KR20200047096A

KR20200047096A - 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물

Info

Publication number: KR20200047096A
Application number: KR1020180129120A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 최혜연; 아메드 아브달; 김송철; 심인경; 이송
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-05-07
Also published as: KR102184341B1

Abstract

본 발명은 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물, 상기 조성물로 생성된 역분화 만능 유도세포를 포함하는 세포치료제, 상기 역분화 만능 유도세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물은 단일 가닥의 불안정한 mRNA를 세포 내로 효과적으로 도입할 수 있으며, 도입된 mRNA 는 일정 시간 후 자연적으로 세포에서 분해되어 숙주 세포의 DNA에 통합(integration) 되는 것을 피할 수 있어 안정적으로 역분화 만능 유도세포를 생성한다. 또한, 정상뿐 만 아니라 환자로부터 분리된 세포 또한 효과적을 역분화 만능 유도세포로 생성할 수 있는 효과가 있어, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

역분화 만능 유도세포 유도용 조성물{Composition for inducing dedifferentiation for induced pluripotent stem cells}

본 발명은 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물, 상기 조성물로 생성된 역분화 만능 유도세포를 포함하는 세포치료제, 상기 역분화 만능 유도세포의 제조 방법에 관한 것이다.

역분화 만능 유도세포 기술은 현재 다양한 난치병 치료를 위한 재생 의학의 유망한 기술로 간주되고 있다. 역분화 만능 유도세포는 배아 줄기세포를 이용에 의한 많은 윤리적문제와 치료제로 사용 시의 여러 문제들을 해결 할 수 있다. 이러한 장점으로 인해 역분화 만능 유도세포는 다양한 줄기세포 치료법을 환자에게 적용할 수 있고 이때 발생되는 면역 거부 반응을 피할 수 있어 활용성이 높다. 이러한 역분화 만능 유도세포는 비 바이러스 방법(episomal 벡터, 센다이 바이러스, PiggyBac transposon, small molecules 등)과 바이러스 방법(렌티 바이러스, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스 등)을 통해 줄기세포 유도 전사 인자(Oct4, Sox2, Myc, Nanog, Klf4, Lin28 등)를 세포에 형질 도입함으로써 세포의 재 프로그램을 통해 생성하는 것으로 보고되었다[(Abdal Dayem, Nanomaterials 2018, 8, 761.), (Zulliger, R., Journal of Controlled Release 2015, 219, 471-487.), (Okita, K., Science 2008, 322, 949-953.), (Lee, C.H., Biomaterials 2011, 32, 6683-6691.), (Takahashi, K, cell 2007, 131, 861-872.)]. 그러나 종래 방법들은 줄기세포 유도 전사 인자들의 도입 방법에 따라 숙주의 유전자에 돌변 변이를 유도하거나, 형질 전환 효율이 낮은 다양한 문제점들을 가지고 있어 역분화 만능 유도세포의 생성 방법이 필요한 실정이다.

