JP7497397B2 - タンパク質を中枢神経系（ｃｎｓ）に送達するための、組換え寄生虫 - Google Patents

タンパク質を中枢神経系（ｃｎｓ）に送達するための、組換え寄生虫 Download PDF

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Description

本発明は、その一部の実施形態では、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）により分泌されるポリペプチドに融合された薬学的ポリペプチドの分泌のための核酸構築物、およびそれを有するトキソプラズマ、より具体的には、対象を処置するための医薬組成物およびそれを使用する方法に関するが、これらに限定されるものではない。
タンパク質治療剤の送達のためのロバストな方法の欠如は、その臨床処置への変換において、現在、大いに障害となっている。タンパク質は、単純な化合物によって模倣することができない、高度に特異的で複雑な一連の機能を果たすことが多い（Nat Rev Drug Discov. 2008; 7(1):21-39. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Leader B, Baca QJ, and Golan DE）。しかしながら、その高分子的性質のため、体内の標的部位への治療用タンパク質の送達は、非常に困難である。生物学的障壁に対する透過性が低いことに併せて、機能的安定性が低く、投与後または貯蔵中に活性が急速に喪失することにより、活性タンパク質の送達は制限される。化学的改変、複合体および担体システムの進行中の開発は、一部の治療用タンパク質の送達に寄与したが、これらの多くは、「接近可能な標的空間」内、すなわち、血管コンパートメント中、または細胞表面上にある標的に依然として限定される（Mitragotri 2014, Nat. Rev. Drug. Discov. 13(9):655-72）。血液脳関門（ＢＢＢ）が脳への分子の輸送を厳密に調節するため、神経疾患の分野では特に効率的な送達が困難であるが、標的が細胞内にある場合は、複雑性がさらに増す。
補充タンパク質をＣＮＳ内の細胞に送達するためには、ＢＢＢを通過し、ＣＮＳ内の特定の細胞を標的とすることができる機構を開発することが必要である。
現在、特定のタンパク質の欠損により引き起こされる病態を処置するための主な手法は、遺伝子療法、幹細胞療法および酵素補充療法である。
遺伝子療法は、治療用タンパク質の機能的コピーの発現を増加させることを目的として、治療用タンパク質をコードする遺伝子の機能的コピーを挿入する手法である（Cox, D. B. T., et al., 2015）。遺伝子療法は、遺伝子の正確な配列を提供するが、翻訳機構または翻訳後修飾の欠陥により引き起こされるか、またはそれに付随するタンパク質機能の喪失に対処するものではない。さらに、遺伝子療法は、挿入変異誘発（Persons, D. A. & Baum, C. 2011）、移動、生殖細胞系伝達、免疫原性、および限定的な導入遺伝子転換能（Schambach, A., et al., 2013、Al-Dosari et al., 2009）に起因するがん発生のリスクを有し得る。ＣＮＳを標的とするために、最も一般的に遺伝子療法は、ウイルスベクターの使用によって仲介される。ここでウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ感染性貧血ウイルス）に由来するものであり、より最近では、ＳＶ４０－ＡＡＶおよびレンチウイルスがこれらの中で最も一般的である。ある種のウイルスベクターは他のものよりも安全であるが、タンパク質プロセッシングの欠陥に対処するものではなく、臨床効率も依然として限定的である。
幹細胞療法は、移植細胞のタンパク質合成機構を利用するものであり、タンパク質の内因性合成の欠陥を補うことができる。この手法を臨床的に実行するために多くの努力が払われているにも拘わらず、そのような処置の効率は、移植細胞に対する拒絶反応、および患者特異的幹細胞の使用に関する低い費用効率によって下がっている。さらに、幹細胞治療に伴うリスクには、移植細胞に対する拒絶反応を低減させるのに必要とされる免疫抑制に伴う副作用、およびがんの発生が含まれる（Dimmeler, S., et al., 2014）。
補充タンパク質を体外で合成した後、ＣＮＳ内に送達するタンパク質または酵素補充療法（ＥＲＴ）が臨床的に意義のあるものとなるためには、ＢＢＢの不透過性を克服し、正確なターゲティング法を開発しなければならない。タンパク質送達に関するそのような手法の１つは、脳への直接注入、またはタンパク質が低い効率で拡散し得る隣接臓器への直接的注入である。かくして、そのような手法のリスクに加えて、必要な量でＣＮＳ内の特定の領域をターゲティングする能力には限界がある。そのような手法の別の問題は、臨床的に実行が難しいことが多い、反復投与の必要性である（Abbott, N. J. 2013）。
ＥＲＴをＢＢＢ透過性の増大と組み合わせて、治療用タンパク質がより高い効率でＣＮＳ内に拡散するようにすることができる（Malhotra, M. & Prakash, S. 2011）。これは、ＢＢＢを構成する細胞の縮小、またはＢＢＢを通る輸送機構の操作によって達成される。しかしながら、この手法は、オプソニン作用のため効率的ではなく、目的の補充タンパク質と共に望ましくない物質がＣＮＳ内に拡散するリスクを有する（Bradbury, M. W. B. 2012）。
代替的な手法は、ＣＮＳに進入する成分に治療用タンパク質を結合して、ＢＢＢを通過するその固有の能力を利用するものである。ＢＢＢを通過する輸送を媒介することができる薬剤としては、融合タンパク質、デンドリマー、固体脂質ナノ粒子、リポソームおよびナノ粒子が挙げられる（Solaro, R., 2010）。しかしながら、これらの手法はさらなる開発を必要とし、臨床試験には達していない。
トキソプラズマ・ゴンディは、アピコンプレクサ門の単細胞性細胞内寄生原生動物である。トキソプラズマ・ゴンディの主な宿主はネコ科動物であり、ネコ科動物においてのみ、その生活環の有性期を経ることができる。しかしながら、トキソプラズマ・ゴンディは、二次宿主として、ヒトを含む多くの温血生物に感染し得る。ヒトにおいては、げっ歯類と同様に、宿主が寄生虫に感染した後（典型的には、感染性組織嚢胞または卵母細胞の摂取後）、寄生虫は複製の速いタキゾイト期に分化する。トキソプラズマ・ゴンディのタキゾイトは、能動的浸透によって有核宿主細胞に侵入し、寄生体胞を確立させ、その内部で内生二分裂によって複製する。タキゾイトは、腸上皮を通って移動し、免疫細胞上での「ヒッチハイク」と、自発的に自らを移動させることの両方により遠位組織に到達し、血液脳関門を突破し、脳中に拡散する［Harker 2015, Parasite Immunol. 37(3):141-9］。かくして、タキゾイトは、循環器に進入し、二次組織に播種する。複製は、播種、および感染急性期の遠位組織への到達にとって重要である。一度、脳の独特の環境に入ると、トキソプラズマ・ゴンディは脳中の細胞（主にニューロンであるが、低い割合でグリア細胞にも）浸透し、免疫圧力の後、潜伏性のブラディゾイト期に分化し、細胞質の細胞内嚢胞に滞在する。これが、慢性感染を特徴付ける（Cabral et al. 2016, PLoS Pathog. 12(2):e1005447）。ブラディゾイトを留める組織嚢胞は、非常にゆっくりと増殖し、休止代謝プログラムを有しながら、宿主の生存期間にわたって持続する（Parasite Immunol. 2015, 37(3):141-9. “Toxoplasma gondii dissemination: a parasite's journey through the infected host”）。
トキソプラズマ・ゴンディは、推定で世界人口の１／３に感染しているが、感染は健常なヒトでは無症状のままであり（Montoya, J. G. & Liesenfeld, O. 2004）、規則性のない障害を受けた免疫系を有する個体にとってのみリスクとなる。最も重要なことに、感染中にトキソプラズマ・ゴンディは、宿主細胞中にタンパク質を分泌するが、これは細胞侵入のときと、細胞内のトキソプラズマ・ゴンディが電子密度の高い分泌性細胞小器官であるミクロネーム、ロプトリー、および高密度顆粒の３種を有するときとの両方である。宿主細胞への侵入は、３種全ての細胞小器官の内容物の連続的分泌によって媒介され、これらは、寄生虫が宿主細胞に侵入するとき、およびそれがその内部に滞在するときに、頂端領域からエキソサイトーシスされる（Dlugonska, H. 2008）。ミクロネームは、トキソプラズマ・ゴンディの結合および透過に関与するが、ロプトリーは、一過的構造の作出、接続部の移動、次いで、ＰＶの確立に必要である。ロプトリータンパク質は、「キスアンドスピット」と呼ばれるプロセスにおける宿主との最初の接触の際に分泌される（Boothroyd, J. C. et al., 2008）。高密度顆粒は、多くの寄生虫期を通してタンパク質を分泌する。分泌プロセスは、液胞内ネットワークの形成と一致し、トキソプラズマ・ゴンディの細胞内滞在中、継続する（Dlugonska, H. 2008、Carruthers, V. B. & Sibley, L. D. 1997）。
さらなる背景技術としては、Koshy, A. A. et al. 2010、米国特許第８，６７３，２８９号明細書、米国特許出願公開第２０１２００４５４７７号明細書、Lodoen M.B., et al. 2010. Cellular Microbiology, 12: 55-66が挙げられる。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結されており、プロモーターが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、潜伏期特異的プロモーター、およびトキソプラズマ内因性プロモーターからなる群より選択され、但し、プロモーターがトキソフィリンプロモーターではない、核酸構築物が提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、少なくとも２つの核酸構築物を含む核酸構築物システムであって、少なくとも２つの核酸構築物の第１の核酸構築物が本発明の一部の実施形態の核酸構築物であり、少なくとも２つの核酸構築物の第２の核酸構築物が、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸構築物システムが提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、本発明の一部の実施形態の核酸構築物または本発明の一部の実施形態の核酸構築物システムで形質転換されたトキソプラズマが提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、対象の中枢神経系に目的タンパク質を投与する方法であって、対象に、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマまたは本発明の一部の実施形態の医薬組成物を投与して、対象の中枢神経系に目的タンパク質を投与することを含む方法が提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、処置を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマまたは本発明の一部の実施形態の医薬組成物を投与することを含み、対象が、中枢神経系への薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断されており、投与により処置を必要とする対象を処置する、方法が提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、処置を必要とする対象を処置する方法であって、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を有するトキソプラズマを対象に投与することを含み、異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結されており、対象が、中枢神経系への薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断されており、投与により処置を必要とする対象を処置する方法が提供される。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、潜伏期特異的プロモーター、およびトキソプラズマ内因性プロモーターからなる群より選択され、但し、プロモーターはトキソフィリンプロモーターではない。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性プロモーターは、ロプトリータンパク質ではない。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、弱毒化されていない。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマのロプトリーから分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、ロプトリーから分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソフィリンおよび／またはＲＯＰ１を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、ロプトリーから分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、配列番号３４４～４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、非ロプトリータンパク質である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、ミクロネームタンパク質および高密度顆粒タンパク質からなる群より選択される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマの高密度顆粒から分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、高密度顆粒から分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、ＧＲＡ１６および／またはＧＲＡ２４を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマのミクロネームから分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、ミクロネームから分泌されるタンパク質は、配列番号２８０～３２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、高密度顆粒から分泌されるタンパク質は、配列番号２３４～２７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマ・ゴンディのマクロファージ遊走阻止因子（ＴｇＭＩＦ）を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、トキソプラズマ分泌タンパク質オープンリーディングフレームの上流および／または下流にトキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、トキソプラズマ分泌タンパク質オープンリーディングフレームの上流に配置される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、トキソプラズマ分泌タンパク質オープンリーディングフレームの下流に配置される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の核酸配列は、ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ、ＧＲＡ１６ ３’－ＵＴＲ、ＧＲＡ２４ ３’－ＵＴＲ、ＳＡＧ１ ３’－ＵＴＲ、またはＤＨＦＲ ３’－ＵＴＲである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）の核酸配列は、ＧＲＡ２ ５’－ＵＴＲ、ＧＲＡ１６ ５’－ＵＴＲ、ＧＲＡ２４ ５’－ＵＴＲ、ＳＡＧ１ ５’－ＵＴＲ、またはＤＨＦＲ ５’－ＵＴＲである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＧＲＡ２プロモーター、ＧＲＡ１６プロモーター、ＧＲＡ２４プロモーター、ＳＡＧ１プロモーター、またはＤＨＦＲプロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）の核酸配列は、トキソフィリン３’－ＵＴＲである。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が、薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含むのと同じ核酸構築物中に含まれる。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物とは別個の核酸構築物中に含まれる。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、Ｃｒｅ－リコンビナーゼコード配列を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、ベータ（β）－ラクタマーゼ（ＢＬＡ）コード配列を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、トキソプラズマのゲノムへの組込みに好適である。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントは、薬物に応答して活性となる。
本発明の一部の実施形態によれば、薬物は、抗生物質を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は前記トキソプラズマ分泌タンパク質からの前記薬学的ポリペプチドの脱離を可能にする、少なくとも１個のインフレーム切断部位をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、宿主細胞中でのトキソプラズマの増殖を容易にするエレメントを含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、対象のＣＮＳへの目的タンパク質の送達にとって必要ではないビルレンス遺伝子を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＤＨＦＲ－ＴＳ、ＢＬＥ、ＨＸＧＰＲＴ、ＵＰＲＴ、ＴＫ、ＣＤ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）またはエピトープタグ（例えば、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｔｙ－１、ＦＬＡＧなど）を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、患者中枢神経系における内因性タンパク質の不足によって特徴付けられ病状を有すると診断された対象を処置するためのものである。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、患者中枢神経系への薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断された対象を処置するためのものである。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、免疫抑制剤をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与前および／またはトキソプラズマの投与後および／またはトキソプラズマの投与と同時に、対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与前に対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与後に対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与と同時に対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドが、病状を処置することができる内因性タンパク質に対応する野生型アミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる抗体を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる抗原を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる毒素を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、酵素、構造ポリペプチド、運動ポリペプチド、調節ポリペプチド、貯蔵ポリペプチド、シグナリング／リガンドポリペプチド、受容体ポリペプチド、感覚ポリペプチド、抗体、タンパク質チャネルおよび／または輸送ポリペプチドを含む。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、末梢投与によって実施される。
本発明の一部の実施形態によれば、末梢投与は、静脈内投与を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、末梢投与は、経口投与を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、中枢神経系への直接投与によって実施される。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性の欠陥タンパク質は、内因性タンパク質の野生型アミノ酸配列と比較した場合、内因性タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換を有するものを含む。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性の欠陥タンパク質は、病状を示さない健常な対象における内因性タンパク質のレベルと比較して、内因性タンパク質レベルが低下しているものを含む。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性の欠陥タンパク質は、病状を有すると診断された対象において存在しない内因性タンパク質を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）のアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４またはアイソフォーム５である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）アイソフォーム１またはＭＥＣＰ２アイソフォーム２である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４またはアイソフォーム５である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、生存運動ニューロンタンパク質のアイソフォームＳＭＮ、アイソフォームＳＭＮ－デルタ５、アイソフォームＳＭＮ－デルタ７、またはアイソフォームＳＭＮ－デルタ５７である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、パーキン（ＰＡＲＫ２）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、パーキン（ＰＡＲＫ２）のアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４、アイソフォーム５、アイソフォーム６、アイソフォーム７、またはアイソフォーム８である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）のアイソフォーム１またはアイソフォーム２である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＴＦ（ＴＡＬＥ転写因子）である。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、クラッベ病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、レット症候群と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、カナバン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、脊髄性筋萎縮症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、パーキンソン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、低酸素／虚血性または神経炎症性ＣＮＳ障害と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、アルツハイマー病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、筋萎縮性側索硬化症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、ハンチントン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、リソソーム蓄積症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、ＭＥＣＰ２重複症候群と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、自己破壊エレメントを誘導することができる薬物を対象に投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、宿主細胞内および／または体内でトキソプラズマを持続させるのに必要な分子を対象に投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、抗生物質である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、低分子である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、代謝産物である。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するか、または同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む、本特許明細書に従うものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明の一部の実施形態を、添付の図面を参照しながら、ほんの一例としてここで説明する。ここで、図面への詳細な特定の参照によって示される特徴は例示であり、本発明の実施形態の模式的考察のためのものであることを強調する。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態をどのように実施することができるかを当業者に明らかにするものである。
