427
TGME49_327200 棒状体颈部蛋白，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 195 428
TGME49_309590 棒状体蛋白质ROP1（ROP1） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 196 429
TGME49_315490 棒状体蛋白质ROP10（ROP10） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 197 430
TGME49_203990 棒状体蛋白质ROP12（ROP12） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 198 431
TGME49_312270 棒状体蛋白质ROP13（ROP13） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 199 432
TGME49_315220 棒状体蛋白质ROP14（ROP14） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 200 433
TGME49_211290 棒状体蛋白质ROP15（ROP15） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 201 434
TGME49_262730 棒状体蛋白质ROP16（ROP16） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 202 435
TGME49_258580 棒状体蛋白质ROP17（ROP17） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 203 436
TGME49_205250 棒状体蛋白质ROP18（ROP18） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 204 437
TGME49_215785 棒状体蛋白质ROP2A（ROP2A） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 205 438
TGME49_295125 棒状体蛋白质ROP4（ROP4） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 206 439
TGGT1_411430 棒状体蛋白质ROP5 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 207 440
TGVEG_442220 棒状体蛋白质ROP5 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 208 441
TGME49_308090 棒状体蛋白质ROP5（ROP5） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 209 442
TGME49_258660 棒状体蛋白质ROP6（ROP6） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 210 443
TGGT1_365080 棒状体蛋白质ROP7 刚地弓形虫<i>GT1</i> 棒状体 211 444
TGME49_295110 棒状体蛋白质ROP7（ROP7） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 212 445
TGVEG_363030 棒状体蛋白质ROP8 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 213 446
TGME49_215775 棒状体蛋白质ROP8（ROP8） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 214 447
TGME49_243730 棒状体蛋白质ROP9（ROP9） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 215 448
TGME49_295105 棒状体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 216 449
TGME49_315210 棒状体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 217 450
TGME49_315940 棒状体蛋白质，假定的 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 218 451
TGME49_230350 RON11 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 219 452
TGME49_232020 RON12 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 220 453
TGME49_294400 RON2L1 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 221 454
TGME49_296020 ROP2L11 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 222 455
TGME49_296000 ROP2L12 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 223 456
TGME49_242100 ROP38 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 224 457
TGME49_261740 ROP47 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 225 458
TGME49_218270 ROP48 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 226 459
TGME49_308075 ROP5 刚地弓形虫<i>VEG</i> 棒状体 227 460
TGME49_241000 ROP51 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 228 461
TGME49_210370 ROP54 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 229 462
TGME49_300290 含SNARE结构域的蛋白质 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 230 463
TGME49_299060 钠/氢交换剂NHE2 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 231 464
TGME49_314500 枯草杆菌蛋白酶SUB2（SUB2） 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 232 465
TGME49_214080 toxofilin 刚地弓形虫<i>ME49</i> 棒状体 233 466
表3. “polyn.” = 多核苷酸；“polyp” = 多肽。
根据本发明的一些实施方案，异源多核苷酸进一步包含弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列在异源多核苷酸（例如，其编码与药物多肽框内融合的弓形虫分泌的蛋白质）的开放读码框的上游和/或下游。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫5'-非翻译区（5'-UTR）置于弓形虫分泌的蛋白质开放读码框的上游。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫3'-非翻译区（3'-UTR）置于开放读码框的下游，所述开放读码框编码与药物多肽框内融合的弓形虫分泌的蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫3'非翻译区（3'-UTR）核酸序列是GRA2 3'-UTR、GRA16 3'-UTR、GRA24 3'-UTR、SAG1 3'-UTR或DHFR 3'-UTR。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫5'非翻译区（5'-UTR）核酸序列是GRA2 5'-UTR、GRA16 5'-UTR、GRA24 5'-UTR、SAG1 5'-UTR或DHFR 5'-UTR。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列是Toxofilin 3'-UTR。
如所提及的，异源多核苷酸包含编码药物多肽的第二核酸序列，所述药物多肽在弓形虫分泌的蛋白质的下游框内融合。
如本文使用的，短语“药物多肽”指当被引入有此需要的主体的细胞内时，具有疗效例如能够治疗病理状况的多肽。
应当注意，对于某些疾病，药物多肽在到达主体内的某些器官、组织、细胞、细胞区室或细胞定位时可能是有效的。例如，为了治疗神经系统疾病，药物组合物优选靶向神经系统，例如神经元、神经胶质或其它细胞。另外或可替代地，对于某些疾病，在药物组合物的靶位于（置于）细胞核内的情况下，药物多肽应当到达某一细胞定位，例如细胞核。例如，在MECP2的情况下，活性蛋白与核内的DNA结合且调节基因表达。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体进一步包含至少一个框内切割位点，其允许药物多肽与弓形虫分泌的蛋白质脱离。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含对应于能够治疗病理状况的内源性蛋白质的野生型氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的抗体。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的抗原。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含能够治疗病理状况的毒素。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽包含酶、结构多肽、运动多肽、调节多肽、贮存多肽、信号传导/配体多肽、受体多肽、感觉多肽、抗体、蛋白质通道和/或转运多肽。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是半乳糖脑苷脂酶（GALC）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是半乳糖脑苷脂酶（GALC）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4或同种型5。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）同种型1或MECP2同种型2。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4或同种型5。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是天冬酰转移酶（ASPA）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是存活运动神经元蛋白（SMN1）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是存活运动神经元蛋白质同种型SMN、同种型SMN-δ5、同种型SMN-δ7或同种型SMN-δ57。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是Parkin（PARK2）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是Parkin（PARK2）同种型1、同种型2、同种型3、同种型4、同种型5、同种型6、同种型7或同种型8。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是转录因子EB（TFEB）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是转录因子EB（TFEB）同种型1或同种型2。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是TALEN（TALE核酸酶）。
根据本发明的一些实施方案，药物多肽是TALE TF（TALE转录因子）。
下表4列出了示例性治疗性蛋白质，其可以通过本发明的一些实施方案的弓形虫分泌给主体。
表4，示例性药物蛋白质
表4。
应当注意，本文所述的任何序列（例如，弓形虫分泌的蛋白质和/或治疗性多肽）可以进行密码子优化，用于在靶细胞（例如弓形虫）中表达。此类序列修饰的实例包括但不限于改变的G/C含量，以更紧密地接近通常在目标靶细胞物种中发现的含量，并且去除在靶细胞中非典型地发现的密码子，通常称为密码子优化的种类。