당뇨병은 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성에 의한 고혈당을 특징으로 발생되는 만성 대사성 질환으로 크게 제1형 당뇨병 (T1D)과 제2형 당뇨병 (T2D)으로 분류된다. T1D는 주로 췌장 베타 세포의 면역 매개 손상에 면역계가 이상 작동하여 인슐린을 생산하는 베타세포를 공격하여 유발되며 어린이 및 성인에서 발생되고, T2D는 인슐린 분비 저하와 인슐린 저항성으로 인해 생기며, 이 두 가지 인자의 관여 정도에 따라 인슐린 분비부족 우위 당뇨병과 인슐린 저항성 우위 당뇨병으로 나뉜다[Choi, H.Y., Journal of Controlled Release 2016, 235, 222-235]. 현재 전 세계적으로 1억 7000만 명이 당뇨병을 앓고 있으며 2030년에는 숫자가 2배로 증가한다고 예상되고 있다. 상기의 설명과 같이 인슐린이 생성되지 못하거나 생성된 인슐린이 정상 작용을 하지 못해 혈당 조절이 할 수 없으므로, 치료를 위해서 환자들은 주기적인 혈당 측정과 인슐린 주사가 유일한 치료법이다. 그러나 이러한 치료방법은 다양한 부작용을 동반하기 때문에 효과적인 다른 치료제의 개발이 시급하다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결 할 수 있는 효율적인 역분화 만능 유도세포를 제조하기 위하여, 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 및 목적 유전자를 암호화하는 RNA로 형성된 복합체를 개발하였다. 상기 복합체는 형질 전환 효율 및 역분화 만능 유도세포 생성 효율이 높고, 정상뿐 만 아니라 환자로부터 분리된 세포 또한 효과적을 역분화 만능 유도세포로 생성할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 역분화 만능 유도세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs) 유도용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 세포치료제를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 역분화 만능 유도세포의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 및 목적 유전자를 암호화하는 RNA가 결합되어 형성된 복합체를 포함하는, 역분화 만능 유도세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs) 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물로 생성된 역분화 만능 유도세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 용액을 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO) 용액에 첨가하여, GO-PEI 복합체를 형성시키는 단계; (b) Oct3, Nanog, Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 각각 발현되는 세포들에서 total RNA를 분리하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 GO-PEI 복합체에 상기 (b) 단계의 total RNA를 넣어 GO-PEI-RNA 복합체를 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 GO-PEI-RNA 복합체를 인간 세포를 제외한 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 역분화 만능 유도세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물은 단일 가닥의 불안정한 mRNA를 세포 내로 효과적으로 도입할 수 있으며, 도입된 mRNA 는 일정 시간 후 자연적으로 세포에서 분해되어 숙주 세포의 DNA에 통합(integration) 되는 것을 피할 수 있어 안정적으로 역분화 만능 유도세포를 생성한다. 또한, 정상뿐 만 아니라 환자로부터 분리된 세포 또한 효과적을 역분화 만능 유도세포로 생성할 수 있는 효과가 있어, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 환자 혈액에서 추출한 말초혈액 단핵 세포 분리 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 환자 유래 피부 섬유아세포 분리 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 환자에서 유래한 췌도 유래 중간엽줄기세포 분리 방법을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체를 이용한 역분화 만능 유도세포 생산 방법을 모식화한 도이다.
도 5는 센다이바이러스를 이용한 역분화 만능 유도세포 생산 방법을 모식화한 도이다.
도 6은 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체와 센다이바이러스를 이용하여 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)(A), 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)(B)로부터 생산된 역분화 만능 유도세포의 알칼라인 포스파타제 활성도와 콜로니 형태를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체와 센다이바이러스를 이용하여 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)(A), 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)(B)로부터 생산된 역분화 만능 유도세포의 줄기세포성 마커 발현 수준을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체와 센다이바이러스를 이용하여 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)(A), 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)(B)로부터 역분화 만능 유도세포의 줄기세포성 마커의 면역형광 염색 결과를 확인한 도이다.

본 발명은 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 및 목적 유전자를 암호화하는 RNA가 결합되어 형성된 복합체를 포함하는, 역분화 만능 유도세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs) 유도용 조성물을 제공한다.

상기 목적 유전자는 역분화 만능 유도세포를 유도할 수 있는 다능성(pluripotency) 관련 유전자이고, 바람직하게는 Oct3, Nanog, Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 더욱 바람직하게는 Oct3, Nanog 및 Sox2이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 목적 유전자를 세포 내로 도입시킬 수 있으나 세포 내 게놈으로 목적 유전자를 삽입하지 않으며, 이는 본 발명의 조성물은 도입된 RNA는 일정 시간 후 자연적으로 세포에서 분해되어 숙주 세포의 DNA에 통합(integration) 되는 것을 피할 수 있어 안정적으로 역분화 만능 유도세포를 생성할 수 있다.