本発明の一部の実施形態の臨床概念の模式図である。（１）選択した薬学的ポリペプチドコード配列を、トキソプラズマ・ゴンディの分泌ポリペプチドのコード配列に融合し、（２）核酸構築物をトキソプラズマに導入し、（３）融合タンパク質を寄生虫の内部で発現させ、寄生虫の分泌性細胞小器官（ここでは、例としてロプトリーを示す）に局在化させ、（４）寄生虫は対象のＣＮＳに進入し、病巣に到達し、（５）対象の細胞中にタンパク質が分泌され、病理学的表現型を回復させる。 治療用トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株の作製に使用された、ｐＧＲＡ骨格に基づく構築物の概略的なマップである。核酸構築物は、治療用ポリペプチドコード配列と、トキソプラズマ・ゴンディのトキソフィリンのコード配列および「ＨＡ」タグとをインフレームで融合させた融合物からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦの上流は、トキソフィリン遺伝子の内因性５’ＵＴＲ（非翻訳領域）（プロモーターとして作用するトキソフィリン５’－ＵＴＲ）であり、ＯＲＦの下流は、豊富な高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ２の３’ＵＴＲ（ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ）である。この構築物はまた、ＤＨＦＲ－ＴＳの内因性５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に組み入れられたＨＸＧＰＲＴ遺伝子からなる選択マーカーカセットも含有する。また、選択可能な抗生物質耐性を含む細菌発現カセットも構築物中に含まれる。 治療用トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株の作製に使用される、ｐＧＲＡ骨格に基づく構築物の概略的なマップである。核酸構築物は、治療用ポリペプチドコード配列と、トキソプラズマ・ゴンディのＧＲＡ１６のコード配列およびＨＡタグとをインフレームで融合させた融合物からなるＯＲＦを含む。ＯＲＦの上流は、ＧＲＡ１６遺伝子の内因性５’ＵＴＲ（プロモーターとして作用するＧＲＡ１６ ５’－ＵＴＲ）であり、ＯＲＦの下流は、豊富な高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ２の３’ＵＴＲ（ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ）である。この構築物はまた、ＤＨＦＲ－ＴＳの内因性５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に組み入れられたＨＸＧＰＲＴ遺伝子からなる選択マーカーカセットも含有する。また、選択可能な抗生物質耐性を含む細菌発現カセットも構築物中に含まれる。 図４Ａ～Ｉは、哺乳動物細胞（ＨＦＦ）内の新規寄生虫株を示す図であり、寄生虫株は、トキソフィリン融合治療用タンパク質であるアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）およびガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴΔ４３（一般的な材料および実験方法のセクションでは「変異型ＧＡＬＣ－ＴＡＴ」とも称される）を発現し、寄生虫の分泌ロプトリー細胞小器官に対する特異的な局在化を示す。図４Ａ：ロプトリーを強調した、細胞内トキソプラズマ・ゴンディの模式的な構造である。赤色は内膜複合体（ＩＭＣ）、青色はＤＮＡ（宿主細胞核およびトキソプラズマ・ゴンディ核）、緑色はロプトリータンパク質である。図４Ｂ～Ｉ：ＨＡタグ付きトキソフィリン－ＡＳＰＡ（図４Ｂおよび４Ｃ）、ＨＡタグ付きトキソフィリン－ＳＭＮ１（図４Ｄおよび４Ｅ）、ＨＡタグ付きトキソフィリン－ＭＥＣＰ２（図４Ｆおよび４Ｇ）ならびにＨＡタグ付きトキソフィリン－ＧＡＬＣ－ＴＡＴ変異型（図４Ｈおよび４Ｉ）を内因性に発現する、ＨＦＦ細胞上で増殖した寄生虫の、抗ＨＡ抗体（全パネルで緑色）を用いた蛍光顕微鏡分析であって、抗ＩＭＣ１抗体（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）によって内膜複合体ＩＭＣ１を共染色したもの、または細胞の偏光画像（グレースケール）の上に重ね合わせたものである。寄生虫は、混合集団で示されるが、緑色の染色を示す寄生虫のみがトランスジェニックタンパク質を発現する。図４Ｂ～Ｉに示される全画像においてスケールバー＝５μＭである。 図５Ａ～Ｉは、哺乳動物細胞（ＨＦＦ）内の新規寄生虫株を示す図であり、寄生虫株は、トキソフィリン融合治療用タンパク質であるアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）およびメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）を発現し、寄生体胞（ＰＶ）空間および宿主細胞核への対する特異的な局在化を提示する。図５Ａ：分泌された高密度顆粒エフェクタータンパク質の分布を強調した、宿主細胞（線維芽細胞）内部の寄生体胞中の細胞内トキソプラズマ・ゴンディ寄生虫の模式図である。赤色は内膜複合体（ＩＭＣ）、青色はＤＮＡ（宿主細胞核およびトキソプラズマ・ゴンディ核）、黄色は高密度顆粒分泌エフェクタータンパク質、橙色は寄生体胞。図５Ｂ～Ｉ：ＨＡタグ付きＧＲＡ１６－ＡＳＰＡ（図５Ｂおよび５Ｃ）、ＨＡタグ付きＧＲＡ１６－ＳＭＮ１（図５Ｄおよび５Ｅ）、ＨＡタグ付きＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２（図５Ｂ～Ｇは拡大率１００倍、図５Ｈ～Ｉは拡大率４０倍）を内因性に発現する、ＨＦＦ細胞上で増殖した寄生虫の、抗ＨＡ抗体（全パネルで緑色）を用いた蛍光顕微鏡分析であって、抗ＩＭＣ１抗体（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）によって内膜複合体ＩＭＣ１を共染色したもの、または細胞の偏光画像（グレースケール）の上に重ね合わせたものである。寄生虫は混合集団で示されるが、緑色の染色を示す寄生虫のみがトランスジェニックタンパク質を発現する。スケールバー＝５μＭ（図５Ｂ～Ｇ）。スケールバー＝２０μＭ（図５Ｈ～Ｉ）。 ＴＡＬＥヌクレアーゼ（図６Ａ）およびＴＡＬＥ転写因子（図６Ｂ）の模式図であって、例として、「ＴＡＣＧＴＡＣＧ」（配列番号４５０５）標的配列に対して設計したものを示す。ＴＡＬＥリピートは、標的配列中のヌクレオチドの順序に従って提示される。ＴＡＬＥの性質故に、最初のヌクレオチドは常にＴでなければならず（したがって、それはＴＡＬのＮ末端に組み込まれるため、アノテーションは省く）、最後のヌクレオチド（この場合、Ｇ）は半モノマー内に表示される（したがって、そのアノテーションは「ハーフリピート」である）ことに留意されたい。本発明の一部の実施形態のトキソプラズマによって発現され、分泌されるためには、これらの構築物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、本発明の一部の実施形態の核酸構築物に挿入する。ＴＡＬＥ＿Ｎｕｃ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）について、ＯＲＦは、ＮＬＳからＦｏｋＩの後ろまでである（例えば、配列番号４５０６に示したポリヌクレオチドの２１１３番～４１０４番ヌクレオチド）。ＴＡＬＥ－ＴＦ（ＴＡＬＥ転写因子）について、ＯＲＦは、ＴＡＬＥ Ｎ末端（Ｎ末）からＥＧＦＰの後ろまでである（例えば、配列番号４５０７に示したポリヌクレオチドの２１２０番～５００５番ヌクレオチド）。「ＴＡＬＥ－ＴＦ」＝ＴＡＬＥ転写因子；「ＴＡＬＥＮ」＝ＴＡＬＥヌクレアーゼ。「ＮＩ」、「ＮＧ」、「ＮＮ」および「ＨＤ」＝後述する実施例５に記載のモノマー。 ＴＡＬＥヌクレアーゼ（図６Ａ）およびＴＡＬＥ転写因子（図６Ｂ）の模式図であって、例として、「ＴＡＣＧＴＡＣＧ」（配列番号４５０５）標的配列に対して設計したものを示す。ＴＡＬＥリピートは、標的配列中のヌクレオチドの順序に従って提示される。ＴＡＬＥの性質故に、最初のヌクレオチドは常にＴでなければならず（したがって、それはＴＡＬのＮ末端に組み込まれるため、アノテーションは省く）、最後のヌクレオチド（この場合、Ｇ）は半モノマー内に表示される（したがって、そのアノテーションは「ハーフリピート」である）ことに留意されたい。本発明の一部の実施形態のトキソプラズマによって発現され、分泌されるためには、これらの構築物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、本発明の一部の実施形態の核酸構築物に挿入する。ＴＡＬＥ＿Ｎｕｃ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）について、ＯＲＦは、ＮＬＳからＦｏｋＩの後ろまでである（例えば、配列番号４５０６に示したポリヌクレオチドの２１１３番～４１０４番ヌクレオチド）。ＴＡＬＥ－ＴＦ（ＴＡＬＥ転写因子）について、ＯＲＦは、ＴＡＬＥ Ｎ末端（Ｎ末）からＥＧＦＰの後ろまでである（例えば、配列番号４５０７に示したポリヌクレオチドの２１２０番～５００５番ヌクレオチド）。「ＴＡＬＥ－ＴＦ」＝ＴＡＬＥ転写因子；「ＴＡＬＥＮ」＝ＴＡＬＥヌクレアーゼ。「ＮＩ」、「ＮＧ」、「ＮＮ」および「ＨＤ」＝後述する実施例５に記載のモノマー。 治療用トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株の作製に使用された構築物の概略的なマップである。核酸構築物は、治療用ポリペプチドコード配列と、トキソプラズマ・ゴンディのトキソフィリンのコード配列および「ＨＡ」タグとをインフレームで融合させた融合物からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦの上流は、トキソフィリン遺伝子の内因性５’ＵＴＲ（非翻訳領域）（「トキソフィリン５’－ＵＴＲ」）であり、ＯＲＦの下流は、豊富な高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ２の３’ＵＴＲ（「ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ」）である。この構築物はまた、ＤＨＦＲ－ＴＳの内因性５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に組み入れられた、ＨＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ－ＴＳ遺伝子またはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子からなる選択マーカーカセットも含有する。また、分子クローニングのために使用される、選択可能な抗生物質耐性を含む細菌発現カセットも、構築物中に含まれる。 治療用トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株の作製のために使用された構築物の概略的なマップである。核酸構築物は、治療用ポリペプチドコード配列と、トキソプラズマ・ゴンディのＧＲＡ１６のコード配列およびＨＡタグとをインフレームで融合させた融合物からなるＯＲＦを含む。ＯＲＦの上流は、ＧＲＡ１６遺伝子の内因性５’ＵＴＲ（「ＧＲＡ１６ ５’－ＵＴＲ」）であり、ＯＲＦの下流は、豊富な高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ２の３’ＵＴＲ（「ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ」）である。この構築物はまた、ＤＨＦＲ－ＴＳの内因性５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に組み入れられた、ＨＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ－ＴＳ遺伝子またはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子からなる選択マーカーカセットも含有する。また、分子クローニングのために使用される、選択可能な抗生物質耐性を含む細菌発現カセットも、構築物中に含まれる。 図９Ａ～Ｎは、哺乳動物細胞（ＨＦＦ）内のトランスジェニック寄生虫株を示す図であり、寄生虫株は、１２種の新規トキソフィリン融合治療用タンパク質を発現する。図９Ａ：ロプトリーを強調した、細胞内トキソプラズマ・ゴンディの模式的な構造である。マゼンタ色は内膜複合体（ＩＭＣ）、シアン色はＤＮＡ（宿主細胞核およびトキソプラズマ・ゴンディ核）、黄色はロプトリータンパク質。図９Ｂ：ロプトリーマーカーＲＯＰ２／４（黄色）で免疫染色された、ＨＦＦ細胞中で増殖させたトキソプラズマ・ゴンディの代表的な蛍光顕微鏡画像である。左はＤＡＰＩ（シアン色）で共染色されたもの、右は偏光画像上に重ね合わせたもの（グレースケール）。図９Ｃ～Ｎ：ＨＡタグ付きトキソフィリン融合治療用タンパク質を発現するトランスジェニック寄生虫の画像であり、図９Ｃ－アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、図９Ｄ：コドン最適化されたアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡｏｐｔ）、図９Ｅ－ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）、図９Ｆ：コドン最適化されたガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣｏｐｔ）、図９Ｇ：ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（ＧＡＬＣ－ＴＡＴ）、図９Ｈ：ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴΔ４３（ＧＡＬＣ－ＴＡＴΔ４３－「一般的な材料および実験方法」のセクションでは「変異型ＧＡＬＣ－ＴＡＴ」とも称されるもの）、図９Ｉ：グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、図９Ｊ：メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、図９Ｋ：コドン最適化されたメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２ｏｐｔ）、図９Ｌ：パーキン（ＰＡＲＫ２）、図９Ｍ－生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）、および図９Ｎ：コドン最適化された転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢｏｐｔ）。トキソフィリン－ＡＳＰＡｏｐｔ、トキソフィリン－ＧＡＬＣ－ＴＡＴΔ４３、トキソフィリン－ＧＤＮＦ、トキソフィリン－ＭｅＣＰ２ｏｐｔ、トキソフィリン－ＰＡＲＫ２、トキソフィリン－ＳＭＮ１およびトキソフィリン－ＴＦＥＢを発現する寄生虫の例示的画像は、これらの寄生虫の分泌ロプトリー細胞小器官への局在化を示す。トキソフィリン融合タンパク質は、抗ＨＡ抗体（黄色）を使用して免疫染色された。左：ＤＡＰＩ（シアン色）および寄生虫マーカー抗ＩＭＣ－１（マゼンタ色）で共染色されたもの、右：偏光画像上に重ね合わせたもの（グレースケール）。寄生虫は混合集団で示されるが、黄色の染色を示す寄生虫のみがトランスジェニックタンパク質を発現する。スケールバー＝５μＭ。 図１０Ａ～Ｊは、哺乳動物細胞（ＨＦＦ）内のトランスジェニック寄生虫株を示す図であり、寄生虫株は、８種の新規トキソフィリン融合治療用タンパク質を発現する。図１０Ａ：分泌される高密度顆粒エフェクタータンパク質の分布を強調した、宿主細胞内の寄生体胞中の細胞内トキソプラズマ・ゴンディ寄生虫の模式的な構造である。マゼンタ色は内膜複合体（ＩＭＣ）、シアン色はＤＮＡ（宿主細胞核およびトキソプラズマ・ゴンディ核）、黄色は高密度顆粒分泌エフェクタータンパク質、橙色は寄生体胞。図１０Ｂ：ＨＡタグ付きＧＲＡ１６タンパク質を発現し、抗ＨＡ抗体（黄色）で免疫染色された、ＨＦＦ細胞中で増殖したトキソプラズマ・ゴンディの代表的な蛍光顕微鏡画像である。左はＤＡＰＩ（シアン色）と共染色されたもの、右は偏光画像上に重ね合わせたもの（グレースケール）。図１０Ｃ～Ｊ：ＨＡタグ付きＧＲＡ１６融合治療用タンパク質を発現するトランスジェニック寄生虫の例示的画像であり、図１０Ｃ：アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、図１０Ｄ：生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）、図１０Ｅ：ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）、図１０Ｆ：ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（ＧＡＬＣ－ＴＡＴ）、図１０Ｇ：コドン最適化されたアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡｏｐｔ）、図１０Ｈ：コドン最適化されたガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣｏｐｔ）、図１０Ｉ：コドン最適化されたメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２ｏｐｔ）、および図１０Ｊ：コドン最適化された転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢｏｐｔ）。ＧＲＡ１６－ＡＳＰＡ、ＧＲＡ１６－ＳＭＮ１、ＧＲＡ１６－ＡＳＰＡｏｐｔ、ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔおよびＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔは、寄生体胞への局在化を示す。ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔおよびＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔは、宿主細胞核への局在化も示す。ＧＲＡ１６融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（黄色）を使用して免疫染色した。左はＤＡＰＩ（シアン色）および寄生虫マーカー抗ＩＭＣ－１（マゼンタ色）と共染色されたもの、右は偏光画像上に重ね合わせたもの（グレースケール）。寄生虫は混合集団で示されるが、黄色の染色を示す寄生虫のみがトランスジェニックタンパク質を発現する。スケールバー＝５μＭ。 時間および感染多重度（ＭＯＩ）にわたる、ＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ株、ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ株およびＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔ株のタキゾイトによるＨＦＦ細胞の核へのタンパク質送達の動力学を、時間に対する感染多重度（ＭＯＩ）で示した図である。感染細胞および核送達を、ＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（米国、イリノイ州、シカゴ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した自動化画像分析によって計数した。グラフは、３つの株を一緒にまとめた結果を表す。 図１２Ａ～Ｃは、トキソプラズマ・ゴンディ株ＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ（図１２Ａ）、ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ（図１２Ｂ）およびＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔ（図１２Ｃ）のタキゾイトによる感染の１６～２２時間後の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＬＵＨＭＥＳヒト神経細胞の代表的な画像である。ＧＲＡ１６融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（黄色）を使用して免疫染色し、ＤＡＰＩ（シアン色）および成熟ニューロンのためのマーカーである抗ＮｅｕＮ（マゼンタ色）で共染色した。各図の左側の差込図は、抗ＨＡのみ（上、黄色）、抗ＨＡとＤＡＰＩ（中央、黄色およびシアン色）および抗ＨＡとＮｅｕＮ（下、黄色およびマゼンタ色）で可視化された感染細胞を示す。全ての株が、融合タンパク質の明確な分泌およびヒトニューロンの核へのターゲティングを示す。 図１３Ａ～Ｄは、トランスジェニック株ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔのタキゾイトによる感染の１２時間後のＰ１仔マウスの大脳皮質および海馬に由来するニューロン富化一次培養物の、代表的な免疫組織化学染色画像である。ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（黄色）を使用して免疫染色する。図１３Ａ：ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２のみ（黄色）。図１３Ｂ：ＤＡＰＩのみ（シアン色）。図１３Ｃ：ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２とＤＡＰＩ染色の併合。図１３Ｄ：偏光画像（グレースケール）上に重ね合わせた、ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２（黄色）、ＤＡＰＩ（シアン色）およびＮｅｕＮ（マゼンタ色）の併合。送達されたＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２ｏｐｔは、ニューロンの核において濃縮されたヘテロクロマチンＤＮＡの領域に対する共局在化の特徴的なパターンを示し、送達されたＭｅＣＰ２のヘテロクロマチンへの有効な結合を示唆している。 ＭＯＩ＝１のＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株を感染させた、Ｒ３０６Ｃ ＭｅＣＰ２変異体ヒトＬＵＨＭＥＳニューロンの核抽出物のウェスタンブロットの図であり、ＭｅＣＰ２特異的抗体で免疫沈降およびブロティングを行ったものである。ブロットは、内因性変異型ＭｅＣＰ２およびトキソプラズマ・ゴンディに送達されたＭｅＣＰ２に対応する２つのバンドを示す。トキソプラズマ・ゴンディによって送達されたＭｅＣＰ２は、ＧＲＡ１６との融合により、高い分子量を有する。 ＨＦＦ細胞内のトランスジェニックなトキソプラズマ・ゴンディ株Ｐｒｕ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔの、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したブラディゾイトの例示的画像である。ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（赤色）を使用して免疫染色した。図１５Ａ：ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２のみ。図１５Ｂ：ブラディゾイト嚢胞壁マーカーであるＤｏｌｉｃｈｏｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で共染色されたものであり、寄生虫嚢胞は緑色で、宿主線維芽細胞（ＨＦＦ）の核は青色で示され、嚢胞を含有する宿主線維芽細胞の核内のＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２融合タンパク質はＨＡ染色された（赤色）。図１５Ｃ：ＤＢＡで共染色され、偏光画像（グレースケール）上に重ね合わせたもの。提示された嚢胞は、ブラディゾイト期での、ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２の連続的発現、宿主細胞の核への融合タンパク質の分泌およびターゲティングを示す。白色の矢頭は、送達されたタンパク質ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２を含有するブラディゾイト嚢胞を含有する細胞の核を示す。
