WO2022153996A1

WO2022153996A1 - 間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤

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Publication number: WO2022153996A1
Application number: PCT/JP2022/000658
Authority: WO
Inventors: 輝黒木; スムリティアーリャ; 嘉銘蔡
Original assignee: ロート製薬株式会社
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2022-07-21
Also published as: CN116745407A; JPWO2022153996A1

Abstract

本発明は、上述のような状況の中、間葉系幹細胞を用いた新規の抗炎症剤及び神経疾患治療剤を提供することを目的とする。　本発明は、ＳＩＲＴ１を高発現することを特徴とする間葉系幹細胞である。また、ＢＤＮＦを高発現することを特徴とする間葉系幹細胞も含む。さらに、これらを含む抗炎症剤及び神経疾患治療剤も本発明に含まれる。

Description

間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤

　本発明は、間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤に関する。

　間葉系幹細胞は、１９８２年にＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎによって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１参照）。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。そのため、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。

　再生医療では幹細胞製品を使用した臨床研究は、幅広い分野で行われている。自家細胞及び他家細胞の移植において、安全上の問題が発生したという報告はほとんどなく、安全性が高いことが知られている。そのような中、間葉系幹細胞を用いた臨床試験も数多く行われているが、最近では大腸炎、心臓修復、急性腎障害、虚血性脳卒中、ＡＲＤＳ（急性呼吸不全）、重症下肢虚血及びＭＳ（多発性硬化症）についての臨床試験が失敗に終わっており（非特許文献２）、間葉系幹細胞の有効性に課題があることがわかってきている。このため、間葉系幹細胞への特定の遺伝子の導入や培養条件の工夫、投与前のプレコンディションの調整等の検討が行われている。

Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｆ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），２８４，ｐｐ．１４３－１４７Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２０１５），ｖｏｌ．１７（１），ｐｐ．１１－２２

　本発明は、上述のような状況の中、間葉系幹細胞を用いた新規の抗炎症剤及び神経疾患治療剤を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、ＳＩＲＴ１を高発現することを特徴とする、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ（ｓｔｒｏｍａｌ）　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）が、炎症性疾患及び神経疾患の治療に有効であることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、炎症性疾患及び神経疾患の治療のために有効な治療剤を提供できる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。

［１］ＳＩＲＴ１を高発現することを特徴とする、間葉系幹細胞。
［２］ＢＤＮＦを高発現することを特徴とする、間葉系幹細胞。
［３］臍帯組織由来である、［１］又は［２］に記載の間葉系幹細胞。
［４］［１］から［３］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含有する抗炎症剤。
［５］［１］から［３］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含有する神経疾患治療剤。

　本発明によると、新規な抗炎症剤及び神経疾患治療剤、並びに新規な炎症性疾患及び神経疾患の治療方法を提供することができる。

図１は、臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃｔｒｌ）及びＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１）のＳＩＲＴ１発現を示す図である。図２は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１細胞との共培養によるＴＨＰ１細胞内ＴＮＦα遺伝子発現の抑制効果を示す図である。図３は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１細胞との共培養によるＴＨＰ１細胞内ＴＮＦα遺伝子発現の抑制効果を示す図である。図４は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１細胞との共培養によるＴＨＰ１細胞内ＴＮＦα濃度の低減効果を示す図である。図５は、ＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１とを共培養した時の上清中のＴＮＦα濃度を示す図である。図６は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１細胞との共培養によるＴＨＰ１細胞内ＴＮＦα遺伝子発現の抑制効果の比較を示す図である。図７は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＭＳＣ群）とＴＨＰ１とを共培養した時の上清中のＢＤＮＦ濃度を示す図である。横軸（ｈ）はトランスフェクション後の時間を示す。図８は、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＭＳＣ群）又はＳＩＲＴ１をトランスフェクションした脂肪由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１ＡＤＭＳＣ群）のＴＨＰ１細胞との共培養によるＴＨＰ１細胞内ＣＤ２０６遺伝子発現の比較を示す図である。図９は、無血清培地で培養した臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃｔｒｌ）及びＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１）におけるトランスフェクション２４時間後のＳＩＲＴ１発現を示す図である。図１０は、無血清培地で培養した臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃｔｒｌ）及びＳＩＲＴ１をトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１）におけるトランスフェクション７２時間後のＳＩＲＴ１発現を示す図である。

　以下、本発明の間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤について詳細に説明する。

＜間葉系幹細胞＞
（ＳＩＲＴ１高発現間葉系幹細胞）
　本発明の間葉系幹細胞は、ＳＩＲＴ１（Ｓｉｒｔｕｉｎ１、サーチュイン１）を高発現することを特徴とする。ＳＩＲＴ（Ｓｉｒｔｕｉｎ，サーチュイン）はＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）のクラスIIIに属しており、タンパク質のリジン残基をＮＡＤ＋依存的に脱アセチル化する酵素である。ヒトＳＩＲＴ１は、ゲノムの安定性、ＤＮＡ修復、ｐ５３を介したアポトーシスの誘導、脂肪生成、老化等、細胞における多くの重要なプロセスに関わることが知られている。

