JP7300764B2 - 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 - Google Patents
細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7300764B2 JP7300764B2 JP2021521927A JP2021521927A JP7300764B2 JP 7300764 B2 JP7300764 B2 JP 7300764B2 JP 2021521927 A JP2021521927 A JP 2021521927A JP 2021521927 A JP2021521927 A JP 2021521927A JP 7300764 B2 JP7300764 B2 JP 7300764B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- muscle
- cells
- cell
- disease
- muscular dystrophy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 106
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 title description 81
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title description 7
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 title description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 318
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 claims description 225
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 77
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 76
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 71
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 61
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 50
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 claims description 46
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 claims description 44
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 claims description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 44
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 claims description 43
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 31
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 28
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 27
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 13
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 11
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 201000009342 Limb-girdle muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 5
- 102100034239 Emerin Human genes 0.000 claims description 4
- 201000009344 Emery-Dreifuss muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037149 Facioscapulohumeral dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 claims description 4
- 102100022745 Laminin subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009110 Oculopharyngeal muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 4
- 201000011212 X-linked dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006815 congenital muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009338 distal myopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000008570 facioscapulohumeral muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 2
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N (nz)-n-[(3-nitrophenyl)methylidene]hydroxylamine Chemical compound O\N=C/C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N 0.000 description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 29
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 26
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 26
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 24
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 23
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 23
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 21
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 21
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 18
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 15
- 101150077768 ddb1 gene Proteins 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 15
- 101100170004 Dictyostelium discoideum repE gene Proteins 0.000 description 14
- 101100170005 Drosophila melanogaster pic gene Proteins 0.000 description 14
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 101710150875 TAR DNA-binding protein 43 Proteins 0.000 description 14
- 102100040347 TAR DNA-binding protein 43 Human genes 0.000 description 14
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 14
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 12
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 102000012698 DDB1 Human genes 0.000 description 10
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 10
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 9
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 9
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 description 7
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 7
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 7
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 description 7
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 6
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 6
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 108010058699 Choline O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 102100023460 Choline O-acetyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 4
- 201000008163 Dentatorubral pallidoluysian atrophy Diseases 0.000 description 4
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 4
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 4
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 4
- 101100170007 Mus musculus Ddb1 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 4
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 230000004693 neuron damage Effects 0.000 description 4
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 3
- 208000029402 Bulbospinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 3
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 3
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 3
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 2
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 description 2
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 208000006096 Attention Deficit Disorder with Hyperactivity Diseases 0.000 description 2
- 201000005943 Barth syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 2
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 101001053946 Homo sapiens Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101000578287 Homo sapiens Non-POU domain-containing octamer-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 2
- 208000026680 Metabolic Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 101710150912 Myc protein Proteins 0.000 description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000010316 Myotonia congenita Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100028102 Non-POU domain-containing octamer-binding protein Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000036757 Postencephalitic parkinsonism Diseases 0.000 description 2
- 208000032319 Primary lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 2
- 208000005793 Restless legs syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108700013394 SOD1 G93A Proteins 0.000 description 2
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000323 Tourette Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000016620 Tourette disease Diseases 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 206010046298 Upper motor neurone lesion Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 201000011474 congenital myopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical compound O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 208000000170 postencephalitic Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 201000002241 progressive bulbar palsy Diseases 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 2
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 208000001076 sarcopenia Diseases 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 2
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010088468 Ebola virus envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- GKXJWSZPLIKUPS-IUNAMMOKSA-N N-[(2Z,6Z)-2,6-bis(hydroxyimino)cyclohexylidene]hydroxylamine Chemical compound O\N=C1\CCC\C(=N\O)C1=NO GKXJWSZPLIKUPS-IUNAMMOKSA-N 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N Rivastigmine Chemical compound CCN(C)C(=O)OC1=CC=CC([C@H](C)N(C)C)=C1 XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102220592942 Transcription factor GATA-4_G93A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 229940039856 aricept Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000001196 cardiac muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000736 corneocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003136 dopamine receptor stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940005501 dopaminergic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009041 edaravone Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229940108366 exelon Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N galanthamine Chemical compound O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CC[C@]23[C@@H]1C[C@@H](O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003125 jurkat cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004924 lung microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N memantine Chemical compound C1C(C2)CC3(C)CC1(C)CC2(N)C3 BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008172 membrane trafficking Effects 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 229940033872 namenda Drugs 0.000 description 1
