KR101753069B1 - 헤마글루티닌-뉴라미니다아제와 f 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 - Google Patents

헤마글루티닌-뉴라미니다아제와 f 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 중간엽줄기세포는 예를 들면 운동신경원 질환에서 나타나는 운동신경세포와의 융합을 통해 그 사멸을 억제할 수 있다. 따라서 운동신경원 세포의 사멸 억제를 통해 루게릭병과 같은 신경퇴행성질환의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

헤마글루티닌-뉴라미니다아제와 F 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 {Mesenchymal stem cells overexpressing hemagglutinin neuraminidase and fusion protein and its use}
본원은 헤마글루티닌 뉴라미니다아제와 F 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 운동신경원 질환 세포치료제로서의 그 용도와 관련된 것이다.
운동신경원 질환은 일단 손상되거나 사멸되고 나면 복구와 재생이 어려운 신경세포의 특성 때문에 중대한 후유증을 남기면서 정상 상태로 회복 못하고 악화일로로 진행하는 경우가 많다. 이러한 특성 때문에 대부분의 운동신경원 질환들이 현재까지의 치료기술로는 완치가 불가능하고 이로 인한 공동체의 사회경제적, 심리적 부담 비용이 만만치 않다.
대표적인 운동 신경원 질환인 신경퇴행성 질환은 병의 빠른 진행속도와 후유증의 중증도가 가장 심한 근위축성측삭경화증(ALS, 루게릭병), 케네디병(spinal bulbar muscular atrophy, 척수연수근위축) 등이 포함된다. 운동신경원 질환의 유병률은 알츠하이머나 파킨슨병에 비해 크지는 않으나, 유병률에 비하여 사회적 비용은 아주 높은 실정이다.
ALS와 관련한 치료제는 미국 FDA 승인을 받은 릴루졸(riluzole) 외에는 거의 전무한 실정이며 그나마 약 3개월간의 생존연장효과 밖에 없어 치료기술의 개발이 시급하며 절실하다. 또한 케네디병의 경우 치료제가 없는 실정으로 줄기세포치료를 포함한 새로운 치료방법이 절실히 요구되는 질환이라 할 수 있다. 난치성 신경퇴행질환에서 사용되는 대부분의 약물은 증상을 개선하고 예방하는데 어느정도 도움이 될 수 있지만, 아직까지 신경세포사멸 억제를 근본적으로 막지는 못한다.
최근 논문에 따르면 퍼킨지 세포 퇴행(Purkinje cell degeneration) 질환을 가진 생쥐모델에 골수세포를 이식하였더니 골수세포와 융합한 퍼킨지 뉴런(Purkinge neuron)을 관찰할 수 있었고 사멸중인 퍼킨지 뉴런들과 달리 골수세포와 융합된 세포들은 생존해 있음을 확인할 수 있었다 (Diaz et al., Cell Transplant. 2012;21(7):1595-602.). 또 다른 연구에서는 사멸중인 심근세포와 골수유래 줄기세포의 세포융합은 심근세포 사멸을 억제한다는 결과를 보고하였다 (Yang et al, J Cell Mol Med. 2012 Dec;16(12):3085-95).
현재 여러 치료제가 개발중에 있고 특히 최근에는 세포치료에 관심을 두고 있다. 하지만 기존의 세포치료기술은 건강한 세포(또는 줄기세포)를 질병부위에 삽입해 사멸된 세포를 대신하거나 사멸 중인 세포의 주변 환경을 개선시켜 재생시키는 것을 목표로 하나, 이러한 시도는 많은 전임상 또는 임상시험에서 효과가 없거나 효과가 미미한 정도이며, 신경세포는 다른 기관과 다르게 신경회로를 형성하는 것이 기능에 매우 중요하기에 외부에서 공급된 세포가 신경세포로 분화되어 기존 신경회로를 그대로 복원시킬 것을 기대하는 것은 매우 어려운 현실이다.
따라서 기존의 방법 이외에 새로운 신경세포 사멸 억제를 통한 세포 치료 방법 개발이 절실하다.
본원은 운동신경세포의 사멸을 억제하여 운동신경세포 본래의 기능을 유지할 수 있도록 하는 세포융합 능력이 향상된 줄기세포 및 이를 이용한 치료제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포를 제공한다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 다양한 유래일 수 있으나, 특히 지방조직, 포유류 특히 인간 지방조직 유래일 수 있다.
