JP6944692B2 - ボルナウイルスベクター及びその利用 - Google Patents
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Description
項1. ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とするウイルスベクター。
項2. (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とする、項1に記載のウイルスベクター。
項3. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項4. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項5. (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする項2〜4のいずれかに記載のウイルスベクター。
項6. (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする項2〜5のいずれかに記載のウイルスベクター。
項7. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号9に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする項2〜6のいずれかに記載のウイルスベクター。
項9. 項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項10. 項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項11. ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項9又は10に記載の組換えウイルスの作製方法。
項13. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項14. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項15. 項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
本発明の好適なウイルスベクターは、(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているものであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊される一方で、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列が挿入されるものであることに一つの特徴を有する。かかるウイルスベクターのことを、態様Aのウイルスベクターと記載する。
以下、上記(a)の組換えウイルスRNAのcDNAを、単に「(a)組換えBDVゲノムのcDNA」ともいう。態様Aのウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記(a)、(b)及び(c)以外の配列を含んでもよい。
態様Aにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、ボルナ病ウイルスゲノム(BDVゲノム)における少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子が、該BDVゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、該BDVゲノムにおけるG遺伝子が破壊された配列において、外来性遺伝子と前記G遺伝子とは異なる遺伝子型を有する鳥ボルナウイルスゲノム(ABVゲノム)のG遺伝子(以降、G’遺伝子と記載することもある)が挿入された配列を有する。
ここで、遺伝子が破壊されたとは、通常、該遺伝子が蛋白質(例えばG遺伝子であればG蛋白質)をコードすることができる形態では存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。
He80;GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
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huP2br;GenBank Accession# AB258389, Nakamura,Y., Takahashi,H., Shoya,Y., Nakaya,T., Watanabe,M., Tomonaga,K., Iwahashi,K., Ameno,K., Momiyama,N., Taniyama,H., Sata,T., Kurata,T., de la Torre,J.C., Ikuta,K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
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Bo/04w;GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
リボザイムとしては、(a)組換えウイルスのcDNAから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。(b)としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするcDNA等のDNAが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするcDNA等のDNAも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、1〜数個(数個とは、例えば、10個、好ましくは5個、より好ましくは3個、更に好ましくは2個である)の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)が好ましい。また、(a)組換えBDVゲノムのcDNAの上流、すなわち3’末端側に(b1)HamRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)が配置され、かつ、該(a)の下流、すなわち5’末端側に(b2)HDVRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)配列が配置されていることがより好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
HDVRzの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A. Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)等に記載されている。
本発明においては、これらの文献に記載されているHamRzの塩基配列をコードするcDNA及びHDVRzの塩基配列をコードするcDNAを用いることができる。本発明における好ましいHamRzの塩基配列及びHDVRzの塩基配列を以下に示す。
HamRz:
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’
(配列番号2)
HDVRz:
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
(配列番号3)
本発明における(c)プロモーター配列としては、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列、RNAポリメラーゼI系のプロモーター配列、T7ポリメラーゼ系のプロモーター配列が挙げられる。中でもRNAポリメラーゼII系のプロモーター配列が好ましい。RNAポリメラーゼII系のプロモーターとしては、CMVプロモーター、CAGGSプロモーターが挙げられる。中でも、CAGGSプロモーターが好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
本発明のウイルスベクターは、態様Aの場合も含めて、前記(a)、(b)及び(c)以外に、その他の塩基配列として、SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがSV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含む場合には、該配列は(a)及び(b)の下流に配置されていることが好ましい。SV40ウイルスDNAの複製開始点/プロモーター領域配列の一部としては、SV40複製開始点/プロモーター領域内の5’側の113塩基からなる断片が好適である。
SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列(配列番号4)は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。具体的には、例えば、態様Aのウイルスベクターの場合、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、CAT遺伝子をBDVのゲノム配列に置き換え、さらにP遺伝子の下流に連結する非翻訳領域(P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)内に目的とする外来性遺伝子を挿入して得られたウイルスベクターを鋳型にして、PCR等によりG遺伝子に欠損変異等を挿入することで、G遺伝子が欠損したウイルスベクター(G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)を作製する。ついで、得られたG遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの所望の領域に、ABVゲノムのG遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型(持続感染型)のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターとしては、例えば、ABVゲノムのG遺伝子を外来性遺伝子の上流に挿入した場合、(a)組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に、ABVゲノムのG遺伝子と外来性遺伝子をこの順に挿入した組換えBDVゲノムのcDNA(例えば、図3(a)に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのcDNA)を有するものである。なお、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの作製において、好ましくは、L遺伝子のイントロン部分も同様にPCRにより削りとることができる。また、M遺伝子についても、同様に、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを鋳型にPCR等により欠損させて作製することができる(G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)。
上記ウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスも、本発明の1つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びに態様Aのウイルスベクターを用いた場合はBDVのN蛋白質、BDVのP蛋白質、BDVのL蛋白質及びABVのG蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えBDVゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりBDVのM蛋白質を有していてもよい。