本発明のその一部の実施形態は、薬学的ポリペプチドと融合したトキソプラズマ分泌タンパク質の分泌のための核酸構築物、およびそれを有するトキソプラズマに関し、より具体的には、対象を処置するための医薬組成物およびそれを使用する方法に関するが、これらに限定されるものではない。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その利用において、以下の説明で示される詳細または実施例による例示に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態も可能であり、また、様々な方法で実施もしくは実行することができる。
本発明者らは、異種ポリペプチドをコードする遺伝子構築物で形質転換されたトキソプラズマ寄生虫が、異種ポリペプチドを合成し、それを哺乳動物細胞に送達することを見出した（図４Ｂ～Ｉ、５Ｂ～Ｉ、９Ｂ～Ｎ、１０Ｂ～Ｊ、１１Ａ～Ｃ、１２Ａ～Ｃ、１３Ａ～Ｄ、１４および１５Ａ～Ｃ、ならびに後述する実施例）。哺乳動物細胞内では、異種ポリペプチドは細胞内のその活性領域まで移動し、そこで、内因性薬学的タンパク質の既知の機能と関連する細胞プロセスを増大させることができる。例えば、本発明者らは、トキソプラズマ分泌タンパク質ＧＲＡ１６と翻訳可能に融合した哺乳動物タンパク質ＭｅＣＰ２およびＴＦＥＢを発現し、マウスおよびヒト細胞に送達するＩ型およびＩＩ型のトキソプラズマ株を作製した。当該トキソプラズマ株は、ｅｘ ｖｉｖｏでトキソプラズマによる処置を受けた哺乳動物細胞内の所望の細胞内の局所（核）で、融合した治療用タンパク質を分泌し（図１３Ａ～Ｄ）、かくして、構築物、トキソプラズマおよび方法による、対象への治療用タンパク質の特異的送達および対象の実行可能性を立証した。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、潜伏期特異的プロモーター、およびトキソプラズマ内因性プロモーターからなる群より選択され、但し、前記プロモーターがトキソフィリンプロモーターではない、核酸構築物が提供される。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、トキソプラズマにおける発現に好適である。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、Ｃｒｅ－リコンビナーゼのコード配列を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、ベータ（β）－ラクタマーゼ（ＢＬＡ）のコード配列を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、トキソプラズマのゲノムへの組込みに好適である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、宿主細胞中でのトキソプラズマの増殖を容易にするエレメント（例えば、宿主の免疫系を回避するのに重要なエレメント、ある特定の代謝産物の生成または利用に必須のエレメント、ある特定の毒素または抗生物質に対抗するのに重要なエレメント）を含まないが、内因性の機能的ＣＰＳＩＩを含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、対象のＣＮＳへの目的タンパク質の送達に必要ではないビルレンス遺伝子を含まない。
核酸構築物は、トキソプラズマ細胞中でのポリヌクレオチド配列の構成的、一過的、調節的または誘導的な様式の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
記載のように、異種ポリヌクレオチドは、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結されている。
コード核酸配列は、調節配列がそれに連結されたコード配列に対して調節効果を発揮することができる場合、調節配列（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結」される。
本明細書で使用される用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の上流にある、ＲＮＡポリメラーゼが結合してＲＮＡの転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、遺伝子の発現のタイミングおよび強度、例えば、寄生虫および／または宿主細胞の生存期間のどの段階または状態で遺伝子を発現させるか、を制御する。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、核酸構築物の発現に使用されるトキソプラズマに対して異種である。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、構成的プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、誘導的プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、潜伏期特異的プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、トキソプラズマ内因性プロモーターであり、但し、プロモーターはトキソフィリンプロモーターではない。
本発明の一部の実施形態によれば、プロモーターは、トキソフィリン内因性プロモーターではない。トキソフィリンの予測プロモーター（ＧｅｎｅＩＤ＝ＴＧＭＥ４９＿２１４０８０の予測プロモーター；配列番号３６８９）は、実施例の一部の実験で使用したトキソフィリンプロモーター（配列番号４４８２）および上流の追加のヌクレオチドを含有することに留意されたい。
一部の実施形態によれば、プロモーターは、配列番号３６８９および／または配列番号４４８２に示した核酸配列を含まない。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性プロモーターは、ロプトリータンパク質のものではない。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＧＲＡ２プロモーター、ＧＲＡ１６プロモーター、ＧＲＡ２４プロモーター、ＳＡＧ１プロモーター、またはＤＨＦＲプロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＧＲＡ２プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＧＲＡ１６プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＧＲＡ２４プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＳＡＧ１プロモーターである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ内因性プロモーターは、ＤＨＦＲプロモーターである。
以下の表１に、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの発現を駆動するために本発明の一部の実施形態の核酸構築物中にクローニングすることが可能な、好適な内因性プロモーターを列挙する。
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表２に、本発明の一部の実施形態の核酸構築物中へクローニングすることが可能な、好適な構成的プロモーターおよび誘導的プロモーターを列挙する。
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記載のように、異種ポリヌクレオチドは、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む。
本明細書で使用される語句「トキソプラズマ分泌タンパク質」とは、トキソプラズマが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染した宿主細胞において分泌するのに十分な、トキソプラズマポリペプチドの少なくとも機能的な断片（アミノ酸配列）を指す。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質またはその機能的断片は、トキソプラズマがｉｎ ｖｉｖｏで感染した場合に、宿主細胞で分泌され得るものである。
本発明の一部の実施形態によれば、第１の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質の機能的断片をコードする。
本発明の一部の実施形態によれば、第１の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質の全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマのロプトリーから分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、ロプトリーから分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソフィリンおよび／またはＲＯＰ１を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、ロプトリーから分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、配列番号３４４～４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、非ロプトリータンパク質である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、ミクロネームタンパク質および高密度顆粒タンパク質からなる群より選択される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマの高密度顆粒から分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、高密度顆粒から分泌されるトキソプラズマ分泌タンパク質は、ＧＲＡ１６、および／またはＧＲＡ２４を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマのミクロネームから分泌される。
本発明の一部の実施形態によれば、ミクロネームから分泌されるタンパク質は、配列番号２８０～３２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、高密度顆粒から分泌されるタンパク質は、配列番号２３４～２７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ分泌タンパク質は、トキソプラズマ・ゴンディのマクロファージ遊走阻止因子（ＴｇＭＩＦ）を含む。
下記の表３に、本発明の一部の実施形態の核酸構築物中にクローニング可能なトキソプラズマ分泌タンパク質を列挙した。当該タンパク質は、それが局在化されるか、または局在化されると予測される細胞小器官に従ってまとめられている。
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本発明の一部の実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、トキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）の核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）の核酸配列は、（例えば、薬学的ポリペプチドとインフレームで融合されたトキソプラズマ分泌タンパク質をコードする）異種ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの上流および／または下流にある。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）は、トキソプラズマ分泌タンパク質オープンリーディングフレームの上流に配置される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、薬学的ポリペプチドとインフレームで融合されたトキソプラズマ分泌タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に配置される。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の核酸配列は、ＧＲＡ２ ３’－ＵＴＲ、ＧＲＡ１６ ３’－ＵＴＲ、ＧＲＡ２４ ３’－ＵＴＲ、ＳＡＧ１ ３’－ＵＴＲ、またはＤＨＦＲ ３’－ＵＴＲである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）の核酸配列は、ＧＲＡ２ ５’－ＵＴＲ、ＧＲＡ１６ ５’－ＵＴＲ、ＧＲＡ２４ ５’－ＵＴＲ、ＳＡＧ１ ５’－ＵＴＲ、またはＤＨＦＲ ５’－ＵＴＲである。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）の核酸配列は、トキソフィリン３’－ＵＴＲである。
記載のように、異種ポリヌクレオチドは、トキソプラズマ分泌タンパク質の下流にインフレームで融合された、薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む。
本明細書で使用される語句「薬学的ポリペプチド」とは、処置を必要とする対象の細胞内に導入された場合に、（例えば、病状を処置可能な）処置効果を有するポリペプチドを指す。
ある特定の疾患について、薬学的ポリペプチドは、対象内のある特定の臓器、組織、細胞、細胞コンパートメントに達したとき、または細胞局在化したときに有効となり得ることに留意すべきである。例えば、神経疾患を処置するために、医薬組成物は、神経系、例えば、ニューロン、グリア細胞または他の細胞に好ましくはターゲティングされる。これに加えて、またはこの代わりに、ある特定の疾患について、薬学的ポリペプチドは、医薬組成物の標的が細胞核内にある（位置する）場合、細胞核などのある特定の場所に細胞局在化すべきである。例えば、ＭＥＣＰ２の場合、活性タンパク質は、核内のＤＮＡに結合し、遺伝子発現を調節する。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、トキソプラズマ分泌タンパク質からの薬学的ポリペプチドの脱離を可能にする、少なくとも１つのインフレーム切断部位をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる内因性タンパク質に対応する野生型アミノ酸配列を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる抗体を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる抗原を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、病状を処置することができる毒素を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、酵素、構造ポリペプチド、運動ポリペプチド、調節ポリペプチド、貯蔵ポリペプチド、シグナリング／リガンドポリペプチド、受容体ポリペプチド、感覚ポリペプチド、抗体、タンパク質チャネルおよび／または輸送ポリペプチドを含む。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）アイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４またはアイソフォーム５である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）のアイソフォーム１またはＭＥＣＰ２アイソフォーム２である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４またはアイソフォーム５である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、生存運動ニューロンタンパク質のアイソフォームＳＭＮ、アイソフォームＳＭＮ－デルタ５、アイソフォームＳＭＮ－デルタ７、またはアイソフォームＳＭＮ－デルタ５７である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、パーキン（ＰＡＲＫ２）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、パーキン（ＰＡＲＫ２）のアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３、アイソフォーム４、アイソフォーム５、アイソフォーム６、アイソフォーム７、またはアイソフォーム８である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）のアイソフォーム１またはアイソフォーム２である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）である。
本発明の一部の実施形態によれば、薬学的ポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＴＦ（ＴＡＬＥ転写因子）である。
下記の表４に、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマにより対象に分泌され得る例示的な治療用タンパク質を列挙する。
Figure 0007497397000194
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本明細書に記載の配列（例えば、トキソプラズマ分泌タンパク質および／または治療用ポリペプチド）は、いずれも、標的細胞（例えば、トキソプラズマ）内での発現のためにコドン最適化することができることに留意すべきである。そのような配列改変の例としては、目的の標的細胞種で典型的に見出される配列に近づくようにＧ／Ｃ含量を変化させることや、コドン最適化と一般的に称される、標的細胞種に非定型的に見出されるコドンの除去が挙げられるが、これに限定されるものではない。
語句「コドン最適化」とは、目的の標的細胞内でのコドンの使用に近づけるための、構造遺伝子またはその断片内での使用に適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を指す。したがって、最適化された遺伝子または核酸配列は、本来のまたは天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、標的細胞内で統計的に好ましいコドン、または統計的に好まれるコドンを利用するように改変された遺伝子を指す。ヌクレオチド配列は、典型的には、ＤＮＡレベルで試験され、標的細胞種における発現のために最適化されたコード領域は、任意の好適な手順を使用して決定される。この方法では、コドンの使用の偏りの尺度となるコドン使用の標準偏差を次のように算出することができる。最初に、本来の遺伝子の各コドンの使用の比例偏差平方を、高度に発現される標的細胞遺伝子における各コドンの使用に対して求め、次に、偏差平方平均を算出する。使用する式は、次の式である： １ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［（Ｘｎ－Ｙｎ）／Ｙｎ］２／Ｎ（式中、Ｘｎは、高度に発現される標的細胞遺伝子におけるコドンｎの使用頻度を表し、Ｙｎは、目的の遺伝子におけるコドンｎの使用頻度を表し、Ｎは、目的の遺伝子におけるコドンの総数を表す）。
特定の標的細胞型のための好ましいコドン使用に基づき、核酸配列を最適化する１つの方法は、任意の追加の統計計算を実施することなく、コドン最適化表を直接使用する方法である。コドン最適化表は、例えば、２０００年の国際ＤＮＡ配列データベースから作出されたコドン使用表を基に、コドン使用データベースでオンラインで提供されるものである（Y Nakamura, T Gojobori, T Ikemura - Nucleic acids research, 2000 - Oxford Univ Press）。コドン使用データベースは、様々な異なる種に関するコドン使用表を含み、各コドン使用表は、Ｇｅｎｂａｎｋの提供するデータに基づいて統計的に決定されたものである。
上述した表を使用して、特定の種（例えば、トキソプラズマ・ゴンディ）において最も好ましい、または最も好まれるコドンを各アミノ酸について決定することにより、目的タンパク質をコードする天然に存在するヌクレオチド配列を、その特定の標的細胞種のためにコドン最適化することができる。これは、特定の種のゲノム内での発生率が統計的に低いと考えられるコドンを、統計的により好まれる、アミノ酸に関して対応するコドンで置き換えることによって行われる。しかしながら、１つまたは複数のあまり好まれないコドンを選択して、存在する制限部位を欠失させたり、潜在的に有用な接続部（シグナルペプチドまたは停止カセットを加えるための５’および３’末端や、正確な全長配列を作製するためにセグメントの切断およびスプライシングに使用することができる内部部位）に新しい制限部位を作出したり、またはｍＲＮＡの安定性もしくは発現に負に影響し得るヌクレオチド配列を除去することができる。