본원에 따른 중간엽줄기세포의 과발현에 사용되는 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 및 F 단백질은 산다이바이러스, 인간면역결핍바이러스 1 (Env) 유래, 인플루엔자 바이러스 또는 베시큘라 스토마티티스 바이러스 (VSV-G) 유래일 수 있다. 이들 단백질과 동일 또는 유사한 기전을 통해 세포의 융합을 촉진시키고 사멸을 억제할 수 있다 (Eckert DM, Kim PS. Annu Rev Biochem. 2001;70:777-810.; Sapir A, Avinoam O, Podbilewicz B, Chernomordik LV. Dev Cell. 2008 Jan;14(1):11-21.; Kouris NA, Schaefer JA, Hatta M, Freeman BT, Kamp TJ, Kawaoka Y, Ogle BM. Stem Cells Int. 2012;2012:414038).
본원에 따른 중간엽줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래일 수 있으며, 일 구현예에서, 자가 유래의 것이 사용된다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 중간엽줄기세포를 포함하는 운동신경원 질환 치료 또는 예방용 세포 치료제 또는 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물은 정맥 주사 또는 척수내 주사를 통해, 운동신경세포의 사멸로 인한 운동신경원 질환 예를 들면 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 근위축성 측삭경화증(amytrophic lateral sclerosis), 진행성 구음장애(progressive bulbar palsy), 또는 원발성 측삭경화증(primary lateral sclerosis)과 같은 운동신경세포의 보존이 치료 또는 예방에 필수적인 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 HN과 F 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포는 운동신경세포와의 세포융합능력이 향상되고 그 결과 사멸중인 운동신경세포의 사멸을 억제할 수 있어, 신경퇴행성 질환과 같은 운동신경원 질환에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 hATMSCs와 세포융합에 의한 사멸중인 NSC34 운동신경세포주의 세포사멸 억제효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 hATMSCs와 세포융합이 일어난 NSC34 cell group에서 Bax 및 Bcl-xL의 발현분석을 한 것이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 HN 및 F가 삽입된 발현벡터를 제작하기 위한 도식도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 HN/F-hATMSCs에서 HN 및 F mRNA 발현을 분석한 것이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 HN/F-hATMSCs에서 HN 및 F 단백질 발현의 이미징 분석이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 HN/F-hATMSCs의 면역표현형(immunophenotyping)을 분석한 것이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 HN/F-hATMSCs에서 NSC34 운동신경세포주와의 세포융합 능력을 분석한 것이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주가 융합된 세포에서 ChAT 및 CD105 발현을 분석한 것이다.
본 발명은 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질 유전자를 중간엽줄기세포가 향상된 운동신경세포와의 세포융합을 통해 운동신경세포의 사멸을 억제할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)”는 이미 성인이 된 몸의 각 부위에서 얻어지는 성체줄기세포이며 제대혈, 지방, 골수(bone marrow), 혈액, 진피 또는 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포 및 운동신경세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 또한, 중간엽줄기세포는 면역억제제의 사용 없이도 동종 또는 이종 수혜자에서 효과적으로 생착될 수 있는 특징이 있다. 상기 중간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래의 줄기세포이다. 지방조직 유래의 중간엽줄기세포는 골수, 양수, 제대혈 줄기 세포와 달리 다량을 제공받을 수 있는 실용적인 장점을 가지고 있고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기 세포로 추정되고 있으며, 최근 선진국에서 광범위하게 이루어지고 있는 성형수술이 지방흡입술(liposuction)임을 고려하다면 지방유래 줄기세포는 무한적인 공급성으로 인해 유용성이 특이 높다.
일 구현예에서 중간엽줄기세포를 얻는 과정을 설명하면 다음과 같다: 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포 소스, 예컨대 지방조직, 혈액 또는 골수로부터 중간엽줄기세포를 분리한다. 이어 상기 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 중간엽줄기세포를 수득한다.
또한 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하는 중간엽줄기세포는 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는 혈청(예컨대 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어 RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
중간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 중간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 중간엽줄기세포는 마커로서 CD29, CD44 및 CD90와 음성 표지마커인 CD34, CD45 및 HLA-DR의 표현형을 가진다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질을 과발현한다. 상기 단백질의 과발현에 의해 운동신경세포와의 융합능이 향상되었다.