　本発明においてＳＩＲＴ１の由来は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等の哺乳類であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、他の細胞に比べ、ＳＩＲＴ１の遺伝子及び／又はタンパクを高発現している間葉系幹細胞であればよいが、具体的には、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞に比べて、ＳＩＲＴ１遺伝子及び／又はタンパクを高発現していればよく、好ましくは従来の間葉系幹細胞に比べ、ＳＩＲＴ１遺伝子発現が１０倍以上、好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上、さらに好ましくは５０００倍以上高ければよい。本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞に比べて、ＳＩＲＴ１タンパク発現が、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上高ければよい。ここで、従来の間葉系幹細胞とは、従来の培養条件下（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地による培養）で得られる間葉系幹細胞をいう。また、本発明の間葉系幹細胞は、他の細胞に比べて、ＳＩＲＴ１を高発現していればよく、例えば、本発明の間葉系幹細胞は、ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞もしくはヒト小気道上皮細胞に比べ、ＳＩＲＴ１遺伝子を高発現していればよく、好ましくはヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞もしくはヒト小気道上皮細胞に比べ１０倍以上、好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上高ければよい。本発明の間葉系幹細胞は、ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞もしくはヒト小気道上皮細胞に比べＳＩＲＴ１タンパク発現が、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上高ければよい。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、ＳＩＲＴ１遺伝子を導入した間葉系幹細胞である。本発明の間葉系幹細胞は、外部から人工的にＳＩＲＴ１遺伝子を導入して強制発現させることにより、ＳＩＲＴ１を高発現するようになった細胞であることを特徴とする。ここで、ＳＩＲＴ１遺伝子は間葉系幹細胞に一過性に発現させたものであってもよいし、安定的に発現させたものであってもよい。

　本発明において、間葉系幹細胞に導入するＳＩＲＴ１遺伝子は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等の哺乳類由来であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。具体的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の遺伝子データベースにＳＩＲＴ１遺伝子として登録されている遺伝子が挙げられ、例えばＮＭ＿０１２２３８．４として登録されているヒトＳＩＲＴ１遺伝子が好ましい例として挙げられる。間葉系幹細胞に導入するＳＩＲＴ１遺伝子は、間葉系幹細胞での発現に必要なプロモーター配列等を有していてもよい。

　間葉系幹細胞へのＳＩＲＴ１遺伝子の導入方法としては、特に制限はないが、例えば合成したｍＲＮＡを用いる方法、ベクターを用いる方法等が挙げられる。

　合成したｍＲＮＡを間葉系幹細胞に導入する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができ、例えば、リポソームを用いる方法（この方法のためのトランスフェクション試薬が多数市販されている）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

　上記ベクターを用いる方法におけるベクターとしては、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター等が挙げられる。上記ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。上記非ウイルスベクターの具体例としては、プラスミドベクター、エピゾーマルベクター等が挙げられる。ベクターを間葉系幹細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。

　上記ベクターは、ＳＩＲＴ１遺伝子の導入を確認するためのマーカー遺伝子を含んでいてもよい。上記マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。上記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

　上記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。上記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。上記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。上記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、特定の条件で培養すること等によりＳＩＲＴ１遺伝子及び／又はタンパクの発現が増強した間葉系幹細胞である。例えば、レスベラトロール等のポリフェノールがＳＩＲＴ１の発現を誘導を行うと言った、ＳＩＲＴ１の発現を誘導できる特定の培養方法、或いは特定の培地等による培養を行うことにより、間葉系幹細胞におけるＳＩＲＴ１の発現を誘導し、ＳＩＲＴ１の発現が高い間葉系幹細胞を取得することもできる。また、ＳＩＲＴ１遺伝子の及び／又はタンパクの発現が増強した間葉系幹細胞をセルソーター、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離することで、よりＳＩＲＴ１の発現が高い間葉系幹細胞を取得することができる。

（ＢＤＮＦ高発現間葉系幹細胞）
　本発明の間葉系幹細胞は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）を高発現することを特徴とする。ＢＤＮＦは、脳由来神経栄養因子であり、ニューロトロフィンファミリーに属する神経栄養因子である。ニューロトロフィン、特にＢＤＮＦは、軸索を逆行性だけでなく順行性にも輸送され神経終末から放出されてシナプス後細胞に対しても影響を及ぼすことが明らかにされている。

　本発明においてＢＤＮＦの由来は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等の哺乳類であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、他の細胞に比べ、ＢＤＮＦの遺伝子及び／又はタンパクを高発現している間葉系幹細胞であればよいが、具体的には、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞に比べて、ＢＤＮＦの遺伝子及び／又はタンパクを高発現していればよく、好ましくは従来の間葉系幹細胞で得られる間葉系幹細胞に比べＢＤＮＦ遺伝子発現が１０倍以上、好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上、さらに好ましくは５０００倍以上高ければよい。また、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞に比べて、ＢＤＮＦタンパク発現が１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上高ければよい。ここで、従来の間葉系幹細胞とは、従来の培養条件下（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地による培養）で得られる間葉系幹細胞をいう。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、ＳＩＲＴ１遺伝子及び／又はタンパクが高発現であることにより、それに関連するＢＤＮＦ遺伝子及び／又はタンパクが高発現である間葉系幹細胞である。このような間葉系幹細胞は、外部から人工的にＳＩＲＴ１遺伝子を導入して強制発現させた細胞であってもよいし、特定の培養条件等で培養することでＳＩＲＴ１遺伝子及び／またはタンパクの発現が増強している細胞であっても、元来ＳＩＲＴ１遺伝子及び／またはタンパクの発現が増強している細胞であってもよい。ＢＤＮＦ遺伝子の及び／又はタンパクの発現が増強した間葉系幹細胞を、セルソーター、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離することで、よりＢＤＮＦの発現が高い間葉系幹細胞を取得することができる。

　本発明の間葉系幹細胞のひとつの実施形態は、ＢＤＮＦ遺伝子を導入した間葉系幹細胞である。本発明の間葉系幹細胞は、外部から人工的にＢＤＮＦ遺伝子を導入して強制発現させることにより、ＢＤＮＦを高発現するようになった細胞であることを特徴とする。ここで、ＢＤＮＦ遺伝子は間葉系幹細胞に一過性に発現させたものであってもよいし、安定的に発現させたものであってもよい。なお、ＢＤＮＦ遺伝子の導入方法については、上述のＳＩＲＴ１遺伝子の導入方法と同様の方法を用いることができる。なお、本発明において、間葉系幹細胞に導入するＢＤＮＦ遺伝子は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット等の哺乳類由来であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。具体的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の遺伝子データベースにＢＤＮＦ遺伝子として登録されている遺伝子が挙げられ、例えばＮＭ＿１７０７３１として登録されているヒトＢＤＮＦ遺伝子が好ましい例として挙げられる。