상기 조성물은 췌장베타세포, 피부세포, 심근세포, 뇌세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 간세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에 처리할 수 있으나, 바람직하게는 췌장베타세포 및 피부세포이고, 상기 세포는 정상뿐 만 아니라, 환자로부터 분리된 세포일 수 있다.

상기 그래핀 옥사이드 및 폴리에틸렌이민은 RNA와 1 내지 40의 N/P 비율로 결합될 수 있고, 바람직하게는 25 내지 35의 N/P 비율이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리에틸렌이민은 1 내지 40kDa이고, 바람직하게는 20 내지 30kDa이고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "역분화 만능 유도세포(induced pluripotent stem cell)"는 재프로그램 인자의 발현 또는 발현 유도에 의해 체세포를 재프로그램하여 생성된 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. 역분화 만능 유도세포는 태아, 출생후(postnatal), 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 역분화 만능 유도세포는 RPE 세포 또는 다른 세포 타입으로의 분화가 시작되기 전에 새로이 생성될 수 있다(당업계 공지 방법에 의해). 역분화 만능 유도세포는 조직-매칭된 RPE 세포를 생성할 목적으로 특정 환자 또는 매칭된 공여자로부터 온 물질을 사용하여 특이적으로 생성될 수 있다. 역분화 만능 유도세포는 의도된 수여자에서 실질적으로 면역원성이 아닌 세포, 예를 들면 자가세포 또는 의도된 수여자에 세포 조직적합한 세포에서 제조된 세포에서 제조될 수 있다. 추가적 예시로서, 역분화 만능 유도세포는 체세포 또는 다른 세포를 하나 이상의 재프로그램 인자로 세포를 접촉하여 재프로그램함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 재프로그램 인자는 세포에 의해, 예를 들면, 세포에 부가된 외인성 핵산으로부터, 또는 소분자 등 그 유전자 발현을 촉진 또는 유도하는 인자에 반응하는 내인성 유전자로부터 발현될 수 있다(Suh and Blelloch, Development 138, 1653-1661 (2011); Miyosh et al., ell Stem Cell (2011), doi:10.1016/j.stem.2011.05.001; Sancho-Martinez et al., Journal of Molecular Cell Biology (2011) 1-3; Anokye-Danso et al., Cell Stem Cell 8, 376-388, April 8, 2011; Orkin and Hochedlinger, Cell 145, 835-850, June 10, 2011 참조) 재프로그램 인자는 외인성 공급원, 예를 들면, 배양 배지에 추가하고 세포 내로 당업계에 알려진 방법 예컨대 세포 도입 펩타이드, 단백질 또는 핵산 트랜스팩션제, 리포펙틴과의 커플링, 전기천공, 유전자총, 마이크로주입법 등에 의해 도입됨으로써 제공될 수 있다.

상기 세포치료제는 췌장베타세포, 피부세포, 심근세포, 뇌세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 간세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 재생시키거나 이식하는 것이고, 바람직하게는 췌장베타세포, 피부세포이고, 상기 세포는 정상뿐 만 아니라, 환자로부터 분리된 세포일 수 있다.

본 발명의 용어, "세포치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직 재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.

본 발명의 세포 치료제는 약학 조성물로 이용될 수 있으며, 약학 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 준비 및 배양

1-1. 역분화 만능 유도세포 배양

역분화 만능 유도세포는 feeder-free system 조건에서 10μM Y27632 (ROCK 억제제, Tocris Bioscience)가 보충된 mTeSR? 1 배지(StemCell Technologies, Vancouver, BC Canada)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 또한, 본 발명의 역분화 만능 유도세포의 검증을 위한 positive control로 RIKEN BioResource 센터 세포 은행(HPS0076)을 통해 교토 대학에서 제공 한 409B2 hiPSCs 라인을 사용하였다. 또한, hiPSC의 계대 배양을 위해 Accutase(Stem cell Technologies)를 처리한 세포는 24시간 동안 마트리젤 (Matrigel, BD Biosciences, SanJose, CA, USA)이 코팅된 배양 플레이트에서 배양한 후 feeder-free system 으로 교체하였다.