- 238000005319 nano flow HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 210000001152 parietal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000003863 physical function Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000004725 rapid separation liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940051845 razadyne Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000010825 rotarod performance test Methods 0.000 description 1
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
- C12N2760/18822—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Psychology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
Description
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）遺伝子を細胞に形質導入して過剰発現させることにより他の細胞との細胞融合能力を高め、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞との細胞融合により細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達することができる、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びに細胞損傷に関連する疾患における用途に関する。
一般に、疾患及び老化は、細胞損傷及び細胞死により進行する。細胞損傷及び死滅が誘発される代表的な疾患としては、神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などが挙げられる。
急速な老齢人口の増加に伴い、脳、脊椎、末梢神経の損傷をはじめとする神経変性疾患が増加する傾向にある。神経変性疾患の原因は、いまだ明らかにされていない。また、各神経変性疾患の病理機序として、少しずつ異なる機序が作用することが知られている。
例えば、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）などは、運動ニューロンのみ選択的に死滅して運動機能のみ退行するものである。その結果、四肢麻痺の症状が現れるので、運動ニューロン疾患ともいう。
一方、前記運動ニューロン疾患とは異なり、アルツハイマー病、パーキンソン病などは、脳のニューロンが消失する代表的な神経変性疾患として知られている。アルツハイマー病においては、ニューロンの消失により全般的な脳萎縮所見が現れる。このような脳病理所見は、疾患初期には主に記憶力を担う主な脳部位である海馬及び嗅内皮質部位に限定されて現れるが、次第に頭頂葉、前頭葉などを経て脳全体に広がる。このような脳病理所見の進行により、初期には記憶力の低下が主に現れるが、進行に伴う漸進的な経過を経て、様々な臨床症状が現れるようになり、徐々に悪化する。パーキンソン病は、中脳に位置する黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ；ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の消失により誘発される。ドーパミン作動性ニューロンの消失は、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）内の深刻なドーパミン減少を誘発し、大脳基底核（ｂａｓａｌ ｇａｎｇｌｉａ）、視床（ｔｈａｌａｍｕｓ）及び運動皮質（ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｅｘ）を含む錐体外路系（ｅｘｔｒａｐｙｒａｍｉｄａｌ ｓｙｓｔｅｍ）による運動調節機能に障害を生じさせる。
このように様々な病理機序が作用するので、いずれか１つの機序に作用する治療剤では疾患の治療が困難であり、それ故に現在までほとんど全ての臨床試験が失敗しており、根本的な治療剤が全くない状態である。具体的には、ＡＬＳの治療剤で米国ＦＤＡに承認されたものとしては、運動ニューロンを破壊する過度なグルタミン酸を抑制するリルゾール（ｒｉｒｕｚｏｌｅ）、フリーラジカルによる酸化ストレス損傷を抑制するエダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）以外にはほとんどない実情であり、これらも約３カ月間の生存延長効果や、身体機能の悪化を僅かに鈍化させる効果しかない。アルツハイマー病においては、米国ＦＤＡに承認された治療剤として、脳のニューロンの活動を助ける神経伝達物質であるアセチルコリンを活性化するアリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）、エクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ）、ナメンダ（Ｎａｍｅｎｄａ）、ラザダイン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）などがあるが、これらも脳細胞の損傷を最小限に抑えて症状を緩和したり、進行速度を遅らせるだけであり、治療剤としては力不足である。パーキンソン病においても、ドーパミン作用剤であるレボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）が治療の根幹として用いられているが、長期的な効果は限定的である。他の神経変性疾患においても、完治をもたらす治療剤がない現状である。よって、より広範囲の機序に作用し、強力な効果を有する治療剤が至急必要とされ、幹細胞治療を含む新たな治療方法が切実に求められている疾患であるといえる。
現在、神経変性疾患を治療するために、細胞移植、症状を改善する薬物の投与など、様々な治療法が提示されており、特に最近は細胞治療に関心が置かれている。しかしながら、従来の細胞治療技術は、健康な細胞（または幹細胞）を疾患部位に挿入することにより死滅した細胞を代替したり、死滅中の細胞の周辺環境を改善して再生させることを目標とするが、そのような試みは、多くの前臨床または臨床試験において効果がないか、効果が僅かであった。また、ニューロンの場合は、他の器官とは異なり、神経回路を形成することが機能において非常に重要であるので、外部から供給された細胞がニューロンに分化し、既存の神経回路をそのまま復元することは期待しがたい。よって、従来の方法以外に、新たなニューロン損傷緩和または保護のための治療方法の開発が切実に求められる。
一方、筋肉は、人体を支えて生命現象を維持する必須組織である。筋肉においては、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）が分化して多核筋管（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｍｙｏｔｕｂｅ）細胞を形成して筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）を作るが、筋芽細胞と筋細胞の死滅は、様々な疾患の原因となっている。また、遺伝子突然変異や様々な原因で筋細胞が消失する疾患が報告されているが、根本的な治療剤がいまだない状況である。このような筋肉疾患は、種類によって症状や疾患の程度が様々であり、ニューロンや脊髄などの神経系統の問題により発生する複合的な形態をとることもある。
例えば、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、筋細胞が破壊される疾患であり、遺伝子異常により発生し、症状は力が弱くなり、立つことが困難になることから始まって次第に酷くなり、呼吸筋肉が麻痺して死亡することもある。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などの多くの種類があり、種類によって異なる症状が現れる。前記ＤＭＤ及びＢＭＤは、Ｘ染色体に存在するジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の異常により発生し、約１／３は自然突然変異、残りは伴性遺伝に起因する。ＤＭＤとＢＭＤは、どちらも同じ遺伝子の異常が原因であるが、フレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）などにより強力な表現型を示すものをＤＭＤという。ＤＭＤにおいては、疾患の予後が不良であり、９～１３才でほとんどの患者が歩行不能になり、筋力弱化だけでなく、認知低下を同伴することもあり、心筋症、呼吸筋障害を伴って死亡に至ることもある。ＤＭＤにおいては、近年、エキソンスキッピング（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ）による治療を試みる方法が多く用いられている。エキソンスキッピングは、ジストロフィン遺伝子のｅｘｏｎ５１のスプライシング促進配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ）を標的とするものであるが、ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅのみ回復させ、軽症型の遺伝子変異に置換する原理であるので、根本的な治療法ではなく、全てのＤＭＤを対象とする治療法でもない。
このように、筋肉疾患患者は疾患が進行すると一人では日常生活が行えず、根本的な治療剤も全くない状況であるので、筋細胞損傷または死滅による筋肉疾患を効果的に治療できる新たな治療法が強く求められている。
よって、本発明者らは、神経変性疾患、筋肉変性疾患などの細胞損傷に対する疾患治療剤を開発すべく努力した結果、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷もしくは死滅中の細胞または遺伝子異常のある細胞の細胞損傷を回復させて正常遺伝子を伝達する能力が高まることを確認した。よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術は、細胞損傷を誘発する神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の治療に有用であることを確認し、本発明を完成するに至った。
Annemieke Aartsma-Rus et al" Development of Exon Skipping Therapies for Duchenne Muscular Dystrophy: A Critical Review and a Perspective on the Outstanding Issues, Nucleic Acid Ther. 2017 Oct 1;27(5): 251-259
Eckert DM, Kim PS. Annu Rev Biochem. 2001;70:777-810.
Sapir A, Avinoam O, Podbilewicz B, Chernomordik LV. Dev Cell. 2008 Jan;14(1):11-21.
Kouris NA, Schaefer JA, Hatta M, Freeman BT, Kamp TJ, Kawaoka Y, Ogle BM. Stem Cells Int. 2012;2012:414038
Eagle, H. Science 130:432(1959)
Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)
Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)
Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)
Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)
Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)
Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)
Dulbecco, R. et al., VirProcy 8:396(1959)
Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)
Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)
McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)
Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)
R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)
Yu J et al. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920
Takahashi K et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872
L.G. VILLA-DIAZ et al. (2012) Derivation of Mesenchymal Stem Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells Cultured on Synthetic Substrates. STEM CELLS. 30, 1174-1181
Hyun Soo Choi et al. (2014) Neural Stem Cells Differentiated From iPS Cells Spontaneously Regain Pluripotency. STEMCELLS. 32, 2596-2604
Remington's Pharmaceutical Sciences, 最新版
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその細胞損傷に関連する疾患、より具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患における用途を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
さらに、本発明は、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。
さらに、本発明は、神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いるための、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。
本発明によれば、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合によりＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞内の正常遺伝子及び転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、損傷した細胞内の細胞修復に関与する遺伝子の発現を調節したり、正常遺伝子を伝達して正常タンパク質を回復させることにより、損傷した細胞が回復することが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合すると正常細胞に回復することが確認された。
よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術により、細胞損傷を回復させて正常遺伝子を導入することができるので、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、細胞損傷に関連する疾患、具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患を治療するのに有用である。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のものであるが、これらに限定されるものではなく、これらのタンパク質と同一または類似の機序により細胞の融合を促進し、死滅を抑制し、損傷した細胞の損傷を回復させるものであれば、様々な由来のもの並びに／または全長及び／もしくは断片のいかなる形態のヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質が用いられてもよい（非特許文献２，３，４）。
本発明によるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）は、ウイルスで発現する糖タンパク質であり、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの両方の活性を有する単一のウイルスタンパク質であるか、またはそれぞれが別個のタンパク質として存在するものであるが、これらに限定されるものではなく、本発明による効果を発揮するものであれば、いかなるものでも本発明に含まれる。前者の例としては、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐ ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ－１）、２型（ＨＰＩＶ－２）または３型（ＨＰＩＶ－３）、鳥類ニューカッスル病ウイルス（ａｖｉａｎ ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）などのパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）由来のものが挙げられ、後者の例としては、インフルエンザウイルス由来のものが挙げられる。これらのタンパク質及び核酸配列は公知であり、例えばヘマグルチニン・ノイラミニダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）ＥＣ：３．２．１．１８に開示されており、タンパク質配列は、例えばセンダイウイルス由来のものがＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１に公開されている。本発明の一実施例においては、本発明の実施例２と同様に製造されるセンダイウイルス由来のＨＮ単一タンパク質が用いられる。