短语“密码子优化”指选择适当的DNA核苷酸用于在结构基因或其片段内使用，其接近目标靶细胞内的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列指这样的基因，其中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已被修饰，以便在靶细胞内利用统计上优选的或统计上有利的密码子。通常在DNA水平下检查核苷酸序列，并且优化编码区用于在使用任何合适的程序测定的靶细胞物种中表达。在该方法中，密码子使用的标准差，密码子使用偏差的量度，可以通过首先找到天然基因的每个密码子使用相对于高度表达的靶细胞基因那种的平方比例偏差来计算，随后为计算平均平方偏差。使用的公式是：1 SDCU = n = 1 N [（ Xn - Yn）/Yn ] 2/N，其中Xn指高度表达的靶细胞基因中密码子n的使用频率，其中Yn指与目标基因中的密码子n的使用频率，并且N指目标基因中的密码子总数。
根据用于特定靶细胞类型的优选密码子使用来优化核酸序列的一种方法是基于密码子优化表的直接使用，例如通过从国际DNA序列数据库制表的密码子使用，在密码使用数据库处在线提供的那些表，而无需执行任何额外的统计计算：2000年的状态。YNakamura，T Gojobori，T Ikemura - Nucleic acids research，2000 - Oxford UnivPress。密码子使用数据库含有用于许多不同物种的密码子使用表，其中每个密码子使用表已根据Genbank中存在的数据进行统计学确定。
通过使用上述表来确定对于特定物种（例如，刚地弓形虫）中的每个氨基酸的最优选或最有利的密码子，编码目标蛋白的天然存在的核苷酸序列可以对于该特定靶细胞物种进行密码子优化。这通过用在统计上更有利的关于氨基酸的相应密码子替换在特定物种基因组中具有低统计学发生率的密码子来实现。然而，可以选择一个或多个较不有利的密码子来缺失现有的限制位点，以在潜在有用的连接处创建新的限制位点（5'和3'末端以添加信号肽或终止盒，可能用于切割区段且将区段剪接在一起以产生正确的全长序列的内部位点），或消除可能负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。
在任何修饰之前，天然存在的编码核苷酸序列可能已经含有许多这样的密码子，其对应于特定靶细胞物种中的统计上有利的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可以包括确定天然核苷酸序列内的哪些密码子关于特定靶细胞不是统计上有利的，并且根据特定靶细胞的密码子使用表修饰这些密码子，以产生密码子优化的衍生物。修饰的核苷酸序列可以对于靶细胞密码子使用进行完全或部分优化，条件是由修饰的核苷酸序列编码的蛋白质以高于由相应的天然存在的或天然基因编码的蛋白质的水平产生。另外或可替代地，密码子优化/使用序列可以比由相应的天然存在的或天然基因编码的蛋白质更好地折叠。另外或可替代地，密码子优化/使用序列比由相应的天然存在的或天然基因编码的蛋白质更好地靶向靶细胞器。另外或可替代地，密码子优化/使用序列比由相应的天然存在的或天然基因编码的蛋白质更少降解。
例如，可以使用下表5的弓形虫密码子使用。
表5
表5。
根据本发明的一些实施方案，异源多核苷酸进一步包含编码可选择标记物的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，可选择标记物包含氯霉素乙酰转移酶（CAT）、DHFR-TS、BLE、HXGPRT、UPRT、TK、CD、荧光蛋白（例如GFP、YFP、RFP、mCherry或其它）或表位标签（例如HA、Myc、Ty-1、FLAG或其它）。
根据本发明的一些实施方案，可选择标记物包含HXGPRT。
可以在6-硫代黄嘌呤（6-TX）的存在下选择缺乏HXGPRT活性的弓形虫速殖子，而在霉酚酸（MPA）和/或黄嘌呤中可以选择表达HXGPRT活性的品系（Pfefferkorn和Borotz，1994，Pfefferkorn E. R.，Borotz S.（1994）Exp. Parasitol. 79，374–382）。
根据本发明的一些实施方案，可选择标记物包含氯霉素乙酰转移酶（CAT）（用于使用氯霉素的阳性选择）、DHFR-TS（用于使用乙胺嘧啶的阳性选择）、BLE（用于使用腐草霉素的阳性选择）、HXGPRT（用于使用霉酚酸+黄嘌呤的阳性选择或使用6-硫代黄嘌呤的阴性选择、UPRT（用于使用5'-氟-2'-脱氧尿苷的阴性选择）、TK（用于使用更昔洛韦的阳性选择）、CD（用于使用5-氟胞嘧啶的阳性选择）、荧光蛋白（例如GFP、YFP、RFP、mCherry或其它）或表位标签（例如HA、Myc、Ty-1、FLAG或其它）。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体进一步包含编码诱导型自毁元件的第三核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，诱导型自毁元件在与治疗盒相同的框中。
根据本发明的一些实施方案，诱导型自毁元件处于由不同的调节元件调节的分开的读码框中。例如，治疗盒可以由潜伏期启动子驱动，而自毁盒由药物诱导型启动子驱动。
根据本发明的一些实施方案，诱导型自毁元件响应于药物而具有活性。
根据本发明的一些实施方案，药物包含抗生素。
根据本发明的一些实施方案，编码诱导型自毁元件的第三核酸序列包含在相同的核酸构建体中，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，编码诱导型自毁元件的第三核酸序列包含在关于核酸构建体的分开的核酸构建体中，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列在可选择标记物和/或自毁元件的开放读码框的上游和/或下游。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含至少两种核酸构建体的核酸构建体系统，其中所述至少两种核酸构建体的第一核酸构建体是本发明的一些实施方案的核酸构建体，并且所述至少两种核酸构建体的第二核酸构建体包含编码可选择标记物的多核苷酸。
典型的克隆载体还可以含有转录和翻译起始序列，转录和翻译终止子和多腺苷酸化信号。
下述是弓形虫核酸构建体的非限制性列表，其可以用作生成本发明的一些实施方案的核酸构建体的主链：pGRA、pUPRT、pROP1、pTUB1、pTUB8、pLIC、pTOXO、pMIC2、pHX、pCAT、pDHFR、pBlueScript、pTetO7SAG1、pTetO7SAG4、pSAG1、pSAG4、pHTU、pTKO、pLoxP-DHFR、pminCAT/HXGPRT+、pminCAT/HXGPRT-、pDHFR-TSc3/M3、pDHFR-TSc3/M2M3、pminiHXGPRT和pUC19。这些载体可以从各种来源获得，所述来源例如非营利性质粒储库“addgene”；NIHAIDS Reagent Program；Agilent Technologies；NEB；Thermo Fisher Scientific；SigmaAldrich；GenScript；以及MoBiTec GmbH。
下表6提供了非限制性的示例性载体和目录号。
表6，载体主链
表6。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用本发明的一些实施方案的核酸构建体或本发明的一些实施方案的核酸构建体系统转化的弓形虫。
如本文使用的，术语“弓形虫”指细胞内寄生原生动物刚地弓形虫。
可以连同本发明的一些实施方案的构建体和方法一起使用的刚地弓形虫品系的非限制性实例包括：
（i）I型 - 包括但不限于：GT1、RH、ENT、VEL、TgCatCo1和CAST。
（ii）II型 - 包括但不限于：ME49、Beverly、PDS、PLK、PTG、DEG、PIH、TgNmBr1和PRU。
（iii）III型 - 包括但不限于：VEG、C56、CTG、CEP、TgGoatUS4和STRL。
（iv）非典型类型 - 包括但不限于：TgCTPrC3、TgBbUS1、TgRabbitBr1和TgPigUS15。
根据本发明的一些实施方案，弓形虫是未减毒的。
如本领域常规的，术语“减毒的”指与未遗传修饰的天然（野生型）刚地弓形虫相比，刚地弓形虫的弱化和/或较少活力的品系。通常，刚地弓形虫的减毒突变体能够刺激免疫应答，并且产生免疫而不引起疾病。减毒可以通过常规方法来实现，所述常规方法包括但不限于γ-辐射或嘧啶营养缺陷型的生成。
减毒弓形虫的非限制性实例在US 20120045477 A1和US 8673289 B2中描述，其通过引用完全并入本文。
应当注意，刚地弓形虫复制对于其在感染的急性期过程中在体内传播且到达远端组织的能力、其在受感染细胞中持续存在的能力以及其在宿主中建立慢性囊肿的能力是必需的。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫的特征在于与减毒弓形虫的增殖速率相比更高的增殖速率。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫不是营养缺陷型。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫包含适合于嘧啶的从头生物合成的功能性内源途径。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫能够分化成缓殖子阶段。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫能够进行RNA合成和/或DNA复制。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫能够进行RNA合成。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫能够进行DNA复制。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的弓形虫包含内源功能性氨基甲酰磷酸合成酶II（CPSII）酶（如US8673289中所述），例如，如SEQ ID NO：4612-4617中任一个所提供的。
本发明的一些实施方案的构建体和弓形虫可以用于将目标蛋白质递送到主体内，例如，递送到主体的特定组织或细胞类型内。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了将目标蛋白质施用于主体的目标组织内的方法，该方法包括向主体施用本发明的一些实施方案的弓形虫或本发明的一些实施方案的药物组合物，从而将目标蛋白质施用于主体的目标组织。
目标组织的实例包括但不限于中枢神经系统、肌肉、眼睛的部分、血液、淋巴结、脾、白血细胞、消化系统和固有层。
应当注意，因为弓形虫可以穿过血脑屏障，所以它可以将目标蛋白质递送到有此需要的主体的中枢神经系统内。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了将目标蛋白质施用到主体的中枢神经系统内的方法，该方法包括向主体施用本发明的一些实施方案的弓形虫或本发明的一些实施方案的药物组合物，从而将目标蛋白质施用于主体的中枢神经系统。
因此，本发明的一些实施方案的弓形虫可以通过递送能够治疗主体的目标蛋白质（例如治疗性多肽），用于治疗有此需要的主体。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了治疗有此需要的主体的方法，其包括向所述主体施用本发明的一些实施方案的弓形虫或本发明的一些实施方案的药物组合物，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽来治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有此需要的主体的方法，其包括向所述主体施用包含核酸构建体的弓形虫，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽来治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
术语“治疗”指抑制、预防或停止病理状况（疾病、病症或状况）的发展和/或引起病理状况的减少、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法和测定可以用于评价病理状况的发展，并且类似地，各种方法和测定可以用于评价病理状况的减少、缓解或消退。
如本文使用的，术语“预防”指阻止疾病、病症或状况在主体中发生，所述主体可能处于疾病的风险中，但尚未被诊断为患有疾病。
如本文使用的，术语“主体”包括哺乳动物，优选患有病理状况的处于任何年龄的人类。优选地，该术语涵盖处于发展病理状况的风险中的个体。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有病理状况，其特征在于主体的中枢神经系统中的缺陷型内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，与内源性蛋白质的野生型氨基酸序列相比，缺陷型内源性蛋白质包含内源性蛋白质的至少一个氨基酸的缺失、插入和/或取代。
根据本发明的一些实施方案，与缺乏病理状况的健康主体中的内源性蛋白质水平相比，缺陷型内源性蛋白质包含降低水平的内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，缺陷型内源性蛋白质在诊断有病理状况的主体中不存在内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有克拉伯病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有雷特综合征。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有卡纳万病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有脊髓性肌萎缩。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有帕金森氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有缺氧/缺血性或神经炎性CNS病症。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有阿尔茨海默氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有肌萎缩侧索硬化。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有亨廷顿氏病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有溶酶体贮积病。