　上記ＳＩＲＴ１の遺伝子及び／又はタンパクの発現が高い細胞は、関与するＬＵＲＡＰ１Ｌ，ＡＣＴＡ２，ＳＱＳＴＭ１，ＣＯＸ４Ｉ１，ＰＸＮ，ＲＡＣ２，ＥＦＨＤ２，ＨＭＧＡ２，ＦＯＳＬ１、ＣＤ４４、ＳＰＡＲＣ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＨＭＧＡ１、ＦＴＨ１もしくはＦＴＬの遺伝子及び／又はタンパクが高発現もしくはこれらの活性が高い細胞ということもできる。したがって、本発明は、ＬＵＲＡＰ１Ｌ，ＡＣＴＡ２，ＳＱＳＴＭ１，ＣＯＸ４Ｉ１，ＰＸＮ，ＲＡＣ２，ＥＦＨＤ２，ＨＭＧＡ２，ＦＯＳＬ１、ＣＤ４４、ＳＰＡＲＣ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＨＭＧＡ１、ＦＴＨ１もしくはＦＴＬの遺伝子及び／又はタンパクが高発現もしくはこれらの活性が高い間葉系幹細胞も含む。

　ＬＵＲＡＰ１Ｌ、ＡＣＴＡ２、ＳＱＳＴＭ１、ＣＯＸ４Ｉ１、ＰＸＮ、ＲＡＣ２、ＥＦＨＤ２、ＨＭＧＡ２、ＦＯＳＬ１、ＣＤ４４、ＳＰＡＲＣ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＨＭＧＡ１、ＦＴＨ１もしくはＦＴＬの遺伝子及び／又はタンパクが高発現もしくはこれらの活性が高いことについても、上記ＳＩＲＴ１やＢＤＮＦと同様に規定され、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞に比べて、ＬＵＲＡＰ１Ｌ、ＡＣＴＡ２、ＳＱＳＴＭ１、ＣＯＸ４Ｉ１、ＰＸＮ、ＲＡＣ２、ＥＦＨＤ２、ＨＭＧＡ２、ＦＯＳＬ１、ＣＤ４４、ＳＰＡＲＣ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＨＭＧＡ１、ＦＴＨ１もしくはＦＴＬの遺伝子及び／又はタンパクを高発現している及び／又はＬＵＲＡＰ１Ｌ、ＡＣＴＡ２、ＳＱＳＴＭ１、ＣＯＸ４Ｉ１、ＰＸＮ、ＲＡＣ２、ＥＦＨＤ２、ＨＭＧＡ２、ＦＯＳＬ１、ＣＤ４４、ＳＰＡＲＣ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ８、ＨＭＧＡ１、ＦＴＨ１もしくはＦＴＬタンパクが高活性であればよい。好ましくは従来の間葉系幹細胞に比べ２倍以上高発現及び／又は活性が亢進している。ここで、従来の間葉系幹細胞とは、従来の培養条件下（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地による培養）で得られる間葉系幹細胞をいう。

　ＬＵＲＡＰ１Ｌ（ｌｅｕｃｉｎｅ　ｒｉｃｈ　ａｄａｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ｌｉｋｅ）は、胎盤や肺において発現しており、ＮＦκＢシグナル経路の制御に関与していることが知られている。

　ＡＣＴＡ２（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）は、アクチンファミリーに属する。アクチンは、様々な細胞運動性に関与する高度に保存されたタンパク質であり、主に血管平滑筋で発現していることが知られている。

　ＳＱＳＴＭ１（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ１）は，セクエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）を構成する主要タンパク質であることが知られている。

　ＣＯＸＩＶ（ＣＯＸ－４、シトクロムＣオキシダーゼのサブユニットIV）は、ヒトミトコンドリア呼吸鎖酵素の一つであるシトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）の、核ゲノムにコードされたサブユニットであることが知られている。

　ＰＸＮ（Ｐａｘｉｌｌｉｎ）は、ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ遺伝子の一種であり、細胞外マトリックスへの局所的なアクチン膜の付着に関与する細胞骨格成分として、複数の構造分子及び調節タンパク質と相互作用して、アクチンのダイナミクスを変化させることが知られている。

　ＲＡＣ２（ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃ３　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｏｘｉｎ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　２）はＲｈｏファミリーであり、細胞外シグナルの下流で様々な細胞機能を制御することが知られている。

　ＥＦＨＤ２（ＥＦ－Ｈａｎｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｍｅｍｂｅｒ　Ｄ２、ｓｗｉｐｒｏｓｉｎ－１）は、２００４年に初めて報告された比較的新しい細胞内タンパク質であり、Ｔ細胞内シグナルに関連し，Ｂ細胞の寿命にかかわるとされている。カノニカルＮＦκＢ経路のネガティブレギュレーターとしても知られている。

　ＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ｇｒｏｕｐ　ＡＴ－Ｈｏｏｋ　２）は様々な遺伝子の発現調節にかかわる非ヒストンクロマチン蛋白で，がん遺伝子として知られている。

　ＦＯＳＬ１はＦＯＳ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　１（ＦＲＡ－１）としても知られ、ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　（ｂＺＩＰ）　転写因子であり、Ｆｏｓファミリーのタンパク質であることが知られている。

　ＣＤ４４は１回膜貫通型糖タンパク質で、４つの機能的ドメインからなり、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス－細胞間のシグナリング、レセプターを介するヒアルロン酸の取り込み／分解や細胞遊走等を含む様々な細胞機能に関与することが知られている。

　ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｃｉｄｉｃ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈ　ｉｎ　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）は，細胞内－細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用と腫瘍の悪性化に関わると考えられ、ＳＰＡＲＣ遺伝子は，組織の発達や再構築及び線維化に関わる多機能な糖タンパク質をコードしていることが知られている。

　ＳＥＲＰＩＮＨ１（Ｓｅｒｐｉｎ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｈ　Ｍｅｍｂｅｒ　１）は、セリンプロテアーゼ阻害剤（ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）のセルピン（Ｓｅｒｐｉｎ）スーパーファミリーに属しており、その発現は熱ショック（ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ）によって誘導される。ＳＥＲＰＩＮＨ１タンパク質は小胞体内腔に局在し、コラーゲンに結合する。コラーゲン分子の成熟に関与する分子シャペロンであると考えられている。

　ＭＴＲＮＲ２Ｌ８（ＭＴ－ＲＮＲ２　Ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　８）はｈｕｍａｎｉｎ　ｆａｍｉｌｙに属しており、神経保護及び抗アポトーシス因子として働くことが知られている。

　ＨＭＧＡ１　（Ｈｉｇｈ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｇｒｏｕｐ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓｏｆｏｒｍ　Ｉ）は、非ヒストンクロマチンタンパク質（ｎｏｎ－ｈｉｓｔｏｎｅ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であり、クロマチン構造を変化させ、転写因子と相互作用することにより、いくつかの遺伝子の転写を調節することができる構造的な転写因子として知られている。

　ＦＴＨ１　（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　１）は、主要な細胞内鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンに特有な重鎖（Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　Ｓｕｂｕｎｉｔ）をコードしており、さまざまな組織での鉄の取り込みと放出の速度に影響を与えていると考えられている。

　ＦＴＬ（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）は、鉄代謝調節因子の１つであり、神経膠腫で過剰発現していることが知られている。

　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上の細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、脂肪組織に含有される間葉系幹細胞を意味し、脂肪組織由来間質細胞と称してもよい。これらのうち、抗炎症治療及び神経疾患治療に対する有効性の観点、入手容易性の観点等から、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞がより好ましく、臍帯由来間葉系幹細胞が最も好ましい。

　本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）と同種由来であってもよいし、異種由来であってもよい。本発明における間葉系幹細胞の種として、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラットが挙げられ、好ましくは処置される対象（被検体）と同種由来細胞である。本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）に由来、すなわち自家細胞であってもよいし、同種の別の対象に由来、すなわち他家細胞であってもよい。好ましくは他家細胞である。

　間葉系幹細胞は同種異系の被験体に対しても拒絶反応を起こしにくいため、あらかじめ調製されたドナーの細胞を拡大培養して凍結保存したものを、本発明の疾患治療剤における間葉系幹細胞として使用することができる。そのため、自己の間葉系幹細胞を調製して用いる場合と比較して、商品化も容易であり、かつ安定して一定の効果を得られ易いという観点から、本発明における間葉系幹細胞は、同種異系であることがより好ましい。

　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が間葉系幹細胞である。

　本発明において臍帯とは、胎児と胎盤を結ぶ白い管状の組織であり、臍帯静脈、臍帯動脈、膠様組織（ウォートンジェリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ　Ｊｅｌｌｙ）、臍帯基質自体等から構成され、間葉系幹細胞を多く含む。臍帯は、本発明の疾患治療剤を使用する被験体（投与対象）と同種動物から入手されることが好ましく、本発明の疾患治療剤をヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの臍帯である。

　本発明において脂肪組織とは、脂肪細胞、及び微小血管細胞等を含む間質細胞を含有する組織を意味し、例えば、哺乳動物の皮下脂肪を外科的切除又は吸引して得られる組織である。脂肪組織は、皮下脂肪より入手され得る。後述する脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与対象と同種動物から入手されることが好ましく、ヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの皮下脂肪である。皮下脂肪の供給個体は、生存していても死亡していてもよいが、本発明において用いる脂肪組織は、好ましくは、生存個体から採取された組織である。個体から採取する場合、脂肪吸引は、例えば、ＰＡＬ（パワーアシスト）脂肪吸引、エルコーニアレーザー脂肪吸引、又は、ボディジェット脂肪吸引等が例示され、細胞の状態を維持するという観点から、超音波を用いないことが好ましい。

　本発明において骨髄とは、骨の内腔を満たしている柔組織のことをいい、造血器官である。骨髄中には骨髄液が存在し、その中に存在する細胞を骨髄細胞と呼ぶ。骨髄細胞には、赤血球、顆粒球、巨核球、リンパ球、脂肪細胞等の他、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞等が含まれている。骨髄細胞は、例えば、ヒト腸骨、長管骨、又はその他の骨から採取することができる。

　本発明において、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞とは、それぞれ脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞である。

　本発明における間葉系幹細胞は、ＳＩＲＴ１又はＢＤＮＦの遺伝子及び／若しくはタンパクの発現量が高いことに加えて、例えば、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）による表面マーカー発現、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出）、上記以外の遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来型ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、タンパク質アレイ、サイトカイン等のタンパク質分泌（例えば、血漿凝固解析、ＥＬＩＳＡ、サイトカインアレイ）、代謝産物（メタボローム解析）、本分野で知られている他の方法等によって、特徴付けられてもよい。

（間葉系幹細胞の調製方法）
　ＳＩＲＴ１の発現量が高い本発明の間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、脂肪、臍帯、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、ＳＩＲＴ１遺伝子を導入することにより、ＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞を取得することができる。間葉系幹細胞へのＳＩＲＴ１遺伝子の導入方法については、「ＳＩＲＴ１高発現間葉系幹細胞」の項における説明を適用できる。また、レスベラトロール等のポリフェノール等、特定の培地を用いた培養により、ＳＩＲＴ１の発現量が高い間葉系幹細胞を取得することもできる。