また、融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、細胞間の融合またはウイルスの細胞への融合／エントリー、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、膜トラフィッキング（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に用いられる糖タンパク質を意味する。本発明の一実施例においては、ウイルス由来のＦタンパク質が用いられるが、それは構造的特徴によりクラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩに分けられる。クラスＩの例としては、エボラウイルスのＧＰ２、ＭｏＭｕＬｖ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）のＭｏ－５５、免疫不全ウイルスＨＩＶのｇｐ４１、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ（ＳＩＶ）ｇｐ４１などが挙げられる。クラスＩＩの例としては、ＳＦＶ Ｅ１、ＴＢＥＶ Ｅなどが挙げられる。クラスＩＩＩの例としては、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）のｇＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）のｇＢ、ＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＧタンパク質、バキュロウイルスの糖タンパク質であるｇｐ６４などが挙げられる。これらの融合糖タンパク質及び核酸配列は公開されており、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＣ８２３００．１に公開されている。
本発明における前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子は、全長及び／または断片の形態で用いられる。具体的には、本発明に開示されているタンパク質をコードする野生型遺伝子配列及びその断片はもとより、細胞内での発現、タンパク質の安定性などの特徴が有利に働くように塩基配列の一部が人為的に改変された遺伝子、及び自然界に見られる塩基配列の一部が改変された遺伝子、またはそれらの全ての断片が含まれるものである。
本発明における前記ベクターとは、宿主細胞において標的遺伝子を発現させるための手段を意味する。前記ベクターは、標的遺伝子の発現のための要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含むものであり、複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）、プロモーター、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などを含んでもよく、宿主細胞のゲノムへの導入のための好ましい酵素部位（例えば、制限酵素部位）、宿主細胞への導入を確認するための選択マーカー、タンパク質への翻訳のためのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＲＢＳ）、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）などをさらに含んでもよい。前記ベクターは、前記プロモーター以外の転写調節配列（例えば、インハンサーなど）をさらに含んでもよい。
さらに、前記ベクターは、当該技術分野で公知のプラスミドＤＮＡ、組換えベクターまたはその他の媒体であり、具体的には直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクターまたは遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）であり、前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ベクターであるが、これらに限定されるものではない。
さらに、前記ベクターとは、遺伝子治療用発現ベクターを意味する。前記「遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、遺伝子異常により誘発される各種遺伝病を治療するために、遺伝子異常のある細胞に正常遺伝子を挿入したり、新たな機能を提供することにより、その機能を正常化させる方法を意味する。よって、本発明における遺伝子治療用発現ベクターとは、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子を体内の正常細胞に伝達して発現させることにより、遺伝子異常のある細胞と正常細胞との細胞融合を用いて新たな機能を提供し、その機能を正常化することのできる発現ベクターを意味する。
本発明の一実施例におけるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子は、前述したように公知の配列からそれを特異的に認識することのできるプライマーを作製し、それを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により前記遺伝子を増幅し、それを前述した発現ベクターに導入すると、それを後述する本発明による細胞に導入することができる。導入方法は公知であり、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ファージによる形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、ウイルスによる感染法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を提供する。
本発明における「形質転換」とは、外部から与えられたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることであり、すなわち生物のある系統の細胞から抽出された核酸の一種であるＤＮＡを他の系統の生きている細胞に導入したときにＤＮＡがその細胞に取り込まれて遺伝子形質が変化する現象を意味する。
本発明における前記形質転換された細胞は、幹細胞、前駆細胞または動物細胞であるが、これらに限定されるものではない。また、前記幹細胞は、具体的には胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ）であるが、これらに限定されるものではなく、前記幹細胞から分化した幹細胞、例えば胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞などが全て含まれる。さらに、前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、非自己、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞である。自己由来のものが最も好ましく、レシピエントに由来するものであるので、薬学的組成物の投与の際に免疫反応の問題がなく、安全であるという利点がある。
前記胚性幹細胞は、胚発生初期である胞胚期（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）から形成され、あらゆる細胞に分化可能な潜在力（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有するものであり、いかなる組織細胞にも分化可能であるという利点があり、細胞治療研究に用いられている。
前記成体幹細胞とは、胚芽発達段階以降も成体全般に見られる未分化の幹細胞を意味する。このような成体幹細胞は、周辺組織の特性に細胞自身を合わせて分化する組織特異的分化能力（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を有する。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格筋、臍帯、臍帯血などの様々な成体細胞に由来するものである。具体例として、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）、骨格筋幹細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）、脂肪由来の幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、脂肪由来の前駆細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、血管内皮前駆細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、前記間葉系幹細胞は、既に成人になったヒトの各部位から得られる成体組織由来の幹細胞であり、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜または胎盤から分離することができ、様々な細胞、例えば脂肪細胞、運動ニューロンなどに分化することができる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を意味する。さらに、間葉系幹細胞は、免疫抑制剤を用いなくても、同種または異種の受益者において効果的に生着するという特徴がある。前記間葉系幹細胞は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトの間葉系幹細胞である。
本発明の一実施例における間葉系幹細胞は、脂肪組織由来の間葉系幹細胞である。脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、骨髄、羊水、臍帯血幹細胞とは異なり、多量の提供が受けられるという実用的な利点を有し、脂肪細胞の約１％が幹細胞であるものと推定されており、近年、先進国において広範囲に行われている成形手術が脂肪吸引術（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）であることを考慮すると、脂肪由来の幹細胞は無限の供給性を有し、有用性が特に高いといえる。
前記間葉系幹細胞を得る過程は次の通りである。ヒトまたはマウスを含む哺乳動物、好ましくはヒトの間葉系幹細胞源、例えば脂肪組織、血液または骨髄から間葉系幹細胞を分離する。次に、前記細胞を好適な培地で培養する。培養過程で浮遊細胞を除去し、培養プレートに付着した細胞を継代培養し、最終的に確立された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）間葉系幹細胞を得る。
また、骨髄などに非常に少量で存在する間葉系幹細胞を分離及び培養する過程は、当該技術分野において周知であり、例えば特許文献３に開示されている。
前記過程で用いられる培地としては、幹細胞の培養に用いられる一般的ないかなる培地を用いてもよい。より具体的には、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清及びヒト血清）または血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む培地を用いる。本発明に用いられる培地としては、例えばＲＰＭＩシリーズ、Ｅａｇｌｅｓ'ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献５）、α－ＭＥＭ（非特許文献６）、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ ＭＥＭ（非特許文献７）、１９９培地（非特許文献８）、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（非特許文献９）、Ｆ１２（非特許文献１０）、Ｆ１０（非特許文献１１）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ、非特許文献１２）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（非特許文献１３）、Ｗａｙ－ｍｏ、ｈ'ｓ ＭＢ７５２／１（非特許文献１４）、ＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ（非特許文献１５）及びＭＣＤＢシリーズ（非特許文献１６）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記培地は、他の成分、例えば抗生剤または抗真菌剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、グルタミンなどを含んでもよい。培地及び培養についての一般的な説明は非特許文献１７に記載されており、この文献は参照として本明細書に組み込まれる。
間葉系幹細胞の確認は、例えばフローサイトメトリーにより行うことができる。このフローサイトメトリーは、間葉系幹細胞の特異な表面マーカーを用いて行われる。本発明の一実施例による間葉系幹細胞は、マーカーとしてＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲの表現型を有する。
また、前記人工多能性幹細胞に関しては、多能性のない成人の皮膚細胞などの体細胞に逆分化を起こす４種類の特定遺伝子を導入して発現させるか、逆分化を起こす４種類の遺伝子を導入した細胞で形成された逆分化誘導タンパク質を抽出し、それを再び体細胞に注入することにより、胚性幹細胞などの多能性を有する幹細胞を作製することができるが、これを人工多能性幹細胞または逆分化幹細胞という。人工多能性幹細胞による幹細胞治療や、患者から体細胞を得て人工多能性幹細胞を作製し、生体外で分化させることにより様々な疾患の経過を研究し、疾患モデルや新薬開発における細胞基盤研究などに用いられる。前記人工多能性幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献１８、１９などに開示されている方法により得られる。また、人工多能性幹細胞由来の幹細胞、例えば人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｍｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＭＳＣｓ）、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）などが全て含まれる。本発明の一実施例における前記人工多能性幹細胞由来の幹細胞は、人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞である。
前記人工多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞は、公知の方法、例えば非特許文献２０、２１などに開示されている方法により得られる。
また、前記前駆細胞とは、特定細胞の形態及び機能を備える前段階の細胞であり、特定細胞系統の細胞に分化するか、特定タイプの組織を形成することができ、自己再生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）能は有するが、分化能は極めて制限される細胞を意味する。内胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞及び外胚葉前駆細胞が全てこれに含まれる。
また、前記動物細胞は、ヒトを含む動物起源の機能的及び構造的基本単位であり、ヒトを含む動物（例えば、サル、イヌ、ヤギ、ブタ、ラットなどの哺乳動物）起源の細胞であればいかなるものでもよい。よって、本発明の動物細胞は、これらに限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、生殖細胞、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞、角質細胞）、免疫細胞、癌細胞などが含まれる。具体例として、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ＮＳ０（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、Ｓｐ２／０（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ）細胞、ヒト網膜細胞（ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＶＥＣ細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨｅｐＧ－２細胞、ＨＬ－６０細胞、ＩＭ－９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｔ９８Ｇ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明における前記ベクターについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略し、以下では筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物の特有な構成についてのみ説明する。
なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターは、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。
本発明における前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、細胞損傷に関連する疾患である。
前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄神経損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。
また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｕｌｂａｒ ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄神経損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明による薬学的組成物は、一般に用いられる薬学的に許容される担体と共に好適な形態に剤形化することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば水、好適なオイル、食塩水、水性グルコース、グリコールなどの非経口投与用担体などが挙げられ、安定化剤や保存剤をさらに含んでもよい。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などの抗酸化剤が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベン及びクロロブタノールが挙げられる。また、本発明による細胞治療用組成物は、その投与方法や剤形に応じて、必要であれば懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、鎮痛剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適宜含んでもよい。前述したものをはじめとして、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、非特許文献２２に詳細に記載されている。
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することのできる方法で薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形態または多用量容器に入れた形態に製造することができる。