根据本发明的一些实施方案，主体被诊断有MECP2重复综合征。
根据本发明的一些实施方案，主体不具有受损的免疫系统。具有受损的免疫系统的主体的实例包括但不限于AIDS患者，接受化学疗法的主体，接受例如用于细胞、组织和/或器官移植的免疫抑制药物的主体。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括向主体施用能够诱导自毁元件的药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括向主体施用维持宿主细胞和/或体内的弓形虫所必需的分子。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是抗生素。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是小分子。
根据本发明的一些实施方案，维持弓形虫所必需的分子是代谢产物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在施用弓形虫之前和/或在施用弓形虫之后和/或在向主体施用弓形虫同时，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫之前，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫之后（或随后），向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在向主体施用弓形虫的同时，向主体施用免疫抑制药物。
根据本发明的一些实施方案，施用通过外周施用来执行。
根据本发明的一些实施方案，外周施用包括静脉内施用。
根据本发明的一些实施方案，外周施用包括经口施用。
根据本发明的一些实施方案，施用通过腹膜内注射来执行。
根据本发明的一些实施方案，施用通过肌内注射来执行。
根据本发明的一些实施方案，施用通过气溶胶来执行。
根据本发明的一些实施方案，施用通过直接施用于中枢神经系统或其相邻组织来执行。
根据本发明的一些实施方案，例如使用弓形虫和/或包含其的药物组合物，通过本发明的一些实施方案的方法治疗的疾病，是上表7中列出的任何疾病。
表7列出了与内源性蛋白质的缺陷或异常表达或功能相关的非限制性疾病，其可以通过施用本发明的一些实施方案的治疗性多肽来治疗。
表7
<i>基因名称/符号</i> <i>相关疾病</i>
TFEB 溶酶体贮积病和神经退行性疾病
HGSNAT 粘多糖贮积症3C（圣菲利波综合征C）
MEF2C 帕金森氏病
NRTN 帕金森氏病
PGF 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
RPE65 利伯先天性黑朦，色素性视网膜炎
GDNF 帕金森氏病，核上性麻痹 ，多发性硬化，阿尔茨海默氏病，肌萎缩侧索硬化，亨廷顿氏病，视网膜变性，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
CNGB3 全色盲
BDNF 肌萎缩侧索硬化，亨廷顿氏病，阿尔茨海默氏病，脊髓损伤，肥胖，溶酶体贮积症。
APP 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
ASPA 卡纳万病
S1PR1 多发性硬化
IDS 粘多糖贮积症II型（亨特综合征，艾杜糖醛酸硫酸酯酶缺乏）
HTRA2 帕金森氏病，阿尔茨海默氏病
CDNF 帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，肌萎缩侧索硬化
DNAJC5 神经退行性病症
IDUA 粘多糖贮积症I型（赫尔勒综合征，胡-射二氏综合征（Hurler–Scheie syndrome），Scheie综合征）
SPON1 阿尔茨海默氏病
NMNAT2 涉及轴突变性的病症，例如泰素诱导的神经病，多发性硬化，一些病毒病症，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
FMR1 脆性X综合征
MECP2 雷特综合征
GNS 粘多糖贮积症3D（圣菲利波综合征D）
VEGFB 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
HIF1A 阿尔茨海默氏病
SERPINF1 帕金森氏病，肌萎缩侧索硬化，多发性硬化，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
VEGFA 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
STC1 视网膜变性，视神经疾病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
NGB 视神经萎缩，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
NFE2L2
MAPK7 阿尔茨海默氏病
NMNAT1 帕金森氏病，利伯先天性黑蒙，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
NGF 肌萎缩侧索硬化，阿尔茨海默氏病，唐氏综合征，感觉神经病
NAGLU 粘多糖贮积症3B（圣菲利波综合征B）
CLU 阿尔茨海默氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
MME 阿尔茨海默氏病
CTSA 半乳糖唾液酸贮积症
PPT1 神经元蜡样脂褐质沉积病1型（巴腾病）
TIMP2 多发性硬化，阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病，帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
MANF 帕金森氏病，色素性视网膜炎，视网膜动脉阻塞，糖尿病，Wolfram综合征，阿尔茨海默氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
TIMP1 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GAD2 帕金森氏病
GALC 克拉伯病（球形细胞脑白质营养不良）
GAD1 帕金森氏病
NTF3 夏-马-图三氏病，多发性硬化，脊髓损伤，X连锁的肾上腺脑白质营养不良，糖尿病神经病变，轴突神经病变，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GUSB 斯赖综合征
HGF 肌萎缩侧索硬化
SERPINI1 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
RGS2 焦虑症
NPY 癫痫，创伤后应激障碍
UCP2 急性和兴奋毒性脑损伤，帕金森氏病,
SST 癫痫，阿尔茨海默氏病,
SGSH 粘多糖贮积症3A（圣菲利波综合征A）
CYP2J2 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GM2A GM2神经节苷脂贮积病（泰赛二氏病（TSD），Sandhoff–Jatzkewitz病，GM2激活物缺乏症）
HEXA GM2神经节苷脂贮积病（泰赛二氏病（TSD），Sandhoff–Jatzkewitz病，GM2激活物缺乏症）
UCHL1 阿尔茨海默氏病
HEXB GM2神经节苷脂贮积病（泰赛二氏病（TSD），Sandhoff–Jatzkewitz病，GM2激活物缺乏症）
PINK1 帕金森氏病
PRDX3 肌萎缩侧索硬化，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病
PRDX1 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GLB1 GM1神经节苷脂贮积病
TPP1 神经元蜡样脂褐质沉积病2型（巴腾病）
ANG 肌萎缩侧索硬化，帕金森氏病
HMOX1 阿尔茨海默氏病（AD），帕金森氏病（PD），创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
NRG1 夏-马-图三氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
NFIL3 肌萎缩侧索硬化
MAN2B1 α-甘露糖苷贮积症
DHCR24 阿尔茨海默氏病。
DDC 帕金森氏病，芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症
TP53 脑肿瘤（星形细胞肿瘤，少突胶质细胞瘤，少突星形细胞肿瘤，室管膜肿瘤，脉络丛肿瘤，其它神经上皮肿瘤（星形母细胞瘤、第三脑室脊索样神经胶质瘤、血管中心神经胶质瘤），神经元和混合神经元-神经胶质瘤，松果体区肿瘤，胚胎肿瘤，颅神经和椎旁神经肿瘤（许旺细胞瘤、神经纤维瘤、神经束膜瘤、恶性外周神经鞘瘤），脑膜上皮细胞肿瘤，间充质肿瘤，原发性黑色素细胞病变，与脑膜相关的其它赘生物（血管母细胞瘤），造血系统肿瘤（恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、粒细胞肉瘤），生殖细胞肿瘤（生殖细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、混合生殖细胞肿瘤），蝶鞍区肿瘤（颅咽管瘤、颗粒细胞瘤、垂体细胞瘤、腺垂体梭形细胞嗜酸细胞瘤），转移性肿瘤）。
ADNP 阿尔茨海默氏病，肌萎缩侧索硬化，额颞叶变性/痴呆（FTD），创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GAN 巨轴突神经病
GAL 癫痫，阿尔茨海默氏病，阿片成瘾/戒断
SMN1 脊髓性肌萎缩
PROC 肌萎缩侧索硬化，阿尔茨海默氏病，多发性硬化，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
TRAP1 帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
IL18BP 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
PRDX6 阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
TXN 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GAA 庞贝氏症
GHRL 阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
CSF3 帕金森氏病，肌萎缩侧索硬化，大脑性瘫痪，阿尔茨海默氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
UBE3A 天使人综合症
ABCD1 肾上腺脑白质营养不良
NDP 诺里病，家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR），内耳疾病
TH 帕金森氏病
GCH1 帕金森氏病
BCL2 肌萎缩侧索硬化，帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
ENO2 阿尔茨海默氏病
EPO 帕金森氏病，多发性硬化，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GBA 戈谢病
AGA 天冬氨酰基葡萄糖胺尿症
UPF1 肌萎缩侧索硬化
PSAP 帕金森氏病，脱髓鞘病症，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
ANXA1 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
IGF1 肌萎缩侧索硬化，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
IGF2 阿尔茨海默氏病
PARK2 帕金森氏病，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
FUCA1 岩藻糖苷贮积症
SIRT1 亨廷顿氏病，肌萎缩侧索硬化，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，额颞叶痴呆，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
PARK7 肌萎缩侧索硬化，帕金森氏病
ANXA2 创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GCG 阿尔茨海默氏病中的脑胰岛素抗性，帕金森氏病，肌萎缩侧索硬化
LEP 阿尔茨海默氏病，肥胖，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
SH3BP5 阿尔茨海默氏病。
CNTF 帕金森氏病，核上性麻痹，多发性硬化，阿尔茨海默氏病，肌萎缩侧索硬化，亨廷顿氏病，视网膜变性，创伤性脑损伤，缺氧/缺血性CNS病症，神经炎性疾病，包括中风和神经退行性疾病。
GLA 法布里病
KCNN3 阿尔茨海默氏病