본원에 따른 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN)는 바이러스에서 발현되는 당 단백질로, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제의 활성을 모두 갖고 있는 단일 바이러스 단백질로, 또는 각각이 별개의 단백질로 존재하며, 본원에 따른 효과를 달성하는 한 모두 본원에 포함될 수 있다. 전자의 예로는 볼거리 바이러스, 산다이바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 또는 조류 뉴캐슬병 바이러스 등과 같은 파라믹소바이러스 바이러스 유래의 것을 들 수 있으며, 후자의 예로는 인플루엔자 바이러스 유래의 것을 들 수 있다. 이러한 단백질 및 핵산 서열은 공지되어 있으며 예를 들면 헤마글루티닌-뉴라미니다아제는 Enzyme entry (http://enzyme.expasy.org) EC:3.2.1.18의 정보를 참조할 수 있으며, 단백질 서열은 예를 들면 산다이바이러스 유래의 것으로 GenBank accession no. AAB06288.1로 공개되어 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 본원에 따른 실시예 1의 방법에 따라 제조될 수 있는 산다이바러이스 유래 HN 단일단백질이 사용된다.
융합 단백질 (Fusion protein, F protein)은 세포간 융합 또는 바이러스의 세포에의 융합/엔트리, 엔도사이토시스, 멤브레인 트래피킹에 사용되는 당 단백질을 일컫는 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 바이러스 유래의 F 단백질이 사용되며, 이는 구조적 특징에 따라 클래스 I, II 및 III로 나뉜다. 클래스 I의 예로는 에볼라 바이러스의 GP2, MoMuLv (Moloney murine leukemia virus의 Mo-55, 면역결핍바이러스 HIV의 gp41, Simian Virus (SIV) gp41 등을 포함한다. 클래스 II의 예로는 SFV E1, TBEV E 등을 포함한다. 클래스 III의 예로는 HSV (Herpes Simplex virus)의 gB (glycoprotein B), EBV (Epstei-Barr virus) 의 gB, VSV (Vesicular Stomatitis virus)의 단백질 G 및 베큘로바이러스의 당단백질인 gp64 등을 포함한다. 이러한 융합 당 단백질 및 핵산 서열은 공개되어 있으며, 예를 들면 GenBank Accession no. AAC82300.1로 공개되어 있다.
본원 발명의 목적 달성을 위해, 본원 발명의 효과를 달성하는 한, 다양한 유래 및/또는 전장 및/또는 단편의 다양한 형태의 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질 유전자가 중간엽줄기세포에 도입되어 이의 발현에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 단백질을 코딩하는 야생형 유전자 서열 및 그 단편은 물론 세포내에서의 발현 또는 단백질의 안정성 등과 같은 특징이 유리하도록 염기서열의 일부가 인위적으로 변형된 유전자, 및 자연적으로 발견되는 염기서열 일부가 변형된 유전자 또는 이들의 모두의 단편을 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축중변이가 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 상기 유전자에 포함된다.
인위적 유전자 염기서열의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법 (site-directed mutagenesis, Kramer et al, 1987), 에러유발 PCR (Cadwell, R.C. and G.F. Joyce. 1992. PCR methods Appl., 2:28-33.), 점돌연변이법 (Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) 등에 의해 제조될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 상술한 유전자는 약학조성물이 투여되는 대상체의 세포내에서 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질은 일구현예서 바이헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) / F(fusion) 단백질은 그 전장 또는 본원의 효과를 달성하는 한 그 단편이 또한 사용될 수 있으며, 전장 서열의 예는 앞서 언급한 바와 같다.
헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) / F(fusion) 단백질 유전자는 상기 공지된 서열로부터 이를 특이적으로 인식할 수 있는 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄증폭반응 (Polymerase Chain Reaction)을 통해 상기 유전자를 증폭하고 이를 상술한 바와 같은 진핵발현 벡터에 도입한 후 이를 후술하는 바와 같이 본원에 따른 중간엽줄기세포에 전달이입하여 사용할 수 있다. 세포에서 단백질을 과발현하는 방법은 공지되어 있다. 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) / F(fusion) 단백질 유전자를 적절한 진핵세포 발현벡터 예를 들면 파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스 유래의 벡터 또는 플라즈미드에 발현 프로모터에 작동가능하도록 연결되도록 클로닝 하여, 발현 벡터를 구축한 후, 이를 본원에 따른 세포에 도입할 수 있다. 도입 방법은 공지되어 있으며 예를 들면 리포좀 매개 전달이입, 칼슘포스페이트법, DEAE-덱스트란 매개 전달이입, 양하전 지질 매개 전달이입법, 전기천공, 파아지 시스템을 이용한 트랜스덕션 또는 바이러스를 이용한 감염 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
이런 측면에서 본원은 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) / F(fusion) 단백질 유전자를 과발현하는 중간엽줄기세포를 포함하는 신경퇴행성질환 치료용 약학 조성물 또는 세포치료제에 관한 것이다.