　この遺伝子導入もしくは、誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の５０％以上がＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞であることが好ましく、７０％以上がＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞であることがより好ましく、８０％以上がＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞であることがさらに好ましく、９０％以上がＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞であることが特に好ましく、実質的にＳＩＲＴ１の発現量が高い細胞の均一な細胞集団であることが最も好ましい。以下に、ＳＩＲＴ１の発現量が高い間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。

　本発明の間葉系幹細胞は、上述の特性（ＳＩＲＴ１遺伝子及び／又はタンパクの高発現等）を有することに加えて、さらに次の特性を持つ細胞として定義してもよい；
（１）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
（２）表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５が陰性であり、及び
（３）培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。

［抗炎症剤及び神経疾患治療剤］
　本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤は、上述した本発明の、ＳＩＲＴ１高発現間葉系幹細胞及び／又はＢＤＮＦ高発現間葉系幹細胞を含有する。本発明の抗炎症剤によると、炎症を予防、抑制もしくは治療にすることができる。また、本発明の神経疾患治療剤によると、神経疾患を予防、抑制もしくは治療することができる。本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤が含有する間葉系幹細胞については、上記間葉系幹細胞の項の説明を適用できる。

　本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤の対象への投与経路は、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、臍帯静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、舌下投与、経直腸投与、経腟投与、眼内投与、経鼻投与、吸入、経皮投与、インプラント、臓器表面への噴霧及びシート等の貼付による直接投与等が挙げられるが、本発明の抗炎症剤の有効性の観点から、好ましくは動脈内投与、静脈内投与及び脳室内投与であり、対象者の負担の軽減の観点から、より好ましくは静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与が好ましい。

　本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤において、その用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤の剤形等によって異なりうるが、十分な抗炎症剤及び神経疾患治療剤の治療効果を奏する観点からは、その量は多い方が好ましい傾向にあり、一方、副作用の発現を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。通常、成人に投与する場合には、細胞数として、１×１０^３～１×１０^１２個／回、好ましくは１×１０^４～１×１０^１１個／回、より好ましくは１×１０^５～１×１０^１０個／回、さらに好ましくは５×１０^６～１×１０^９個／回である。また、患者の体重あたりの投与量としては、１×１０～５×１０^１０個／ｋｇ、好ましくは１×１０^２～５×１０^９個／ｋｇ、より好ましくは１×１０^３～５×１０^８個／ｋｇ、さらに好ましくは１×１０^４～５×１０^７個／ｋｇである。新生児に投与する場合には、細胞数として、１×１０^３～１×１０^１１個／回、好ましくは１×１０^４～１×１０^１０個／回、より好ましくは１×１０^５～１×１０^９個／回、さらに好ましくは５×１０^５～５×１０^８個／回である。また、患者の体重あたりの投与量としては、１×１０～５×１０^１０個／ｋｇ、好ましくは１×１０^２～５×１０^９個／ｋｇ、より好ましくは１×１０^３～５×１０^８個／ｋｇ、さらに好ましくは１×１０^４～５×１０^７個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与してもよい。

　本発明の抗炎症剤及び神経疾患治療剤は、一又は二以上の他の薬剤と共に投与してもよい。他の薬剤としては、抗炎症剤もしくは及び神経疾患治療剤として用いることができる任意の薬剤が挙げられる。

　本発明の間葉系幹細胞は様々な炎症性疾患に用いることができるが、具体的疾患としては、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、変形性関節症、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、腎不全、狼瘡、膵炎、アレルギー、線維症、貧血、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、化学療法／放射線関連合併症、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、クローン病、アレルギー性結膜炎、糖尿病性網膜症、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、喘息、石綿症、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、ＨＩＶ関連悪液質、大脳マラリア、強直性脊椎炎、らい病、ＣＯＰＤ、肺線維症、線維筋痛、食道癌、胃食道逆流症、バレット食道等が挙げられる。

　本発明の間葉系幹細胞は様々な神経疾患に用いることができるが、具体的疾患としては、自律神経障害、ホルネル症候群、多系統萎縮症、純粋自律神経不全等の自律神経系障害、慢性疼痛、神経障害性疼痛、複合性局所疼痛症候群等の疼痛、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作、脳内出血、クモ膜下出血等の脳卒中（脳血管事故）、アルツハイマー病、脳血管性認知症、レーヴィ体認知症、ＨＩＶ関連認知症、前頭側頭型認知症等の認知症、痙攣性症候群、アテトーゼまたは運動異常症候群及び失調性症候群等の脳性麻痺症候群、くも膜下出血、脳内出血、脳室内出血等の頭蓋内出血、低酸素－虚血、虚血性卒中、低血糖、高ナトリウム血症、低ナトリウム血症、低マグネシウム血症、先天代謝異常等による、新生児痙攣性疾患、多発性硬化症等の脱髄性疾患、キランーバレー症候群、遺伝性ニューロパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患、重症筋無力症、モノニューロパシー、多発ニューロパシー、神経叢障害等の末梢神経系障害、急性横断性脊髄炎、動静脈奇形、脊髄梗塞（虚血性脊髄障害）等の脊髄障害、脊髄小脳失調症、脊髄小脳変性症等の小脳疾患、脳腫瘍、脳炎、髄膜炎、パーキンソン病等が挙げられる。また、新生児を対象とした、周産期脳障害、新生児脳症及び脳性麻痺等に用いることもできる。

　本発明は、上述のＳＩＲＴ１の発現が高い間葉系幹細胞を用いることを特徴とする、炎症性疾患もしくは神経疾患の治療方法も含む。また、本発明は、上述のＢＤＮＦの発現が高い間葉系幹細胞を用いることを特徴とする、炎症性疾患もしくは神経疾患の治療方法も含む。本発明の治療方法は、上述の本発明の抗炎症剤及び／又は神経疾患治療剤を用いることを特徴とする方法ということもできる。なお、各文言の説明については、上述の間葉系幹細胞、抗炎症剤及び神経疾患治療剤における説明を適用できる。