ARSA 异染性脑白质营养不良，多种硫酸酯酶缺乏症
SUMF1 多种硫酸酯酶缺乏症，粘多糖贮积症III A型（圣菲利波病A型）
CRH 脑水肿
SMPD1 尼曼-皮克病
表7。
根据本发明的一些实施方案，疾病（病理状况）不是癌症。
核酸构建体、核酸构建体系统或者用本发明的一些实施方案的核酸构建体或核酸构建体系统转化的弓形虫本身可以施用于生物，或者在其中它与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中施用。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，其包含本发明的一些实施方案的弓形虫和药学可接受的载体。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物用于治疗被诊断有本文所述的任何病理状况的主体。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物用于治疗被诊断有病理状况的主体，所述病理状况的特征在于主体的中枢神经系统中的缺陷型内源性蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物用于治疗被诊断有病理状况的主体，所述病理状况可通过在主体的中枢神经系统中施用药物多肽来治疗。
根据本发明的一些实施方案，药物组合物进一步包含免疫抑制剂。
如本文使用的，“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组分（例如生理学合适的载体和赋形剂）的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物的施用。
在本文中，术语“活性成分”指可负责生物学效应的核酸构建体、核酸构建体系统或者用本发明的一些实施方案的核酸构建体或核酸构建体系统转化的弓形虫。
在下文中，可互换使用的短语“生理学可接受的载体”和“药学可接受的载体”指不对生物造成显著刺激并且不消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。
在本文中，术语“赋形剂”指加入药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和施用药物的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，所述参考文献引入本文作为参考。
合适的施用途径可以包括例如经口，直肠，经粘膜尤其是经鼻，肠或肠胃外施用包括肌内、皮下和髓内注射，以及鞘内，直接心室内，心内例如进入右心室腔或左心室腔内，进入普通冠状动脉内，静脉内，腹膜内，鼻内或眼内注射。
用于对中枢神经系统（CNS）的药物递送的常规方法包括：神经外科策略（例如，脑内注射或脑室内输注）；在利用BBB的内源转运途径之一的尝试中，试剂的分子操纵（例如，嵌合融合蛋白的产生，所述嵌合融合蛋白包含与本身不能穿过BBB的试剂组合的对于内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽）；设计为增加试剂的脂质溶解度的药理学策略（例如，水溶性试剂与脂质或胆固醇载体的缀合）；以及通过高渗性破坏（起因于甘露醇溶液输注到颈动脉内或生物活性剂如血管紧张素肽的使用）对BBB完整性的瞬时破坏。
可替代地，可以以局部而非全身方式施用药物组合物，例如，经由将药物组合物直接注射到患者的组织区域内。
术语“组织”指由设计为执行一种或多种功能的细胞组成的生物的部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的一些实施方案的药物组合物可以通过本领域众所周知的的方法来制造，例如，借助于常规混合、溶解、培养、制粒、糖衣丸制备、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。例如，弓形虫的制造可以生产通过在细胞培养物中培养弓形虫。
用于根据本发明的一些实施方案使用的药物组合物因此可以使用一种或多种生理学可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其促进活性成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配制取决于所选择的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中，例如在汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中配制。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂一般是本领域已知的。
对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。此类载体致使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、食品、浆料、悬浮液等等，用于通过患者经口摄入。用于经口使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得到的混合物，并且需要时，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂特别是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。需要时，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣丸核心提供有合适的涂层。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填料（如乳糖）、粘合剂（如淀粉）、润滑剂（如滑石或硬脂酸镁）和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。用于经口施用的所有制剂都应该是适合于所选择的施用途径的剂量。
对于经颊施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的施用，用于根据本发明的一些实施方案使用的活性成分方便地以从加压包装或喷雾器呈现的气溶胶喷雾形式递送，伴随合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的使用。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门来递送计量的量来确定。可以配制用于在分配器中使用的例如明胶的胶囊和药液筒，其含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如通过弹丸注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿中或在具有任选添加的防腐剂的多剂量容器中。该组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括以水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制备为适当的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物（例如无菌、无热原的水基溶液）构建。
本发明的一些实施方案的药物组合物也可以配制在直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂（使用例如常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯）。
适用于本发明的一些实施方案的背景下的药物组合物包括其中活性成分以有效达到预期目的的量包含的组合物。更具体地，治疗有效量意指活性成分（例如，核酸构建体、核酸构建体系统或者用本发明的一些实施方案的核酸构建体或核酸构建体系统转化的弓形虫）的量有效预防、减轻或改善病症（例如，影响主体的中枢神经系统的病症）的症状，或者延长正在治疗的主体的存活。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
对于本发明的方法中使用的任何制剂，最初可以从体外测定、离体测定、细胞培养测定和/或动物模型估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。
本文所述活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外标准药学程序、在细胞培养物或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径而变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医生考虑到患者的状况加以选择。（参见例如Fingl等人，1975，于"The Pharmacological Basis of Therapeutics"中，第1章第1页）。
可以个别调整剂量和间隔，以提供足以诱导或抑制生物效应的活性成分的组织水平（例如，脑水平）（最小有效浓度，MEC）。MEC对于每种制剂可能不同，但可以从体外数据估计。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和施用途径。检测测定可以用于确定血浆、组织或CSF（脑脊髓液）浓度。
取决于正在治疗状况的严重性和响应性，施用可以是单次或多次施用，其中治疗过程持续数天至数周，或例如，在慢性疾病的情况下，一生，或直到实现治愈或达到疾病状态的减少。
例如，对于慢性疾病，可以调整剂量直至症状得到控制、稳定和/或改善。
当然，待施用的组合物的量取决于正在治疗的主体、痛苦的严重性、施用方式、主体的免疫状态、开处方医生的判断等。
需要时，本发明的一些实施方案的组合物可以存在于包装或分配器装置例如FDA批准的试剂盒中，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。该包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以伴随施用说明书。包装或分配器也可以容纳有与容器相关的通知，该通知以由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通知反映了由该机构批准的组合物或人或兽医施用的形式。例如，此类通知可以是由美国食品和药物管理局（U.S. Food and Drug Administration）批准的用于处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于治疗指示的状况，如上文进一步详述的。
如本文使用的，术语“约”指± 10 %
术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其缀合物意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括但限于”。
术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分实质上不改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本和新型特征的情况下。
如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。在本申请自始至终，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。相应地，范围的描述应该视为已具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，范围如1至6的描述应该视为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的各个数目，例如，1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
无论何时在本文中指示数目范围，它意欲包括在所指示的范围内的任何引用的数目（分数或整数）。短语在第一指示数目和第二指示数目之间的“范围/范围（ranging/ranges between）”以及从第一指示数目“到”第二指示数目的“范围/范围”（“ranging/ranges from”）在本文中可互换使用，并且意欲包括第一指示数目和第二指示数目以及它们之间的所有分数和整数数字。
如本文使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或者通过化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展、基本上改善状况的临床或美学症状、或者基本上预防状况的临床或美学症状的出现。
当提及特定序列表时，此类提及应理解为还涵盖基本上对应于其互补序列的序列，如包括起因于例如等位基因变异、测序错误、克隆错误或者导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变的次要序列变异，条件是此类变异的频率50个核苷酸中少于1个，可替代地100个核苷酸中少于1个，可替代地200个核苷酸中少于1个，可替代地500个核苷酸中少于1个，可替代地1000个核苷酸中少于1个，可替代地5,000个核苷酸中少于1个，可替代地10,000个核苷酸中少于1个。
应理解，为了清楚起见，在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开提供，或以任何合适的子组合提供，或如在本发明的任何其它描述的实施方案中合适的提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不视为那些实施例的必需特征，除非该实施例如果没有那些元件不起作用。