본원에서 “세포치료제” 또는 “세포 치료용 조성물”이란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하는 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품을 말하는 것으로, 인간의 세포 혹은 다른 종의 세포를 화학 물질 의약품처럼 치료제로서 사용하는 것으로 결합이 있는 세포를 치환(replace)하거나 재생(repair)시켜준다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다.
본 발명의 세포 치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.
본원의 세포 치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는 자가(autologous) 또는 타가 또는 동종이계(allogenic) 또는 이종(Xenogenic) 일 수 있다. 가장 바람직하게는 자가유래의 것으로 수용자로부터 유래한 것이기 때문에 약제학적 조성물의 투여 시 면역 반응의 문제가 없고 안전하다는 이점이 있다.
일 구현예에서 본원의 약학적 조성물 또는 세포치료제에 포함되는 중간엽줄기세포는, 동물의 중간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 중간엽줄기세포는 지방조직, 골수, 지방조직, 말초혈액, 간 유래 일 수 있으나, 특히 지방조직 유래이다.
본원에서 사용된 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 본 용어가 적용되는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.
다른 구현예에서, 본원의 세포치료제에 포함될 수 있는 세포는 중간엽줄기세포로부터 유래된, 운동신경세포와 융합될 수 있는 중간엽줄기세포로부터 유래된 전구세포; 또는 상기 중간엽줄기세포와 융합된 운동신경세포를 포함한다.
본원에 따른 중간엽줄기세포는 운동신경세포와의 세포융합을 통해 운동신경세포의 사멸을 억제 및 보호하는 기전으로 대부분의 운동신경원 질환의 증상을 완화 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “운동신경원 질환”이란, 척수, 뇌간, 대뇌의 피질에 위치한 운동신경세포의 사멸로 인한 운동신경원의 퇴행성 변화(neuronal degeneration)에 의해 초래되는 질환으로 신경퇴행성 질환으로도 불리며, 주요 침범양상에 따라 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 근위축성 측삭경화증(amytrophic lateral sclerosis), 진행성 구음장애(progressive bulbar palsy), 원발성 측삭경화증(primary lateral sclerosis)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 세포 치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 정맥 투여 또는 본 발명에 따른 세포 또는 조성물의 투여가 필요한 장기에 직접 주사되는 방식으로 투여될 수 있다.
본원에 따른 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 세포치료제는 정맥 투여 또는 척수내 투여된다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분인 줄기세포와 융합된 운동신경세포를 기준으로 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
세포배양
K-STMECELL IRB(Institutional review board)의 동의 및 양해하에 얻은 사람 지방유래 중간엽줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, hATMSCs)는 항생제가 첨가된 RKCM 배양배지(10% FBS 첨가, K-STEMCELL에서 제공)에 배양되었다. 생쥐 운동신경세포주 (NSC34 Motor Neuron-Like Hybrid Cell line, CEDARLANE, USA)는 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium ) 배양배지(10% FBS 첨가)에 배양되었으며 두 세포 모두 5% CO2 공급하에 37℃ 조건하에서 배양되었다.
실시예 1. 사멸중인 운동신경세포주와 지방유래 중간엽줄기세포의 세포융합에 의한 운동신경세포주 세포사멸 억제효과 분석
세포 트랙커(tracker) CM-DiI으로 표지한 운동신경세포주 NSC34 세포에 세포사멸 유도인자인 탭시가긴(thapsigargin) 2.5 μM을 처리 후 24시간 배양하였다. 아넥신(Annexin) V 염색 후 아넥신 V 항체를 이용하여 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 아넥신 V-positive NSC34 세포를 분리하였다. 녹색 염료로 표지한 hATMSCs와 아넥신 V-positive NSC34 세포를 Sandai virus (HVJ) Envelope Cell fusion Kit (GenomONETM-CF EX Sendai virus (HVJ) Envelope Cell Fusion Kit, COSMO BIO, Japan)을 제조자의 방법대로 이용하여 세포융합을 실시한 후 유세포 분석기를 통해 V-positve 세포를 분석하였다. 도 1에서와 같이 hATMSCs와 세포융합이 일어나지 않은 NSC34 세포 그룹에서는 99.5%의 아넥신 V-positive 세포를 확인하였고, hATMSCs와 세포융합이 일어난 NSC34 세포 그룹에서는 32.9%의 아넥신 V-positive 세포를 확인하였다. 이러한 결과는 hATMSCs와의 세포융합에 의해 NSC34 운동신경세포주 사멸을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.