また、前記薬学的組成物は、有効成分を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与される。本発明の薬学的組成物は、疾患の治療のために、治療学的に有効な量で含まれる。本発明における「治療」とは、特に断らない限り、その「治療」が行われる疾患または疾病の少なくとも１つの症状を逆転または緩和するか、その進行を抑制または予防することを意味する。また、前記「治療学的に有効な量」とは、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床医により求められる、組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味し、それには治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量が含まれる。本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分が効果に応じて変化することは、当業者にとって明らかである。
よって、最適な薬学的組成物含有量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれる他の成分の含有量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に用いられる薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節される。
本発明の一実施例における薬学的組成物は、静脈投与または脊髄内投与される。
前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。例えば、本発明の組成物の投与量は、有効成分であるヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞０．１×１０５～１．０×１０８細胞数／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．５×１０６～１．０×１０７細胞数／ｋｇ（体重）である。ただし、投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、感受性などの要因に応じて様々に処方することができ、当業者であればこのような要因を考慮して投与量を好適に調節することができる。投与回数は１回、または臨床的に許容される副作用の範囲内で２回以上であってもよく、投与部位も１つの部位または２つ以上の部位であってもよい。ヒト以外の動物に対しても、ｋｇ当たりのヒトと同じ投与量で投与してもよく、例えば目的の動物とヒトの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などで前記投与量を換算した量を投与してもよい。本発明による治療の対象動物の例としては、ヒト及びその他の目的とする哺乳動物を挙げることができ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどが含まれる。
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明における前記細胞については、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患、細胞の投与方法、投与量などについては、前記ベクターを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
なお、本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物の有効成分として有用である。
また、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
さらに、本発明は、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を治療学的に有効な量で個体に投与するステップを含む、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
本発明における前記個体は、筋肉変性疾患または筋肉疾患により苦痛を感じる個体であり、より具体的には前述したヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたは前記ベクターで形質転換された細胞を投与することにより前記疾患による細胞損傷、例えば筋細胞損傷が緩和及び／または回復する哺乳動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ブタなどである。
前記神経変性疾患または神経疾患は、ニューロン損傷、脊髄損傷、末梢神経損傷またはニューロン死滅を誘発する。
また、前記神経変性疾患または神経疾患は、運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患と、脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患に分けられる。
前記運動ニューロン損傷または死滅を誘発する神経変性疾患または神経疾患の改善または治療のためには、運動ニューロンの保存及び回復が必須である。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、ケネディ病（ｓｐｉｎａｌ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または進行性球麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｕｌｂａｒ ｐａｌｓｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記脳のニューロン損傷もしくは死滅、脊髄損傷または末梢神経損傷を誘発する神経変性疾患または神経疾患は、損傷した脳または脊髄のニューロン、末梢神経の回復により疾患を予防または治療することができる。このような神経変性疾患または神経疾患の例としては、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発梗塞性認知症（ｍｕｌｔｉ－ｉｎｆａｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ；ｍｉｄ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、うつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、代謝性脳疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ；ＭＳＡ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ；ＰＳＰ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ；ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳炎後パーキンソニズム（ｐｏｓｔ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、トゥレット障害（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、むずむず脚症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または注意欠陥多動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記筋肉変性疾患または筋肉疾患は、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する。このような筋肉変性疾患または筋肉疾患の例としては、ミオパチー（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性ミオパチー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、バース症候群（Ｂａｒｔｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）またはＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。
また、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの用途を提供する。
さらに、本発明は、筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用組成物として用いるための、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞の用途を提供する。
本発明における前記ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、その投与方法、投与量などについては、前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、それを含む薬学的組成物の投与方法、投与量などについての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。また、前記疾患については、前記筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
本発明によれば、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質により他の細胞との細胞融合能力が高まり、損傷した細胞との融合により正常遺伝子が伝達されて発現し、細胞損傷を回復させる遺伝子の発現が調節されることが確認された。また、細胞損傷に関連する様々な疾患モデルにおいて、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞または遺伝子異常が誘発された細胞と細胞融合し、正常細胞に回復することが確認された。よって、前記ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞は、筋肉変性疾患または筋肉疾患を予防または治療するのに有用である。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
細胞培養
Ｋ－ＳＴＭＥＣＥＬＬ ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）の同意及び了解の下に得たヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｈＡＴＭＳＣｓ）は、抗生剤を添加したＲＫＣＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加、Ｋ－ＳＴＥＭＣＥＬＬにより提供）で培養した。マウス運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、ＵＳＡ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２Ａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ラット心筋芽細胞株（Ｈ９ｃ２ ｈｅａｒｔ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。
Ｋ－ＳＴＭＥＣＥＬＬ ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）の同意及び了解の下に得たヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｈＡＴＭＳＣｓ）は、抗生剤を添加したＲＫＣＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加、Ｋ－ＳＴＥＭＣＥＬＬにより提供）で培養した。マウス運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ３４ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、ＵＳＡ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２Ａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。ラット心筋芽細胞株（Ｈ９ｃ２ ｈｅａｒｔ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）は、抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）で培養した。
また、正常なヒトから同意の下に血液の提供を受けて作製したヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ）は、ｂＦＧＦを含まないｈＥＳ ｃｅｌｌ培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の入った培養プレートに浮遊状態で４日間培養した。次に、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＲＡ、５×１０－７Ｍ）の入ったｈＥＳ ｃｅｌｌ培養培地で４日間培養し、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ［ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（２％）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ（２μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養培地］で７日間培養した。凝集状態のｃｏｌｏｎｉｅｓから離れた浮遊状態の細胞をｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍの入ったポリ－l－オルニチン（ｐｏｌｙ－l－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（１０ｍｇ／ｍｌ）／ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）（５μｇ／ｍｌ）コーティング培養プレートで７日間培養し、５～７日ごとにアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）で処理して細胞を継代培養することにより、人人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）を得た。
前記細胞は、全て５％ＣＯ２を供給して３７℃の条件下で培養した。
死滅中の運動ニューロン細胞株と脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞融合による運動ニューロン細胞株の細胞死抑制効果の分析
細胞トラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ）ＣＭ－ＤｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した運動ニューロン細胞株ＮＳＣ３４細胞を細胞死誘導因子であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）２．５μＭで処理して２４時間培養した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞を分離した。緑色染料（ｃｅｌｌ－ｓｔａｌｋｅｒＴＭ、Ｂｉｔｅｒｉａｌｓ）で標識したｈＡＴＭＳＣｓとアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞をセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－ＣＦ ＥＸ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。図１に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群において、９９．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、３２．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。これらの結果は、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合によりＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の死滅を抑制できることを示すものである。
細胞トラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ）ＣＭ－ＤｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した運動ニューロン細胞株ＮＳＣ３４細胞を細胞死誘導因子であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）２．５μＭで処理して２４時間培養した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞を分離した。緑色染料（ｃｅｌｌ－ｓｔａｌｋｅｒＴＭ、Ｂｉｔｅｒｉａｌｓ）で標識したｈＡＴＭＳＣｓとアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４細胞をセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－ＣＦ ＥＸ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。図１に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群において、９９．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、３２．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。これらの結果は、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合によりＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の死滅を抑制できることを示すものである。
また、死滅抑制効果を分子レベルで確認した。要約すると、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群をフローサイトメトリーにより分離し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ－ＰＣＲ）及び定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）によりｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘとａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ－ｘＬの発現を分析した。図２に示すように、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＮＳＣ３４細胞群に比べて、ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＮＳＣ３４細胞群において、Ｂａｘ ｍＲＮＡの発現は大幅に減少し、Ｂｃｌ－ｘＬ ｍＲＮＡの発現は大幅に増加した。