　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［試験１：ＳＩＲＴ１の臍帯由来間葉系幹細胞へのトランスフェクション１］
　臍帯由来間葉系幹細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を、１５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で培養容器に播種した。２４～４８時間後、細胞が７０－９０％のコンフルエント状態であることを確認し、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした。具体的には、ｍＲＮＡをＯｐｔｉｍｅｍ培地（サーモフィッシャー社製）で希釈し、トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ社製、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ（登録商標）ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を加え、ピペットで優しく攪拌した後、チューブの外側からタップすることで混合し、ｍＲＮＡ－リポソーム複合体を作製した。室温で２－５分間静置して安定化させたのち、培養細胞を播種した容器に全体的に少しずつ、滴下した。その後、３７℃で２４～７２時間培養した。ＳＩＲＴ１遺伝子発現は、配列番号１及び２のプライマーセットを用いてＰＣＲによって確認した。

［試験２：臍帯由来間葉系幹細胞でのＳＩＲＴ１の発現量の測定］
　ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした細胞をＲＩＰＡバッファー（サーモフィッシャ―社、８９９００）により溶解した。得られた細胞溶解物を電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法）した後に、ゲル上のたんぱく質をニトロセルロース膜にブロッティングした。その後、１％ＢＳＡ溶液で１時間ブロッキングした後、ＳＩＲＴ１抗体（アブカム社、ａｂ１０４８３３）の１：５００希釈液に室温で１時間浸した。なお、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びブロッティングにはサーモフィッシャー社のキット（ＮＷ０４１２０）を使用した。メンブレンをＴＢＳＴで洗浄した後、二次抗体（アブカム社、ａｂ１５０１１３）の１：２０００希釈液を１時間反応させた。反応後、メンブレンを洗浄し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ　ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）での画像により、ＳＩＲＴ１の発現量を確認した（図１）。なお、トランスフェクションを行っていない臍帯由来間葉系幹細胞をコントロール（Ｃｔｒｌ）として、トランスフェクション後２４時間及び７２時間における発現量を示した（図１）。また、内部標準としてのβチューブリンに対してはローダミン結合抗体（ＢｉｏＲａｄ社、１２００４１６６）を使用した。

［試験３：臍帯由来間葉系幹細胞による抗炎症効果の検討１］
　ヒト由来単球細胞であるＴＨＰ１（以下「ＴＨＰ１」という）を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で１２ウェルプレートに播種して、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（Ｐｈｏｒｂｏｌ　１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３－ａｃｅｔａｔｅ、以下「ＰＭＡ」という、品番１６２－２３５９１、富士フイルム和光純薬株式会社）を１００ｎＭ添加して、４日間培養した。臍帯由来間葉系幹細胞（以下「МＳＣ」という）及びＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（以下「ＳＩＲＴ１МＳＣ」という）は共培養の前日に０．４μｍトランズウェルインサート上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して培養した。共培養開始時に、ＴＨＰ１及びМＳＣのウェルに１ｕｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下「ＬＰＳ」という、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、品番１４８７４－２４）を添加し、МＳＣを播種したトランズウェルを、ＴＨＰ１を播種したウェル上に設置し、３日間共培養した（３７℃、２％ＣＯ_２）。その後、ＴＨＰ１細胞溶解物（細胞ライセート、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）を回収し、ＴＮＦα遺伝子の発現をＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ１（サーモフィッシャー社）を用い、ｑＲＴ－ＰＣＲにて定量した。その際に配列番号３及び４のプライマーセットを用いた。

　ＬＰＳ刺激無し（未処理群）と比較し、ＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ群）ではＴＮＦα遺伝子発現が上昇したが、МＳＣとの共培養によりその発現は抑制された（МＳＣ群）。ＳＩＲＴ１МＳＣとの共培養によりその発現は更に抑制された（ＳＩＲＴ１МＳＣ群）（図２）。このことから、МＳＣは炎症に対して有効であり、特にＳＩＲＴ１を高発現するМＳＣは優れた抗炎症効果を有することがわかった。なお、ＳＩＲＴ１МＳＣは、試験１の項に記載した方法にて作成した後、常法にて凍結保存した細胞を使用した。具体的には、解凍し、培養フラスコにて３もしくは４日間予備的に培養を行った細胞を回収してトランズウェルに播種し、使用した。

［試験４：臍帯由来間葉系幹細胞による抗炎症効果の検討２］
　ＴＨＰ１を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で１２ウェルプレートに播種して、２００ｎＭのＰＭＡを添加して、４日間培養した。МＳＣ及びＳＩＲＴ１МＳＣは共培養の前日に０．４μｍトランズウェルインサート上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して培養した。共培養開始時に、ＴＨＰ１及びМＳＣのウェルに１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、МＳＣを播種したトランズウェルを、ＴＨＰ１を播種したウェル上に設置し、２日間共培養した（３７℃，２％ＣＯ_２）。その後、ＴＨＰ１細胞溶解物を回収し、ＴＮＦα遺伝子の発現を上記と同様にｑＲＴ－ＰＣＲにて定量した。また、培養上清を４００ｘＧで５分間遠心分離した後、上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。なお、ＳＩＲＴ１МＳＣは、試験１の項に記載した方法にて作成した後、常法にて凍結保存した細胞を使用した。具体的には、解凍し、培養フラスコにて３もしくは４日間予備的に培養を行った細胞を回収してトランズウェルに播種し、使用した。