1-2. 환자 유래 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 분리

도 1에 나타낸 바와 같이, 환자 유래 말초혈액 단핵 세포를 분리하기 위하여, 구체적으로, 제공된 환자 유래 혈액은 Ficoll-Plaque PLUS(GE Healthcare)를 통한 밀도 구배 원심 분리 방법을 사용하여 분리하였다. 10ml의 혈액을 25ml 인산 완충 생리 식염수(PBS)와 혼합한 후, 15ml Ficoll-Plaque을 첨가한 후 400g에서 30분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 밀도 구배 층으로 원심 분리된 PBMC를 새로운 튜브에 옮긴 후 50ml PBS로 2번 세척 후 300g에서 10분간 원심 분리하였다. 상기 세포들은 RPMI1640(GIBCO-BRL)에 인터류킨 2(10U / mL) 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

1-3. 환자 유래 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts) 세포 (HDFs) 분리

도 2에 나타낸 바와 같이 환자 유래 피부 섬유아세포를 분리하기 위하여, 구체적으로, 세포 분리를 위해 환자의 피부를 2.5 cm X 1cm를 잘라내 PBS로 3 회 세척하였다. 그 후, 메스를 이용하여 잘게 자른 후 Dulbecco 's modified Eagle 's (DMEM, Gibco-BRL)에 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, 100 U / ml, Gibco-BRL)과 5% FBS를 첨가한 배지에 1,000 U/ml Collagenase I(Invitrogen)을 처리하여 1시간 30분 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시켰다. 그 후 2,000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후, PBS로 3회 세척하였다. 분리된 섬유아세포는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.

1-4. 환자 유래 췌장 성체 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC) 분리

도 3에 나타낸 바와 같이, 환자 d래 췌장 성체 줄기 세포를 분리하기 위하여, 췌장 성체 줄기세포 분리에 사용된 조직은 췌장 절제술을 받는 환자의 동의를 얻어 환자의 정상 췌장 조직만을 분리하여 사용하였다. 분리된 췌장 조직에 Collagenase P (Invitrogen)를 췌장관에 직접 주입하고, Ricordi Chamber에 넣어 37℃에서 주입한 Collagenase P 용액을 순환시키면서 반응시켰다. Collagenase P 용액을 순환 시키는 동안 분리된 islet세포를 분리하였다. 이때, 췌도(islet) 세포는 세포 손상을 막기 위하여 빠르게 디티존(dithizone (DTZ))으로 베타세포를 염색한 후 분리하였다. 분리된 췌도(islet) 세포액은 COBE 2991 장치를 사용하여 농도 구배에 따른 세포층을 나누어 DTZ로 염색된 순수한 췌도(islet) 세포를 확인 후 세포 수와 양을 기록하고 세포를 분리하였다. 분리한 췌도(islet) 베타 세포(췌장 성체줄기세포)는 10% FBS와 1% P/S가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.

<실시예 2> 역분화 만능 유도세포 생성

2-1. 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체 및 역분화 만능 유도세포 생성

도 4에 나타낸 바와 같이, GO-PEI/mRNA 복합체를 이용한 역분화 만능 유도세포를 생산하였다.

먼저, GO-PEI 복합체를 제작 하였다. 구체적으로, 25kDa PEI 용액(1 mg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 GO 용액(0.1 mg/ml) (Graphene Supermarket, Calverton, NY, USA)에 10분간 천천히 첨가하였다. 약 10분간의 초음파 처리 후에, 상기 혼합물을 오버나잇으로 교반하고, 원심분리를 이용하여 탈이온수로 5회 세척한 후 탈이온수에서 재분산시켰다.