これらの結果は、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株がｈＡＴＭＳＣｓと細胞融合を起こすと、ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢａｘの発現減少及びａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ遺伝子であるＢｃｌ－ｘＬの発現増加により、細胞死が抑制されることを意味するものである。
ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するヒト脂肪由来の間葉系幹細胞（ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓ）の作製
センダイウイルスゲノムを鋳型とし、表１のプライマーを用いてヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及びＦタンパク質（Ｆ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにそれぞれ挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５αにクローニングして配列を確認した（結果は提示せず）。クローニングしたＨＮ及びＦタンパク質は、それぞれ公開されている配列ＧｅｎＢｎａｋ Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１及びＡＡＣ８２３００．１と同一である。
センダイウイルスゲノムを鋳型とし、表１のプライマーを用いてヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及びＦタンパク質（Ｆ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにそれぞれ挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５αにクローニングして配列を確認した（結果は提示せず）。クローニングしたＨＮ及びＦタンパク質は、それぞれ公開されている配列ＧｅｎＢｎａｋ Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ０６２８８．１及びＡＡＣ８２３００．１と同一である。
クローニング後に得られたクローン（ｃｌｏｎｅ）は、ＬＢ液体培地で２４時間増殖培養し、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）抽出キット（Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドを抽出し、その後リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってｈＡＴＭＳＣｓに形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｈＡＴＭＳＣｓ（ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。部分（ｐａｒｔｉａｌ）ＨＮ及びＦプライマーは、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲを用いたＨＮまたはＦ ｍＲＮＡにおける発現確認用に用いた。
発現分析の結果、図４に示すように、ＨＮ及びＦ遺伝子の過剰発現が確認された。これらの結果は、リポソームトランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によりＨＮ及びＦ遺伝子を同時に過剰発現させることに成功したこと意味するものである。
また、表１に示すように、ＨＮ遺伝子の増幅のための正方向プライマーにｍｙｃタンパク質をコードする塩基配列を連結し、Ｆ遺伝子の増幅のための正方向プライマーにヒスチジンをコードする塩基配列を連結したので、ｍｙｃタンパク質とヒスチジンに対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいて共焦点レーザ顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ、Ｊａｐａｎ）によりＨＮとＦタンパク質の発現を分析した。
画像解析の結果、図５に示すように、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞表面にＨＮとＦタンパク質が発現することが確認された。これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するヒト脂肪由来の間葉系幹細胞を作製することに成功したことを意味するものである。
ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおける幹細胞のマーカーに対する発現の評価
脂肪由来の間葉系幹細胞の陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲに対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおける脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーに対する発現を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。発現分析の結果、図６に示すように、対照群と比較して、陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲにおける発現差がないことが確認された。このような免疫表現型解析（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を行った結果は、ＨＮ及びＦ遺伝を導入したｈＡＴＭＳＣｓが幹細胞としての特性を維持することを意味するものである。
脂肪由来の間葉系幹細胞の陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲに対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおける脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーに対する発現を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。発現分析の結果、図６に示すように、対照群と比較して、陽性マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０と、陰性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲにおける発現差がないことが確認された。このような免疫表現型解析（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を行った結果は、ＨＮ及びＦ遺伝を導入したｈＡＴＭＳＣｓが幹細胞としての特性を維持することを意味するものである。
ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合能力に関する評価
実施例２で作製したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合能力を評価するために、緑色染料で標識したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと細胞トラッカーＣＭ－ＤｉＩで標識したＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対して融合分析（ｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。２種類の細胞を細胞数１：１の比で１．５ｍｌ試験管に混合し、４℃の条件下で５分間反応させ、その後３７℃の細胞培養器で１５分間反応させた。抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）を入れた６ウェルプレートに移し、その後５％ＣＯ２を供給して３７℃の条件下で１６時間培養した。細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。分析の結果、図７に示すように、対照群に比べて、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率が３．５倍以上に増加することが確認された。これらの結果は、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対する細胞融合率が向上したことを意味するものである。
実施例２で作製したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合能力を評価するために、緑色染料で標識したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと細胞トラッカーＣＭ－ＤｉＩで標識したＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対して融合分析（ｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。２種類の細胞を細胞数１：１の比で１．５ｍｌ試験管に混合し、４℃の条件下で５分間反応させ、その後３７℃の細胞培養器で１５分間反応させた。抗生剤を添加したＤＭＥＭ培養培地（１０％ＦＢＳ添加）を入れた６ウェルプレートに移し、その後５％ＣＯ２を供給して３７℃の条件下で１６時間培養した。細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率を分析した。対照群としてｈＡＴＭＳＣｓを用いた。分析の結果、図７に示すように、対照群に比べて、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株の細胞融合率が３．５倍以上に増加することが確認された。これらの結果は、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓにおいてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株に対する細胞融合率が向上したことを意味するものである。
また、図７に示すように、共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像解析により、緑色蛍光を示すＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと赤色蛍光を示すＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞の画像が確認された。
ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞におけるｈＡＴＭＳＣｓのマーカー及び運動ニューロンのマーカーの発現分析
実施例４の融合細胞において、運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣｈＡＴ）と脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５に対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、共焦点レーザ顕微鏡により脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣｈＡＴとＣＤ１０５の発現を分析した。分析の結果、図８に示すように、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞において、運動ニューロンのマーカーであるＣｈＡＴと脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５の発現が確認された。
実施例４の融合細胞において、運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣｈＡＴ）と脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５に対する抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて、共焦点レーザ顕微鏡により脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣｈＡＴとＣＤ１０５の発現を分析した。分析の結果、図８に示すように、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞において、運動ニューロンのマーカーであるＣｈＡＴと脂肪由来の間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５の発現が確認された。
これらの結果は、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合したことを示し、融合した細胞において、脂肪由来の間葉系幹細胞と運動ニューロン細胞株で発現するマーカータンパク質が全て発現することを意味するものである。
死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株とＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞のプロテオミクス分析
死滅中の運動ニューロンとＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合による細胞損傷回復機序を調べるために、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞に対するプロテオミクス分析（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＥＳＩ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｈｅｒ）及びｎａｎｏＨＰＬＣ（ＲＳＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ）により行い、ヒートマップ分析（ｈｅａｔｍａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＭｅＶ ｓｏｆｔｗａｒｅにより行った。対照群としてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株を用いた。分析の結果、図９及び図１０に示すように、細胞修復（ｃｅｌｌ ｒｅｐａｉｒ）に関連する５つの遺伝子（ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１、ＭＳＨ２、ＮＯＮＯ及びＰＣＮＡ）が死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロンにおいては減少するのに対して、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においては増加することが確認されたので、前記５つの遺伝子を細胞損傷回復標的遺伝子として選択した。
死滅中の運動ニューロンとＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合による細胞損傷回復機序を調べるために、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞に対するプロテオミクス分析（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＥＳＩ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｈｅｒ）及びｎａｎｏＨＰＬＣ（ＲＳＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ）により行い、ヒートマップ分析（ｈｅａｔｍａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ）をＭｅＶ ｓｏｆｔｗａｒｅにより行った。対照群としてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株を用いた。分析の結果、図９及び図１０に示すように、細胞修復（ｃｅｌｌ ｒｅｐａｉｒ）に関連する５つの遺伝子（ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１、ＭＳＨ２、ＮＯＮＯ及びＰＣＮＡ）が死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロンにおいては減少するのに対して、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においては増加することが確認されたので、前記５つの遺伝子を細胞損傷回復標的遺伝子として選択した。
また、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞において、前記細胞修復に関連する５つの遺伝子（ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１、ＭＳＨ２、ＮＯＮＯ及びＰＣＮＡ）のうちＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２の発現変化が確認された。要約すると、実施例２のアネキシンＶ陽性ＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株及び実施例４の融合細胞において、ＲＴ－ＰＣＲ及び定量ＲＴ－ＰＣＲによりＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２の発現を分析した。対照群としてＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株を用いた。図１１に示すように、死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロンにおいてはＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２ ｍＲＮＡの発現が減少するのに対して、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株が融合した細胞においては大幅に増加した。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓが死滅中のＮＳＣ３４運動ニューロン細胞株と融合して細胞損傷が回復する過程において、ＤＤＢ１、ＨＭＧＢ１及びＭＳＨ２が関与することを意味するものである。
死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現する人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓ）の細胞融合によるＣ２Ｃ１２筋芽細胞株細胞死抑制効果の分析