天然に存在するコードヌクレオチド配列は、任意の改変の前に、特定の標的細胞種において統計的に好まれるコドンに対応するいくつかのコドンを既に含有してもよい。したがって、本来のヌクレオチド配列のコドン最適化は、本来のヌクレオチド配列内のどのコドンが特定の標的細胞において統計的に好まれないかを決定し、そして特定の標的細胞用のコドン使用表に従って、決定したコドンを改変することによって、コドン最適化された誘導体を作製することを含んでもよい。改変されたヌクレオチド配列は、それがコードするタンパク質が対応する天然に存在する遺伝子または本来の遺伝子によってコードされるタンパク質よりも高いレベルで産生される限り、改変されたヌクレオチド配列は、標的細胞コドン使用のために、完全にまたは部分的に最適化することができる。これに加えて、またはこの代わりに、コドン最適化／使用配列は、対応する天然に存在するタンパク質または本来の遺伝子によってコードされるタンパク質よりも良好に折り畳まれ得る。これに加えて、またはこの代わりに、コドン最適化／使用配列は、対応する天然に存在するタンパク質または本来の遺伝子によってコードされるタンパク質よりも標的細胞小器官により良好にターゲティングされる。これに加えて、またはこの代わりに、コドン最適化／使用配列は、対応する天然に存在するタンパク質または本来の遺伝子によってコードされるタンパク質よりも、分解されにくい。
例えば、トキソプラズマにおけるコドン使用を示す下記表５を使用することができる。
Figure 0007497397000201
Figure 0007497397000202
本発明の一部の実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＤＨＦＲ－ＴＳ、ＢＬＥ、ＨＸＧＰＲＴ、ＵＰＲＴ、ＴＫ、ＣＤ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）またはエピトープタグ（例えば、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｔｙ－１、ＦＬＡＧなど）を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、選択マーカーは、ＨＸＧＰＲＴを含む。
ＨＸＧＰＲＴ活性を欠いたトキソプラズマタキゾイトは、６－チオキサンチン（６－ＴＸ）の存在下で選択することができるが、ＨＸＧＰＲＴ活性を発現する株は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）および／またはキサンチン中で選択することができる（Pfefferkorn and Borotz, 1994, Pfefferkorn E. R., Borotz S. (1994) Exp. Parasitol. 79, 374-382）。
本発明の一部の実施形態によれば、選択マーカーは、（クロラムフェニコールを使用する陽性選択のための）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、（ピリメタミンを使用する陽性選択のための）ＤＨＦＲ－ＴＳ、（フレオマイシンを使用する陽性選択のための）ＢＬＥ、（ミコフェノール酸＋キサンチンを使用する陽性選択、または６－チオキサンチンを使用する陰性選択のための）ＨＸＧＰＲＴ、（５’－フルオ－２’－デオキシウリジンを使用する陰性選択のための）ＵＰＲＴ、（ガンシクロビルを使用する陽性選択のための）ＴＫ、（５－フルオロシトシンを使用する陽性選択のための）ＣＤ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）またはエピトープタグ（例えば、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｔｙ－１、ＦＬＡＧなど）を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、核酸構築物は、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列をさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントは、治療用カセットと同じ読み枠に含まれる。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントは、別個の読み枠に含まれ、異なる調節エレメントによって調節される。例えば、治療用カセットは潜伏期プロモーターによって駆動し、自己破壊カセットは薬物誘導プロモーターによって駆動する。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントは、薬物に応答して活性となる。
本発明の一部の実施形態によれば、薬物は抗生物質を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含むのと同じ核酸構築物に含まれる。
本発明の一部の実施形態によれば、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列は、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含むのとは別個の核酸構築物に含まれる。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマ非翻訳領域（ＵＴＲ）核酸配列は、選択マーカーおよび／または自己破壊エレメントのオープンリーディングフレームの上流および／または下流にある。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、少なくとも２つの核酸構築物を含む核酸構築物システムであって、少なくとも２つの核酸構築物の第１の核酸構築物が、本発明の一部の実施形態の核酸構築物であり、少なくとも２つの核酸構築物の第２の核酸構築物が、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸構築物システムが提供される。
典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳終結配列ならびにポリアデニル化シグナルも含有してもよい。
以下は、本発明の一部の実施形態の核酸構築物を作製するための骨格として使用することができる、トキソプラズマ核酸構築物の非限定的な一覧である：ｐＧＲＡ、ｐＵＰＲＴ、ｐＲＯＰ１、ｐＴＵＢ１、ｐＴＵＢ８、ｐＬＩＣ、ｐＴＯＸＯ、ｐＭＩＣ２、ｐＨＸ、ｐＣＡＴ、ｐＤＨＦＲ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＴｅｔＯ７ＳＡＧ１、ｐＴｅｔＯ７ＳＡＧ４、ｐＳＡＧ１、ｐＳＡＧ４、ｐＨＴＵ、ｐＴＫＯ、ｐＬｏｘＰ－ＤＨＦＲ、ｐｍｉｎＣＡＴ／ＨＸＧＰＲＴ＋、ｐｍｉｎＣＡＴ／ＨＸＧＰＲＴ－、ｐＤＨＦＲ－ＴＳｃ３／Ｍ３、ｐＤＨＦＲ－ＴＳｃ３／Ｍ２Ｍ３、ｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴ、およびｐＵＣ１９。これらのベクターは、非営利プラスミド保管センターである「ａｄｄｇｅｎｅ」；ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；ＮＥＢ社；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社；およびＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨなどの様々な供給元から取得することができる。
下記の表６は、例示的ベクターおよびカタログ番号を提供するが、これらに限定されるものではない。
Figure 0007497397000203
本発明の一部の実施形態の態様によれば、本発明の一部の実施形態の核酸構築物または本発明の一部の実施形態の核酸構築物システムで形質転換されたトキソプラズマが提供される。
本明細書で使用される用語「トキソプラズマ」とは、細胞内寄生原生動物トキソプラズマ・ゴンディを指す。
本発明の一部の実施形態の構築物および方法と共に使用することができるトキソプラズマ・ゴンディ株としては、下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｉ型であるＧＴ１、ＲＨ、ＥＮＴ、ＶＥＬ、ＴｇＣａｔＣｏ１およびＣＡＳＴが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｉ）ＩＩ型であるＭＥ４９、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＰＤＳ、ＰＬＫ、ＰＴＧ、ＤＥＧ、ＰＩＨ、ＴｇＮｍＢｒ１およびＰＲＵが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｉｉ）ＩＩＩ型であるＶＥＧ、Ｃ５６、ＣＴＧ、ＣＥＰ、ＴｇＧｏａｔＵＳ４およびＳＴＲＬが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｖ）非定型であるＴｇＣＴＰｒＣ３、ＴｇＢｂＵＳ１、ＴｇＲａｂｂｉｔＢｒ１およびＴｇＰｉｇＵＳ１５が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマは、弱毒化されていない。
当業界では従来から知られているように、用語「弱毒化」とは、遺伝的に改変されていない本来の（野生型）トキソプラズマ・ゴンディと比べて、弱体化および／または威力の低下したトキソプラズマ・ゴンディ株を指す。通常、トキソプラズマ・ゴンディの弱毒化変異体は、免疫応答を刺激し、免疫を産生させることはできるが、疾患を引き起こすことはできない。弱毒化は、γ線照射またはピリミジン栄養要求株の作製などの従来の方法によって達成することができるが、これらに限定されるものではない。
弱毒化トキソプラズマの例としては、参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００４５４７７号明細書および米国特許第８，６７３，２８９号明細書に記載のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
トキソプラズマ・ゴンディの複製は、感染の急性期に体内に播種し、遠位組織に到達するための能力、感染細胞中で持続するための能力、および宿主中で慢性嚢胞を確立するための能力に必須であることに留意すべきである。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、弱毒化されたトキソプラズマの増殖速度と比較して、高い増殖速度を特徴とする。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、栄養要求株ではない。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、ピリミジンのｄｅ ｎｏｖｏ生合成に好適な、機能的な内因性経路を有する。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、ブラディゾイト期に分化することができる。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、ＲＮＡ合成および／またはＤＮＡ複製を行うことができる。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、ＲＮＡ合成を行うことができる。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、ＤＮＡ複製を行うことができる。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマは、例えば、配列番号４６１２～４６１７のいずれかに示されるような、内因性機能的カルバモイルリン酸シンテターゼＩＩ（ＣＰＳＩＩ）酵素（米国特許第８，６７３，２８９号明細書に記載）を有する。
本発明の一部の実施形態の構築物およびトキソプラズマを使用して、目的タンパク質を対象、例えば、対象の特定の組織または細胞型、に送達することができる。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、対象の目的の組織に目的タンパク質を投与する方法であって、対象に、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマまたは本発明の一部の実施形態の医薬組成物を投与して、対象の目的の組織に目的タンパク質を投与する方法が提供される。
目的の組織の例としては、中枢神経系、筋肉、眼の一部、血液、リンパ節、脾臓、白血球、消化器系、および固有層が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
トキソプラズマは血液脳関門を通過することができるため、目的タンパク質を、それを必要とする対象の中枢神経系に送達することが可能であることに留意すべきである。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、対象の中枢神経系に目的のタンパク質を投与する方法であって、対象に、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマまたは本発明の一部の実施形態の医薬組成物を投与して、対象の中枢神経系に目的のタンパク質を投与することを含む方法が提供される。
かくして、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマを使用して、対象を処置可能な目的タンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）を送達することによって、処置を必要とする対象を処置することができる。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、処置を必要とする対象を処置する方法であって、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマまたは本発明の一部の実施形態の医薬組成物を対象に投与することを含み、対象が、対象の中枢神経系における薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断されており、当該投与により処置を必要とする対象を処置する方法が提供される。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、処置を必要とする対象を処置する方法であって、トキソプラズマ分泌タンパク質をコードする第１の核酸配列が薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物を有するトキソプラズマを、前記対象に投与することを含み、異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結されており、対象が、中枢神経系への薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断されており、当該投与により処置を必要とする対象を処置する、方法が提供される。
用語「処置する」とは、病状（疾患、障害もしくは病態）の発生を阻害、防止、もしくは停止させること、および／または病状の軽減、寛解、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当業者であれば、様々な方法およびアッセイを使用して、病状の発生を評価することが可能であり、同様に、様々な方法およびアッセイを使用して、病状の軽減、寛解または退縮を評価することができることを理解するであろう。
本明細書で使用される用語「防止する」とは、疾患のリスクを有し得るが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において、疾患、障害または状態が起こらないようにすることを指す。
本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳動物、好ましくは、病状に罹患する任意の年齢にあるヒトを含む。この用語は、病状を発生するリスクを有する個体を含むことが好ましい。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、対象の中枢神経系における内因性タンパク質の欠損を特徴とする病状を有すると診断されている。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性タンパク質の欠損は、内因性タンパク質の野生型アミノ酸配列と比較した場合、内因性タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性タンパク質の欠損は、病状を含まない健常な対象における内因性タンパク質のレベルと比較した場合、内因性タンパク質のレベルの低減を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、内因性タンパク質の欠損は、病状を有すると診断された対象において内因性タンパク質が存在しないことである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、クラッベ病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、レット症候群と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、カナバン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、脊髄性筋萎縮症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、パーキンソン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、低酸素／虚血性または神経炎症性ＣＮＳ障害と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、アルツハイマー病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、筋萎縮性側索硬化症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、ハンチントン病と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、リソソーム蓄積症と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、ＭＥＣＰ２重複症候群と診断されたものである。
本発明の一部の実施形態によれば、対象は、免疫不全ではない。免疫不全である対象の例としては、ＡＩＤＳ患者、化学療法を受けている対象、細胞、組織および／または臓器移植などのために免疫抑制剤を受けている対象が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、自己破壊エレメントを誘導することができる薬物を対象に投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、宿主細胞内および／または体内でトキソプラズマを持続させるのに必要な分子を対象に投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、抗生物質である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、低分子である。
本発明の一部の実施形態によれば、トキソプラズマを持続させるのに必要な分子は、代謝産物である。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与前および／またはトキソプラズマの投与後および／またはトキソプラズマの投与と同時に、対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与前に、対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与後（またはそれに続いて）、対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、対象へのトキソプラズマの投与と同時に、対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、末梢投与によって実施する。
本発明の一部の実施形態によれば、末梢投与は、静脈内投与を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、末梢投与は、経口投与を含む。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、腹腔内注射によって実施する。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、筋肉内注射によって実施する。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、エアロゾルによって実施する。
本発明の一部の実施形態によれば、投与は、中枢神経系またはその隣接組織への直接的投与によって実施する。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって、例えば、トキソプラズマおよび／またはそれを含む医薬組成物を使用して処置することのできる疾患は、上記表７に列挙した疾患のいずれかである。
表７は、本発明の一部の実施形態の治療用ポリペプチドの投与によって処置することのできる、内因性タンパク質の発現または機能の欠損または異常と関連する疾患の非限定的な例示を列挙するものである。
Figure 0007497397000204
Figure 0007497397000205
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Figure 0007497397000207
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本発明の一部の実施形態によれば、疾患（病状）は、がんではない。
本発明の一部の実施形態の核酸構築物、核酸構築物システム、あるいは核酸構築物または核酸構築物システムで形質転換されたトキソプラズマは、そのままの状態で生物に投与するか、または好適な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物として投与することができる。
本発明の一部の実施形態の態様によれば、本発明の一部の実施形態のトキソプラズマと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、本明細書に記載の病状のいずれかと診断された対象を処置するためのものである。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、対象の中枢神経系における内因性タンパク質の欠損を特徴とする病状を有すると診断された対象を処置するためのものである。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、対象の中枢神経系への薬学的ポリペプチドの投与によって処置可能な病状を有すると診断された対象を処置するためのものである。
本発明の一部の実施形態によれば、医薬組成物は、免疫抑制剤をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分の１つまたは複数を、生理的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分と共に含む処方を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
本明細書における用語「活性成分」とは、生物学的効果を担うことができる、本発明の一部の実施形態の核酸構築物、核酸構築物システム、あるいは核酸構築物または核酸構築物システムで形質転換されたトキソプラズマを指す。
以後、互換的に使用することができる語句「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こすことなく、投与される化合物の生物活性および特性を無効化しない、担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句の中に含まれる。
本明細書における用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
薬物の処方化および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる“Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに見出すことができる。