또한 사멸억제 효과를 분자수준에서 확인하였다. 요약하면, hATMSCs와 세포융합이 일어난 NSC34 세포 그룹을 유세포 분석기를 통해 분리한 후 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)을 통해 pro-apoptotic 유전자인 Bax와 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-xL의 발현을 분석하였다. 도 2에서와 같이 hATMSCs와 세포융합이 일어나지 않은 NSC34 세포 그룹에 비해 hATMSCs와 세포융합이 일어난 NSC34 세포 그룹에서 Bax mRNA의 발현이 현저하게 감소하였고, Bcl-xL mRNA의 발현은 현저하게 증가하였다.
이러한 결과는 사멸중인 NSC34 운동신경세포주가 hATMSCs와 세포융합을 하였을 때 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현 감소 및 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-xL의 발현 증가를 통해 세포사멸이 억제되는 것을 의미한다.
실시예 2. 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) / F(fusion) 단백질을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(HN/F-hATMSCs) 제작
센다이 바이러스 게놈을 주형으로 표 1과 같은 프라이머를 이용하여 헤마글루티닌 뉴라미니다아제 (HN)와 F 단백질 유전자 (F) 유전자를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA는 pcDNA3.1 발현벡터에 각각 삽입시켜 E. coli strain DH5α에 클로닝하였으며, 서열을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음). 클로닝된 HN 및 F 단백질은 각각 공개된 서열 GenBnak Accesssion No.AAB06288.1 및 AAC82300.1과 동일하다.
[표 1] 본 발명에 사용된 HN 및 F 유전자의 클로닝에 사용된 프라이머 서열
Figure 112015069354018-pat00001
클로닝 후 획득된 클론(clone)은 LB 액체배지에서 24시간 증폭, 배양하여, 플라즈미드 추출 키트 (Midiprep kit) (Invitrogen, USA)를 이용하여 플라스미드(plasmid)를 추출한 다음 리포좀 (liposome) (lipofectamine 3000, Invitrogen)을 제조사의 방법대로 이용하여 hATMSCs에 형질도입시켜 HN/F 유전자가 도입된 hATMSCs(HN/F-hATMSCs)를 획득하였다. 형질도입된 세포주로부터 총 RNA를 추출하여 RT-PCR 및 실시간 정량 RT-PCR을 통해 HN 및 F 유전자의 발현을 분석하였다. 대조군으로 hATMSCs를 이용하였다. 부분 (partial) HN 및 F 프라이머는 RT-PCR 및 실시간 정량 PCR을 이용한 HN 또는 F mRNA에 대한 발현 확인용으로 사용하였다.
발현분석 결과 도 4에서와 같이 HN 및 F 유전자의 과발현을 확인하였다. 이러한 결과는 리포좀을 이용한 형질주입(liposomal transfection)을 통하여 성공적으로 HN 및 F 유전자를 동시에 과발현시켰음을 의미한다.
또한 표 1에 제시된 바와 같이 HN 유전자 증폭을 위한 정방향 프라이머에 myc 단백질을 코딩하는 염기서열을 부착하였고 F 유전자 증폭을 위한 정방향 프라이머에 히스티딘을 코딩하는 염기서열을 부착하였기 때문에 myc 단백질과 히스티딘에 대한 항체 (Santcruz Biotechnology, USA)를 이용하여 HN/F-hATMSCs에서 공초점레이저 현미경(Nicon, Japan)을 통해 HN과 F 단백질의 발현을 분석하였다.
이미지 분석결과, 도 5에서와 같이 HN/F-hATMSCs의 세포표면에 HN과 F단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 HN과 F 단백질을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포가 성공적으로 제작되었음을 의미한다.