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する細胞において細胞融合能力が発揮されるか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓ）を作製した。要約すると、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをリポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従って人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ（ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する細胞において細胞融合能力が発揮されるか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓ）を作製した。要約すると、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをリポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従って人工多能性幹細胞由来の神経幹細胞（ｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ）に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓ（ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
次に、細胞トラッカーＣＭ－ＤｉＩで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を細胞死誘導因子であるタプシガルギン２．５μｇ／ｍｌで処理して２４時間培養した。アネキシンＶ染色後に、アネキシンＶ抗体を用いたフローサイトメトリーによりアネキシンＶ－Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株を分離した。前記ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓを緑色染料で標識し、実施例１と同様にアネキシンＶ－Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株と細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図１２に示すように、ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓとの細胞融合が起こっていないＣ２Ｃ１２細胞群において、７２．３％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ－ＮＳＣｓとの細胞融合が起こったＣ２Ｃ１２細胞群において、２１．６％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｉＰＳＣｓ－ＮＳＣｓが死滅中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株と融合すると細胞損傷が回復することを意味するものである。
Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）の細胞融合能力の評価
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する一般の細胞株においても細胞融合能力を発揮するか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を作製した。要約すると、ＧＦＰ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＧＦＰ－ＨＮを挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。また、ＲＦＰ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＲＦＰ－Ｆタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｈｅＬａ（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した。対照群としてｈｅＬａ細胞株を用いた。発現分析の結果、図１３に示すように、ＨＮ及びＦ遺伝子の過剰発現が確認された。
ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する一般の細胞株においても細胞融合能力を発揮するか否かを調べるために、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を作製した。要約すると、ＧＦＰ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＧＦＰ－ＨＮを挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。また、ＲＦＰ－ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター及び実施例２で得たＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＲＦＰ－Ｆタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したｈｅＬａ（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した。対照群としてｈｅＬａ細胞株を用いた。発現分析の結果、図１３に示すように、ＨＮ及びＦ遺伝子の過剰発現が確認された。
前述したように作製したＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａの細胞融合能力を評価するために、ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａとＤＡＰＩで標識したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリー及び共焦点レーザ顕微鏡によりＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の細胞融合率を分析した。対照群として、ＧＦＰを形質導入したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とｍＣｈｅｒｒｙを形質導入したＨｅＬａ細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収して共焦点レーザ顕微鏡により細胞融合率を比較分析した。分析の結果、図１４に示すように、ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株において細胞融合が起こり、対照群に比べて、ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａとＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の細胞融合率が７倍以上に増加することが確認された。
これらの結果は、細胞に関係なく、ＨＮとＦタンパク質により細胞融合が起こることを意味するものである。
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株とヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）／Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株の細胞融合能力の評価
様々なベクターによりＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株の細胞融合能力を評価するために、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターを用いて、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）とＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子をＨｅＬａ細胞株に導入した。要約すると、図１５に示すように、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターと実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子及びＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＨＮ及びＦタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（Ｆ－Ｐ２Ａ－ＨＮ－ＨｅＬａ）を得た。また、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを前述したようにＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
様々なベクターによりＨＮとＦタンパク質を過剰発現するＨｅＬａ細胞株の細胞融合能力を評価するために、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターを用いて、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）とＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質遺伝子をＨｅＬａ細胞株に導入した。要約すると、図１５に示すように、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターと実施例２で得たＨＮタンパク質遺伝子及びＦタンパク質遺伝子クローンを用いて、ＨＮ及びＦタンパク質を挿入したｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ発現ベクターをクローニングした。次に、リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でメーカーの示す方法に従ってＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（Ｆ－Ｐ２Ａ－ＨＮ－ＨｅＬａ）を得た。また、実施例２でクローニングしたＨＮ及びＦタンパク質をそれぞれ挿入したｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを前述したようにＨｅＬａ細胞株に形質導入し、ＨＮ／Ｆ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞株（ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａ）を得た。形質導入した細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲによりＨＮ及びＦ遺伝子の発現を分析した（結果は提示せず）。
次に、細胞融合能力を評価するために、前述したように得たＨｅＬａ細胞株のそれぞれをＧＦＰで標識し、実施例４と同様にＲＦＰで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株と細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーによりＨｅＬａ細胞株とＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の細胞融合率を分析した。対照群として、ＧＦＰで標識したＨｅＬａ細胞株とＲＦＰで標識したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収してフローサイトメトリーにより細胞融合率を比較分析した。分析の結果、図１６に示すように、Ｆ－Ｐ２Ａ－ＨＮ－ＨｅＬａの細胞融合率は２６．９％、ＨＮ／Ｆ－ＨｅＬａの細胞融合率は５０．１％であったので、対照群に比べて、細胞融合がそれぞれ約４倍、７倍に増加することが確認された。
これらの結果は、様々なベクターにより細胞にＨＮとＦタンパク質が過剰発現し、ＨＮ及びＦタンパク質を過剰発現する細胞において、他の細胞との細胞融合能力が高まることを意味するものである。
Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＨｅＬａ細胞株が融合した細胞における細胞修復に関連する遺伝子発現の分析
ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際の細胞損傷回復機序を確認するために、実施例６で選択した細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１のプロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）をスクリーニングしたところ、図１７のように転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）であるＴＤＰ－４３（ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３）の結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）がＤＤＢ１のプロモーター部位に存在することが確認された。
ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際の細胞損傷回復機序を確認するために、実施例６で選択した細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１のプロモーター部位（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）をスクリーニングしたところ、図１７のように転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）であるＴＤＰ－４３（ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３）の結合モチーフ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）がＤＤＢ１のプロモーター部位に存在することが確認された。
よって、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際のＴＤＰ－４３の増加に伴ってＤＤＢ１の発現が増加するか否かを確認するために、図１８のようにマウスＤＤＢ１（ｍＤＤＢ１）に特異的に結合するプライマーを作製し、それを用いてＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＨｅＬａ細胞株から全ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりマウス特異的ＤＤＢ１遺伝子を確認した。ＤＤＢ１の発現がＴＤＰ－４３により調節されることを確認するために、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株にＴＤＰ－４３を過剰発現させ、その後ＲＮＡを抽出して定量ＲＴ－ＰＣＲにより分析した。次に、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰを形質導入したＨｅＬａ細胞株、及びＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株のそれぞれをセンダイウイルス（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－ＣＦ ＥＸ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＨＶＪ）Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ、ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ、Ｊａｐａｎ）でメーカーの示す方法に従って細胞融合し、その後ｆｕｓｉｏｎ ＧＦＰ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いてＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を行った。その結果、図１９に示すように、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株が融合した細胞株において融合時間に応じてｍＤＤＢ１が増加し、ｍＤＤＢ１プロモーター部位においてＴＤＰ－４３のｏｃｃｕｐａｎｃｙが４倍以上に増加することが確認され、ＴＤＰ－４３の増加に応じてＤＤＢ１の発現が調節されることが確認された。
また、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際にＴＤＰ－４３が受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）の核内に転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）されたか否かを確認するために、ＣＭ－ＤｉＩで標識したＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株とＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株を前述した方法と同様に細胞融合し、ＤＡＰＩ染色後に共焦点レーザ顕微鏡によりＴＤＰ－４３の転座を分析し、Ｎ２Ａ神経芽細胞腫細胞株にＮｕｃＢｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて染色し、ＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株と前述した方法と同様に細胞融合し、その後ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｉ抗体（ａｂｃａｍ）により免疫染色を行って共焦点レーザ顕微鏡により分析した。分析の結果、図２０に示すように、ＧＦＰ－ＴＤＰ－４３を形質導入したＨｅＬａ細胞株のＴＤＰ－４３がＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株の核に転座されたことが確認された。
これらの結果は、ＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合の際の細胞修復に関連する遺伝子ＤＤＢ１の発現増加は、ドナー細胞（ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ）のＴＤＰ－４３が受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）の核内に転座され、その後ｍＤＤＢ１のプロモーター部位に結合することにより発現が調節されて行われることを意味するものである。また、図２１に示すように、細胞損傷に関連する疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞が損傷した細胞との融合によりＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞内の転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、伝達した転写調節因子により損傷した細胞内の細胞修復に関与する遺伝子の発現が調節され、損傷した細胞が回復するので、細胞損傷に関連する疾患を治療することができることを意味する。