이 후, GO-PEI/mRNA 복합체를 제작하였다. 구체적으로, GO-PEI와 RNA(Oct3, Nanog, Sox2의 3가지 total RNA 를 각각 0.5 ug씩)의 복합체 형성을 위한 조건을 확립하기 위하여 gel retardation 어세이를 수행하였다. GO-PEI와 RNA의 복합체 형성을 식별하기 위하여 GO-PEI의 다른 N/P 비율(0, 7.5, 15, 30, 및 45)과 2ug 의 total RNA 복합체를 아가로즈 겔 전기영동 분석법을 통하여 분석하였다. GO-PEI 및 RNA 혼합물을 실온에서 20분간 배양한 후, 시료들을 65℃에서 10분간 가열하였다. GO-PEI RNA 복합체는 EtBr 염색된 1% (w/v) 아가로즈 겔에서 전기영동으로 확인할 수 있었다. 겔은 gel documentation system (GL 2200 PRO Imaging system, CARESTREAM, Rochester, NY, USA)을 사용하여 판독하였다. 그 결과 GO-PEI 30 N/P 비율과 복합체를 이룬 것에서 상당한 지연을 보인 것을 확인할 수 있었으므로, N/P 30 비율의 GO-PEI와 2 ug RNA 복합체를 사용하였다. 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체는 혈청이 없는 DMEM 배지에 넣고 4℃에서 30분 동안 반응한 후, 상기 실시예 1에서 준비한 환자 유래 말초혈액 단핵 세포 (PBMC), 환자 유래 피부 섬유아세포 세포 (HDFs) 또는 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)에 처리하였다. 역분화 만능 유도세포의 생성 효율은 생성된 콜로니의 수와 초기 형질 전환시킨 세포 수를 반영하여 계산하였다.

2-2. 센다이 바이러스 및 이를 이용한 역분화 만능 유도세포 생성

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체와 비교할 수 있는 대조군으로서, RNA를 형질 전환하는 방법인 센다이 바이러스를 이용한 방법을 함께 실험하여 비교 분석하였다.

구체적으로, 말초혈액단핵구를 CytoTune®-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(Life Technologies)를 통해 형질전환 하였고, 센다이바이러스 키트는 Oct4와 Sox2, Klf4, c-Myc, 즉 야마나카 인자가 인코딩된 리프로그래밍 백터가 바이러스안에 함유되어 있다. 형질전환 전 4일 동안 세포를 12 well 배양 플레이트에 각 well마다 5Х10⁵씩 배양하며, 배지는 20% 넉아웃된 혈정 대체제(KOSR; knockout serum replacement)과 사이토카인(SCF, FLT-3, IL-3, IL-6)이 첨가된 IMDM을 첨가하였다. 이후 적절한 MOI에 맞게 센다이바이러스를 24시간 처리해 주었다. 형질전환된 세포는 마트리젤로 표면처리가 된 6 well 플레이트에 옮기고 역분화 만능 유도세포 전용 배지(20% KOSR과 1mM 비필수아미노산 1mM GlutaMax, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 KO/F12 배지)로 배양하였다. 8일 후, 콜로니가 형성(도5의 A)되기 전까지, bFGF가 첨가된 역분화 만능 유도세포 전용 배지로 바꾸었다. 도5의 B에 나타낸 바와 같이, 인간피부세포나 췌도 유래 중간엽줄기세포도 마찬가지로 센다이바이러스를 통해서 리프로그래밍하였다.

<실시예 3> 알칼리 포스파타제 (Alkaline phosphatase, AP) 활성 분석 및 염색

본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체를 이용한 역분화 만능 유도세포의 생성을 확인하기 위하여, 센다이 바이러스가 도입-역분화 만능 유도세포와 Yamanaka-역분화 만능 유도세포를 대조군으로 두었다.

구체적으로, 알칼리 포스파타아제 염색 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 세포의 고정 및 투과성 처리는 아세톤, 포르말린 및 시트르산 고정액으로 수행한 다음 나프톨 및 패스트 레드 알칼리 용액으로 염색하였다. AP 활성 분석은 fluorometer를 이용해 분석했고, 염색된 세포는 위상차 현미경 (Olympus)으로 측정하였다.