如上文所述和如下文权利要求节段请求保护的本发明的各种实施方案和方面在下述实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，其连同上文说明书一起以非限制性方式示出本发明的一些实施方案。
一般地，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中详尽地解释。参见例如，"Molecular Cloning: Alaboratory Manual" Sambrook等人，（1989）；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel，R. M.，编辑（1994）；Ausubel等人，"Current Protocols inMolecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland（1989）；Perbal，"APractical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons，New York（1988）；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人（eds）"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York（1998）；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.，编辑（1994）；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷ColiganJ. E. ，编辑（1994）；Stites等人（eds），"Basic and Clinical Immunology"（8thEdition），Appleton & Lange，Norwalk，CT（1994）；Mishell and Shiigi（编辑），"SelectedMethods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，New York（1980）；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.，编辑（1984）；“Nucleic Acid Hybridization"Hames，B. D.和Higgins S. J. ，编辑（1985）；"Transcription and Translation" Hames，B. D.和Higgins S. J. ，编辑（1984）；"Animal Cell Culture" Freshney，R. I.，ed.（1986）；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,（1986）；"A Practical Guide toMolecular Cloning" Perbal，B.,（1984）和"Methods in Enzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications"，AcademicPress，San Diego，CA（1990）；Marshak等人，"Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press（1996）；所有这些都如同在本文中完全阐述一样通过引入作为参考。Toxoplasma gondii: the modelapicomplexan - Perspectives and methods. LM Weiss，K Kim，2011。本文件自始至终提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且是为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。
一般材料和实验方法
刚地弓形虫培养
寄生虫在人包皮成纤维细胞（HFF）上在达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中生长，所述DMEM补充有2 mM L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素或庆大霉素抗生素混合物和10%胎牛血清（FBS），从而称为“完全DMEM培养基”。每天监测培养物，并且通过将裂解的培养皿的一滴上清液或一滴注射器释放的细胞内寄生虫转移到具有HFF的新鲜培养皿中来传代寄生虫。
用于表达异源多肽的刚地弓形虫表达载体的生成，所述异源多肽由与目标药物多 肽融合的弓形虫分泌的蛋白质组成
为了生成表达特定治疗性蛋白质的刚地弓形虫的稳定转基因系，本发明人首先通过分子克隆生成刚地弓形虫表达构建体。构建体包括长开放读码框（ORF），其由Toxofilin cDNA[SEQ ID NO：4481]或GRA16 cDNA [SEQ ID NO：4472]组成，随后为HA标签编码序列（SEQ IDNO：4474），随后为目标治疗性哺乳动物cDNA，例如鼠MeCP2同种型1 [SEQ ID NO：4476]；人ASPA [SEQ ID NO：4483]，人SMN1 [SEQ ID NO：4479]；人PARK2 [SEQ ID NO：4478]；人GDNF[SEQ ID NO：4489]；人TFEB（转录因子EB）同种型1 [SEQ ID NO：4600]序列；人GALC同种型1[SEQ ID NO：4486或SEQ ID NO：4601（GALC版本2）；GALC-TAT，其包括甘氨酸柔性接头（Gly）[SEQ ID NO：4490]，随后为蛋白质转导结构域（TAT），其促进跨越膜的非经典运输，以便帮助GALC靶向宿主细胞的溶酶体（SEQ ID NO：4488）或“突变的GALC-TAT”（具有缺失的GALC-TAT）（SEQ ID NO：4487）。目标cDNA也可以根据刚地弓形虫的密码子使用进行密码子优化，以便增加异源多肽在刚地弓形虫中的表达效率、稳定性和定位（例如使用对于在刚地弓形虫中的表达密码子优化的，密码子优化的鼠MeCP2同种型1 [ SEQ ID NO：4477]、密码子优化的人ASPA [SEQ ID NO：4602]、密码子优化的人GALC同种型1 [SEQ ID NO：4603]和密码子优化的人TFEB同种型1 [SEQ ID NO：4604]）。刚地弓形虫表达载体还包括来自相同或其它弓形虫基因的调节元件，其保证其正确表达和靶向。ORF的上游是内源性5'调节序列，其可以是Toxofilin基因的内源性5'调节序列，此处称为“Toxofilin启动子”或“Toxofilin5'-UTR”（SEQ ID NO：4482），或GRA16基因的内源性5'调节序列，此处称为“GRA16启动子”或“GRA16 5'-UTR”（SEQ ID NO：4473）。ORF的下游是丰富的致密颗粒蛋白质GRA2的3'-UTR（SEQ ID NO：4491；图3）。表达载体还包括含有可选择标记物HXGPRT [SEQ ID NO：4475]或DHFR-TS [SEQ ID NO：4484或4606]或mCherry [SEQ ID NO：4608]的分开ORF，被DHFR-TS（上游）的5’ UTR [SEQ ID NO：4492]和DHFR-TS（下游）的3’ UTR [SEQ ID NO：4493或4609]包围。
转基因刚地弓形虫的生成
I型品系RH或RHΔHX或者II型品系Prugniaud、Prugniaud-GFP-萤光素酶或PrugniaudΔHPT（也称为Prugniaud ΔHX）的刚地弓形虫用于生成转基因品系。使用22-26号针收集或机械外出细胞外速殖子，从细胞碎片中过滤，沉淀并且重悬浮于300 μl cytomix缓冲液（120 mM KCl、0.15 mM CaCl2 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7.6、25 mM HEPES pH 7.6、2 mMEGTA、5 mM MgCl2），伴随各30 μl的新鲜加入的2 mM ATP和5 mM GSH（总共360 μl）。通过用BTX ECM电穿孔仪的电穿孔，将20-60 μg质粒DNA或用酶ScaI线性化的DNA转染到速殖子内。将几滴转染的细胞转移到IFA孔上（24孔板的免疫荧光测定孔，其中HFF细胞在玻璃盖玻片上接种），并且进行免疫荧光染色用于评价转染效率和瞬时蛋白质表达（由质粒DNA的表达）。将剩余的转染的寄生虫转移到在完全DMEM中具有HFF的新鲜烧瓶上。如果使用药物抗性可选择标记物，则第二天将培养基更换为含有用于选择的药物的新鲜培养基（用于DHFR-TS选择的1 μM乙胺嘧啶、或用于HXGPRT选择的25 μg/ml霉酚酸 + 50 μg/ml黄嘌呤）。从寄生虫开始从HFF排出的那天开始，含有细胞外寄生虫的上清液小滴每1-2天进入含有选择药物的选择性培养基中的第二个HFF烧瓶内。当第二个烧瓶中的寄生虫开始从HFF排出时，上清液的小滴每1-2天从第二个烧瓶进入第三个烧瓶内，等等。如果使用荧光蛋白可选择标记物，当第二个烧瓶中的寄生虫从约50%-90%的HFF细胞中排出时，收集具有细胞外寄生虫的培养基，从细胞碎片中过滤并且使用FACS机器分选。收集发射对应于用于选择的荧光蛋白的荧光的寄生虫，并且进入完全DMEM培养基中的下一个HFF烧瓶内。在第3-5个烧瓶开始裂解（约2-5周）后，寄生虫视为含有将DNA构建体整合到其基因组内的寄生虫的“稳定库”。使一滴稳定的库进入IFA（免疫荧光测定）孔内，并且进行免疫荧光染色以评价库中的构建体阳性寄生虫的百分比、蛋白质表达和基因组整合（“稳定”）寄生虫中的蛋白质定位（基因组表达）。通过有限稀释的人工分选或通过在96孔板中FACS分选一个寄生虫/孔来建立克隆系。板保持不受干扰5-10天，这之后它们使用明视野显微镜通过肉眼进行筛选，以检测具有单个噬菌斑的孔，所述单个噬菌斑假定源于单个寄生虫。将具有单个噬菌斑的孔用移液管剧烈混合，并且将50 μl混合物传递到新培养皿和PCR管。通过以下制备裂解产物：将收集的细胞在PCR管中形成团块，将其重悬浮于10 μl裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液由在TE缓冲液中的10%蛋白酶K组成，并在60℃下温育60分钟，随后为在热循环仪中在95℃下10分钟。使用对于遗传构建体特异性的引物，一微升（1 μl）裂解产物用作PCR筛选的模板。将PCR阳性克隆传递到IFA孔上，固定，免疫荧光染色并且使用荧光显微镜和偏振光显微镜分析每个克隆中的蛋白质表达和蛋白质定位。
抗体
抗体及其使用的各自浓度如下：抗HA（Roche，IFA: 1:1000，WB: 1:1000），抗IMC-1（来自Prof. Dominique Soldati-Favre，IFA的赠予: 1:1000-1:2000），抗MeCP2（CellSignaling，IFA: 1:200，WB: 1:1000，IP: 1:26），抗NeuN（Abcam，IFA: 1:500），抗NCoR1（Bethyl Laboratories，WB: 1:1000），抗TBL1（Abcam，WB: 1:1000），Alexa Fluor 抗大鼠488和594（Invitrogen，IFA: 1:1000），Alexa Fluor 抗兔488和594（Invitrogen，IFA: 1:1000），Alexa Fluor 抗小鼠488和594（Invitrogen，IFA: 1:1000）。[0344] 实施例1
刚地弓形虫构建体的生成，其导致目标治疗性蛋白质的表达、定位至寄生虫的分泌细 胞器和分泌到宿主细胞内
实验程序
通过电穿孔将构建体转染到RH（RHhxgprt）或Pru（Pruhxgprt）品系刚地弓形虫寄生虫内。这随后为选择表达可选择标记物的寄生虫的过程（对于含有DHFR-TS（SEQ ID NO：4484）的构建体的乙胺嘧啶选择，其与目标构建体共转染），或使用MPA+黄嘌呤用于基于HXGPRT（SEQ ID NO：4475）的表达的选择，通过有限稀释或流式细胞术克隆，以及基于PCR的筛选。通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色验证阳性克隆，以表征加上HA标签的治疗性蛋白质在分泌的棒状体细胞器、致密颗粒细胞器、寄生泡空间、寄生泡膜或宿主细胞中的表达和特异性定位。在HFF（人包皮成纤维细胞）细胞上进一步维持验证的阳性系。
实验结果
用于递送治疗性蛋白质半乳糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂酶-TAT、GDNF、天冬酰转移酶、 MeCP2、存活运动神经元蛋白和E3泛素-蛋白连接酶parkin的构建体和刚地弓形虫品系的生 成 - 结果证实刚地弓形虫可以被工程改造为表达与寄生虫的内源性蛋白质融合的异源（哺乳动物，例如人）治疗性蛋白质。使用这种方法，本发明人已生成了3种新型稳定的刚地弓形虫转基因系，其表达与常见神经病理状况相关的3种人蛋白质：半乳糖脑苷脂酶-TAT（突变的GALC-TAT SEQ ID NO：4487）、MeCP2（密码子优化的SEQ ID NO：4477）和GDNF（SEQID NO：4489），以及含有稳定刚地弓形虫转基因寄生虫的另外4个混合群体库，所述寄生虫表达与常见神经病理状况相关的3种人蛋白质：半乳糖脑苷脂酶（GALC，同种型1，SEQ IDNO：4486）、半乳糖脑苷脂酶-TAT（WT GALC-TAT SEQ ID NO：4488）、天冬酰转移酶（ASPA SEQID NO：4483）和存活运动神经元蛋白（SMN1，SEQ ID NO：4479）。
通过病毒蛋白质转导结构域改善治疗性蛋白质的分泌和摄取 - 为了改善半乳糖脑苷脂酶蛋白质从宿主细胞到细胞外空间的分泌，以及通过相邻细胞的蛋白质摄取，本发明人已将半乳糖脑苷脂酶与病毒蛋白转导结构域（PTD）融合。Tat-PTD先前已在细胞培养模型系统中显示，通过增强酶的分泌和摄取两者而显著增加（6倍）半乳糖脑苷脂酶的交叉校正效率（Meng，X.-L.等人，2013）。