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜（特に経鼻）、腸または非経口送達が挙げられ、非経口送達には、筋肉内、、皮下および髄内への注射や、くも膜下腔内、直接脳室内、心臓内（例えば、右心室腔内もしくは左心室腔内）、一般的な冠動脈内、静脈内、腹腔内、径鼻、または眼内への注射が挙げられる。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の手法としては、神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）、ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを活用する試みにおける薬剤の分子的操作（例えば、それ自体はＢＢＢを通過することができない薬剤と、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドとを含む、キメラ融合タンパク質の生成）、薬剤の脂質溶解性を増加させるように設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤の結合）、および高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一過的破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入またはアンギオテンシンペプチドなどの生物活性剤の使用の結果である）が挙げられる。
上記の代わりに、医薬組成物を、全身的にではなく、局所的に投与することも可能であり、局所投与は、例えば、患者の組織領域への直接的な注射により行うことができる。
用語「組織」とは、１種または複数の機能を実施するように設計された細胞からなる、生物の部分を指す。例としては、脳組織、網膜、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、血管組織、腎組織、肺組織、生殖腺組織、造血組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一部の実施形態の医薬組成物は、当業界で周知のプロセス、例えば、公知の混合、溶解、培養、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。例えば、トキソプラズマの製造を、細胞培養物中でのトキソプラズマを培養することによって行うことができる。
かくして、本発明の一部の実施形態に従う使用のための医薬組成物は、活性成分の薬学的に使用することができる製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１種または数種の生理的に許容される担体を使用する従来の様式で、処方することができる。適切な処方は、選択した投与経路に依存する。
注射のためには、医薬組成物の活性成分を、水性溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液を用いて製剤化することができる。経粘膜投与のためには、透過させようとする障壁にとって適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は、当業界で一般に公知である。
経口投与のためには、活性化合物と、当業界で周知の薬学的に許容される担体とを合わせることによって、容易に医薬組成物を処方することができる。そのような担体により、医薬組成物を、患者による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、食品、スラリー、懸濁液などに処方することができる。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製することが可能であり、所望により、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠コアは、好適なコーティングと共に提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液を使用することができ、濃縮された糖溶液は、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。種々の活性化合物の用量の様々な組合せの同定または特徴付けのために、錠剤または糖衣錠コーティングには、染料または色素を添加してもよい。
経口的に使用することができる医薬組成物としては、ゼラチンから作られる押し込み式カプセル、ならびにゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られる軟質密封カプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により安定剤との混合物として活性成分を含有してもよい。軟質カプセル中では、活性成分は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁されていてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての処方は、選択された投与経路にとって好適な用量であるべきである。
頬投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジ剤の形態であってもよい。
経鼻吸入による投与のために、好適な推進剤の使用によって、本発明の一部の実施形態による使用のための活性成分を、加圧パックまたはネブライザーによるエアロゾルスプレー剤の形態で好適に送達することができる。推進剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素である。加圧型のエアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを設けることによって、用量単位を決定することができる。ディスペンサーにおける使用のための（例えば、ゼラチン製の）カプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する処方にすることができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、非経口投与用、例えば、ボーラス注射用または連続輸注用に処方することができる。注射用の処方は、所望により添加した保存剤と共に、単位用量形態、例えば、アンプルまたは複数用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。
非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な油性または水性の基剤を用いた注射用懸濁液として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、高濃縮溶液の調製を可能にするための、好適な安定剤または活性成分の溶解度を増大させる薬剤を含有してもよい。
上記にの代わりに、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌済、パイロジェンフリーの水を基剤とする溶液）を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
本発明の一部の実施形態の医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に処方することもできる。
本発明の一部の実施形態の文脈において好適な医薬組成物には、活性成分を意図する目的を達成するのに有効な量で含有する組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは、障害（例えば、対象の中枢神経系に影響する障害）の症状を防止、軽減、または改善する、または処置される対象の生存期間を延長するのに有効な活性成分（例えば、本発明の一部の実施形態の核酸構築物、核酸構築物システム、あるいは核酸構築物または核酸構築物システムで形質転換されたトキソプラズマ）の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本発明の方法において使用される任意の製剤について、治療有効量または用量は、初めにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ、細胞培養アッセイ、および／または動物モデルから概算することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成することができるように、動物モデルにおいて用量を処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養物または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。こういったｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方化するのに使用することができる。用量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて変化してもよい。正確な処方、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して、個々の医師が選択することができる（例えば、Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1を参照されたい）。
活性成分の組織レベル（例えば、脳レベル）が、生物学的効果を誘導または抑制するのに十分量（最小有効濃度、ＭＥＣ）となるように、用量および投与間隔を個別に調整することができる。ＭＥＣはそれぞれの製剤について異なっていてもよいが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから概算することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存するであろう。検出アッセイを使用して、血漿、組織またはＣＳＦ（脳脊髄液）における濃度を決定することができる。
処置する病態の重症度および応答性に応じて、投与量は、単回または複数回の投与用であってもよく、処置の経過は、数日から数週間（例えば、慢性疾患の場合は一生涯）、あるいは治癒が認められるか、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
例えば、慢性疾患については、症状が管理される、安定する、および／または改善されるまで、用量を調整することができる。
投与される組成物の量は、勿論、処置される対象、苦痛の重症度、投与の様式、対象の免疫状態、処方する医師の判断などに依存するであろう。
本発明の一部の実施形態の組成物は、必要に応じて、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）により承認されたキット等のパックまたはディスペンサーデバイスに入れて提供してもよく、このようなパックまたはデバイスは、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有してもよい。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイルを含む、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態で容器に付随する通知が添付されていてもよく、この通知は、組成物の形態がヒトまたは動物への投与用として当該機関により承認されていることを反映するものである。このような通知は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局により承認されたラベルの形態であってもよいし、または承認された製品の差し込み物の形態であってもよい。また、本発明の製剤を含み、適合可能な医薬用担体中に処方化された組成物を調製し、適切な容器中に入れて、上記で詳述したように、表示した病態の処置用であることを標識してもよい。
本明細書で使用される用語「約」とは、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその同根語は、「含むが、限定されるものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ると定義する。しかし、追加の成分、工程および／または部分は、特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数を対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限でではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も特異的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
本明細書に数値範囲が示される場合、それは常に示される範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「の範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「処置する」とは、病態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延、若しくは逆転、状態の臨床的若しくは審美的症状の実質的な寛解、または病態の臨床的若しくは審美的症状の悪化の実質的な予防を含む。
特定の配列表に言及する場合、このような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、対立遺伝子変化、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するわずかな配列の変化を有するものをも含むものである。但し、当該変換の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、あるいは、１００ヌクレオチド中１未満、あるいは、２００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５，０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを理解されたい。
本発明の特徴であって、明確にするために個別の実施形態として記載したものは、組み合わせて１つの実施形態としても提供可能であることを理解されたい。逆に、簡潔にするために１つの実施形態として記載した本発明の様々な特徴を、個別に、または任意の適切な部分組合せで、または本発明で記載した他の実施形態との適切な組み合わせとして提供することもできる。様々な実施形態に関連して記載された特徴は、その特徴なしでは実施形態が動作不能でない限り、それらの実施形態の必須要件とは見なさない。
上述したように本明細書に記載され、下記特許請求の範囲によって請求される本発明のさまざまな実施形態および態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
次に、以下の実施例に参照するが、これらは上記説明と共に本発明の実施形態の一部を詳細に示すものであるが、本発明を限定するものではない。
本明細書において使用される命名法および本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組み換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、第４，８０１，５３１号明細書、第５，１９２，６５９号明細書、および第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第３，８３９，１５３号明細書、第３，８５０，７５２号明細書、第３，８５０，５７８号明細書、第３，８５３，９８７号明細書、第３，８６７，５１７号明細書、第３，８７９，２６２号明細書、第３，９０１，６５４号明細書、第３，９３５，０７４号明細書、第３，９８４，５３３号明細書、第３，９９６，３４５号明細書、第４，０３４，０７４号明細書、第４，０９８，８７６号明細書、第４，８７９，２１９号明細書、第５，０１１，７７１号明細書、および第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。上記文献の全てが、本参照により、本明細書に完全に記載したかのように参照により組み込まれる。Toxoplasma gondii: the model apicomplexan - Perspectives and methods. LM Weiss, K Kim, 2011。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に組み込まれる。
一般的な材料および実験方法
トキソプラズマ・ゴンディ培養物
２ｍＭのＬ－グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンまたはゲンタマイシン抗生物質混合物および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（「完全ＤＭＥＭ培地」と呼ばれるもの）で培養したヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上で寄生虫を増殖させた。培養物を毎日モニタリングし、溶解したプレートの上清の液滴または注射筒に遊離した細胞内寄生虫の液滴を、ＨＦＦを含む新鮮なプレートに移すことにより、寄生虫を継代した。
目的の薬学的ポリペプチドに融合したトキソプラズマ分泌タンパク質を含む異種ポリペプチドの発現のための、トキソプラズマ・ゴンディ発現ベクターの作製
特定の治療用タンパク質を発現するトキソプラズマ・ゴンディの安定なトランスジェニック株を作製するために、本発明者らは、第１に分子クローニングによってトキソプラズマ・ゴンディ発現構築物を作製した。この構築物は、トキソフィリンｃＤＮＡ［配列番号４４８１］またはＧＲＡ１６ ｃＤＮＡ［配列番号４４７２］、次にＨＡタグコード配列（配列番号４４７４）、次に目的の治療的哺乳動物ｃＤＮＡ、例えば、マウスＭｅＣＰ２アイソフォーム１［配列番号４４７６］、ヒトＡＳＰＡ［配列番号４４８３］、ヒトＳＭＮ１［配列番号４４７９］、ヒトＰＡＲＫ２［配列番号４４７８］、ヒトＧＤＮＦ［配列番号４４８９］、ヒトＴＦＥＢ（転写因子ＥＢ）アイソフォーム１［配列番号４６００］配列、ヒトＧＡＬＣアイソフォーム１［配列番号４４８６または配列番号４６０１］（ＧＡＬＣバージョン２）、グリシン可動性リンカー（Ｇｌｙ）［配列番号４４９０］とそれに続くタンパク質形質導入ドメイン（ＴＡＴ）（配列番号４４８８）とを含むＧＡＬＣ－ＴＡＴ、または「変異型ＧＡＬＣ－ＴＡＴ」（欠失を有するＧＡＬＣ－ＴＡＴ）（配列番号４４８７）からなる長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。当該タンパク質形質導入ドメイン（ＴＡＴ）は、宿主細胞のリソソームへのＧＡＬＣのターゲティングを補助するために、膜を通過する非古典的輸送を容易にするものである。目的のｃＤＮＡは、トキソプラズマ・ゴンディのコドン使用に従ってコドン最適化して、トキソプラズマ・ゴンディにおける異種ポリペプチドの発現の効率、安定性および局在化を増大させることもできる（例えば、トキソプラズマ・ゴンディにおける発現のためにコドン最適化された、コドン最適化マウスＭｅＣＰ２アイソフォーム１［配列番号４４７７］、コドン最適化ヒトＡＳＰＡ［配列番号４６０２］、コドン最適化ヒトＧＡＬＣアイソフォーム１［配列番号４６０３］およびコドン最適化ヒトＴＦＥＢアイソフォーム１［配列番号４６０４］と同様）。トキソプラズマ・ゴンディ発現ベクターはまた、その正確な発現およびターゲティングを保証する、同じまたは異なるトキソプラズマ遺伝子に由来する調節エレメントも含む。ＯＲＦの上流には内因性５’調節配列があり、当該内因性５’調節配列は、本明細書では「トキソフィリンプロモーター」もしくは「トキソフィリン５’－ＵＴＲ」（配列番号４４８２）と呼ぶ、トキソフィリン遺伝子の内因性５’調節配列であるか、または、本明細書では「ＧＲＡ１６プロモーター」もしくは「ＧＲＡ１６ ５’－ＵＴＲ」（配列番号４４７３）と呼ぶ、ＧＲＡ１６遺伝子の内因性５’調節配列である。ＯＲＦの下流には、豊富な高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ２の３’－ＵＴＲ（配列番号４４９１；図３）がある。発現ベクターは、さらに個別のＯＲＦを含んでもよく、当該ＯＲＦは、ＤＨＦＲ－ＴＳの５’－ＵＴＲ（上流）［配列番号４４９２］およびＤＨＦＲ－ＴＳの３’ＵＴＲ（下流）［配列番号４４９３または４６０９］により囲まれた、選択マーカーＨＸＧＰＲＴ［配列番号４４７５］またはＤＨＦＲ－ＴＳ［配列番号４４８４もしくは４６０６］またはｍＣｈｅｒｒｙ［配列番号４６０８］を含有する。
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディの作製
トキソプラズマ・ゴンディのＩ型株ＲＨもしくはＲＨΔＨＸ、またはＩＩ型株Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ－ＧＦＰ－ルシフェラーゼもしくはＰｒｕｇｎｉａｕｄ ΔＨＰＴ（Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ ΔＨＸとしても公知）を、トランスジェニック株の作製に使用した。細胞外タキゾイトを回収するか、または２２～２６ゲージ針を使用してタキゾイトを機械的に放出させ、細胞残渣から濾過し、ペレット化し、３００μｌのサイトミックスバッファー（１２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．６、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）にその場でそれぞれ３０μｌの２ｍＭ ＡＴＰおよび５ｍＭ ＧＳＨを添加しながら再懸濁した（合計３６０μｌ）。２０～６０μｇのプラスミドＤＮＡ、またはＳｃａＩ酵素で線状化したＤＮＡを、ＢＴＸ ＥＣＭエレクトロポレーターを用いるエレクトロポレーションによってタキゾイトにトランスフェクトした。数滴のトランスフェクト細胞を、ＩＦＡウェル（ガラスカバースリップ上にＨＦＦ細胞を播種した２４ウェルプレートの免疫蛍光アッセイウェル）上に移し、トランスフェクション効率および一過性のタンパク質発現（プラスミドＤＮＡからの発現）の評価のために、免疫蛍光染色を行った。トランスフェクトされた寄生虫の残りを、完全ＤＭＥＭ中のＨＦＦの入った新しいフラスコに移した。薬物耐性選択マーカーを使用した場合は、次の日に培地を、選択のために使用する薬物（ＤＨＦＲ－ＴＳの選択には１μＭピリメタミン、ＨＸＧＰＲＴの選択には２５μｇ／ｍｌのミコフェノール酸＋５０μｇ／ｍｌのキサンチン）を含有する新鮮な培地に交換した。寄生虫がＨＦＦから放出し始めた日から開始して、細胞外寄生虫を含有する上清の液滴を１～２日毎に、選択薬を含有する選択培地にＨＦＦの入った第２のフラスコに移した。第２のフラスコ中の寄生虫がＨＦＦから放出し始めたら、上清の液滴を１～２日毎に、第３のフラスコに移すというように、継代を続けた。蛍光タンパク質選択マーカーを使用した場合、第２のフラスコ中の寄生虫の約５０％～９０％がＨＦＦ細胞から放出した時、細胞外寄生虫を含む培地を回収し、細胞残渣から濾過し、ＦＡＣＳ装置を使用して選別した。選択のために使用した蛍光タンパク質に対応する蛍光を発する寄生虫を回収し、完全ＤＭＥＭ培地中のＨＦＦの入った次のフラスコに移した。第３～第５のフラスコが溶解を開始した後（約２～５週間）の寄生虫を、ＤＮＡ構築物をそのゲノム内に組み込んだ寄生虫を含有する「安定プール」であると考えた。安定プールの液滴を、ＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）ウェルに移し、免疫蛍光染色して、プール中の構築物陽性寄生虫のパーセンテージ、ゲノムに組み込まれた（「安定な」）寄生虫によるタンパク質発現およびタンパク質局在化（ゲノム発現）を評価した。限界希釈による手動の選別、または９６ウェルプレート中、ウェルあたり１個の寄生虫を選別するＦＡＣＳによソーティングにより、クローン株を確立した。プレートを５～１０日間静置した後、単一の寄生虫を起源とすると推定される単一のプラークを含むウェルを、明視野顕微鏡を使用して目視でスクリーニングして、検出した。単一のプラークを含むウェルを、ピペットで激しく混合し、５０μｌの混合物を新しいプレートおよびＰＣＲチューブに移した。ＰＣＲチューブ内の回収した細胞をペレット化し、それを１０％プロテイナーゼＫを含むＴＥバッファーからなる１０μｌの溶解バッファーに再懸濁し、サーモサイクラーで６０℃で６０分間、次いで、９５℃で１０分間インキュベートすることにより、溶解物を作製した。１マイクロリットル（１μｌ）の溶解物を、遺伝子構築物に特異的なプライマーを使用するＰＣＲスクリーニングのための鋳型として使用した。ＰＣＲ陽性クローンを、ＩＦＡウェルに移し、固定し、免疫蛍光染色し、各クローン中でのタンパク質発現およびタンパク質局在化について蛍光顕微鏡および偏光顕微鏡を使用して分析した。
抗体