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＡＤ細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＤ動物モデルであるＴＧ２５７６マウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、ＴＧ２５７６マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養した。４日後にウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してＡＤマウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
細胞損傷に関連する疾患であるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＡＤ細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＤ動物モデルであるＴＧ２５７６マウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、ＴＧ２５７６マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養した。４日後にウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してＡＤマウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように得たＡＤマウス由来の神経幹細胞を実施例４と同様に細胞融合した。細胞融合の２４時間後にアネキシンＶ抗体を５μｌ添加して常温で１５分間反応させ、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図２２に示すように、ＡＤマウス由来の神経幹細胞において、５０．７％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったＡＤマウス由来の神経幹細胞において、１５．９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質によるＡＤニューロンとの融合により、ハンチントン病ニューロンにおいて現れる細胞損傷が回復することを意味するものである。
ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ハンチントン病細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからハンチントン病動物モデルであるＲ６／２ Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｒ６／２マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養し、その後ウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してハンチントン病マウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
細胞損傷に関連する疾患であるハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ハンチントン病細胞モデルを作製した。要約すると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからハンチントン病動物モデルであるＲ６／２ Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｒ６／２マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）を分離し、分離した組織からトリプシンにより幹細胞を分離及び濾過した。次に、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地にＥＧＦ及びＦＧＦをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ添加して球状に４日間培養し、その後ウェルプレートに移し、５％ＦＢＳ及びＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ培養培地で７日間培養してハンチントン病マウス由来の神経幹細胞の分化を誘導した。
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように得たハンチントン病マウス由来の神経幹細胞を実施例４と同様に細胞融合した。細胞融合の２４時間後にアネキシンＶ抗体を５μｌ添加して常温で１５分間反応させ、その後フローサイトメトリーによりＶ陽性細胞を分析した。分析の結果、図２３に示すように、ハンチントン病マウス由来の神経幹細胞において、３７．５％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こったハンチントン病マウス由来の神経幹細胞において、１１．１％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質によるハンチントン病ニューロンとの融合により、ハンチントン病ニューロンにおいて現れる細胞損傷が回復することを意味するものである。
心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患である心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、心不全疾患細胞モデルを作製した。要約すると、細胞トラッカーＣＭＤＦＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したＨ９ｃ２心筋芽細胞株を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）２００μＭで処理し、その後３時間培養して酸化ストレスを誘導することにより、心不全疾患細胞モデルを得た。
細胞損傷に関連する疾患である心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、心不全疾患細胞モデルを作製した。要約すると、細胞トラッカーＣＭＤＦＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したＨ９ｃ２心筋芽細胞株を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）２００μＭで処理し、その後３時間培養して酸化ストレスを誘導することにより、心不全疾患細胞モデルを得た。
次に、実施例２で得たＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓをＣＭ－ＤｉＩで標識し、前述したように得た心不全疾患細胞モデルを実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収した。回収した細胞をアネキシンＶで染色してフローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性細胞を分離し、その後分離した細胞のうちの緑色蛍光陽性細胞を分析した。分析の結果、図２４に示すように、心不全疾患細胞モデルにおいて、２９％のアネキシンＶ陽性細胞が確認され、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとの細胞融合が起こった心不全疾患細胞モデルにおいて、１３．４％のアネキシンＶ陽性細胞が確認された。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現するｈＡＴＭＳＣｓにおけるＨＮ及びＦタンパク質による心不全が誘導された細胞との融合により、細胞損傷が回復することを意味するものである。
筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）疾患動物モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患である筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＬＳ疾患動物モデルであるＧ９３Ａ ＳＯＤ１ Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１ Ｔｇマウスを対照群（Ｔｇ－ｓａｌｉｎｅ）、Ｔｇ－ＭＳＣ及びＴｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入（ｉｎｔｒａ－ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、Ｔｇ－ＭＳＣ群にはｈＡＴＭＳＣｓを、Ｔｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群には実施例２で作製したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを０．５～２×１０６の細胞数で注入してロータロッド試験（ｒｏｔａ ｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行った。その結果、図２６に示すように、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したＴｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群において、ＨＮ／Ｆタンパク質によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとニューロンの融合が確認され、ニューロン損傷の回復により運動性が向上することが確認された。
細胞損傷に関連する疾患である筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＡＬＳ疾患動物モデルであるＧ９３Ａ ＳＯＤ１ Ｔｇマウス（生後８０日）の提供を受けた。次に、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１ Ｔｇマウスを対照群（Ｔｇ－ｓａｌｉｎｅ）、Ｔｇ－ＭＳＣ及びＴｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入（ｉｎｔｒａ－ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、Ｔｇ－ＭＳＣ群にはｈＡＴＭＳＣｓを、Ｔｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群には実施例２で作製したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを０．５～２×１０６の細胞数で注入してロータロッド試験（ｒｏｔａ ｒｏｄ ｔｅｓｔ）を行った。その結果、図２６に示すように、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを注入したＴｇ－ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ＭＳＣ群において、ＨＮ／Ｆタンパク質によるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとニューロンの融合が確認され、ニューロン損傷の回復により運動性が向上することが確認された。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）疾患細胞モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
細胞損傷に関連する疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＤＭＤ疾患細胞モデルを作製した。要約すると、ＤＭＤ疾患は筋肉線維のジストロフィン欠乏により発症する筋肉疾患であるので、ジストロフィンに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉジストロフィン、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ）を入手し、それをメーカーの示す方法に従ってＣ２Ｃ１２筋芽細胞に導入し、ジストロフィン発現が抑制されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を作製した。ＤＭＤ疾患の病理症状によりジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を確認するために、ジストロフィン及びＣＴＧＦに特異的に結合するプライマーを作製し、前記ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ－ＰＣＲによりジストロフィン及びＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。また、ＣＴＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によりＣＴＧＦタンパク質発現を分析した。対照群としてＣ２Ｃ１２細胞株を用いた。発現分析の結果、図２７に示すように、ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株において、ＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィンの遺伝子発現が減少し、ＣＴＧＦの遺伝子及びタンパク質発現が増加することが確認された。
細胞損傷に関連する疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、ＤＭＤ疾患細胞モデルを作製した。要約すると、ＤＭＤ疾患は筋肉線維のジストロフィン欠乏により発症する筋肉疾患であるので、ジストロフィンに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉジストロフィン、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ）を入手し、それをメーカーの示す方法に従ってＣ２Ｃ１２筋芽細胞に導入し、ジストロフィン発現が抑制されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を作製した。ＤＭＤ疾患の病理症状によりジストロフィン及びＣＴＧＦ発現を確認するために、ジストロフィン及びＣＴＧＦに特異的に結合するプライマーを作製し、前記ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ－ＰＣＲによりジストロフィン及びＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。また、ＣＴＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によりＣＴＧＦタンパク質発現を分析した。対照群としてＣ２Ｃ１２細胞株を用いた。発現分析の結果、図２７に示すように、ｓｉジストロフィンを導入したＣ２Ｃ１２筋芽細胞株において、ＤＭＤ疾患細胞モデルのジストロフィンの遺伝子発現が減少し、ＣＴＧＦの遺伝子及びタンパク質発現が増加することが確認された。
前述したように作製したＤＭＤ疾患細胞モデルにおいて、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、実施例２のように作製したＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓと前述したように作製したＤＭＤ疾患細胞モデルを実施例４と同様に細胞融合し、その後細胞を回収して定量ＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロットによりジストロフィン及びＣＴＧＦの発現を分析した。分析の結果、図２８に示すように、ＤＭＤ疾患細胞モデルにおいて、ジストロフィン発現が減少し、ＣＴＧＦ発現が増加するのに対して、ＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓとＤＭＤ疾患細胞モデルが融合した細胞において、ジストロフィン発現が大幅に増加し、ＣＴＧＦ発現が大幅に減少することが確認された。
これらの結果は、ＨＮとＦタンパク質を過剰発現する細胞がＤＭＤ疾患細胞モデルと細胞融合し、細胞融合したＤＭＤ疾患細胞モデルが正常細胞に回復することを意味するものである。また、細胞融合したＤＭＤ疾患細胞モデルに正常なジストロフィン遺伝子が伝達され、ジストロフィンの発現が回復することを意味するものである。
ＤＭＤ疾患動物モデルにおけるＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの細胞融合を用いた治療効果の分析
ＤＭＤ疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＤＭＤ疾患動物モデルであるｍｄｘマウス（生後２～４週間）の提供を受けた。ｍｄｘマウスから骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行ったところ、図２９に示すように、ジストロフィンが減少することが確認された。次に、ｍｄｘマウスを対照群（ｓａｌｉｎｅ）、ＭＳＣ及びｆＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、ＭＳＣ群には緑色染料で標識したｈＡＴＭＳＣｓを、ｆＭＳＣ群には緑色染料で標識した実施例２のＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを０．５～２×１０６の細胞数で注入し、１週間後に骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）を分離した。次に、ｈＮｕｃｌｅｉ抗体（ａｂｃａｍ）で染色し、摘出した骨格筋において共焦点レーザ顕微鏡により生着能を分析した。また、注入して３週間後または１５週間後に骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行った。さらに、注入して１週間後に骨格筋を分離し、分離した骨格筋から全ＲＮＡを抽出して定量ＲＴ－ＰＣＲによりＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。
ＤＭＤ疾患において、ＨＮ／Ｆタンパク質を過剰発現する細胞による細胞融合を用いた治療効果を確認するために、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからＤＭＤ疾患動物モデルであるｍｄｘマウス（生後２～４週間）の提供を受けた。ｍｄｘマウスから骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行ったところ、図２９に示すように、ジストロフィンが減少することが確認された。次に、ｍｄｘマウスを対照群（ｓａｌｉｎｅ）、ＭＳＣ及びｆＭＳＣ群に分け、図２５に示すように、脊髄内注入方法により、対照群には塩類溶液（ｓａｌｉｎｅ）を、ＭＳＣ群には緑色染料で標識したｈＡＴＭＳＣｓを、ｆＭＳＣ群には緑色染料で標識した実施例２のＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓを０．５～２×１０６の細胞数で注入し、１週間後に骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）を分離した。次に、ｈＮｕｃｌｅｉ抗体（ａｂｃａｍ）で染色し、摘出した骨格筋において共焦点レーザ顕微鏡により生着能を分析した。また、注入して３週間後または１５週間後に骨格筋を分離し、ジストロフィン抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫組織化学を行った。さらに、注入して１週間後に骨格筋を分離し、分離した骨格筋から全ＲＮＡを抽出して定量ＲＴ－ＰＣＲによりＣＴＧＦ遺伝子発現を分析した。