治疗性蛋白质半乳糖脑苷脂酶-TAT、天冬酰转移酶、MeCP2和存活运动神经元蛋白 定位至刚地弓形虫棒状体分泌细胞器 - 结果证实刚地弓形虫可以将异源（哺乳动物，例如人）治疗性蛋白质定位至寄生虫的棒状体分泌细胞器（图4A），它们可以从其中潜在地释放到宿主细胞的细胞质内且定位至受感染细胞内的靶位点。含有半乳糖脑苷脂酶-TAT、天冬酰转移酶、MeCP2和存活运动神经元蛋白的融合蛋白定位至寄生虫棒状体，如对于明显进入宿主细胞内的先前的Toxofilin融合物所报道的。这通过免疫荧光染色（IFA）证明（图4B-I）。
因此，本发明人已成功证实刚地弓形虫可以被工程改造为表达与寄生虫的内源性蛋白质融合的异源（哺乳动物，例如人）蛋白质，并且这些蛋白质定位至寄生虫的棒状体分泌细胞器。本发明人已将人蛋白质工程改造为与Toxofilin融合，所述Toxofilin是由寄生虫天然分泌到宿主细胞内的内源性蛋白质，其允许“骑”在寄生虫的蛋白质分泌机构上，用于目标蛋白质（例如，治疗性蛋白质）的靶向和分泌。这是建议刚地弓形虫作为该技术的可行基础的道路上的重要里程碑。
使用这种方法，本发明人已生成了新型稳定的刚地弓形虫转基因系，其表达与克拉伯病相关的人蛋白质且定位至棒状体：半乳糖脑苷脂酶-TAT（突变的GALC-TAT SEQ IDNO：4487），以及含有稳定刚地弓形虫转基因寄生虫的另外4个混合群体库，所述寄生虫表达与常见神经病理状况相关的3种人蛋白质且定位至棒状体：半乳糖脑苷脂酶-TAT（WT GALC-TAT SEQ ID NO：4488）、天冬酰转移酶（ASPA SEQ ID NO：4483）、MeCP2（SEQ ID NO:4477）和存活运动神经元蛋白（SMN1，SEQ ID NO：4479）。
治疗性蛋白质天冬酰转移酶、MeCP2和存活运动神经元蛋白定位至刚地弓形虫密 集颗粒分泌细胞器和寄生泡空间- 结果证实刚地弓形虫可以将异源（哺乳动物）人治疗性蛋白质定位至寄生虫的致密颗粒分泌细胞器和寄生泡空间（图5A），它们可以从其中释放到宿主细胞的细胞质内且定位至受感染细胞内的靶位点（图5B-I）。由于使用来自致密颗粒蛋白质的序列来驱动由寄生虫致密颗粒的目标蛋白质分泌的这种方法是前所未有的，这是首次通过融合到致密颗粒蛋白质（GRA16），已发现哺乳动物蛋白质被分泌到寄生泡空间内。这通过免疫荧光染色（IFA）证明（图5B-I）。然后基于它们融合的天然GRA16蛋白的已知定位，预期融合蛋白通过寄生泡膜进入宿主细胞内（Bougdour等人2013）。
因此，本发明人已成功证实弓形虫可以被工程改造为表达与寄生虫的内源性蛋白质融合的异源（哺乳动物）蛋白质，并且这些蛋白质定位至寄生虫的致密颗粒分泌细胞器和寄生泡空间。本发明人已将人蛋白质工程改造以与GRA16融合，所述GRA16是由寄生虫天然分泌到宿主细胞内的内源性蛋白质，其允许“骑”在寄生虫的蛋白质分泌机器上，用于目标蛋白质（例如，治疗性蛋白质）的靶向和分泌。这是建议刚地弓形虫作为该技术的可行基础的道路上的重要里程碑。
使用这种方法，本发明人已生成了新型稳定的刚地弓形虫转基因系，其表达与雷特综合征相关的人蛋白质MeCP2且定位至致密颗粒分泌细胞器和寄生泡空间，以及含有稳定刚地弓形虫转基因寄生虫的另外2个混合群体库，所述寄生虫表达与常见的神经病理状况相关的两种人蛋白质（天冬酰转移酶和存活运动神经元蛋白）且定位至致密颗粒分泌细胞器和寄生泡空间。
治疗性蛋白质MeCP2从转基因寄生虫分泌到宿主细胞内，且定位在宿主细胞中的 活性区域，核 - 结果证实由与刚地弓形虫分泌多肽融合的药物多肽组成的蛋白质融合物（以及此处具体地，与刚地弓形虫致密颗粒蛋白质GRA16融合的治疗性蛋白质MeCP2），可以从寄生虫释放到宿主细胞内且易位到宿主细胞中的治疗性蛋白质的靶位点（此处，核）。如通过免疫荧光染色（IFA）所示，含有MeCP2的融合蛋白定位至宿主细胞核（图5F-I）。这是提示刚地弓形虫作为该技术的可行基础的道路上的重要里程碑。
使用这种方法，本发明人已生成了新型稳定的刚地弓形虫转基因系，其表达与雷特综合征相关的人蛋白质MeCP2且定位至宿主细胞核（图5F-1）。
实施例2
通过寄生性递送拯救半乳糖脑苷脂酶缺乏症
基于制造商的方案[Otto P. van Diggelen. MOSCERDAM SUBSTRATES，Laboratoryprotocol for enzyme analysis for Krabbe disease；Galactocerebrosidase]的基于命名为6-十六烷酰基氨基-4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷（6HMU-β-D-半乳糖苷）的半乳糖脑苷脂酶合成荧光底物的酶促分解的半乳糖脑苷脂酶促活性测定。使用克拉伯患者衍生的成纤维细胞，该测定用于评估表达GALC-和GALC-TAT的寄生虫在培养物中拯救克拉伯病表型的能力。未处理的克拉伯病细胞（克拉伯患者衍生的成纤维细胞）、用假载体（空的人表达载体）转染的克拉伯病细胞和/或用不表达GALC的刚地弓形虫寄生虫感染的克拉伯病细胞用作阴性对照。阳性对照是野生型（WT）细胞系，或用人表达载体转染的克拉伯病细胞，所述人表达载体驱动独立的（加上HA标签的）GALC或GALC-TAT基因、或者与由测试的转基因寄生虫表达的融合物相同的Toxofilin/GRA16-融合的GALC或GALC-TAT基因的表达。这允许排除任何负面结果可能由蛋白质本身缺乏足够的效应，或者通过将Toxofilin或GRA16与治疗性蛋白质的N末端融合而破坏治疗性蛋白质的活性的可能性，并且因此允许寄生递送系统效率的可定量和直接推断。
该测定用于表征表达半乳糖脑苷脂酶的寄生虫拯救克拉伯病患者衍生的成纤维细胞中显示的半乳糖脑苷脂酶缺乏症的能力。该实验证实转基因寄生虫通过将补充蛋白质递送至培养中的细胞来拯救克拉伯病的能力。
实施例3
通过寄生递送拯救MECP2缺乏症
衍生自具有MECP2基因的突变或缺失的雷特综合征小鼠模型的神经和神经胶质细胞呈现一系列异常的形态和分子特征。[Percy，A. Rett syndrome: coming to terms withtreatment. Adv. Neurosci.（2014），[de la Torre-Ubieta等人Advancing theunderstanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016]。
使用雷特综合征细胞培养模型，雷特综合征的分子和形态特征表型的定量评分被用于评估表达MeCP2的寄生虫拯救培养物中的雷特综合征表型的能力。未处理的雷特综合征模型细胞、用假载体转染的雷特综合征模型细胞和/或用不表达MeCP2的刚地弓形虫寄生虫感染的雷特综合征模型细胞用作阴性对照。阳性对照是WT细胞系和用人表达载体转染的雷特综合征模型细胞，所述人表达载体驱动独立的（加上HA标签的）MECP2编码序列、或者与由测试的转基因寄生虫表达的融合物相同的Toxofilin/GRA16融合的MECP2编码序列的表达。这允许排除任何负面结果可能由蛋白质本身缺乏足够的效应，或者通过将Toxofilin或GRA16与治疗性蛋白质的N末端融合而破坏治疗性蛋白质的活性的可能性，并且因此允许寄生递送系统效率的可定量和直接推断。
该测定用于表征表达MeCP2的寄生虫拯救雷特综合征细胞培养模型中显示的MeCP2缺乏症的能力。该实验证实转基因寄生虫通过将补充蛋白质递送至培养的细胞来拯救雷特综合征的能力。
实施例4
在动物模型中测试转基因寄生虫系的治疗潜力
测试寄生虫的转基因系影响整个生物中的表型的能力。在小鼠中测试转基因寄生虫允许在免疫系统和功能性血脑屏障（BBB）的存在下的系统评价。将转基因刚地弓形虫寄生虫施用于待鼻内、肠内（例如经口）、皮下、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、颅内或脑内测试的状况的相应动物模型。转基因刚地弓形虫寄生虫以速殖子、缓殖子组织囊肿或卵囊的形式施用。
在用寄生虫接种后，动物模型进行表征且评价与所研究的状况相关的表型的表现（例如疾病的病理表型）。表型包括行为，形态和分子表型。通过与用不表达治疗性多肽的寄生虫治疗的动物和假治疗的动物比较，揭示了转基因寄生虫的效应。
例如，用表达治疗性蛋白质MeCP2的刚地弓形虫寄生虫治疗的雷特综合征的小鼠模型通过已知的疾病表型进行评价，所述疾病表型包括社交相互作用削弱，气味标记增加，后肢紧扣，寿命减少，焦虑，呼吸问题，活动减退，运动协调受损，miRNA介导的IGF1缺陷，BDNF水平降低，皮层可塑性受损，神经胶质功能障碍，GABA能神经元功能障碍，体细胞尺寸降低，树突棘密度降低，突触数目降低，活动降低（Ca2+成像），sEPSC和sIPSC频率和幅度降低，Tuj1+细胞数目降低，PAX6、SCN1A/1B表达降低，皮层神经元中的树突复杂度降低，皮层神经元中的AP频率降低，皮层神经元中的总转录降低，神经元、突触、高度表达基因的表达降低，皮层神经元中的即刻早期基因和线粒体基因，皮层神经元中的mRNA翻译降低，来自皮层神经元的BDNF分泌降低，皮层神经元中的AKT/mTOR途径活性降低，以及皮层神经元中的氧消耗和最大呼吸降低[de la Torre-Ubieta等人Advancing the understanding ofautism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016.]。
实施例5
用于递送定制的转录激活因子样效应物（TALE）的构建体和刚地弓形虫品系的生成
刚地弓形虫被工程改造为表达且分泌定制的转录激活因子样效应物（TALE）。定制的TALE可以用于广泛多样的基因组工程改造应用，包括转录调节和基因组编辑。TALE的DNA识别和结合区域由34-aa序列（单体）的串联重复组成，其确定识别的DNA序列的序列。存在4种类型的单体，所述单体在其重复变量残基（RVD）方面不同，这决定了它们识别的核苷酸。称为“NI”的单体（SEQ ID NO：4508）对于“A”核苷酸是特异性的；称为“HD”的单体（SEQ ID NO：4495）对于“C”核苷酸是特异性的；称为“NG”的单体（SEQ ID NO：4509）对于“T”核苷酸是特异性的，并且称为“NN”的单体（SEQ ID NO：4494）对于“G”或“A”核苷酸是特异性的。最近以来，另外的RVD NH（SEQ ID NO：4504）显示提供更高的G-特异性。串联重复DNA结合结构域始终以半长重复（0.5重复）结束。定制的TALE DNA结合结构域可以用于生成定制的TALE转录因子（TALE-TF），并且通过与合成的VP64转录激活因子融合来调节来自基因组的内源性基因的转录。定制的TALE DNA结合结构域也可以用于生成定制的TALE核酸酶（TALEN），并且可以用于生成位点特异性双链断裂，以通过融合到FokI核酸内切酶的催化结构域，促进通过非同源修复或同源定向修复的基因组编辑。通过从单体（SEQ ID NO：4508、4509、4494、4455和4504）构建DNA结合结构域来制备TALE，将所述DNA结合结构域插入TALEN主链或TALE-TF主链内。因为主链还包括在DNA结合结构域的末端处的0.5重复，所以存在4种类型的TALEN主链（例如，SEQ ID NO：4500、4501、4502和4503），以及4种TALE-TF主链（例如，SEQ ID NO：4496、4497、4498和4499）。主链还含有巨细胞病毒启动子（CMV）、来自Hax3 TALE的非重复N末端（N末端）、来自Hax3 TALE的非重复C末端（C末端）、用于插入定制的TALE DNA结合结构域（如BsaI）的IIs型限制性位点、含有ccdB阴性选择基因和氯霉素抗性基因的阴性选择盒（ccdB + CmR）、核定位信号（NLS）、以及来自FokI核酸内切酶（FokI）的催化结构域或衍生自单纯疱疹病毒（VP64）的VP16蛋白的合成转录激活因子，随后为2A自切割接头（2A）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。所有随后都为多腺苷酸化信号（聚A信号）（Sanjana等人，A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering，2012）。如上文一般材料和实验方法中所述，将所得到的TALE序列插入刚地弓形虫内源性分泌多肽的编码序列的下游，并且将所得到的构建体转染到刚地弓形虫内，以产生表达且分泌TALE的转基因刚地弓形虫品系。
例如，为了靶向有此需要的主体的基因组中的TACGTACG（SEQ ID NO：4505）序列，可以使用TALE核酸酶构建体或TALE转录因子构建体。在这些构建体的开放读码框中，对于靶向示例性“靶序列”（SEQ ID NO：4505）特异性的单体一个接一个地排列，如图6A（对于TALE核酸酶）和图6B（对于TALE转录因子）中示意性显示的。这些构建体的序列信息可在序列表（SEQ ID NO：4506和4507）中获得。
实施例6
表达哺乳动物治疗性蛋白质且将其定位至其棒状体分泌细胞器的刚地弓形虫寄生虫 的生成
为了生成表达哺乳动物蛋白且将其靶向其棒状体分泌细胞器的弓形虫寄生虫，本发明人用含有编码与棒状体蛋白质Toxofilin融合的目标蛋白质的序列的质粒转染I型RHΔHX速殖子或RH（用pDHFR选择质粒共转染）刚地弓形虫。在Toxofilin融合系统中测试的哺乳动物蛋白质是：神经胶质衍生的神经营养因子（GDNF）、parkin（PARK2）、半乳糖脑苷脂酶（GALC）、与TAT蛋白转导结构域融合的半乳糖脑苷脂酶（GALC-TAT；SEQ ID NO：4487）、甲基CpG结合蛋白（MeCP2）、天冬酰转移酶（ASPA）和运动神经元存活（SMN1）。为了改善蛋白质表达和靶向，本发明人还测试了一些蛋白质的密码子优化形式，包括GALC、MECP2、ASPA以及以密码子优化形式测试的另外的基因TFEB（SEQ ID NO： 4604）。