それぞれの抗体を使用した濃度は、以下の通りである：抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ社製、ＩＦＡ：１：１０００、ＷＢ：１：１０００）、抗ＩＭＣ－１（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｓｏｌｄａｔｉ－Ｆａｖｒｅ教授より寄贈、ＩＦＡ：１：１０００～１：２０００）、抗ＭｅＣＰ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、ＩＦＡ：１：２００、ＷＢ：１：１０００、ＩＰ：１：２６）、抗ＮｅｕＮ（Ａｂｃａｍ社製、ＩＦＡ：１：５００）、抗ＮＣｏＲ１（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ＷＢ：１：１０００）、抗ＴＢＬ１（Ａｂｃａｍ社製、ＷＢ：１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 抗ラット４８８および５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＩＦＡ：１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 抗ウサギ４８８および５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＩＦＡ：１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 抗マウス４８８および５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＩＦＡ：１：１０００）。
実施例１
目的の治療用タンパク質の発現、寄生虫分泌性細胞小器官への局在化、および宿主細胞内への分泌をもたらす、トキソプラズマ・ゴンディ構築物の作製
実験手順
構築物を、エレクトロポレーションによってトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫のＲＨ（ＲＨｈｘｇｐｒｔ）株またはＰｒｕ（Ｐｒｕｈｘｇｐｒｔ）株にトランスフェクトした。この後、選択マーカーを発現する寄生虫の選択プロセス［目的の構築物と共トランスフェクトしたＤＨＦＲ－ＴＳ（配列番号４４８４）を含有する構築物はピリメタミン選択、また、ＨＸＧＰＲＴ（配列番号４４７５）の発現に基づく選択についてはＭＰＡ＋キサンチンを使用］、限界希釈またはフローサイトメトリーによりクローニング、およびＰＣＲに基づくスクリーニングが続く。陽性クローンを、ウェスタンブロット分析および免疫蛍光染色により検証して、分泌ロプトリー細胞小器官、高密度顆粒細胞小器官、寄生体胞空間、寄生体胞膜、または宿主細胞中でのＨＡタグ付き治療用タンパク質の発現および特異的局在化を特徴付けた。検証した陽性株を、ＨＦＦ（ヒト包皮線維芽細胞）細胞上でさらに維持した。
実験結果
治療用タンパク質であるガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ、ＧＤＮＦ、アスパルトアシラーゼ、ＭｅＣＰ２、生存運動ニューロンタンパク質およびＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼパーキンの送達のための、構築物およびトキソプラズマ・ゴンディ株の作製： 結果は、トキソプラズマ・ゴンディを組換えて、寄生虫の内因性タンパク質に融合した異種（哺乳動物、例えば、ヒトの）治療用タンパク質の発現が可能であることを示す。この手法を使用して、本発明者らは、一般的な神経病理と関連する３種のヒトタンパク質、即ち、ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（変異型ＧＡＬＣ－ＴＡＴ、配列番号４４８７）、ＭｅＣＰ２（コドン最適化された配列番号４４７７）およびＧＤＮＦ（配列番号４４８９）、を発現する３種の新規で安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック株と、一般的な神経病理と関連する３種のヒトタンパク質、即ち、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ、アイソフォーム１、配列番号４４８６）、ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（ＷＴ ＧＡＬＣ－ＴＡＴ、配列番号４４８８）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ、配列番号４４８３）および生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１、配列番号４４７９）を発現する、安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック寄生虫を含有する、４種の混合集団プールとを作製した。
ウイルスタンパク質形質導入ドメインによる治療用タンパク質の分泌および取込みの改善： 宿主細胞から細胞外空間へのガラクトセレブロシダーゼタンパク質の分泌、ならびに近隣細胞による当該タンパク質の取込みを改善するために、本発明者らは、ガラクトセレブロシダーゼをウイルスタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合した。Ｔａｔ－ＰＴＤは、細胞培養モデルシステムにおける酵素の分泌と取込みの両方の増強することにより、ガラクトセレブロシダーゼの交差補正効率を有意に増加させる（６倍にする）ことが既に示されている（Meng, X.-L., et al., 2013）。
トキソプラズマ・ゴンディのロプトリー分泌性細胞小器官への治療用タンパク質であるガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ、アスパルトアシラーゼ、ＭｅＣＰ２および生存運動ニューロンタンパク質の局在化： 結果は、トキソプラズマ・ゴンディが異種（哺乳動物、例えば、ヒトの）治療用タンパク質を、寄生虫のロプトリー分泌性細胞小器官（図４Ａ）に局在化させ、そこから宿主細胞の細胞質中に放出させ、感染細胞内の標的部位に局在化させることが潜在的に可能であることを示す。ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ、アスパルトアシラーゼ、ＭｅＣＰ２および生存運動ニューロンタンパク質を含有する融合タンパク質は、宿主細胞へ入ることができた従来のトキソフィリン融合物について報告されたように、寄生虫ロプトリーに局在化した。これは、免疫蛍光染色（ＩＦＡ）によって証明された（図４のＢ～Ｉ）。
かくして、本発明者らは、寄生虫の内因性タンパク質に融合した異種（哺乳動物、例えば、ヒトの）タンパク質を発現するようにトキソプラズマ・ゴンディが組換え可能であること、そしてこれらタンパク質が、寄生虫のロプトリー分泌性細胞小器官に局在化することを示すことに成功した。本発明者らは、トキソフィリンと融合するようにヒトタンパク質をの組換えを行った。トキソフィリンは、寄生虫によって宿主細胞中に天然で分泌される内因性タンパク質であり、ターゲティングおよび分泌のために、目的タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を寄生虫のタンパク質分泌機構に「乗せる」ことができるものである。これは、トキソプラズマ・ゴンディがこの技術の実現可能な基礎となることを示唆する重要な事項である。
この手法を使用して、本発明者らは、クラッベ病と関連するヒトタンパク質である、ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（変異型ＧＡＬＣ－ＴＡＴ、配列番号４４８７）を発現し、ロプトリーに局在化させる、新規で安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック株と、一般的な神経病理と関連する３種のヒトタンパク質、即ち、ガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴ（ＷＴ ＧＡＬＣ－ＴＡＴ、配列番号４４８８）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ、配列番号４４８３）、ＭｅＣＰ２（配列番号４４７７）および生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１、配列番号４４７９）を発現し、ロプトリーに局在化させる、安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック寄生虫を含有する、４種の混合集団プールとを作製した。
治療用タンパク質であるアスパルトアシラーゼ、ＭｅＣＰ２および生存運動ニューロンタンパク質の、トキソプラズマ・ゴンディ高密度顆粒分泌性細胞小器官および寄生体胞空間への局在化： 結果は、トキソプラズマ・ゴンディが、異種（哺乳動物）ヒト治療用タンパク質を寄生虫の高密度顆粒分泌性細胞小器官および寄生体胞空間に局在化させ（図５Ａ）、そこから宿主細胞の細胞質中に放出して、感染細胞内の標的部位に局在化させる（図５Ｂ～Ｉ）ことが可能であることを示す。寄生虫の高密度顆粒から目的タンパク質の分泌を駆動するために高密度顆粒タンパク質由来の配列を使用するこの手法は前例がなく、高密度顆粒タンパク質（ＧＲＡ１６）との融合によって哺乳動物タンパク質が寄生体胞空間中に分泌された初めての事例である。これは、免疫蛍光染色（ＩＦＡ）によって証明された（図５Ｂ～Ｉ）。次いで、融合タンパク質は、寄生体胞膜を通過して宿主細胞中に入ると予想されるが、この予想は、融合相手である本来のＧＲＡ１６タンパク質の既知の局在化（Bougdour et al. 2013）に基づくものである。
かくして、本発明者らは、寄生虫の内因性タンパク質に融合した異種（哺乳動物、例えば、ヒトの）タンパク質を発現するようにトキソプラズマ・ゴンディが組換え可能であること、そしてこれらタンパク質が、寄生虫の高密度顆粒分泌性細胞小器官および寄生体胞空間に局在化することを示すことに成功した。本発明者らは、ＧＲＡ１６と融合するようにヒトタンパク質を操作した。ＧＲＡ１６は、寄生虫によって宿主細胞中に天然で分泌される内因性タンパク質であり、ターゲティングおよび分泌のために目的タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を寄生虫のタンパク質分泌機構に「乗せる」ことができるものである。これは、トキソプラズマ・ゴンディがこの技術の実現可能な基礎となることを示唆する重要な事項である。
この手法を使用して、本発明者らは、レット症候群と関連するヒトタンパク質であるＭｅＣＰ２を発現し、高密度顆粒分泌性細胞小器官および寄生体胞空間に局在化させる、新規で安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック株と、一般的な神経病理と関連する２種のヒトタンパク質、即ち、アスパルトアシラーゼおよび生存運動ニューロンタンパク質を発現し、高密度顆粒分泌性細胞小器官および寄生体胞空間に局在化させる、安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック寄生虫を含有する２種の混合集団プールとを作製した。
トランスジェニック寄生虫から宿主細胞への治療用タンパク質ＭｅＣＰ２の分泌、および宿主細胞中の活性領域である核での局在化： 結果は、トキソプラズマ・ゴンディ分泌ポリペプチドに融合した薬学的ポリペプチドからなるタンパク質融合物（本明細書では具体的に、トキソプラズマ・ゴンディ高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ１６に融合した治療用タンパク質ＭｅＣＰ２）が、寄生虫から宿主細胞内に放出され、宿主細胞内の治療用タンパク質の標的部位（ここでは、核）に移行することができることを示す。免疫蛍光染色（ＩＦＡ）により示されるように、ＭｅＣＰ２を含有する融合タンパク質は宿主細胞核に局在化した（図５Ｆ～Ｉ）。これは、トキソプラズマ・ゴンディがこの技術の実現可能な基礎となることを示唆する重要な事項である。
この手法を使用して、本発明者らは、レット症候群と関連するヒトタンパク質であるＭｅＣＰ２を発現し、宿主細胞核に局在化する、新規で安定なトキソプラズマ・ゴンディトランスジェニック株を作製した（図５Ｆ～Ｉ）。
実施例２
寄生虫送達によるガラクトセレブロシダーゼ欠損症の改善
６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－ガラクトシド（６ＨＭＵ－ベータ－Ｄ－ガラクトシド）と命名されたガラクトセレブロシダーゼの合成蛍光基質の酵素的破壊に基づくガラクトセレブロシダーゼ酵素活性アッセイは、製造業者のプロトコール［Otto P. van Diggelen. MOSCERDAM SUBSTRATES, Laboratory protocol for enzyme analysis for Krabbe disease; Galactocerebrosidase］に基づくものである。クラッベ病患者由来線維芽細胞を使用して、このアッセイによって、ＧＡＬＣを発現する寄生虫およびＧＡＬＣ－ＴＡＴを発現する寄生虫が培養物中のクラッベ病表現型を改善する能力を評価する。未処置のクラッベ病細胞（クラッベ病患者由来線維芽細胞）、偽ベクター（空のヒト発現ベクター）をトランスフェクトしたクラッベ病細胞および／またはＧＡＬＣを発現しないトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を感染させたクラッベ病細胞を、陰性対照として使用する。陽性対照は、野生型（ＷＴ）細胞株、またはヒト発現ベクターをトランスフェクトしたクラッベ病細胞であり、当該発現ベクターは、試験したトランスジェニック寄生虫の発現する融合物と同一の、独立型（ＨＡタグ付き）ＧＡＬＣもしくはＧＡＬＣ－ＴＡＴ遺伝子、またはトキソフィリン／ＧＲＡ１６に融合したＧＡＬＣもしくはＧＡＬＣ－ＴＡＴ遺伝子のいずれかの発現を駆動するものである。これにより、陰性結果が、タンパク質自体の十分な効果の欠如、または治療用タンパク質のＮ末端へのトキソフィリンもしくはＧＲＡ１６の融合による治療用タンパク質の活性の破壊から引き起こされ得る可能性を除外することができ、かくして、寄生虫送達システムの効率の定量可能かつ直接的な推測が可能になる。
このアッセイを、クラッベ病患者由来線維芽細胞内で見られる、ガラクトセレブロシダーゼを発現する寄生虫がガラクトセレブロシダーゼ欠損症を改善する能力を特徴付けるために使用する。この実験は、トランスジェニック寄生虫が培養物中の細胞への補充タンパク質の送達によってクラッベ病を改善する能力を示す。
実施例３
寄生虫送達によるＭＥＣＰ２欠損症の改善
ＭＥＣＰ２遺伝子の変異または欠失を有するレット症候群のマウスモデル由来のニューロンおよびグリア細胞は、数々の異常な形態学的および分子的特徴を呈する［Percy, A. Rett syndrome: coming to terms with treatment. Adv. Neurosci. (2014)、［de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016］。
レット症候群細胞培養モデルを使用して、レット症候群の分子的および形態学的特徴を有する表現型の定量的スコアリングによって、ＭｅＣＰ２を発現する寄生虫が培養物中のレット症候群表現型を改善する能力を評価する。未処置のレット症候群モデル細胞、偽ベクターをトランスフェクトしたレット症候群モデル細胞、および／またはＭｅＣＰ２を発現しないトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫に感染させたレット症候群モデル細胞を、陰性対照として使用する。陽性対照は、ＷＴ細胞株、およびヒト発現ベクターをトランスフェクトしたレット症候群モデル細胞であり、当該発現ベクターは、試験したトランスジェニック寄生虫の発現する融合物と同一の、独立型（ＨＡタグ付き）ＭＥＣＰ２コード配列またはトキソフィリン／ＧＲＡ１６に融合したＭＥＣＰ２コード配列のいずれかの発現を駆動するものである。これにより、陰性結果が、タンパク質自体の十分な効果の欠如、または治療用タンパク質のＮ末端へのトキソフィリンもしくはＧＲＡ１６の融合による治療用タンパク質の活性の破壊から引き起こされ得る可能性を除外することができ、かくして、寄生虫送達システムの効率の定量可能かつ直接的な推測が可能になる。
このアッセイを、レット症候群細胞培養モデルで見られる、ＭｅＣＰ２を発現する寄生虫がＭｅＣＰ２欠損症を改善する能力を特徴付けるために使用する。この実験は、トランスジェニック寄生虫が培養物中の細胞への補充タンパク質の送達によってクラッベ病を改善する能力を示す。
実施例４
動物モデルにおけるトランスジェニック寄生虫株の治療能力の試験
寄生虫のトランスジェニック株が、生物全体の表現型に影響を与える能力について試験する。マウスにおけるトランスジェニック寄生虫の試験により、免疫系および機能的血液脳関門（ＢＢＢ）の存在下でのシステムの評価が可能になる。トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を、試験する状態、即ち、経鼻、経腸（経口など）、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、頭蓋内または脳内から、動物モデルに投与する。トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫は、タキゾイト、ブラディゾイト組織嚢胞または卵母細胞の形態で投与する。
寄生虫の接種後、動物モデルを、試験する病態と関連する表現型（疾患の病理学的表現型など）の兆候について特徴付け、評価する。表現型には、行動学的、形態学的および分子的表現型が含まれる。トランスジェニック寄生虫の効果は、治療用ポリペプチドを発現しない寄生虫で処置された動物との比較、および偽処置された動物との比較によって示す。
例えば、治療用タンパク質ＭｅＣＰ２を発現するトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫で処置したレット症候群のマウスモデルを、以下の表現型を含む、疾患の公知の表現型によって評価する。社会的相互作用の障害、匂いづけ行動の増加、後肢抱擁、生存期間減少、不安、呼吸器の問題、低活動性、運動協調の障害、ｍｉＲＮＡ媒介性ＩＧＦ１欠損、ＢＤＮＦレベルの低下、皮質可塑性の障害、グリア機能障害、ＧＡＢＡ生成ニューロン機能障害、体細胞サイズの低下、樹状突起棘密度の低下、シナプス数の減少、活動低下（Ｃａ２＋イメージング）、ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ周波数および振幅の低下、Ｔｕｊ１＋細胞数の減少、ＰＡＸ６、ＳＣＮ１Ａ／１Ｂ発現の低下、皮質ニューロンにおける樹状突起の複雑性の低下、皮質ニューロンにおけるＡＰ周波数の低下、皮質ニューロンにおける総転写の減少、皮質ニューロンにおけるニューロン、シナプス、高発現遺伝子、極初期遺伝子およびミトコンドリア遺伝子の発現の減少、皮質ニューロンにおけるｍＲＮＡ翻訳の減少、皮質ニューロンからのＢＤＮＦ分泌の減少、皮質ニューロンにおけるＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の活性低下ならびに皮質ニューロンにおける酸素消費および最大呼吸の低下（de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016）。
実施例５
カスタマイズされた転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の送達のための、構築物およびトキソプラズマ・ゴンディ株の作製
カスタマイズされた転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を発現および分泌させるために、トキソプラズマ・ゴンディの組換えを行った。カスタマイズされたＴＡＬＥは、転写調節およびゲノム編集を含む、様々なゲノム操作用途に使用することができる。ＴＡＬＥのＤＮＡ認識および結合領域は、認識したＤＮＡ配列中の、配列を決定する３４アミノ酸配列（モノマー）のタンデムリピートから作られる。モノマーには、それぞれが認識するヌクレオチドを決定するのリピート可変２残基（ＲＶＤ）が異なる４種が存在する。「ＮＩ」と呼ばれるモノマー（配列番号４５０８）は、「Ａ」ヌクレオチドに特異的であり、「ＨＤ」と呼ばれるモノマー（配列番号４４９５）は、「Ｃ」ヌクレオチドに特異的であり、「ＮＧ」と呼ばれるモノマー（配列番号４５０９）は、「Ｔ」ヌクレオチドに特異的であり、「ＮＮ」と呼ばれるモノマー（配列番号４４９４）は、「Ｇ」または「Ａ」ヌクレオチドに特異的である。より最近では、さらなるＲＶＤ ＮＨ（配列番号４５０４）が、より高いＧ特異性を提供することが示された。タンデムリピートＤＮＡ結合ドメインは、半分の長さのリピート（０．５リピート）で常に終わる。カスタマイズしたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを使用して、カスタムＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ－ＴＦ）を作製し、合成ＶＰ６４転写活性化因子との融合により、ゲノムからの内因性遺伝子の転写を調節することができる。また、カスタマイズしたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを使用して、カスタムＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を作製し、これを使用して、部位特異的二本鎖破壊を作製することができる。部位特異的二本鎖破壊は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合による、非相同的修復または相同性指向的修復によるゲノム編集を容易にする。ＴＡＬＥＮ骨格またはＴＡＬＥ－ＴＦ骨格に挿入されるモノマー（配列番号４５０８、４５０９、４４９４、４４９５および４５０４）からＤＮＡ結合ドメインを構築することによって、ＴＡＬＥを作製する。骨格はまたＤＮＡ結合ドメインの末端の０．５リピートをも含むため、４種のＴＡＬＥＮ骨格（例えば、配列番号４５００、４５０１、４５０２および４５０３）、ならびに４種のＴＡＬＥ－ＴＦ骨格（例えば、配列番号４４９６、４４９７、４４９８および４４９９）が存在する。骨格はまた、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、Ｈａｘ３ ＴＡＬＥ由来の非反復Ｎ末端（Ｎ末）、Ｈａｘ３ ＴＡＬＥ由来の非反復Ｃ末端（Ｃ末）、カスタムＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの挿入のために使用されるＩＩ型制限部位（ＢｓａＩなど）、ｃｃｄＢ陰性選択遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｃｄＢ＋ＣｍＲ）を含有する陰性選択カセット、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ならびにＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（ＦｏｋＩ）の触媒ドメインまたは単純ヘルペスウイルス ＶＰ１６タンパク質由来の合成転写活性化因子（ＶＰ６４）を含有し、次いで、２Ａ自己切断リンカー（２Ａ）および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）も含有する。これら全ての後に、ポリアデニル化シグナル（ポリＡシグナル）がある（Sanjana et al., A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering, 2012）。得られるＴＡＬＥ配列を、上記の一般的方法および実験方法に記載したトキソプラズマ・ゴンディ内因性分泌ポリペプチドのコード配列の下流に挿入し、得られる構築物をトキソプラズマ・ゴンディにトランスフェクトして、ＴＡＬＥを発現し、分泌するトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ株を作製する。
例えば、処置を必要とする対象のゲノム内のＴＡＣＧＴＡＣＧ配列（配列番号４５０５）を標的とするために、ＴＡＬＥヌクレアーゼ構築物またはＴＡＬＥ転写因子構築物を使用することができる。これらの構築物のオープンリーディングフレームにおいて、例示した「標的配列」（配列番号４５０５）をターゲティングするのに特異的なモノマーを、図６Ａ（ＴＡＬＥヌクレアーゼについて）および図６Ｂ（ＴＡＬＥ転写因子について）に図示したように、順々に配置する。これらの構築物の配列情報は、配列表で提供する（配列番号４５０６および４５０７）。