　ＬＰＳ刺激無し（未処理群）と比較し、ＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ群）ではＴＮＦα遺伝子発現が上昇したが、МＳＣとの共培養によりその発現は抑制された（МＳＣ群）。ＳＩＲＴ１МＳＣとの共培養によりその発現は更に抑制された（ＳＩＲＴ１МＳＣ群）（図３）。また、ＴＮＦα濃度も、未処理群と比較し、ＬＰＳ刺激により高くなった（ＬＰＳ群）が、МＳＣ（МＳＣ群）もしくは、ＳＩＲＴ１МＳＣ（ＳＩＲＴ１МＳＣ群）の共培養により抑制され、МＳＣ群に比べＳＩＲＴ１МＳＣの抑制効果は高かった（図４）。試験３と同様に、МＳＣは炎症に対して有効であり、特にＳＩＲＴ１を高発現するМＳＣは優れた抗炎症効果を有することが確認できた。

［試験５：臍帯由来間葉系幹細胞による抗炎症効果の検討３］
　ＴＨＰ１を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で１２ウェルプレートに播種して、１００ｎＭＰＭＡを添加し、４日間培養した。МＳＣ及びＳＩＲＴ１МＳＣは共培養の前日に０．４μｍトランズウェルインサート上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して培養した。共培養開始時に、ＴＨＰ１及びМＳＣのウェルに１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加しＬＰＳ刺激を行い、МＳＣを播種したトランズウェルを、ＴＨＰ１を播種したウェル上に設置し、２日間共培養した（３７℃、２％ＣＯ_２）。その後、トランズウェルを取り除き、ＴＨＰ１を、ＬＰＳを含まない培地に交換し、ＴＨＰ１単独で更に１日培養した。培養上清を４００ｘＧで５分間遠心分離した後、上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。ＴＮＦα濃度は、ＳＩＲＴ１МＳＣとの共培養により下がった（図５）。以上から、ＳＩＲＴ１を高発現するМＳＣは優れた抗炎症効果を有することがわかった。なお、ＳＩＲＴ１МＳＣは、試験１に記載した方法にて作成した後、常法にて凍結保存した細胞を使用した。具体的には、解凍し、培養フラスコにて３もしくは４日間予備的に培養を行った細胞を回収してトランズウェルに播種し、使用した。

［試験６：臍帯由来間葉系幹細胞による抗炎症効果の検討４］
　ＴＨＰ１を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で１２ウェルプレートに播種して、２００ｎＭＰＭＡを添加して、４日間培養した。МＳＣ及びＳＩＲＴ１МＳＣは共培養の前日に０．４μｍトランズウェルインサート上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して培養した。共培養開始時に、ＴＨＰ１及びМＳＣのウェルに１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加しＬＰＳ刺激を行い、МＳＣを播種したトランズウェルを、ＴＨＰ１を播種したウェル上に設置し、２日間共培養した（３７℃、２％ＣＯ_２）。その後、トランズウェルを取り除き、ＴＨＰ１を、ＬＰＳを含まない培地に交換し、ＴＨＰ１単独で更に１日培養した。その後、ＴＨＰ１細胞溶解物を回収し、ＴＮＦα遺伝子の発現を上記試験３と同様にｑＲＴ－ＰＣＲにて定量した。ＬＰＳ刺激無し（未処理群）と比較し、ＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ群）ではＴＮＦα遺伝子発現が上昇したが、МＳＣとの共培養によりその発現は抑制された（МＳＣ群）。ＳＩＲＴ１МＳＣとの共培養によりその発現は更に抑制された（ＳＩＲＴ１МＳＣ群）（図６）。試験３と同様に、МＳＣは炎症に対して有効であり、特にＳＩＲＴ１を高発現するМＳＣは優れた抗炎症効果を有することがわかった。なお、ＳＩＲＴ１МＳＣは、試験１に記載した方法にて作成した後、常法にて凍結保存した細胞を使用した。具体的には、解凍し、培養フラスコにて３もしくは４日間予備的に培養を行った細胞を回収してトランズウェルに播種し、使用した。

［試験７：臍帯由来間葉系幹細胞におけるＢＤＮＦ発現量の比較］
　臍帯由来間葉系幹細胞（МＳＣ）及びＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１МＳＣ）を、それぞれ６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３３３５）に５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，＃Ｄ５７９６）で２４時間、４８時間及び７２時間培養を行った。培養後、培養上清を４００ｘＧで５分間遠心分離した後、上清中のＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；脳由来神経栄養因子）濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。ＳＩＲＴ１МＳＣ（Ｓ）はМＳＣ（М）と比較して、ＢＤＮＦが高発現であることがわかった（図７）。ＳＩＲＴ１МＳＣにおけるＢＤＮＦ濃度は、МＳＣに対して２４時間培養後で４．４５倍、４８時間培養後で６．３０倍及び７２時間培養後で７．８１倍であった。また、ＢＤＮＦ遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにて定量したところ、７２時間培養後においてＳＩＲＴ１МＳＣにおけるＢＤＮＦの発現は、МＳＣに対して１．５４倍であった。なお、ｑＲＴ－ＰＣＲには配列番号５及び６のプライマーセットを用いた。

　ＢＤＮＦは、中枢神経系や末梢神経系の一部のニューロンに作用し、ニューロンの維持や、成長、分化を促進する因子であり（Ｎａｔｕｒｅ　３７４（６５２１）：４５０－３）、長期記憶に重要であることも知られている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　１０５（７）：２７１１－６）。ＢＤＮＦの発現量が増強しているＳＩＲＴ１МＳＣは、中枢神経系や末梢神経系の疾患治療、特にニューロンの維持や、成長、分化によって改善が期待されるような神経疾患の治療に有効であると考えられる。また、この実験結果から、トランスフェクション後２４時間～７２時間培養した細胞を疾患治療のための投与に使用することが好ましいといえる。

［試験８：ＳＩＲＴ１ｍＲＮＡの脂肪由来間葉系幹細胞へのトランスフェクション］
　脂肪由来間葉系幹細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を、１５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で培養容器に播種した。２４～４８時間後、細胞が７０－９０％のコンフルエント状態であることを確認し、試験１と同様に、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした。また、試験２と同様に検討を行い、脂肪由来間葉系幹細胞にＳＩＲＴ１が発現していることを確認した。