ASPA（SEQ ID NO：4483）、密码子优化的ASPA（SEQ ID NO：4602）、GALC（SEQ ID NO：4486和4601）、GALC-TAT（SEQ ID NO：4488）、PARK2（SEQ ID NO：4478）、SMN1（SEQ ID NO：4479）、GDNF（SEQ ID NO：4489）、MeCP2（SEQ ID NO：4476）和密码子优化的MeCP2（SEQ IDNO：4477）显示寄生虫中融合蛋白的可变靶向，所述寄生虫包括棒状体靶向以及其它靶向模式，类似于寄生虫中的内质网、高尔基体、核、细胞质、质体样细胞器（apicoplast）、微线体和其它定位（图9A-N）。
GALC-TAT突变形式主要生成棒状体样融合蛋白定位。根据突变的GALC-TAT，本发明人还生成了强烈表达融合蛋白的克隆系且将其靶向棒状体（图9H）。
实施例7
表达哺乳动物治疗性蛋白质，将其定位至其致密颗粒分泌细胞器且将其分泌到寄生泡 内的刚地弓形虫寄生虫的生成
为了生成表达哺乳动物蛋白且将其靶向其致密颗粒分泌细胞器的刚地弓形虫寄生虫，用含有编码与致密颗粒蛋白质GRA16融合的目标蛋白质的序列的质粒转染I型RHΔHX刚地弓形虫。在GRA16融合系统中测试的哺乳动物蛋白质编码基因是GALC [人形式（SEQ ID NO：4486和4601）和密码子优化的（SEQ ID NO：4603）、GALC-TAT（人形式SEQ ID NO：4488）、MECP2（密码子优化的，SEQ ID NO：4477）、ASPA [人形式（SEQ ID NO：4483）和密码子优化的（SEQ ID NO：4602）]、SMN1（人形式，SEQ ID NO：4479）和TFEB（密码子优化的，SEQ ID NO：4604）。
GALC、密码子优化的GALC和GALC-TAT在转染的寄生虫中表达（图10E、10F和10H）。ASPA、密码子优化的ASPA、SMN1、密码子优化的MeCP2和密码子优化的TFEB由致密颗粒表达且分泌到寄生泡（图10C、10G、10D、10I、10J）。
实施例8
使用转基因刚地弓形虫将哺乳动物治疗性蛋白质递送到培养中的人成纤维细胞
本发明人已工程改造了六种I型和II型弓形虫克隆系，除了将融合蛋白分泌到寄生泡内之外，所述弓形虫克隆系还能够将其从寄生泡中释放出来，并且将其以可通过免疫荧光染色检测的量靶向宿主细胞的核。这些克隆系是：密码子优化的RH GRA16-MECP2（RHGRA16-MECP2opt）、密码子优化的RH GRA16-TFEB（RH GRA16-TFEBopt）、密码子优化的Prugniaud-GFP-荧光素酶DHFR-TS GRA16-MECP2（Pru-GFP-LUC GRA16-MECP2opt）、密码子优化的Prugniaud-GFP-荧光素酶DHFR-TS GRA16-TFEB（Pru-GFP-LUC GRA16-TFEBopt）、密码子优化的Prugniaud GRA16-MECP2（Pru GRA16-MECP2opt）和密码子优化的PrugniaudGRA16-TFEB（ Pru GRA16-TFEBopt）。除表达融合蛋白的转基因系之外，本发明人还生成了2种对照系，其表达与单独的HA表位标签融合的载体蛋白GRA16：RH GRA16-HA（RH GRA16-HAstop）和Prugniaud GRA16-HA（Pru GRA16-HAstop）。因为MeCP2和TFEB均为核蛋白，所以宿主细胞核靶向意指它们靶向其在细胞中的活性位点。上述所有系中的蛋白质的分泌和宿主细胞核靶向通过以下在HFF人成纤维细胞中进行检测：用相应系的速殖子感染在完全DMEM中的HFF细胞，固定，免疫荧光染色以及通过荧光和偏振光显微镜检查的分析（图10B、10I和10J）。
为了定量体外GRA16介导的蛋白质递送的效率和动力学，本发明人定量了三种I型系RH GRA16-HAstop、RH GRA16-MECP2opt和RH GRA16-TFEBopt的速殖子随着时间过去的递送和感染复数（MOI），如图11A-C中概括的。
实施例9
使用转基因刚地弓形虫将哺乳动物治疗性蛋白质递送到培养中的人神经元
永生化的人多巴胺能神经元前体细胞，也称为Lund Human Mesencephalic（LUHMES）细胞，在含有F12高级DMEM培养基的培养基中生长，所述DMEM培养基补充有L-谷氨酰胺、N-2无血清补充物和βFGF（β-成纤维细胞生长因子）。使用补充有L-谷氨酰胺、N-2无血清补充物、四环素、GDNF和cAMP（环一磷酸腺苷）的F12高级DMEM培养基，将细胞在培养中分化成形态学和生物化学成熟的多巴胺样神经元。在分化的第6-9天是（在此时细胞是成熟神经元），克隆系RH GRA16-MECP2opt、RH GRA16-TFEBopt和RH GRA16-HAstop的速殖子用于感染神经元。感染后16-22小时，将神经元固定且进行免疫荧光染色，并且通过荧光和偏振光显微镜检查进行分析。测试的所有系都呈现融合蛋白的明显分泌，所述融合蛋白靶向人神经元的核（图12A-C）。
另外，用RH GRA16-MECP2opt速殖子感染人神经元，并且在感染后24小时收集。用PBS洗涤受感染的神经元，使用无菌细胞刮棒刮擦且通过离心形成团块，去除残留的PBS且将团块在液氮中快速冷冻。使用与MeCP2抗体结合的磁珠免疫沉淀从受感染的神经元中提取的核蛋白。遵循标准蛋白质印迹方案，用相同的MeCP2抗体对免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹。所得到的印迹呈现大约75 kDa和大约130 kDa 的2个强条带。~75 kDa条带代表来自人神经元的内源性未截短的MeCP2（预测大小：75kDa），并且~130 kDa条带代表寄生虫递送的GRA16-MeCP2融合蛋白（GRA16预测大小：55kDa。融合蛋白预测大小： 75+55 = 130 kDa）（图14）。
实施例10
使用转基因刚地弓形虫将哺乳动物MECP2递送至小鼠原代皮层和海马培养物，以及递 送的MECP2与异染色质DNA的结合
将来自P1（第1天）小鼠幼仔的皮层和海马的富含神经元的原代培养物培养5天，并且用转基因系RH GRA16-MECP2opt的速殖子感染。感染后12、24和48小时，将神经元固定，免疫荧光染色并且通过荧光和偏振光显微镜检查进行分析。在所有列出的时间点，GRA16-MECP2融合蛋白被分泌且靶向神经元的核，并且它也出现在对应于致密异染色质DNA区域的病灶中，通过强烈的DAPI染色识别（图13A-D）。这是MeCP2功能性的经典标记物，因为它提示它在异染色质上成功结合。值得注意的是，在培养系统中，刚地弓形虫可以感染神经元、神经胶质细胞和其它细胞。因为原代培养物不是纯神经元（根据NeuN染色），本发明人可以看到用转基因刚地弓形虫感染的非神经元细胞（可能主要是神经胶质细胞）也接受了MeCP2融合蛋白，并且呈现相同的特征性病灶模式。
实施例11
GRA16和GRA16-MECP2融合蛋白在刚地弓形虫缓殖子囊肿中的表达
在感染的正常过程期间，在其中寄生虫复制且在体内作为速殖子传播的初始急性期后，免疫压力促使刚地弓形虫速殖子分化成缓殖子，其位于组织中持久的休眠囊肿中，并且主要是在大脑中（Carruthers VB，Suzuki Y，2007. Schizophr Bull. 33（3）:745-51.Effects of Toxoplasma gondii infection on the brain）。因此，本发明人调查了转基因刚地弓形虫在它们分化成缓殖子形式后是否继续表达GRA16融合的治疗性蛋白质。通过用碱性培养基应激3至5天，诱导转基因刚地弓形虫在体外分化成缓殖子。碱性培养基含有用10 mM HEPES调节至pH 8.1的DMEM培养基和补充有青霉素-链霉素的1%胎牛血清（TomitaT，Bzik DJ,等人2013. PLoS Pathog. 9（12）:e1003823. The Toxoplasma gondii cystwall protein CST1 is critical for cyst wall integrity and promotes bradyzoitepersistence）。本发明人测试了品系Pru GRA16-HAstop和Pru GRA16-MeCP2的分化。通过囊壁的DBA（双花扁豆凝集素）染色鉴定的缓殖子囊肿继续表达GRA16-HAstop（数据未显示）和GRA16-MeCP2蛋白两者（图15A-C）。这一发现显示转基因寄生虫在分化成缓殖子阶段后可以继续表达GRA16和GRA16融合蛋白，这对于慢性感染中来自囊肿的连续分泌和蛋白质递送是非常重要的。
实施例12
探测通过刚地弓形虫递送的异源多肽与受体细胞中的内源性蛋白质之间的分子相互 作用
通过对来自受感染培养物和受感染动物的细胞裂解产物执行共免疫沉淀，本发明人可以破译由转基因刚地弓形虫递送的多肽与内源性蛋白质和核酸之间的分子相互作用。
例如，在哺乳动物细胞中，MeCP2结合来自SMRT/NCoR和SIN3A辅阻遏物复合物的DNA和蛋白质两者。可以通过免疫荧光染色和染色质免疫沉淀来探测与DNA的结合，并且可以通过免疫荧光染色和通过蛋白质共免疫沉淀来探测与其它蛋白质的结合。在递送的融合蛋白上添加的表位标签可以用于区分由宿主细胞产生的蛋白质的拷贝和由寄生虫递送的蛋白质的拷贝，而针对蛋白质本身的抗体可以用于探测内源性和寄生虫递送的蛋白质两者（例如用于比较测定）。
实施例13
测试转基因刚地弓形虫在动物模型中连续（/长期）递送目标异源蛋白质的能力
测试寄生虫的转基因系影响整个生物中的表型的能力。在动物模型中测试转基因寄生虫允许在免疫系统和功能性血脑屏障（BBB）的存在下的系统评价。这通过遵循该领域中建立的标准感染方案来完成，以用转基因刚地弓形虫感染小鼠（Cabral CM等人，2016，PLoSPathog. 12（2）:e1005447. Neurons are the Primary Target Cell for the Brain-Tropic Intracellular Parasite Toxoplasma gondii；Berenreiterová M等人，2011.PLoS One. 6（12）:e28925. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in thebrain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioralmanipulation hypothesis；Tait ED等人2010. J. Immunol. 185（3）:1502-12.Virulence of Toxoplasma gondii is associated with distinct dendritic cellresponses and reduced numbers of activated CD8+ T cells；Koshy AA等人2012.PLoS Pathog. 8（7）:e1002825. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade；Jensen KD等人2015. MBio. 6（2）:e02280. Toxoplasma gondii superinfection andvirulence during secondary infection correlate with the exact ROP5/ROP18allelic combination）。将转基因刚地弓形虫寄生虫鼻内、肠内（例如经口）、皮下、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、颅内或脑内施用于动物模型。转基因刚地弓形虫寄生虫以速殖子、缓殖子组织囊肿或卵囊的形式施用。动物模型可以是野生型动物，或具有可通过递送转基因寄生虫中表达的目标蛋白质来治疗或以其它方式影响的状况的模型动物。在急性感染的最初阶段后，动物发展慢性缓殖子组织囊肿，主要在脑中。这种递送模式依赖在感染的慢性阶段来自转基因刚地弓形虫的目标蛋白质的连续表达和分泌。
在慢性感染发展的不同阶段（感染后前3周至2个月，取决于感染的品系和途径），以及在慢性感染已建立和稳定后的不同时间点（感染后数月至数年的时间尺度），脑组织染色用于评价受感染细胞的百分比、寄生虫和递送的蛋白质在脑及其它组织中的分布，并且定量所递送的蛋白质的水平。共免疫沉淀和细胞形态学可以用于确认递送的蛋白质与接受细胞中的内源对应物之间的分子相互作用，并且为其功能提供证据。
使用生理、行为、细胞和分子测量，在慢性感染的不同阶段和疾病进展的不同阶段监测且表征处理的动物模型的状况，以便评价疾病表型的表现和治疗在缓解其中的功效，以及起于治疗的任何潜在毒性。通过与用不表达药物多肽的寄生虫处理的动物和/或假处理的动物比较来评价转基因寄生虫的效应。
例如，用表达治疗性蛋白质MeCP2的刚地弓形虫寄生虫治疗的雷特综合征的小鼠模型通过已知的疾病表型进行评价，所述疾病表型包括社交相互作用削弱，气味标记增加，后肢紧扣，寿命减少，焦虑，呼吸问题，活动减退，运动协调受损，miRNA介导的IGF1缺陷，BDNF水平降低，皮层可塑性受损，神经胶质功能障碍，GABA能神经元功能障碍，体细胞尺寸降低，树突棘密度降低，突触数目降低，活动降低（Ca2+成像），sEPSC和sIPSC频率和幅度降低，Tuj1+细胞数目降低，PAX6、SCN1A/1B表达降低，皮层神经元中的树突复杂度降低，皮层神经元中的AP频率降低，皮层神经元中的总转录降低，神经元、突触、高度表达基因的表达降低，皮层神经元中的即刻早期基因和线粒体基因，皮层神经元中的mRNA翻译降低，来自皮层神经元的BDNF分泌降低，皮层神经元中的AKT/mTOR途径活性降低，以及皮层神经元中的氧消耗和最大呼吸降低（de la Torre-Ubieta等人Advancing the understanding ofautism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016，22:345-61）。
实施例14
测试转基因刚地弓形虫在动物模型中瞬时（/急性）递送目标异源蛋白质的能力