実施例６
哺乳動物治療用タンパク質を発現し、それらをロプトリー分泌性細胞小器官に局在化させるトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫の作製
哺乳動物タンパク質を発現し、それらをロプトリー分泌性細胞小器官にターゲティングするトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を作製するために、本発明者らは、Ｉ型ＲＨΔＨＸタキゾイトまたは（ｐＤＨＦＲ選択プラスミドと共に共トランスフェクトされた）ＲＨを、ロプトリータンパク質トキソフィリンに融合した目的タンパク質をコードする配列を含有するプラスミドと共に、トキソプラズマ・ゴンディにトランスフェクトした。トキソフィリン融合株において試験した哺乳動物タンパク質は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、パーキン（ＰＡＲＫ２）、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインに融合したガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ－ＴＡＴ；配列番号４４８７）、メチルＣｐＧ結合タンパク質（ＭｅＣＰ２）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）および生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）であった。タンパク質発現およびターゲティングを改善する試みとして、本発明者らはまた、ＧＡＬＣ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡを含む種々のタンパク質のコドン最適化バージョンを試験し、さらに追加の遺伝子ＴＦＥＢのコドン最適化した形態（配列番号４６０４）で試験した。
ＡＳＰＡ（配列番号４４８３）、コドン最適化ＡＳＰＡ（配列番号４６０２）、ＧＡＬＣ（配列番号４４８６および４６０１）、ＧＡＬＣ－ＴＡＴ（配列番号４４８８）、ＰＡＲＫ２（配列番号４４７８）、ＳＭＮ１（配列番号４４７９）、ＧＤＮＦ（配列番号４４８９）、ＭｅＣＰ２（配列番号４４７６）およびコドン最適化ＭｅＣＰ２（配列番号４４７７）は、寄生虫における融合タンパク質の様々なターゲティングを示し、ここにはロプトリーターゲティングのみならず、小胞体、ゴルジ体、核、細胞質、アピコプラスト、ミクロネームおよび他の局在化と類似した、他のパターンのターゲティングも含まれた（図９Ａ～Ｎ）。
ＧＡＬＣ－ＴＡＴ変異型は、主にロプトリー様融合タンパク質の局在化をもたらした。ＧＡＬＣ－ＴＡＴ変異型から、本発明者らは、融合タンパク質を強く発現し、それをロプトリーにターゲティングしたクローン株も作製した（図９Ｈ）。
実施例７
哺乳動物治療用タンパク質を発現し、それらを高密度顆粒分泌性細胞小器官に局在化させ、それらを寄生体胞中に分泌するトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫の作製
哺乳動物タンパク質を発現し、それらをその高密度顆粒分泌性細胞小器官Ｉ型ＲＨΔＨＸにターゲティングするトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を作製するために、トキソプラズマ・ゴンディに、高密度顆粒タンパク質ＧＲＡ１６に融合した目的タンパク質をコードする配列を含有するプラスミドをトランスフェクトした。ＧＲＡ１６融合株において試験した哺乳動物タンパク質コード遺伝子は、ＧＡＬＣ［ヒト型（配列番号４４８６および４６０１）およびコドン最適化（配列番号４６０３）、ＧＡＬＣ－ＴＡＴ（ヒト型、配列番号４４８８）、ＭＥＣＰ２（コドン最適化、配列番号４４７７）、ＡＳＰＡ［ヒト型（配列番号４４８３）およびコドン最適化（配列番号４６０２）］、ＳＭＮ１（ヒト型、配列番号４４７９）ならびにＴＦＥＢ（コドン最適化、配列番号４６０４）であった。
ＧＡＬＣ、コドン最適化ＧＡＬＣおよびＧＡＬＣ－ＴＡＴは、トランスフェクトされた寄生虫中で発現された（図１０Ｅ、１０Ｆおよび１０Ｈ）。ＡＳＰＡ、コドン最適化ＡＳＰＡ、ＳＭＮ１、コドン最適化ＭｅＣＰ２およびコドン最適化ＴＦＥＢは、高密度顆粒によって発現され、寄生体胞に分泌された（図１０Ｃ、１０Ｇ、１０Ｄ、１０Ｉ、１０Ｊ）。
実施例８
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディを用いた、培養ヒト線維芽細胞への哺乳動物治療用タンパク質の送達
本発明者らは、融合タンパク質を寄生体胞中に分泌するだけでなく、それを寄生体胞から放出し、免疫蛍光染色によって検出可能な量で宿主細胞の核にターゲティングすることもできる６つのＩ型およびＩＩ型トキソプラズマクローン株を組換えにより作製した。これらのクローン株は、ＲＨ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＭＥＣＰ２（ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ）、ＲＨ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＴＦＥＢ（ＲＨ ＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔ）、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ－ＧＦＰ－ルシフェラーゼＤＨＦＲ－ＴＳ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＭＥＣＰ２（Ｐｒｕ－ＧＦＰ－ＬＵＣ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ）、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ－ＧＦＰ－ルシフェラーゼＤＨＦＲ－ＴＳ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＴＦＥＢ（Ｐｒｕ－ＧＦＰ－ＬＵＣ ＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔ）、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＭＥＣＰ２（Ｐｒｕ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ）、およびＰｒｕｇｎｉａｕｄ ＧＲＡ１６－コドン最適化ＴＦＥＢ（Ｐｒｕ ＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔ）である。融合タンパク質を発現するトランスジェニック株に加えて、本発明者らは、ＨＡエピトープタグのみに融合された担体タンパク質ＧＲＡ１６を発現する２つの対照株：ＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡ（ＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ）およびＰｒｕｇｎｉａｕｄ ＧＲＡ１６－ＨＡ（Ｐｒｕ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ）も作製した。ＭｅＣＰ２およびＴＦＥＢは両方とも核タンパク質であるため、宿主細胞核ターゲティングは、それらが細胞中のその活性部位にターゲティングされたことを意味する。完全ＤＭＥＭ中のＨＦＦ細胞の、それぞれの株のタキゾイトによる感染、固定化、免疫蛍光染色ならびに蛍光顕微鏡および偏光顕微鏡による分析によって、上記の全ての株におけるタンパク質の分泌および宿主細胞核ターゲティングを、ＨＦＦヒト線維芽細胞中で検出した（図１０Ｂ、１０Ｉおよび１０Ｊ）。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＲＡ１６媒介タンパク質送達の効率および動力学を定量するために、本発明者らは、図１１Ａ～Ｃにまとめたように、３種のＩ型株ＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ、ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔおよびＲＨ ＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔのタキゾイトに関する経時的な送達および感染多重度（ＭＯＩ）を定量した。
実施例９
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディを使用した、培養ヒトニューロンへの哺乳動物治療用タンパク質の送達
Ｌｕｎｄヒト中脳（ＬＵＨＭＥＳ）細胞としても知られる、不死化ヒトドーパミン作動性神経前駆細胞を、Ｌ－グルタミン、Ｎ－２無血清補助物質およびβＦＧＦ（ベータ－線維芽細胞増殖因子）を添加したＦ１２ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地を含有する培地中で増殖させた。Ｌ－グルタミン、Ｎ－２無血清補助物質、テトラサイクリン、ＧＤＮＦおよびｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）を添加したＦ１２ ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地を使用して、培養によって細胞を形態学的および生化学的に成熟したドーパミン様ニューロンに分化させた。分化の６～９日目（この時点で細胞は成熟ニューロンである）に、クローン株ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔ、ＲＨ ＧＲＡ１６－ＴＦＥＢｏｐｔおよびＲＨ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐのタキゾイトを使用して、ニューロンに感染させた。感染の１６～２２時間後、ニューロンを固定し、免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡および偏光顕微鏡によって分析した。試験した全ての株が融合タンパク質の明確な分泌を呈し、これらはヒトニューロンの核にターゲティングされていた（図１２Ａ～Ｃ）。
さらに、ヒトニューロンを、ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔタキゾイトに感染させ、感染の２４時間後に回収した。感染ニューロンをＰＢＳで洗浄し、滅菌細胞スクレイパーを使用して欠き取り、遠心分離によってペレット化し、残留ＰＢＳを除去し、ペレットを液体窒素中で瞬間凍結させた。感染ニューロンから抽出した核タンパク質を、ＭｅＣＰ２抗体に結合させた磁気ビーズを使用して免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質を、標準的なウェスタンブロットプロトコールに従って、同じＭｅＣＰ２抗体を用いて免疫ブロットした。得られたブロットは、約７５ｋＤａおよび約１３０ｋＤａの２つの強いバンドを呈した。約７５ｋＤａのバンドは、ヒトニューロン由来の内因性非トランケート型ＭｅＣＰ２（推定サイズ：７５ｋＤａ）を表し、約１３０ｋＤａのバンドは、寄生虫によって送達されたＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２融合タンパク質（ＧＲＡ１６の推定サイズ：５５ｋＤａ、融合タンパク質の推定サイズ：７５＋５５＝１３０ｋＤａ）を表す（図１４）。
実施例１０
培養マウス一次皮質および培養マウス海馬培養物への、トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディを使用した哺乳動物ＭＥＣＰ２の送達、およびヘテロクロマチンＤＮＡへの送達されたＭＥＣＰ２の結合
Ｐ１（１日齢）仔マウスの皮質および海馬に由来するニューロン富化一次培養物を、５日間培養し、トランスジェニック株ＲＨ ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２ｏｐｔのタキゾイトに感染させた。感染の１２、２４および４８時間後にニューロンを固定し、免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡および偏光顕微鏡によって分析した。列挙した全ての時点において、ＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２融合タンパク質が分泌され、ニューロンの核にターゲティングされ、それらはまた、高密度ヘテロクロマチンＤＮＡの領域に対応する病巣に出現することが、強いＤＡＰＩ染色によって認識された（図１３Ａ～Ｄ）。これは、ＭｅＣＰ２機能の古典的なマーカーであり、ヘテロクロマチンに上手く結合することを示唆している。注目すべきことに、培養物の系においては、トキソプラズマ・ゴンディは、両方のニューロン、グリアおよび他の細胞に感染することができる。一次培養物は、（ＮｅｕＮ染色によると）純粋なニューロンではなかったため、本発明者らは、トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディに感染した非ニューロン細胞（おそらく大部分がグリア細胞）もＭｅＣＰ２融合タンパク質を受容し、同様の特徴的な病巣パターンを呈することを見ることができた。
実施例１１
トキソプラズマ・ゴンディのブラディゾイト嚢胞における、ＧＲＡ１６およびＧＲＡ１６－ＭＥＣＰ２融合タンパク質の発現
正常な感染過程においては、寄生虫が複製し、タキゾイトとして体内で播種する初期急性期の後に、トキソプラズマ・ゴンディのタキゾイトから、組織、主として脳、で長期間維持される休止嚢胞内に存在するブラディゾイトへの分化が、免疫圧力によって引き起こされる（Carruthers VB, Suzuki Y, 2007. Schizophr Bull. 33(3):745-51. Effects of Toxoplasma gondii infection on the brain）。したがって、本発明者らは、トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディが、ブラディゾイト形態に分化した後もＧＲＡ１６に融合した治療用タンパク質を継続して発現するかどうかを調査した。トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディのブラディゾイトへのｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化は、アルカリ培地を用いた、３～５日間にわたるストレスによって誘導した。アルカリ培地は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを用いてｐＨ８．１に調整したＤＭＥＭ培地およびペニシリン－ストレプトマイシンを添加した１％ウシ胎仔血清を含有した（Tomita T, Bzik DJ, et al. 2013. PLoS Pathog. 9(12):e1003823. The Toxoplasma gondii cyst wall protein CST1 is critical for cyst wall integrity and promotes bradyzoite persistence）。本発明者らは、Ｐｒｕ ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐ株およびＰｒｕ ＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２株の分化を試験した。嚢胞壁のＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン）染色によって同定されたブラディゾイト嚢胞は、ＧＲＡ１６－ＨＡｓｔｏｐタンパク質（データは示さない）とＧＲＡ１６－ＭｅＣＰ２タンパク質との両方を継続して発現した（図１５Ａ～Ｃ）。この知見は、トランスジェニック寄生虫が、ブラディゾイト期への分化後もＧＲＡ１６およびＧＲＡ１６融合タンパク質を継続して発現可能であることを示し、これは慢性感染における嚢胞からの連続的分泌およびタンパク質送達において重要である。
実施例１２
トキソプラズマ・ゴンディによって送達される異種ポリペプチドと、レシピエント細胞内の内因性タンパク質との分子間相互作用のプロービング
感染培養物および感染動物に由来する細胞溶解物に対して共免疫沈降を実施することにより、本発明者らは、トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディによって送達されるポリペプチドと、内因性タンパク質および核酸との分子間相互作用を解明することができる。
例えば、哺乳動物細胞においては、ＭｅＣＰ２は、ＳＭＲＴ／ＮＣｏＲコリプレッサー複合体およびＳＩＮ３Ａコリプレッサー複合体に由来するＤＮＡおよびタンパク質の両方に結合する。ＤＮＡへの結合は、免疫蛍光染色およびクロマチン免疫沈降によりプロービングし、他のタンパク質への結合は、免疫蛍光染色およびタンパク質共免疫沈降によりプロービングすることができる。送達される融合タンパク質に付加したエピトープタグを使用して、宿主細胞により産生されるタンパク質のコピーと、寄生虫により送達されるタンパク質のコピーとを区別することができるが、タンパク質自体に対する抗体を使用して、（例えば、比較アッセイのために）内因性タンパク質と、寄生虫に送達されるタンパク質との両方をプロービングすることもできる。
実施例１３
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディが、動物モデルにおいて目的の異種タンパク質を連続的（／慢性的）に送達する能力の試験
寄生虫のトランスジェニック株が生物全体の表現型に影響を与える能力について試験する。動物モデルにおけるトランスジェニック寄生虫の試験により、免疫系および機能的血液脳関門（ＢＢＢ）の存在下での株の評価が可能になる。これは、マウスにトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディを感染させるための、当業界で確立された標準的な感染プロトコールに従って行われる（Cabral CM et al., 2016, PLoS Pathog. 12(2):e1005447. Neurons are the Primary Target Cell for the Brain-Tropic Intracellular Parasite Toxoplasma gondii、Berenreiterova M et al., 2011. PLoS One. 6(12):e28925. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis、Tait ED et al. 2010. J. Immunol. 185(3):1502-12. Virulence of Toxoplasma gondii is associated with distinct dendritic cell responses and reduced numbers of activated CD8+ T cells、Koshy AA et al. 2012. PLoS Pathog. 8(7):e1002825. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade、Jensen KD et al. 2015. MBio. 6(2):e02280. Toxoplasma gondii superinfection and virulence during secondary infection correlate with the exact ROP5/ROP18 allelic combination）。トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を、経鼻、経腸（経口など）、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、頭蓋内または脳内から動物モデルに投与する。トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫は、タキゾイト、ブラディゾイト組織嚢胞または卵母細胞の形態で投与する。動物モデルは、野生型動物、またはトランスジェニック寄生虫の発現する目的タンパク質の送達によって処置可能、もしくは影響を与えることのできる病態を有するモデル動物であってもよい。急性感染の初期段階の後、動物は、主に脳内で、慢性的なブラディゾイト組織嚢胞を生じる。この様式の送達は、感染の慢性期におけるトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディによる目的タンパク質の連続的な発現および分泌に依拠する。
慢性感染の発達中の様々な段階（株および感染経路に応じて、感染後の最初の３週間から２ヶ月まで）、ならびに慢性感染が確立され、安定化した後の様々な時点（感染後数ヶ月から数年の時間規模）で、脳組織染色を使用して、感染した細胞のパーセンテージ、寄生虫の分布ならびに脳および他の組織に送達されたタンパク質を評価し、送達されたタンパク質のレベルを定量する。共免疫沈降および細胞形態学を使用して、受容細胞内の送達タンパク質と、内因性対応物との分子間相互作用を確認し、その機能に関する証拠を提供することができる。
疾患表現型の兆候およびそれらを軽減する処置の効能、ならびに処置に伴う潜在的な毒性を評価するために、処置した動物モデルの状態を、慢性感染の様々な段階および疾患進行の様々な段階で、生理学的、行動学的、細胞的および分子的手段を使用してモニタリングし、特徴付けを行った。トランスジェニック寄生虫の効果は、薬学的ポリペプチドを発現しない寄生虫で処置した動物および／または偽処置動物との比較によって評価する。
例えば、治療用タンパク質ＭｅＣＰ２を発現するトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫で処置したレット症候群のマウスモデルを、以下の表現型を含む、疾患の公知の表現型によって評価する。社会的相互作用の障害、匂いづけ行動の増加、後肢抱擁、生存期間減少、不安、呼吸器の問題、低活動性、運動協調の障害、ｍｉＲＮＡ媒介性ＩＧＦ１欠損、ＢＤＮＦレベルの低下、皮質可塑性の障害、グリア機能障害、ＧＡＢＡ生成ニューロン機能障害、体細胞サイズの低下、樹状突起棘密度の低下、シナプス数の減少、活動低下（Ｃａ２＋イメージング）、ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ周波数および振幅の低下、Ｔｕｊ１＋細胞数の減少、ＰＡＸ６、ＳＣＮ１Ａ／１Ｂ発現の低下、皮質ニューロンにおける樹状突起の複雑性の低下、皮質ニューロンにおけるＡＰ周波数の低下、皮質ニューロンにおける総転写の減少、皮質ニューロンにおけるニューロン、シナプス、高発現遺伝子、極初期遺伝子およびミトコンドリア遺伝子の発現の減少、皮質ニューロンにおけるｍＲＮＡ翻訳の減少、皮質ニューロンからのＢＤＮＦ分泌の減少、皮質ニューロンにおけるＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性の低下ならびに皮質ニューロンにおける酸素消費および最大呼吸の低下（de la Torre-Ubieta et al. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nat Med. 2016, 22:345-61）。
実施例１４
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディが、動物モデルにおいて目的の異種タンパク質を一過的（／急性的）に送達するの能力の試験