(1)BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(2)BDVゲノムのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(3)BDVゲノムのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド
(4)BDVゲノムのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
生体細胞(動物個体中の細胞)に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の1つである。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では1回につき通常約5μL〜1mL、脳内接種では1回につき通常約1〜50μL接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、1回につき通常約5〜200μL、好ましくは約10〜100μL接種する。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約1×10-1〜1×109FFUとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば1回につき通常約5〜500μL、好ましくは約20〜200μL接種する。
(1)上記ウイルスベクター、(3)上記組換えウイルス又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の1つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞(動物)に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質(例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等)の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び/又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
1.プラスミドpCAG−Fctの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドpCAG−HR−SV3を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのHe/80株のゲノムの配列(配列番号1)に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
P遺伝子とM遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドpCAG−Fct−P/Mを作製した。
A)上記1で作製したpCAG−Fct(ボルナウイルスのHe80株のcDNA(配列番号1)がクローニングされているプラスミド)を鋳型に、EcoT22IからBst1107Iサイトまでの領域をプライマー1及び4、並びにプライマー2及び3を用いてそれぞれPCRで増幅した。その後、両方のPCR産物を0.5μLずつ混合し、プライマー1及び2にて再度増幅し、P−M遺伝子間にBstBIサイト及びPacIサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
B)A)のPCR産物をEcoT22I及びBst1107Iを用いてpCAG−Fctへと組込み、pCAG−Fct−P/Mを完成させた。
C)BstBIとPacIを用いてGFPを挿入し、プラスミドpCAG−Fct−P/M−GFPを完成させた。
(プライマー)
プライマー1:5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3(配列番号5)
プライマー2:5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3(配列番号6)
プライマー3:5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3(配列番号7)
プライマー4:5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3(配列番号8)
上記で作製したpCAG−Fct−P/M−GFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるG遺伝子をPCRを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、G遺伝子に存在する2つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号(すなわち配列番号1の塩基)2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図6に、G遺伝子欠損型BDVウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表1に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1分を25サイクル)を行った(図6(a))。
上記で作製したp/mGFP ΔG LLを元に、P遺伝子とGFP遺伝子の間に、S3とT2の配列と、外来遺伝子挿入カセットとしてSse8387IとAscI、AsiSI、SwaIサイトを挿入したp/m tandem GFP ΔG LLを作製した。
S3:5-TAAAAAAATCGAATCA-3(配列番号16)
T2:5-TAAAAAAA-3(配列番号17)
プライマー5:5’-AAAGGCGCGCCATGCTGCATTCAACGTATTCTCGTT-3’(配列番号18)
プライマー6:5’-AAAGCGATCGCTTATTCCGACCACCTTCCGAG-3’ (配列番号19)
ヘルパープラスミド、すなわちBDVゲノムのN遺伝子発現プラスミド(pcN)、BDVゲノムのP遺伝子発現プラスミド(pCXN2−P)及びBDVゲノムのL遺伝子発現プラスミド(pcL)を以下の手順で作製した。
pcNは、pHA−p40Nプラスミド(Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001))からN遺伝子領域をPCRで増幅し、pBS−CAG(上述)へと挿入することで作製した。
pCXN2−Pは、pcD−P(Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003))からゲル抽出した断片をpCXN2(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199)のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
pcLについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、DNAシークエンスによって確認した。
p/m PaBV4G GFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2−P及びpcL)を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)又はLipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×104〜1×106の細胞(293T細胞)に対して、p/m PaBV4G GFP ΔG LLを1〜4μg使用し、pcN(0.125〜0.5μg)、pCXN2−P(0.0125〜0.05μg)、pcL(0.125〜0.5μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。
シュードタイプウイルスの回収
上記で作製したp/mGFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2−P及びpcL)を用いて、実施例1を参照にしてG遺伝子欠損組換えBDV細胞を取得した。得られた細胞を10cmシャーレに播種し(3.0×106cells)、10 μgのG蛋白質発現プラスミドをTransIT(登録商標)-293 (TaKaRa)を用いて導入した。G蛋白質発現プラスミドには、Variegated squirrel bornavirus(VSBV)、Parrot bornavirus 4(PaBV-4)、Parrot bornavirus 5(PaBV-5)、Munia bornavirus 1(MuBV-1)のG蛋白質を用いた。プラスミドを導入した細胞を、37℃でウシ胎児血清(FCS)を10%含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。48時間後に細胞をDMEMで2回洗浄した後、1.2 mLのDMEMを加え、シャーレを−80℃に一時間静置した。−80℃と室温での凍結融解を2度おこない、シャーレ中の培養液を回収した。回収した培養液を3,000 rpm、4℃で5分間遠心し、上清をシュードタイプウイルス溶液として用いた。
Claims (15)
- ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とするウイルスベクター。
- (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とする、請求項1記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである請求項2に記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである請求項2に記載のウイルスベクター。
- (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項2〜4のいずれかに記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする請求項2〜5のいずれかに記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号9に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする請求項2〜6のいずれかに記載のウイルスベクター。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする組換えウイルス。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
- ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項9又は10に記載の組換えウイルスの作製方法。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9〜11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
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