［試験９：ＳＩＲＴ１発現脂肪由来間葉系幹細胞との共培養によるＴＨＰ１の遺伝子発現の変化］
　ＴＨＰ１を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で１２ウェルプレートに播種して、２００ｎＭのＰＭＡを添加し、４日間培養した。脂肪由来間葉系幹細胞（以下「ＡＤМＳＣ」という）及びＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした脂肪由来間葉系幹細胞（以下「ＳＩＲＴ１ＡＤМＳＣ」という）は共培養の前日に０．４μｍトランズウェルインサート上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して培養した。共培養開始時に、ＴＨＰ１及びＡＤМＳＣのウェルに１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加しＬＰＳ刺激を行い、ＡＤМＳＣを播種したトランズウェルを、ＴＨＰ１を播種したウェル上に設置し、２日間共培養した（３７℃，２％ＣＯ_２）。その後、ＴＨＰ１細胞溶解物を回収し、ＣＤ２０６遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにて定量した。その際に配列番号７及び８のプライマーセットを用いた。

　ＬＰＳ刺激無し（未処理群）と比較し、ＬＰＳ刺激あり（ＬＰＳ群）では、ＣＤ２０６遺伝子発現が上昇した。ＡＤМＳＣとの共培養（ＡＤМＳＣ群）に比べ、ＳＩＲＴ１ＡＤМＳＣとの共培養（ＳＩＲＴ１ＡＤМＳＣ群）ではその発現は増加した（図８）。ＳＩＲＴ１を高発現するＡＤМＳＣとの共培養で、ＴＨＰ１のＣＤ２０６遺伝子の発現が増加することがわかった。なお、ＳＩＲＴ１МＳＣは、試験１に記載した方法にて作成した後、常法にて凍結保存した細胞を使用した。具体的には、解凍し、培養フラスコにて３もしくは４日間予備的に培養を行った細胞を回収してトランズウェルに播種し、使用した。

　ＣＤ２０６は、マクロファージマンノースレセプタ（ＭＭＲ）とも呼ばれ、マルチレクチンレセプタ構造を持つ、分子量１７５ｋＤａのＩ型単鎖膜貫通糖タンパクであり、抗炎症機能を有するＭ２マクロファージのマーカーのひとつとして知られている。ＳＩＲＴ１を高発現するＡＤМＳＣとの共培養で、ＴＨＰ１のＣＤ２０６遺伝子の発現が増加するという上記の結果は、ＳＩＲＴ１を高発現するＡＤМＳＣが、組織のマクロファージを、抗炎症機能を有するＭ２マクロファージに分化誘導させることで間接的にも抗炎症効果を奏する可能性を示唆している。

［試験１０：各種細胞におけるＳＩＲＴ１発現量の比較］
　臍帯由来間葉系幹細胞（МＳＣ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）、試験１と同様にＳＩＲＴ１のｍＲＮＡをトランスフェクションした臍帯由来間葉系幹細胞（ＳＩＲＴ１МＳＣ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）、ヒト非小細胞肺癌細胞（Ａ５４９、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより分譲）、ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞（ＭＲＣ－５、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより分譲）及びヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ、ロンザ社）の各細胞を８０％コンフルエントになるまで培養して各細胞のｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、ＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ発現を定量ＰＣＲで確認した。なお、МＳＣ及びＳＩＲＴ１МＳＣはＧＭ２培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）、Ａ５４９及びＭＲＣ－５は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地、ＳＡＥＣはロンザ社の推奨培地を用いて、各細胞の推奨播種密度で播種して培養した。また、定量ＰＣＲには試験１に記載の配列番号１及び２のプライマーセットを用いた。МＳＣのＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の各細胞のＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ発現量を表１に示した。

［試験１１：無血清培地培養ＭＳＣにおけるＳＩＲＴ１導入とその発現量の測定］
　無血清培地（ロート社製）にて培養した臍帯由来間葉系幹細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ分取し、懸濁液の状態でエレクトロポレーション法によりＳＩＲＴ１ｍＲＮＡをトランスフェクション（サーモフィッシャー社製）した。その後、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、３７℃で２４～７２時間培養した後でＳＩＲＴ１遺伝子発現を確認した。ＳＩＲＴ１遺伝子発現は、配列番号１及び２のプライマーセットを用いてＰＣＲによって確認した。結果を図９（２４時間培養後）及び１０（７２時間培養後）に示す。なお、図中、Ｃｔｒｌは、エレクトロポレーション無しのコントロール（ｍＲＮＡ無し）、Ｅはエレクトロポレーションありのコントロール（ｍＲＮＡ無し）、ＥＧＦＰはエレクトロポレーション法でＧＦＰ　ｍＲＮＡを導入したサンプル、ＳＩＲＴ１はエレクトロポレーション法でＳＩＲＴ１　ｍＲＮＡを導入したサンプルを示している。

　図９及び図１０に示すとおり、ＳＩＲＴ１ｍＲＮＡをエレクトロポレーション法によってトランスフェクション後、２４時間培養した細胞、７２時間培養した細胞において、ＳＩＲＴ１遺伝子発現が確認できた。以上のとおり、無血清培地培養ＭＳＣに対し、エレクトロポレーション法を用いることで、ＳＩＲＴ１ｍＲＮＡを適切に導入できることが明らかとなった。

　本発明によると、抗炎症剤及び神経疾患治療剤を提供することができる。

Claims

　ＳＩＲＴ１を高発現することを特徴とする、間葉系幹細胞。
　ＢＤＮＦを高発現することを特徴とする、間葉系幹細胞。
　臍帯組織由来である、請求項１又は２に記載の間葉系幹細胞。
　請求項１から３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞を含有する抗炎症剤。
　請求項１から３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞を含有する神経疾患治療剤。