上記の実施例１３と同様、寄生虫のトランスジェニック株が生物全体の表現型に影響を与える能力について試験する。動物モデルにおけるトランスジェニック寄生虫の試験により、免疫系および機能的血液脳関門（ＢＢＢ）の存在下での株の評価が可能になる。これは、タキゾイト、ブラディゾイト組織嚢胞または卵母細胞の形態のトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディの経鼻、経腸（経口など）、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、頭蓋内または脳内投与によって行うことができる。動物モデルは、野生型動物、またはトランスジェニック寄生虫の発現する目的タンパク質の送達によって処置可能、もしくは影響を与えることのできる病態を有するモデル動物であってもよい。この実験計画は、ブラディゾイトへの分化ならびに慢性感染および／または慢性嚢胞の確立に依拠しない、一過性送達の評価に焦点を当てたものである。いくつかの例として、以下が挙げられる：ブラディゾイトに分化することができない、および／または複製することができない、および／または２～３週間より長くｉｎ ｖｉｖｏで持続することができない、または慢性感染を確立することができない、弱毒化された寄生虫による送達；標的組織または標的組織に近い領域への局部投与による送達と、続く、寄生虫のクリアランスまたは不活化。これらの試験を、反復投与のために、複数回反復することもできる。感染を増強するため、および以前にトキソプラズマ・ゴンディに感染していた動物の再感染を補助するために、寄生虫による感染前、感染時、または感染後に、免疫抑制剤を投与してもよい。この実験計画はまた、慢性感染を確立することができるトランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディによって送達するが、試料の回収または分析を慢性感染の確立前の感染の急性期に実施することを含む。この形態の送達は、主にトランスジェニック株のタキゾイトによる目的タンパク質の分泌に依拠する。急性感染の様々な段階（株および感染経路に応じて、感染後、最初の数日から約２ヶ月）において、脳組織染色を使用して、感染細胞のパーセンテージの評価、寄生虫の分布ならびに脳および他の組織における送達タンパク質の特徴付け、および送達されたタンパク質レベルの定量を行った。受容細胞内での送達されたタンパク質と内因性対応物との分子間相互作用を確認し、その機能に関する証拠を提供するために、共免疫沈降および細胞形態学を使用した。
疾患表現型の兆候およびそれらを軽減する処置の効能、ならびに処置に伴う潜在的な毒性を評価するために、処置した動物モデルの状態を、処置開始後の様々な時点で、また、疾患進行の様々な段階で、生理学的、行動学的、細胞的および分子的手段を使用してモニタリングし、特徴付けを行った。トランスジェニック寄生虫の効果は、薬学的ポリペプチドを発現しない寄生虫で処置した動物および／または偽処置動物との比較によって評価する。
実施例１５
トランスジェニックトキソプラズマ・ゴンディの安全性および制御可能性を増加させるさらなる改変の導入
寄生虫は、健常なヒトにおいては一般に無害と考えられるが、そのビルレンスをさらに弱毒化させるために、治療用株については、寄生虫に対するさらなる改変を組み込むことができる。その門のモデル生物であることから、弱毒化され、外部から制御可能な寄生虫（Moe-Behrens GH, Davis R, Haynes KA. Front Microbiol. 2013 4:5. "Preparing synthetic biology for the world"）の作製に使用可能な、寄生虫を改変するための様々な高度に発達した遺伝的手段が存在する（Jimenez-Ruiz E, Wong EH, Pall GS, Meissner M. Parasitology. 2014, 141:1390-8. "Advantages and disadvantages of conditional systems for characterization of essential genes in Toxoplasma gondii"）。１つの手法には、栄養要求性の操作が含まれる。第２に、タンパク質薬を送達する能力に必須ではない寄生虫の特定のビルレンス機構を標的とし、破壊することにより、弱毒化された寄生虫を開発することができる。別の手法には、操作された誘導性致死による能動的制御、例えば、活性化分子の投与によって寄生虫を除去する、誘導性「自殺スイッチ」（自己破壊エレメント）が含まれる。いくつかの例には、寄生虫のｉｎ ｖｉｖｏにおける致死性またはアポトーシス性経路の薬物誘導性活性化のための、広く使用されているテトラサイクリン誘導的プロモーターの使用や、必須遺伝子の誘導的ノックアウト、もしくは致死性またはアポトーシス性経路の誘導的活性化のための、ラパマイシン二量体化ｄｉＣｒｅシステムの利用が含まれる。このような薬物誘導性制御はまた、組織または細胞によって異なる薬物の透過性および薬物の体内での分布の違いによって、特定の組織、領域または細胞型からの寄生虫の示差的なクリアランスを可能にしてもよい。
分析および考察
本発明は、脳寄生虫であるトキソプラズマ・ゴンディの機構を利用するタンパク質送達プラットフォームであり、当該プラットフォームは、血液脳関門の通過、およびＣＮＳ内の細胞、特にニューロン、へのタンパク質の送達を可能にする。
治療用タンパク質のＣＮＳへの送達を可能にするために、本発明者らは、目的タンパク質の合成およびＣＮＳ内の細胞への送達のためにトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫を再び使用した。かくして、本発明者らは、ＣＮＳ内の細胞へのタンパク質の特異的かつ制御された送達のための多用途プラットフォームを確立する。
組換え寄生虫は、以下の新規な能力を有する。
（１）様々な治療用異種タンパク質を合成し、それらをＣＮＳ内の標的細胞中に特異的に分泌するように、寄生虫は容易に改変可能である。
（２）感染した宿主に対して有害な作用を媒介し得る寄生虫のエレメントを減少または排除するための改変を、寄生虫は含有してもよい。
（３）宿主に入った後に、その分布および時空活性の制御を可能にする調節および／または自己破壊エレメントを、寄生虫は含有してもよい。
以下は、本明細書に記載した寄生虫のゲノム変化の概要であるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）寄生虫の特定の内因性分泌タンパク質への選択された治療用タンパク質の融合。治療用融合タンパク質の有効性を増加させ得るさらなる補助エレメントおよび改変を、融合遺伝子／タンパク質に加えることができる。このような補助エレメントおよび改変は、ターゲティングもしくは活性に必要ではなくなった治療用タンパク質を内因性寄生虫タンパク質から脱離させることを可能にする切断部位、またはトキソプラズマおよび送達されるタンパク質の効能および分布の検出および評価を媒介し得るエピトープタグおよび蛍光タンパク質などである。
（ｉｉ）寄生虫の治療的役割にとって必要ではないビルレンス遺伝子の除去。これらの改変は、患者に対する寄生虫の潜在的な有害効果を軽減し、寄生虫を安全な臨床的使用にとって適切なものにする。
（ｉｉｉ）外部から投与された薬物に応答して寄生虫の自己破壊を引き起こすため、または寄生虫の活性を操作するために、誘導することができる調節エレメントの挿入。これらのエレメントは、この技術の安全性を増大させ、また、その時空活性の制御の増大も提供する。
本発明の一部の実施形態の方法を用いて開発された初代の株は、クラッベ病に係わるガラクトセレブロシダーゼおよびガラクトセレブロシダーゼ－ＴＡＴタンパク質、様々な神経変性疾患および他の状態（特に、パーキンソン病、核上麻痺、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、網膜変性、外傷性脳傷害および低酸素性／虚血性ＣＮＳ障害）に係わるＧＤＮＦタンパク質、カナバン病に係わるアスパルトアシラーゼタンパク質、レット症候群に係わるＭｅＣＰ２タンパク質、脊髄性筋萎縮症に係わるＳＭＮタンパク質、パーキンソン病に係わるＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼパーキン、ならびにリソソーム蓄積症および神経変性疾患に係わるＴＦＥＢに基づくものであった。本発明者らは、現在臨床的に試験されており、既知の補助機能を有するいくつかの治療用タンパク質を選択したが、このプラットフォームを様々なタンパク質に適合させることができる。
本技術の可能な用途としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
１．治療用タンパク質の送達による病態の処置。
２．脳機能の増加または神経再生の促進を目的とした、健常個体の脳へのタンパク質の供給。
３．タンパク質合成を補うための高度に特異的かつ効率的な標的タンパク質送達のための一般的な解決手段。
本発明をその特定の実施形態とともに記載したが、多数の代替法、改変および変法も当業者に明らかとなる。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入るすべてのこのような代替法、改変および変法も包含するものとする。
本明細書で述べた全ての刊行物、特許、および特許出願は、当該刊行物、特許、または特許出願について具体的かつ個別に記載した場合と同様に、参照によりそれらが完全に本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用または記載も、そのような参考文献が本願に対する従来技術として存在することの自認と解釈すべきではない。セクションの見出しの使用についても、それらを必ずしも限定として解釈すべきではない。
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配列番号６７： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号２０６： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号３００： Ｘａａはいかなる天然アミノ酸でもよい
配列番号４３９： Ｘａａはいかなる天然アミノ酸でもよい
配列番号１４６２： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号２１１２： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号２２９２： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号３００４： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号３２７０： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号３３２６： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号３５８６： ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号４０３１： ５ＲＴ７０構成的プロモーター
配列番号４０３２： ＤＨＦＲ構成的プロモーター
配列番号４０３３： ＭＩＣ２構成的プロモーター
配列番号４０３４： ＭＩＣ８構成的プロモーター
配列番号４０３５： ＳＡＧ１構成的プロモーター
配列番号４０３６： ＴｅｔＯ７ＳＡＧ１誘導性プロモーター
配列番号４０３７： ＴｅｔＯ７ＳＡＧ４誘導性プロモーター
配列番号４０３８： ＴＵＢ１構成的プロモーターであり、ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔである
配列番号４０３９： ＴＵＢ８構成的プロモーター
配列番号４４７２： ＧＲＡ１６をコードする核酸配列
配列番号４４７３： ＧＲＡ１６＿５’ＵＴＲの核酸配列
配列番号４４７４： ＨＡ ｔａｇをコードする核酸配列
配列番号４４７５： ＨＸＧＰＲＴをコードする核酸配列
配列番号４４７６： ＭｅＣＰ２をコードする核酸配列
配列番号４４７７： ＭＥＣＰ２＿ｃｏｄｏｎ＿ｏｐｔｉｍｉｚｅｄをコードする核酸配列
配列番号４４７８： ＰＡＲＫ２をコードする核酸配列
配列番号４４７９： ＳＭＮ１をコードする核酸配列
配列番号４４８０： ＴＡＴをコードする核酸配列
配列番号４４８１： トキソフィリンをコードする核酸配列
配列番号４４８２： Ｔｏｘｏｆｉｌｉｎ＿５’ＵＴＲの核酸配列
配列番号４４８３： ＡＳＰＡをコードする核酸配列
配列番号４４８４： ＤＨＦＲ－ＴＳ＿ｃＤＮＡをコードする核酸配列
配列番号４４８５： ＤＨＦＲ－ＴＳ＿ｇｅｎｏｍｉｃの核酸配列
配列番号４４８６： ＧＡＬＣをコードする核酸配列
配列番号４４８７： 変異ＧＡＬＣ－ＴＡＴをコードする核酸配列
配列番号４４８８： ＧＡＬＣ－ＴＡＴをコードする核酸配列
配列番号４４８９： ＧＤＮＦをコードする核酸配列
配列番号４４９０： Ｇｌｙ＿ｌｉｎｋｅｒの核酸配列
配列番号４４９１： ＧＲＡ２＿３’ＵＴＲの核酸配列
配列番号４４９２： ＤＨＦＲ－ＴＳ＿５’ＵＴＲの核酸配列
配列番号４４９３： ＤＨＦＲ－ＴＳ＿３’ＵＴＲの核酸配列
配列番号４４９４： ＴＡＬＥモノマーテンプレートｐＮＮの核酸配列
配列番号４４９５： ＴＡＬＥモノマーテンプレートｐＨＤの核酸配列
配列番号４４９６： ｐＴＡＬＥ－ＴＦ（ＮＩ）の核酸配列
配列番号４４９７： ｐＴＡＬＥ－ＴＦ（ＮＧ）の核酸配列
配列番号４４９８： ｐＴＡＬＥ－ＴＦ（ＮＮ）の核酸配列
配列番号４４９９： ｐＴＡＬＥ－ＴＦ（ＨＤ）の核酸配列
配列番号４５００： ｐＴＡＬＥＮ（ＮＩ）の核酸配列
配列番号４５０１： ｐＴＡＬＥＮ（ＮＧ）の核酸配列
配列番号４５０２： ｐＴＡＬＥＮ（ＮＮ）の核酸配列
配列番号４５０３： ｐＴＡＬＥＮ（ＨＤ）の核酸配列
配列番号４５０４： ＴＡＬＥ ＮＨモノマーの核酸配列
配列番号４５０５： 標的配列の核酸配列
配列番号４５０６： ＴＡＬＥ＿Ｎｕｃ＿ＴＡＣＧＴＡＣＧの核酸配列であり、
２～８０５番はｐＵＣ＿ｏｒｉ、
１４５４～２０５４番はＣＭＶ＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、
２１１３～２２３２番はＮＬＳ、
２２３３～２６４０番はＴＡＬ＿Ｎ－Ｔｅｒｍ、
２６４１～２７４２番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ １：ＮＩ”、
２７４３～２８４４番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ２：ＨＤ”、
２８４５～２９４６番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ３：ＮＮ”、
２９４７～３０４８番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ４：ＮＧ”、
３０４９～３１５０番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ５：ＮＩ”、
３１５１～３２５２番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ６：ＨＤ”、
３２５３～３３１２番はＨａｌｆ＿Ｒｅｐｅａｔ、
３３１３～３５０１番はＴＡＬ＿Ｃ－ｔｅｒｍ、
３５０２～４１０４番はＦｏｋ１、
４３４２～４６８５番はＳＶ４０＿ｏｒｉ、
４７３１～５７５６番はハイグロマイシン、
５８８４～６０１４番はＳＶ４０＿ｐＡ＿Ｓｉｇｎａｌ、
６０６９～６９１７番はアンピシリン（相補鎖）である
配列番号４５０７： ＴＡＬＥ＿ＴＦ＿ＴＡＣＧＴＡＣＧであり、
２～８０５番はｐＵＣ＿ｏｒｉ、
１４５４～２０５４番は：ＣＭＶ＿Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、
２１２０～２８３９番はＴＡＬ＿Ｎ－Ｔｅｒｍ、
２８４０～２９４１番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ １：ＮＩ”、
２９４２～３０４３番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ２：ＨＤ”、
３０４４～３１４５番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ３：ＮＮ”、
３１４６～３２４７番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ４：ＮＧ”、
３２４８～３３４９番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ５：ＮＩ”、
３３５０～３４５１番はＴａｎｄｅｍ＿Ｒｅｐｅａｔｓ “Ｒｅｐｅａｔ ６：ＨＤ”、
３４５２～３５１１番はＨａｌｆ＿Ｒｅｐｅａｔ、
３５１２～４０４５番はＴＡＬ＿Ｃ－ｔｅｒｍ、
４０４９～４０５１番はＮＬＳ＿（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡ）、
４０５２～４２２２番はＶＰ６４＿ＡＤ、
４２２９～４２９１番は２２Ａ、
４２９２～５００５番はＥＧＦＰ、
５６４１～６６６６番はハイグロマイシン、
６７９４～６９２４番はＳＶ４０＿ｐＡ＿Ｓｉｇｎａｌ、
６９７９～７８２７番はアンピシリン（相補鎖）である
配列番号４５０８： ＴＡＬＥモノマーテンプレートｐＮＩの核酸配列
配列番号４５０９： ＴＡＬＥモノマーテンプレートｐＮＧの核酸配列
配列番号４６０２： ＡＳＰＡコドン最適化済
配列番号４６０３： ヒトＧＡＬＣアイソフォーム１ コドン最適化済
配列番号４６０４： ヒトＴＦＥＢ（転写因子ＥＢ）アイソフォーム１ コドン最適化済
配列番号４６０５： ＤＨＦＲ（バージョン２）アミノ酸配列
配列番号４６０６： ＤＨＦＲ（バージョン２）核酸配列
配列番号４６０７： ｍＣｈｅｒｒｙ 哺乳類コドン最適化済
配列番号４６０８： ｍＣｈｅｒｒｙ 哺乳類コドン最適化済
配列番号４６０９： ３’ＵＴＲ ＤＨＦＲ（バージョン２）核酸配列

Claims (24)

  1. トキソプラズマ分泌ロプトリータンパク質をコードする第１の核酸配列が、薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物によって形質転換されたトキソプラズマであって、前記異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける前記異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結され、前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、潜伏期特異的プロモーター、およびトキソプラズマ内因性プロモーターからなる群より選択され、但し、前記プロモーターがトキソフィリンプロモーターではなく、前記トキソプラズマ分泌ロプトリータンパク質が宿主細胞中に分泌されるものであり、前記トキソプラズマが、前記薬学的ポリペプチドの中枢神経（ＣＮＳ）または筋肉組織への投与によって治療可能な病理の治療用である、トキソプラズマ。
  2. 前記薬学的ポリペプチドがアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）であり、前記病理がカナバン病である、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  3. 前記薬学的ポリペプチドがガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）であり、前記病理がクラッベ病である、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  4. 前記薬学的ポリペプチドが生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ１）であり、前記病理が脊髄性筋萎縮症である、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  5. 前記薬学的ポリペプチドがメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）であり、前記病理がレット症候群である、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  6. 前記薬学的ポリペプチドがグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）であり、前記病理がパーキンソン病、核上麻痺、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、網膜変性、外傷性脳傷害、低酸素性／虚血性ＣＮＳ障害、神経炎症性疾患、脳卒中および神経変性状態からなる群より選ばれるものである、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  7. 前記薬学的ポリペプチドがパーキン（ＰＡＲＫ２）であり、前記病理がパーキンソン病、外傷性脳傷害、低酸素性／虚血性ＣＮＳ障害、神経炎症性疾患、脳卒中および神経変性状態からなる群より選ばれるものである、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  8. 前記薬学的ポリペプチドが転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）であり、前記病理がリソソーム蓄積症または神経変性疾患である、請求項１に記載のトキソプラズマ。
  9. トキソプラズマ分泌ロプトリータンパク質をコードする第１の核酸配列が、転写調節およびゲノム編集用の薬学的ポリペプチドをコードする第２の核酸配列の上流にインフレームで融合された異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物によって形質転換されたトキソプラズマであって、前記異種ポリヌクレオチドが、トキソプラズマにおける前記異種ポリヌクレオチドの転写を指示するためのプロモーターに作動可能に連結され、前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、潜伏期特異的プロモーター、およびトキソプラズマ内因性プロモーターからなる群より選択され、但し、前記プロモーターがトキソフィリンプロモーターではなく、前記トキソプラズマ分泌ロプトリータンパク質が宿主細胞中に分泌されるものであり、前記トキソプラズマが、前記宿主細胞内の転写調節およびゲノム編集用である、トキソプラズマ。
  10. 前記薬学的ポリペプチドがゲノム編集用のＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）である、請求項９に記載のトキソプラズマ。
  11. 前記薬学的ポリペプチドが転写調節用のＴＡＬＥ－ＴＦ（ＴＡＬＥ転写因子）である、請求項９に記載のトキソプラズマ。
  12. 前記トキソプラズマが、感染した前記宿主細胞中で持続する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  13. 前記核酸構築物が、誘導的自己破壊エレメントをコードする第３の核酸配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  14. 前記核酸構築物が、Ｃｒｅ－リコンビナーゼコード配列を含まないことを条件とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  15. 前記誘導的自己破壊エレメントが、薬物に応答して活性となる、請求項１３に記載のトキソプラズマ。
  16. 前記核酸構築物が、前記トキソプラズマ分泌ロプトリータンパク質からの前記薬学的ポリペプチドの脱離を可能にする、少なくとも１個のインフレーム切断部位をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  17. 弱毒化されていない、請求項１～１５のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  18. 宿主細胞中での前記トキソプラズマの増殖を容易にするトキソプラズマエレメントを含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  19. 宿主細胞中での前記トキソプラズマの増殖を容易にするトキソプラズマエレメントを含まない、請求項９～１１のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  20. 宿主細胞中での前記トキソプラズマの増殖を容易にするトキソプラズマエレメントを含まない、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のトキソプラズマ。
  21. 前記中枢神経系（ＣＮＳ）または前記筋肉組織への前記薬学的ポリペプチドの送達にとって必要ではないビルレンス遺伝子を含まない、請求項１８に記載のトキソプラズマ。
  22. 転写調節およびゲノム編集用の前記薬学的ポリペプチドの送達にとって必要ではないビルレンス遺伝子を含まない、請求項１９に記載のトキソプラズマ。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のトキソプラズマと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  24. 請求項２３に記載の医薬組成物を含む第１の容器と、
    免疫抑制剤を含む第２の容器と
    を含むキット。
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