도 6의 A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포는(hR-iPSC-L1, hR-iPSC-L2) 알칼라인 포스파타제 활성도와 콜로니 형태가 배아줄기세포와 유사함을 확인하였다. 또한, 양성 대조군인 센다이 바이러스가 도입된 역분화 만능 유도세포(hR-SeV-L1, hR-SeV-L2)와 비교하여도 유사함을 확인하였다.

또한, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포는(hR-iPSC-L1, hR-iPSC-L2) 알칼라인 포스파타제 활성도와 콜로니 형태가 배아줄기세포와 유사함을 확인하였다. 또한, 양성 대조군인 센다이 바이러스가 도입된 역분화 만능 유도세포(hR-SeV-L1, hR-SeV-L2)와 비교하여도 알칼라인 포스파타제 활성도 및 콜로니 형태가 더 우수함을 확인하였다.

<실시예 4> 역분화 만능 유도세포 생성 효율 확인

환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)와, 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(베타 세포)(Islet-MSC)에 본 발명의 GO-PEI/RNA 복합체와 센다이바이러스를 도입하여 생성된 역분화 만능 유도세포의 효율을 비교하였다. 구체적으로, 콜로니 수, 역분화 만능 유도세포 수, 효율(%)를 확인하였으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/RNA 복합체는 양성 대조군인 센다이바이러스 도입 방법과 비교하여, 2-3배 이상의 콜로니 수, 역분화 만능 유도세포 수, 효율(%)가 나타남을 확인하였다.

<실시예 5> 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 분석

트리졸(Trizol, Invitrogen)을 이용해서 RNA를 추출하고, 2 ug RNA를 Super Script II (Invitrogen) kit을 이용하여 역전사 및 cDNA를 합성하였다. 본 실시예에 사용된 DNA 프라이머는 Primer3 소프트웨어를 사용해서 디자인하였다. Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Stockholm, Sweden)를 이용해서 정량적 실시간 역정사 중합 효소 연쇄 반응을 하고, 데이터는 하우스 키핑 유전자인 GAPDH의 발현 정도를 기반으로 표준화하였다. Oct4, Nanog 및 Sox2 유전자에 대한 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 외인성 및 내인성 수준을 확인하였으며, 외인성 수준을 확인하기 위하여, 센다이바이러스에 대한 프라이머를 사용하였다.

Gene name	Forward	Reverse
Oct4	CGC AAG CCC TCA TTT CAC	CAT CAC CTC CAC CAC CTG
Nanog	TCC TGA ACC TCA GCT ACA AAC	GCG TCA CAC CAT TGC TAT TC
Sox2	CAT CAC CCA CAG CAA ATG AC	GAA GTC CAG GAT CTC TCT CAT AAA
SeV	GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C	AAC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
GAPDH	AAT CCC ATC ACC ATC TTC CAG	ATG ACC CTT TTG GCT CCC

도 7의 A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포에서는(hR-iPSC-L1, hR-iPSC-L2) Oct4, Nanog 및 Sox2 발현이 높음을 확인하였다. 또한, 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포에서는(hR-iPSC-L1, hR-iPSC-L2) Oct4, Nanog 및 Sox2 발현이 높음을 확인하였다.

또한, 내인성과 외인성 3가지 (Oct4, Sox2, Nanog) 유전자 발현을 확인한 결과 역분화 만능 유도세포 자체에서 발현하는 (내인성) 유전자의 발현만 확인되었고, 외부에서 도입시킨 (외인성) 3가지 유전자의 발현은 나타나지 않음을 확인하였다.