실시예 3. HN/F-hATMSCs의 줄기세포 마커에 대한 발현 평가
지방유래 중간엽줄기세포의 양성 표지마커 CD29, CD44 및 CD90와 음성 표지마커인 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대한 항체(Santcruz Biotechnology, USA)를 이용하여 유세포 분석기를 통해 HN/F-hATMSCs에서 지방유래 중간엽줄기세포 표지마커들에 대한 발현을 분석하였다. 대조군으로 hATMSCs를 이용하였다. 발현분석 결과, 도 6에서와 같이 대조군과 비교해서 양성 표지마커인 CD29, CD44 및 CD90와 음성 표지마커인 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대한 발현차이가 없음을 확인하였다. 이러한 면역표현형분석법(Immunophenotyping)을 실시한 결과는 HN과 F 유전가 도입된 hATMSCs가 줄기세포로의 특성을 유지하고 있음을 의미하는 것이다.
실시예 4. HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주의 세포융합 능력에 대한 평가
실시예 2에서와 같이 제조된 HN/F-hATMSCs의 세포융합 능력을 평가하기 위해서 녹색 염료로 표지한 HN/F-hATMSCs와 세포 트랙커 CM-DiI으로 표지한 NSC34 운동신경세포주와 융합분석법(fusion assay)을 실시하였다. 두 종류의 세포를 세포수 1:1의 비로 1.5 ml 시험관에 혼합하고 5분간 4℃ 조건하에서 반응시킨 후 37℃ 세포배양기에 15분간 반응시켰다. 항생제가 첨가된 DMEM 배양배지(10% FBS 첨가)가 들어있는 6 웰 플레이트에 옮긴 후 5% CO2 공급하에 37℃ 조건하에서 16시간 배양하였다. 세포를 회수하여 유세포 분석기를 통해 HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주의 세포융합율을 분석하였다. 대조군으로는 hATMSCs를 이용하였다. 분석결과, 도 7에서와 같이 대조군에 비해 HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주의 세포융합율이 3.5배 이상 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 HN/F-hATMSCs가 NSC34 운동신경세포주에 대한 세포융합율이 증진되었음을 의미한다.
또한 도 7에 제시된 바가 같이 공초점레이저 현미경을 통한 이미지 분석을 통해 녹색 형광을 나타내는 HN/F-hATMSCs와 적색 형광을 띠는 NSC34 운동신경세포주가 융합된 세포의 이미지를 확인할 수 있었다.
실시예 5. HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주가 융합된 세포에서 hATMSCs의 표지마커 및 운동신경세포 표지마커의 발현 분석
실시예 4의 융합세포에 대하여 운동신경세포 표지마커인 콜린 아세틸트랜스퍼라아제(choline acetyltransferase, ChAT)와 지방유래 중간엽줄기세포 표지마커인 CD105에 대한 항체 (Santcruz Biotechnology, USA)를 이용하여 공초점레이저 현미경을 통해 지방유래 중간엽줄기세포 표지마커인 ChAT와 CD105의 발현을 분석하였다. 분석 결과, 도 8에서와 같이 HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주가 융합된 세포에서 운동신경세포 표지마커인 ChAT 지방유래 중간엽줄기세포 표지마커인 CD105의 발현을 확인하였다.
이러한 결과는 HN/F-hATMSCs와 NSC34 운동신경세포주가 융합되었음을 확인시켜주며, 융합된 세포는 지방유래 중간엽줄기세포와 운동신경세포주에서 발현되는 표지마커 단백질을 모두 발현하고 있다는 것을 의미한다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (7)

  1. 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin neuraminidase, HN) 및 F(fusion) 단백질을 과발현하는, 지방조직 유래의 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem cell)을 포함하는 운동신경원 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 및 F 단백질은 산다이바이러스, 인간면역결핍바이러스 1, 인플루엔자 바이러스 또는 베시큘라 스토마티티스 바이러스 유래인, 운동신경원 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포는 자가, 타가 또는 이종유래인, 운동신경원 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥 주사 또는 척수내 주사되는 되는 것인, 운동신경원 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 운동신경원 질환은 운동신경세포의 사멸로 인한 것으로 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 근위축성 측삭경화증(amytrophic lateral sclerosis), 진행성 구음장애(progressive bulbar palsy), 또는 원발성 측삭경화증(primary lateral sclerosis)를 포함하는 것인, 운동신경원 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
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