与上文实施例13类似，测试寄生虫的转基因系影响整个生物中的表型的能力。在动物模型中测试转基因寄生虫允许在免疫系统和功能性血脑屏障（BBB）的存在下的系统评价，并且可以通过转基因刚地弓形虫寄生虫以速殖子、缓殖子组织囊肿或卵囊形式的鼻内、肠内（例如经口）、皮下、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、颅内或大脑内施用而进行。动物模型可以是野生型动物，或具有可通过递送转基因寄生虫中表达的目标蛋白质来治疗或以其它方式影响的状况的模型动物。该实验设计集中于瞬时递送的评价，所述瞬时递送不依赖分化成缓殖子和慢性感染和/或慢性囊肿建立。一些实例包括：通过减毒寄生虫递送，所述减毒寄生虫不能分化成缓殖子和/或不能复制和/或不能在体内持续长于几周，或者在其它方面不能建立慢性感染；通过局部施用递送至靶组织或靠近靶组织的区域，随后为寄生虫的清除或灭活。这些也可以重复多次用于重复给药。免疫抑制剂可以在用寄生虫感染之前、同时或之后施用，以增强感染且帮助之前已用刚地弓形虫感染的动物的再感染。该实验设计还包括通过能够建立慢性感染的转基因刚地弓形虫的递送，但其中在慢性感染建立之前在感染的急性期执行样品收集或分析。这种递送形式主要依赖通过转基因系的速殖子分泌目标蛋白质。在急性感染期间的不同阶段（感染后第一天至约2个月，取决于感染的品系和途径），脑组织染色用于评价受感染细胞的百分比，表征寄生虫和递送的蛋白质在脑及其它组织中的分布，并且定量所递送的蛋白质的水平。共免疫沉淀和细胞形态学用于确认递送的蛋白质与接受细胞中的内源对应物之间的分子相互作用，并且为其功能提供证据。
使用生理、行为、细胞和分子测量，在治疗开始后的不同时间点和疾病进展的不同阶段监测且表征处理的动物模型的状况，以便评价疾病表型的表现和在缓解其治疗中的功效，以及源于治疗的任何潜在毒性。通过与用不表达治疗性多肽的寄生虫处理的动物和/或假处理的动物比较来评价转基因寄生虫的效应。
实施例15
增加转基因刚地弓形虫的安全性和可控性的进一步修饰的引入
尽管寄生虫一般在健康人中视为无害的，但对寄生虫的另外修饰可以掺入治疗品系中，以便进一步减弱其毒力。作为其门的模式生物，在广泛多样的高度发展的遗传工具用于修饰所述寄生虫（Jiménez-Ruiz E，Wong EH，Pall GS，Meissner M. Parasitology. 2014，141:1390-8. “Advantages and disadvantages of conditional systems forcharacterization of essential genes in Toxoplasma gondii”），其可以用于生成减毒和外源可控的寄生虫（Moe-Behrens GH，Davis R，Haynes KA. Front Microbiol. 2013 4:5. “Preparing synthetic biology for the world”）。一种方法可以包括工程改造的营养缺陷型。其次，可以通过靶向和破坏寄生虫的特定毒力机制来开发减毒寄生虫，所述毒力机制对于其递送蛋白质药物的能力不是必需的。另一种方法可以包括通过工程改造诱导的致死性的主动控制，例如诱导性“自杀开关”（自毁元件），其在施用活化分子时消除寄生虫。一些实例可以包括利用广泛使用的四环素诱导型启动子用于体内寄生虫中的致死或凋亡途径的药物诱导激活，或雷帕霉素二聚化diCre系统用于必需基因的诱导性敲除或者用于致死或凋亡途径的诱导型激活。此类药物诱导型控制还可以允许由于组织或细胞对药物的差异渗透性及其在体内的不同分布，寄生虫从特定组织、区域或细胞类型的差异清除。
分析与讨论
本发明是利用脑寄生虫刚地弓形虫机制的蛋白质递送平台，其允许其穿透血脑屏障且将蛋白质递送至CNS内的细胞，且尤其是神经元。
为了使治疗性蛋白质能够递送至CNS，本发明人重新调整寄生虫刚地弓形虫用于合成目标蛋白质且递送至CNS中的细胞。本发明人因此建立了用于将蛋白质特异性和受控地递送至CNS内的细胞的通用平台。
工程改造的寄生虫具有下述新型能力：
（1）它可以容易地修饰，以合成一系列治疗性异源蛋白质且将其特异性地分泌到CNS内的靶细胞内。
（2）它可以含有减少或排除寄生虫元件的修饰，所述寄生虫元件可以介导对受感染宿主的有害作用。
（3）它可以含有调节和/或自毁元件，所述元件允许在宿主中之后控制其分布和时空活性。
下述是本文描述的寄生虫基因组中的改变的非限制性概括：
（i）选择的治疗性蛋白质与寄生虫的特定内源性分泌蛋白质的融合。可以向融合基因/蛋白添加另外的辅助元件和修饰，其可以增加治疗性融合蛋白的有效性，例如可以允许治疗性蛋白质从内源性寄生虫蛋白质脱离的切割位点，之后不再需要它用于其靶向或活性，或者介导弓形虫和递送蛋白质如表位标签和荧光蛋白的效率和分布的检测和评价。
（ii）对寄生虫的治疗作用不必要的毒力基因的去除。这些修饰减少了寄生虫对患者的潜在有害作用，并且使其与安全的临床使用相关。
（iii）调节元件的插入，所述调节元件可以被诱导以促使寄生虫响应外部施用的药物而自毁，或操纵寄生虫的活动。这些元件增强了该技术的安全特征，并且还提供了其时空活性的增加控制。
用本发明的一些实施方案的方法开发的初始品系基于用于克拉伯病的半乳糖脑苷脂酶和半乳糖脑苷脂酶-TAT蛋白，用于一系列神经退行性疾病和其它状况（其中有帕金森氏病、核上性麻痹 、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、视网膜变性、创伤性脑损伤和缺氧/缺血性CNS病症）的GDNF蛋白，用于卡纳万病的天冬酰转移酶蛋白，用于雷特综合征的MeCP2蛋白，用于脊髓性肌萎缩的SMN蛋白，用于帕金森氏病的E3泛素-蛋白连接酶parkin，以及用于溶酶体贮积病和神经退行性疾病的TFEB。尽管本发明人已选择了目前正在临床上测试且具有已知补充功能的许多治疗性蛋白质，但该平台可以适于广泛多样的蛋白质。
该技术的可能应用包括但不限于：
1. 通过递送治疗性蛋白质的状况治疗；
2. 蛋白质对健康个体中的脑的供应，用于加强脑功能或促进神经再生的目的；
3. 用于补充性蛋白质合成的高度特异性和有效靶向蛋白质递送的一般解决方案。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但显而易见的是许多替代、修改和变化对于本领域技术人员是明显的。因此，其意图包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都在本文中整体引入本说明书作为参考，其程度如同每个个别出版物、专利或专利申请具体且个别地指出引入本文作为参考。另外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，它们不应解释为必然限制。
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Claims (40)

1.一种包含异源多核苷酸的核酸构建体，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导所述异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是所述启动子不是Toxofilin启动子。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述内源性启动子不是棒状体蛋白质的内源性启动子。
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质由所述弓形虫的棒状体分泌。
4.权利要求3的核酸构建体，其中由所述棒状体分泌的所述弓形虫分泌的蛋白质包含Toxofilin和/或ROP1。
5.权利要求1的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质是非棒状体蛋白质。
6.权利要求5的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质选自微线体蛋白质和致密颗粒蛋白质。
7.权利要求1的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质由所述弓形虫的致密颗粒分泌。
8.权利要求7的核酸构建体，其中由所述致密颗粒分泌的所述蛋白质包含选自SEQ IDNO：234-279的氨基酸序列。
9.权利要求7的核酸构建体，其中由所述致密颗粒分泌的所述弓形虫分泌的蛋白质包含GRA16和/或GRA24。
10.权利要求1的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质由所述弓形虫的微线体分泌。
11.权利要求10的核酸构建体，其中由所述微线体分泌的所述蛋白质包含选自SEQ IDNO：280-322的氨基酸序列。
12.权利要求1的核酸构建体，其中所述弓形虫分泌的蛋白质包含刚地弓形虫巨噬细胞移动抑制因子（TgMIF）。
13.权利要求1-12中任一项的核酸构建体，其中所述异源多核苷酸进一步包含在所述异源多核苷酸上游和/或下游的弓形虫非翻译区（UTR）核酸序列。
14.权利要求1-13中任一项的核酸构建体，其进一步包含编码诱导型自毁元件的第三核酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的核酸构建体，条件是所述核酸构建体不包含Cre-重组酶编码序列。
16.权利要求1-15中任一项的核酸构建体，其适合于整合到弓形虫的基因组内。
17.权利要求16的核酸构建体，其中所述诱导型自毁元件对药物具有活性。
18.权利要求17的核酸构建体，其中所述药物包含抗生素。
19.权利要求1-18中任一项的核酸构建体，其进一步包含至少一个框内切割位点，其允许所述药物多肽从所述弓形虫分泌的蛋白质中脱离。
20.权利要求1-19中任一项的核酸构建体，其中所述异源多核苷酸进一步包含编码可选择标记物的核酸序列。
21.一种包含至少两种核酸构建体的核酸构建体系统，其中所述至少两种核酸构建体的第一核酸构建体是权利要求1-19中任一项的核酸构建体，并且所述至少两种核酸构建体的第二核酸构建体包含编码可选择标记物的多核苷酸。
22.权利要求20或21的核酸构建体，其中所述可选择标记物包含氯霉素乙酰转移酶（CAT）、DHFR-TS、BLE、HXGPRT、UPRT、TK、CD、荧光蛋白或表位标签。
23.一种弓形虫，其用权利要求1-20和22中任一项的核酸构建体、或者用权利要求21或22的核酸构建体系统进行转化。
24.权利要求23的弓形虫，其未被减毒。
25.权利要求23或24的弓形虫，其缺乏促进所述弓形虫在宿主细胞中繁殖的弓形虫元件。
26.权利要求25的弓形虫，其缺乏毒力基因，所述毒力基因对于将目标蛋白质递送到主体的中枢神经系统（CNS）内不是必需的。
27.一种药物组合物，其包含权利要求23-26中任一项的弓形虫和药学可接受的载体。
28.权利要求27的药物组合物，其用于治疗被诊断有特征在于主体的中枢神经中缺乏内源性蛋白质的病理状况的主体。
29.权利要求27的药物组合物，其用于治疗被诊断有病理状况的主体，所述病理状况可通过在主体的中枢神经系统中施用所述药物多肽来治疗。
30.权利要求27、28或29的药物组合物，其进一步包含免疫抑制剂。
31.一种将目标蛋白质施用到主体的中枢神经系统内的方法，所述方法包括：
向主体施用权利要求23-26中任一项的弓形虫或者权利要求27、28、29或30的药物组合物，从而将目标蛋白质施用于所述主体的中枢神经系统。
32.一种治疗有此需要的主体的方法，其包括向所述主体施用权利要求24-26中任一项的弓形虫或者权利要求27、28、29或30的药物组合物，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用所述药物多肽治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
33.一种治疗有此需要的主体的方法，其包括向所述主体施用包含核酸构建体的弓形虫，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码药物多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导所述异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述主体被诊断有可通过在主体的中枢神经系统中施用所述药物多肽治疗的病理状况，从而治疗有此需要的主体。
34.权利要求33的方法，其中所述启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是所述启动子不是toxofilin启动子。
35.一种向主体施用目标多肽的方法，其包括向所述主体施用包含核酸构建体的弓形虫，所述核酸构建体包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在编码目标多肽的第二核酸序列的上游框内融合的编码弓形虫分泌的蛋白质的第一核酸序列，其中所述异源多核苷酸与用于指导所述异源多核苷酸在弓形虫中的转录的启动子可操作地连接，其中所述启动子选自：组成型启动子、诱导型启动子、潜伏期特异性启动子和弓形虫内源性启动子，条件是所述启动子不是toxofilin启动子，从而向所述主体施用所述目标多肽。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其进一步包括在向主体施用所述弓形虫之前和/或在施用所述弓形虫之后和/或在施用所述弓形虫同时，向主体施用免疫抑制药物。
37.权利要求31-34和36中任一项的方法，其中所述药物多肽包含对应于能够治疗所述病理状况的所述内源性蛋白质的野生型氨基酸序列。
38.权利要求31-34和36中任一项的方法，其中所述药物多肽包含能够治疗所述病理状况的抗体。
39.权利要求31-34和36中任一项的方法，其中所述药物多肽包含能够治疗所述病理状况的毒素。
40.权利要求31-34和36-39中任一项的方法，其进一步包括向所述主体施用能够诱导所述自毁元件的药物。
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