<실시예 6> 면역 세포 화학 염색(immunocytochemistry, ICC) 분석

면역 세포 화학 염색을 위해, 세포는 상온에서 20분 동안 4% 파라포름 알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 고정 한 후, PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 고정된 세포는 0.1 % Triton X-100으로 15 분간 투과성을 주고, PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 세포는 블로킹 용액(10 % 정상 염소 혈청)으로 상온에서 1 시간 동안 세포를 블로킹하였다. 배아줄기세포 특이 마커인 Oct4 와 Nanog 발현을 확인하기 위하여, OCT4 (polyclonal, 1 : 300, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 및 NANOG (polyclonal, 1 : 300, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)의 1 차 항체로 염색 후 1차 항체 검출을 위해 Fluorescently labeled (Alexa Fluor 488 또는 568, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 2 차 항체를 사용함. 세포는 형광 현미경 (Olympus)으로 분석하였다.

도 8의 A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 췌장 성체 줄기세포(Islet-MSC)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포에서는(hR-iPSC-L1) 배아줄기세포 특이 마커인 Oct4 와 Nanog이 뚜렷하게 염색됨을 확인하였다.

또한, 도 8의 B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GO-PEI/mRNA 복합체가 도입된 환자 유래 피부 섬유아세포 세포(HDFs)로부터 생성된 역분화 만능 유도세포에서는(hR-iPSC-L1) 배아줄기세포 특이 마커인 Oct4 와 Nanog이 뚜렷하게 염색됨을 확인하였다.

양성 대조군으로서 센다이바이러스 또는 Yamanaka가 도입된 HDFs 및 MSC에서 생성된 역분화 만능 유도세포와 비교해보았을 때, 본 발명의 역분화 만능 유도세포는 상기 양성 대조군과 비교하여 염색 발광 정도가 균일하고, 콜로니의 수가 높음을 확인하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Composition for inducing dedifferentiation for induced pluripotent stem cells <130> PN1810-424 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct4 <400> 1 cgcaagccct catttcac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct4 <400> 2 catcacctcc accacctg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 tcctgaacct cagctacaaa c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 gcgtcacacc attgctattc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sox2 <400> 5 catcacccac agcaaatgac 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sox2 <400> 6 gaagtccagg atctctctca taaa 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SeV <400> 7 ggatcactag gtgatatcga gc 22 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SeV <400> 8 aacagacaag agtttaagag atatgtatc 29 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 aatcccatca ccatcttcca g 21 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 atgacccttt tggctccc 18

Claims

그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 및 목적 유전자를 암호화하는 RNA가 결합되어 형성된 복합체를 포함하는, 역분화 만능 유도세포(induced Pluripotent Stem cells, iPSCs) 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 목적 유전자는 역분화 만능 유도세포를 유도할 수 있는 다능성(pluripotency) 관련 유전자인 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 다능성 관련 유전자는 Oct3, Nanog, Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 목적 유전자를 세포 내로 도입시킬 수 있으나 세포 내 게놈으로 목적 유전자를 삽입시키지 않는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 췌장베타세포, 피부세포, 심근세포, 뇌세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 간세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에 처리하여 역분화 만능 유도세포를 유도하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 그래핀 옥사이드 및 폴리에틸렌이민은 RNA와 1 내지 40의 N/P 비율로 결합된 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 1 내지 40kDa인 것인, 조성물.
제1항의 역분화 만능 유도세포 유도용 조성물로 생성된 역분화 만능 유도세포를 포함하는 세포치료제.
제8항에 있어서, 세포치료제는 췌장베타세포, 피부세포, 심근세포, 뇌세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 간세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 재생시키거나 이식하는 것인, 세포치료제.
(a) 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI) 용액을 그래핀 옥사이드(graphene oxide: GO) 용액에 첨가하여, GO-PEI 복합체를 형성시키는 단계;
(b) Oct3, Nanog, Sox2, Oct4, c-Myc 및 Klf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 각각 발현되는 세포들에서 total RNA를 분리하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 GO-PEI 복합체에 상기 (b) 단계의 total RNA를 넣어 GO-PEI-RNA 복합체를 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 GO-PEI-RNA 복합체를 인간 세포를 제외한 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 역분화 만능 유도세포의 제조방법.