その結果、図３０に示すように、ＭＳＣ群及びｆＭＳＣ群のそれぞれにおいて、ｈＡＴＭＳＣｓ及びＨＮ／Ｆ－ｈＡＴＭＳＣｓの生着能が緑色染料で確認された。また、図３１に示すように、ｆＭＳＣ群において、注入３週間後及び注入１５週間後にヒト正常ジストロフィンタンパク質発現が大幅に増加し、ジストロフィンタンパク質発現が持続することが確認された。さらに、図３２に示すように、ｆＭＳＣ群において、注入１週間後にＣＴＧＦ遺伝子発現が大幅に減少することが確認された。
これらの結果は、ｍｄｘマウスの筋肉でジストロフィンを正常に発現する細胞において、ＨＮ及びＦタンパク質によりジストロフィンが欠乏した筋細胞との細胞融合が高まり、細胞融合した筋細胞において、正常な筋細胞に回復することを意味するものである。
これらの結果は、ＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞がＨＮ及びＦタンパク質により損傷した細胞と融合し、損傷した細胞との融合によりＨＮ及びＦタンパク質過剰発現細胞内の転写調節因子を損傷した細胞の核内に伝達し、損傷した細胞において細胞修復に関与する遺伝子の発現が調節されることにより損傷した細胞が回復するので、ＨＮ及びＦタンパク質を用いた細胞融合技術により細胞損傷に関連する神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患を治療することができることを意味するものである。また、ＨＮ／Ｆタンパク質過剰発現細胞がＨＮ／Ｆタンパク質により遺伝子異常のある細胞と融合し、細胞融合により正常遺伝子が伝達されて発現するので、ＨＮ及びＦタンパク質を用いた細胞融合技術が遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の送達ツール（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏｏｌ）として用いられることを意味するものである。
本発明は、細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途に関し、具体的にはＨＮ及びＦタンパク質による細胞融合技術により細胞損傷を回復させて正常遺伝子を導入することができるので、ＨＮ及びＦタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターまたはそれで形質転換された細胞を、細胞損傷に関連する疾患、より具体的には神経変性疾患、神経疾患、筋肉変性疾患または筋肉疾患の治療に有効に用いることができる。
Claims (10)
- ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを有効成分として含有する、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患は、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、及びＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。 - 前記ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ及びＦタンパク質は、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ １）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＨＲＳＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記ベクターは、直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換え非ウイルス性ベクター、組換えウイルス性ベクター及び遺伝子発現誘導ベクターシステム（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記組換えウイルス性ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＨＮ）及びＦ（ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を有効成分として含有する、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患は、先天性筋ジストロフィー（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、遠位型筋ジストロフィー（ｄｉｓｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（Ｅｍｅｒｙ－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、及びＸ連鎖性拡張型心筋症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）からなる群から選択されることを特徴とする、筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。 - 前記細胞は、幹細胞、前駆細胞及び動物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞及び異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、骨格、筋肉、神経、骨膜、羊膜及び胎盤からなる群から選択される少なくとも１種の組織由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の筋細胞損傷または筋細胞死を誘発する筋肉変性疾患または筋肉疾患の予防または治療用薬学的組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022062691A JP2022104986A (ja) | 2018-07-02 | 2022-04-04 | 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 |
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20180076719 | 2018-07-02 | ||
| KR10-2018-0076719 | 2018-07-02 | ||
| KR10-2018-0089538 | 2018-07-31 | ||
| KR20180089538 | 2018-07-31 | ||
| KR1020190079666A KR102100490B1 (ko) | 2018-07-02 | 2019-07-02 | 세포융합 기술을 이용한 유전자 및 세포 치료제 및 이의 용도 |
| KR10-2019-0079666 | 2019-07-02 | ||
| PCT/KR2019/008081 WO2020009444A1 (ko) | 2018-07-02 | 2019-07-02 | 세포융합 기술을 이용한 유전자 및 세포 치료제 및 이의 용도 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022062691A Division JP2022104986A (ja) | 2018-07-02 | 2022-04-04 | 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021529218A JP2021529218A (ja) | 2021-10-28 |
| JP7300764B2 true JP7300764B2 (ja) | 2023-06-30 |
Family
ID=69158729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021521927A Active JP7300764B2 (ja) | 2018-07-02 | 2019-07-02 | 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3824894A4 (ja) |
| JP (1) | JP7300764B2 (ja) |
| KR (1) | KR102100490B1 (ja) |
| CN (2) | CN116870196A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170009464A (ko) | 2015-07-17 | 2017-01-25 | 서울대학교병원 | 헤마글루티닌-뉴라미니다아제와 f 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006204785B2 (en) * | 2005-01-13 | 2010-11-25 | Regenerx Biopharmaceuticals, Inc. | Method of treating or preventing tissue deterioration, injury or damage due to a neuro-, muscular- or neuro-muscular-degenerative disease, or restore tissue adversely affected by said disease |
| KR100679950B1 (ko) | 2005-05-18 | 2007-02-08 | 한훈 | 제대혈 유래 줄기세포와 만니톨을 이용한근위축성측삭경화증 환자의 세포치료용 조성물 |
| JPWO2007139178A1 (ja) * | 2006-05-31 | 2009-10-15 | ディナベック株式会社 | アルツハイマー病治療薬 |
| EP2054434B1 (en) * | 2006-08-03 | 2017-03-15 | Myostin Therapeutics Pty Ltd | Myostatin antagonists |
| KR100825864B1 (ko) | 2006-09-21 | 2008-04-28 | 부산대학교 산학협력단 | 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제 |
| GB2526339A (en) * | 2014-05-21 | 2015-11-25 | Imp Innovations Ltd | Lentiviral vectors |
-
2019
- 2019-07-02 JP JP2021521927A patent/JP7300764B2/ja active Active
- 2019-07-02 KR KR1020190079666A patent/KR102100490B1/ko active IP Right Grant
- 2019-07-02 EP EP19831381.9A patent/EP3824894A4/en active Pending
- 2019-07-02 CN CN202310900115.5A patent/CN116870196A/zh active Pending
- 2019-07-02 CN CN201980044907.9A patent/CN112384247B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170009464A (ko) | 2015-07-17 | 2017-01-25 | 서울대학교병원 | 헤마글루티닌-뉴라미니다아제와 f 단백질을 과발현하는 중간엽줄기세포 및 그 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3824894A4 (en) | 2022-04-20 |
| CN112384247A (zh) | 2021-02-19 |
| CN116870196A (zh) | 2023-10-13 |
| JP2021529218A (ja) | 2021-10-28 |
| CN112384247B (zh) | 2024-09-27 |
| EP3824894A1 (en) | 2021-05-26 |
| KR102100490B1 (ko) | 2020-04-13 |
| KR20200003745A (ko) | 2020-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11850288B2 (en) | Gene and cell therapy using cell fusion technology | |
| Dey et al. | Genetically engineered mesenchymal stem cells reduce behavioral deficits in the YAC 128 mouse model of Huntington's disease | |
| Halabian et al. | Lipocalin-2-mediated upregulation of various antioxidants and growth factors protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells against unfavorable microenvironments | |
| US20220401491A1 (en) | Mesenchymal stem cell expressing trail and cd, and use thereof | |
| US20220401518A1 (en) | Mesenchymal stem cell expressing hepatocyte growth factor, and use thereof | |
| An et al. | Neuroprotective effect of combined hypoxia-induced VEGF and bone marrow-derived mesenchymal stem cell treatment | |
| US20210155663A1 (en) | Mesenchymal stem cells expressing brain-derived neurotrophic factor and use thereof | |
| Devi et al. | Leber’s hereditary optic neuropathy: current approaches and future perspectives on Mesenchymal stem cell-mediated rescue | |
| Fan et al. | Enhancement of angiogenic effect of co-transfection human NGF and VEGF genes in rat bone marrow mesenchymal stem cells | |
| JP7300764B2 (ja) | 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 | |
| KR102285613B1 (ko) | 세포융합 기술을 이용한 유전자 및 세포 치료제 및 이의 용도 | |
| US20220282220A1 (en) | Method for preparation of immortalized stem cell line and use thereof | |
| JP2022104986A (ja) | 細胞融合技術を用いた遺伝子及び細胞治療剤、並びにその用途 | |
| US20220010280A1 (en) | A composition comprising mesenchymal stem cells for inhibiting adipogenesis | |
| WO2022153996A1 (ja) | 間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤 | |
| WO2024071382A1 (ja) | Ｇｌｐ－１分泌機能を有する多能性幹細胞及び幹細胞から分化誘導された細胞 | |
| RU2521225C2 (ru) | Способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных клеток крови пуповины человека | |
| WO2019027298A9 (ko) | Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 | |
| Del Vecchio et al. | Cellular genetic therapy | |
| KR20200047096A (ko) | 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물 | |
| KR101175460B1 (ko) | 사이클린 의존성 인산화효소의 발현 또는 활성 억제제의 존부를 조절하여 성체 줄기세포와 신경세포 간의 분화를 유도하는 방법 | |
| US20180201899A1 (en) | Ipsc-ec performance enhancement via sirt1 overexpression | |
| Alvarez | Stem Cell Biology and Strategies for Therapeutic Development in Degenerative Diseases and Cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210205 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210205 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220104 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220404 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220816 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221115 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230214 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230419 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20230419 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230426 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230523 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230613 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7300764 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |