JP2019511238A - 遺伝子送達の増強方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的細胞へ遺伝子送達するための、もしくは、標的細胞を遺伝子改変するための改善された方法を提供し、標的細胞の遺伝子送達もしくは他の遺伝子改変は、内皮細胞の存在下で、もしくは、標的細胞を内皮細胞と共培養した後に実施され、または、標的細胞の内皮細胞との共培養は、遺伝子送達プロセス中に損傷を受けたであろう細胞を「救助する」ために、遺伝子送達の直後に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子送達はトランスフェクションにより実施される。いくつかの実施形態では、遺伝子送達は形質導入により実施される。いくつかの実施形態では、内皮細胞は臓器特異的内皮細胞である。いくつかの実施形態では、内皮細胞はＥ４ＯＲＦ１発現内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は造血幹細胞などの幹細胞である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，４７６号、および２０１６年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４０３，１１０号の優先権の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

参照による組み込み
参照として組み込むことを可能にする管轄区域のみを目的として、本開示に引用されている全ての参考文献（刊行物、特許出願、特許および他の参考文献を含むが、これらに限定されない）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で引用または言及された製品の製造業者の指示書またはカタログはいずれも、参照により組み込まれる。米国特許第８，４６５，７３２号で提供されている教示の多くは、本発明と共に使用することができ、または本発明と共に使用するために適応させることができる。従って、米国特許第８，４６５，７３２号の全内容は、参照により明示的に本出願に組み込まれる。本明細書に参照により組み込まれた文献またはそれに含まれるいずれの教示も、本発明の実施において使用することができる。

発明の背景
アデノウイルス初期４（Ｅ４）領域は、少なくとも６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。Ｅ４領域全体は、内皮細胞の血管形成を調節し生存を促進することが示されている（Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66）。また、Ｅ４領域全体の中で、内皮細胞におけるこれら生物学的効果に関与するのは、Ｅ４ＯＲＦ１配列であることも示されている（米国特許第８，４６５，７３２号およびSeandel et al. (2008), PNAS, 105(49):19288-93）。Ｅ４ＯＲＦ１を発現するように操作された内皮細胞が、様々な共培養方法において特に有用であることが既に見出されており、それらは、造血幹細胞を含む様々な幹細胞などの、他の方法では培養において維持または増殖することが困難である種々の異なる細胞型の増殖を助けるのに用いることができる（米国特許第８，４６５，７３２号およびSeandel et al. (2008), PNAS, 105(49):19288-93）。

例えば遺伝子編集技術を用いる、遺伝子治療は、多数の遺伝性の疾患および疾病と戦うための、有望で可能性のある解決策を提供する。しかしながら、この分野で克服すべき大きなハードルは、移植のために十分な数の自家細胞を効率的に遺伝子改変する能力であり、また、治療的に有効である可能性が最も高い細胞型を改変する能力である。血液疾患のための遺伝子治療の場合、これらの細胞型には、造血幹細胞（ＨＳＣ）並びに組織特異的再増殖性幹細胞および前駆細胞が含まれる。この重要な造血細胞集団に対する遺伝子補正や他の遺伝子治療技術を用いて、いくつかの血液疾患をより効果的に処置することができた。残念ながら、これらの細胞および他の細胞における遺伝子補正の試みは、これまでのところ、大半が非効率的であることが判明している。

いくつかの細胞形質導入およびトランスフェクション技術（エレクトロポレーションなど）は、顕著な細胞ストレスおよび細胞損傷を引き起こし、しばしば細胞死をもたらす。従って、しばしば、形質導入またはトランスフェクトに成功した一部の細胞のみが生き残る。これは、幹細胞への遺伝子送達にとって特に問題であり、また、大量の正常な、生存可能な、形質導入またはトランスフェクトされた細胞を必要とする用途においても特に問題である。

発明の概要
本発明は、部分的には、本特許開示の「実施例」のセクションでさらに記載されている特定の新たな発見および手順に基づいている。

例えば、特定の「標的細胞」への遺伝子送達効率、および／またはトランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞（幹細胞を含む）の収量が、遺伝子送達が内皮細胞共培養、例えば、Ｅ４ＯＲＦ１遺伝子を発現する内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ）などのエクスビボで培養されるように最適化された内皮細胞との共培養と併せて行われる場合に、有意に増加し得ることが見出された。

出願人の知る限りにおいて、内皮細胞の、より具体的にはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣの、他の「標的」細胞型（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣと共培養した細胞）への遺伝子送達効率、および／または、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量、および／または、遺伝子送達プロセス中に損傷を受けた細胞を「救助する」能力に対する効果は報告されていない。さらに、内皮細胞（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ）が、内皮細胞が取り込まなければ標的細胞により取り込まれたであろう遺伝物質を取り込み、それにより標的細胞への遺伝子送達への全体的な効率を顕著に低下させ、および／または、形質導入またはトランスフェクトに成功した細胞の収量を顕著に減少させると予想される通り、内皮細胞、特にＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣの存在下で遺伝子送達法を行うと、遺伝子送達効率、および／または、形質導入またはトランスフェクトに成功した細胞の収量に、悪影響を及ぼすことはなく、上昇さえし得るという知見は、直観に反すると思われる。しかしながら、本明細書で提示された結果は、そうでないことを示している。それどころか、本明細書で提示された結果は、培養物に送達される遺伝子物質の総量が同じであり、培養物中の標的細胞の相対的な割合が減少した場合でさえ、標的細胞への遺伝子送達効率、および／または、形質導入またはトランスフェクトに成功した細胞の収量が、標的細胞のみの培養物よりも、内皮細胞、特にＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣも含む培養物において、予想されるよりもはるかに高いことを示している。これらの発見に基づいて、本発明は、遺伝子送達のための特定の新規の、かつ、改良された方法、並びにこれらの方法において有用であり得る様々な組成物を提供する。

従って、ある実施形態では、本発明は標的細胞に遺伝子送達する方法であって、（ａ）標的細胞を内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）と共培養すること、および（ｂ）標的細胞を、１つ以上の外因性核酸分子および／または遺伝子送達／遺伝子編集において有用な他の分子と接触させることを含み、ここで、標的細胞を内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）と共培養するステップが、（ｉ）標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子および／または他の分子と接触させる前、または（ｉｉ）標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子および／または他の分子と接触させるのと同時、または（ｉｉｉ）標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子および／または他の分子と接触させた後、または（ｉＶ）これらの任意の組み合わせのいずれかで実施される方法を、提供する。

これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子送達は遺伝子編集プロセスの一部であり、また、遺伝子編集に有用な１つ以上の分子と標的細胞を接触させることを包含してもよい。

いくつかのこれらの実施形態では、標的細胞を、内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）と共培養させる（例えば、標的細胞が、１つ以上の外因性核酸分子および／または他の分子と接触している際に、内皮細胞は、標的細胞と同じ容器に存在し、および／または、標的細胞と接触している）。

いくつかのこれらの実施形態では、標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子および/または他の分子と接触させる前に、標的細胞を、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間（１日）、または少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間（２日）、または少なくとも６０時間、または少なくとも７２時間（３日）、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間（４日）、内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）と共培養する。

いくつかのこれらの実施形態では、遺伝子送達プロセス中に受けた任意の損傷から標的細胞を迅速に「救助する」ために、標的細胞の内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）との共培養を、標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子または遺伝子送達／遺伝子編集において有用な他の分子と接触させた後に「直ちに」開始させる。この文脈における「直ちに」という用語は、「接触させる」ステップの完了から３０分以内を意味する。いくつかの実施形態では、標的細胞の、内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）との共培養を、「接触させる」ステップの完了から、１５分以内、または１０分以内、または５分以内、または３分以内、または２分以内、または１分以内に開始させる。「接触させる」ステップの完了のタイミングは、用いられる遺伝子送達方法によって異なるだろう。例えば、遺伝子送達がエレクトロポレーションにより達成される場合、電気パルスが終了する時に「接触させる」ステップが完了し、標的細胞は、電気パルスが終了した後に内皮細胞との共培養に供されるべきである。同様に、遺伝子送達が、標的細胞をリポフェクション剤と接触させることにより達成される場合、（例えば、培地交換により）リポフェクション剤が除去される時に「接触させる」ステップが完了し、標的細胞は、リポフェクション剤が除去された後に内皮細胞との共培養に供されるべきである。いくつかのこれらの実施形態では、標的細胞を接触させるステップが完了した後に、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間（１日間）、または少なくとも４８時間（２日間）、または少なくとも７２時間（３日間）、または少なくとも９６時間（４日間）、または少なくとも１２０時間（５日間）、または少なくとも１４４時間（６日間）、または少なくとも１６８時間（７日間）、または少なくとも１９２時間（８日間）、または少なくとも２４０時間（１０日間）、または少なくとも２８８時間（１２日間）の間、内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）と共培養させ続ける。

いくつかの実施形態では、共培養プロセス中の標的細胞と内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞など）の割合は、約１：１である。いくつかの実施形態では、共培養プロセス中の標的細胞と内皮細胞の割合は、約２：１〜約１：２である。いくつかの実施形態では、標的細胞と内皮細胞の割合は、約１０：１、または約９：１、または約８：１、または約７：１、または約６：１、または約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５、または約１：６、または約１：７、または約１：８、または約１：９、または約１：１０である。いくつかのこれらの実施形態では、これらは、共培養が開始される時間における、標的細胞と内皮細胞との割合である。いくつかのこれらの実施形態では、これらは、標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子および/または他の分子と接触させる時間における、標的細胞と内皮細胞との割合である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６５％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７５％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８５％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９０％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９５％を超える、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約１０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約２０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約３０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約４０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約５０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約６０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約７０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約８０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約９０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約１００％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約１５０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約２００％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約２５０％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率よりも約３００％高い、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、内皮細胞と共培養される標的細胞に供給される外因性核酸分子の量が内皮細胞と共培養されない標的細胞に供給される外因性核酸分子の量と同一（またはおよそ同一）であるため、および／または、標的細胞をトランスフェクトまたは形質導入するのに利用可能な外因性核酸分子の量が共培養される内皮細胞の存在により減少するために、トランスフェクションまたは形質導入効率の減少が予想される条件下であっても、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率と同様の、標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、内皮細胞と共培養される標的細胞に供給される外因性核酸分子の量が内皮細胞と共培養されない標的細胞に供給される外因性核酸分子の量と同一（またはおよそ同一）であるため、および／または、標的細胞をトランスフェクトまたは形質導入するのに利用可能な外因性核酸分子の量が共培養される内皮細胞の存在により有意に減少するために、トランスフェクションまたは形質導入効率のはるかに大きな減少が予想される条件下であっても、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる効率と比較して、わずか約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％減少した標的細胞の形質導入効率またはトランスフェクション効率をもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約１０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約２０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約３０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約４０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約５０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約６０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約７０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約８０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約９０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約１００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約１５０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約２００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約２５０％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約３００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約４００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約５００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも約６００％多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、内皮細胞共培養を行わない場合に得られる収量よりも６００％を超えて多い、トランスフェクトまたは形質導入に成功した標的細胞の収量をもたらす。

いくつかの実施形態では、これらの遺伝子送達方法の共培養ステップを、大気中の酸素条件下で実施する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子送達方法の共培養ステップを、正常酸素圧条件下で実施する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子送達方法の共培養ステップを、低酸素条件下で実施する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子送達方法の共培養ステップを、著しい低酸素条件下で実施する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子送達方法の共培養ステップを、１８％〜０．１％酸素の範囲の酸素レベルで実施する。

本発明の改善された遺伝子送達方法は、標的細胞の「遺伝子編集」を実施する上で、例えば、部位特異的ヌクレアーゼを用いて、「遺伝子補正された」核酸配列を標的細胞のゲノム内の特定の部位に送達する上で、特に有用であり得ることが期待される。従って、いくつかの実施形態では、上述の方法はまた、標的細胞を、配列特異的ヌクレアーゼなどの１つ以上の外因性ヌクレアーゼと接触させることを含む。これらのヌクレアーゼには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の遺伝子送達方法は、任意の所望の標的細胞型に外因性核酸を送達するために、および／または、任意の所望の標的細胞型を遺伝子改変するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、標的細胞は分化細胞であり、例えばリンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、骨髄系細胞、内分泌細胞、間葉系細胞、または表皮細胞などであるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの、多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、幹細胞は、組織（または臓器）限定的な幹細胞または前駆細胞、すなわち、特定の細胞または組織系統に分化の方向が決定された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）幹細胞または前駆細胞である。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、標的細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）、または、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。いくつかのこれらの実施形態では、ＨＳＣまたはＨＳＰＣは、ＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣまたはＨＳＰＣは、骨髄、末梢血、臍帯血、羊水、または他の幹細胞源に由来する。

いくつかの実施形態では、任意の好適な型の内皮細胞を、上記または明細書の他の部分に記載された遺伝子送達方法において用いることができる。好ましい実施形態では、内皮細胞および標的細胞は、同一の組織または臓器に由来する。一般的には、内皮細胞は、初代血管内皮細胞などの血管内皮細胞であり、例えば、臍帯静脈内皮細胞すなわちＵＶＥＣ細胞であり、造血器系の一部である。好ましくは、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞、すなわち「ＨＵＶＥＣ」などの、ヒト内皮細胞である。好ましくは、標的細胞は造血幹細胞および／または前駆細胞である。

標的細胞を、１つ以上の外因性核酸分子または遺伝子編集で有用な他の分子と接触させるステップは、当業界で公知の任意の好適な方法を用いて実行することができる。いくつかの実施形態では、本ステップは、トランスフェクションによって、例えば、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、または微粒子銃などの方法を用いて実施される。他の実施形態では、本ステップは、ウイルスによる形質導入によって、例えば、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入またはヘルペスウイルス媒介形質導入を用いて実施される。

本明細書に記載の方法を用いて標的細胞に送達される核酸分子は、所望される任意の核酸分子であり得る。例えば、核酸分子は、治療的に有用なタンパク質、またはマーカータンパク質、または任意の他の所望のタンパク質をコードすることができるが、これらに限定されない。同様に、送達される核酸分子は、タンパク質をコードしていなくてもよい。例えば、送達される核酸分子は、例えば標的細胞の遺伝子欠損の補正に用いるために、標的細胞のゲノムに存在するヌクレオチド配列の「遺伝子補正された」フラグメントなどの、タンパク質のフラグメントをコードしていてよい。いくつかのこれらの方法では、遺伝子補正された配列は、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、およびさらなる遺伝子編集／遺伝子補正技術を含むが、これらに限定されない、１つ以上の遺伝子編集／遺伝子補正技術を用いて、標的細胞のゲノム上の変異配列を置換するために用いてよい。

本特許開示の上記およびその他に記載される様々な方法は、「遺伝子改変標的細胞」の生成をもたらす。これらの遺伝子改変標的細胞は、所望により用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子改変標的細胞は、ヒトまたは非ヒト対象などの、それを必要とする対象に投与してもよい。いくつかのこれらの実施形態では、対象は、標的細胞に影響を与える疾病または疾患（例えば、遺伝性の疾病または疾患）および／または、標的細胞集団の欠損をもたらす疾病または疾患を有してよい。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝子改変標的細胞はＨＳＣまたはＨＳＰＣであり、造血系の細胞に影響を与える疾病または疾患を有する対象に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、当該対象は、骨髄破壊的処置により引き起こされる造血発生の欠損を有し得る。他の実施形態では、当該対象は、血液疾患、感染性免疫不全、Ｔ細胞に影響を及ぼす感染性疾患、遺伝的免疫不全、重症複合免疫不全症、赤血球に影響を及ぼす遺伝性疾病、および／または貧血（鎌状赤血球貧血、ファンコニ貧血、またはサラセミアなど）を有してよい。いくつかのこれらの実施形態では、標的細胞は、対象に対して同種異系であってよい。他のこれらの実施形態では、標的細胞は、対象に対して自家であってよい。

本発明はまた、本明細書に記載された方法を用いて生産された遺伝子改変標的細胞、および／または、これらの遺伝子改変標的細胞を含む組成物、例えば治療用組成物を提供する。

本発明のこれらおよび他の実施形態は、本特許開示の他のセクションでさらに記載されている。さらに、当業者には明らかであるが、本明細書に記載された様々な実施形態の特定の改変および組み合わせは、本発明の範囲内に入る。

図１Ａ−Ｂ。形質導入プロセスを開始させる前のＥ４ＯＲＦ１＋ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ細胞）におけるＣＤ３４＋細胞の増殖は、造血幹細胞全体およびＣＤ３４＋細胞のより高い増殖倍率（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）をもたらす。図１Ａ−８日後のＣＤ４５＋造血細胞（造血細胞全体）の増殖倍率。図１Ｂ−８日後のＣＤ３４＋造血細胞の増殖倍率（「前形質導入」サンプル−白棒。「並行形質導入」サンプル−灰色棒。「増殖形質導入」サンプル−黒棒）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図２Ａ−Ｂ。形質導入プロセスを開始させる前のＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞におけるＣＤ３４＋細胞の増殖は、細胞集団の形質導入効率の上昇をもたらす。図２Ａ−８日後の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識細胞の％（白棒−細胞集団全体の％；黒棒−ＣＤ３４＋細胞集団の％）。図２Ｂ−８日後のＣＤ３４＋細胞全体およびＲＦＰ＋／ＣＤ３４＋細胞全体。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図３。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞におけるＣＤ３４＋細胞の増殖は、サイトカイン用量の増加に伴って改善される。図３Ａ−７日後のＣＤ４５＋造血細胞（造血細胞全体）の増殖倍率。図３Ｂ−７日後のＣＤ３４＋造血細胞の増殖倍率（「同時形質導入」サンプル−白棒。「分離形質導入」サンプル−黒棒）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図４Ａ−Ｂ。形質導入がＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ共培養と連動して実施される場合、ＣＤ３４＋細胞の形質導入効率が上昇する。図４Ａ−７日後のＢＦＰ標識細胞％−細胞集団全体。図４Ｂ−７日後のＢＦＰ標識細胞％−ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞集団（「同時形質導入」サンプル−白棒。「分離形質導入」サンプル−黒棒）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図５。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞との共培養中にＣＤ３４＋細胞の形質導入と組み合わせてサイトカイン用量を増加させると、形質導入されたＣＤ３４＋細胞集団の形質導入効率および細胞の全収量の両方が増加する。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図６。造血細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用によりエレクトロポレーションの間に増加する。動員末梢血（ｍＰＢ）から単離された５００，０００個のＣＤ３４＋細胞を、トランスフェクトした。トランスフェクションは、エレクトロポレーションにより緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを送達した。ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。造血細胞上のＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中の造血性の含有量を決定し、血球計数器による計測と組み合わせて、ここで提示される収量（軸は百万の単位で細胞数を示す）が得られた。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図７Ａ−Ｂ。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用によりエレクトロポレーションの間に増加する。動員末梢血から単離された５００，０００個のＣＤ３４＋細胞を、トランスフェクトした。トランスフェクションは、エレクトロポレーションによりＧＦＰ発現プラスミドを送達した。ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝し（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、およびＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。フローサイトメトリーを用いて、細胞数を定量した。造血幹細胞および前駆細胞上のＣＤ３４およびＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中のＨＳＰＣ含有量を決定した。ＧＦＰ発現はトランスフェクトに成功した細胞を表した。フローサイトメトリーによる定量および血球計数器を用いた細胞計測の後、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ全体の収量を、図７Ａに示す棒グラフに提示し（軸は百万の単位で細胞数を示す）、トランスフェクトに成功したＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの収量を、図７Ｂに示す棒グラフに提示している（軸は百万の単位で細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図８Ａ−Ｄ。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、エレクトロポレーションの間に、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と共培養した場合に増加する。実施例に記載したように、ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのために、全体で１０００個の細胞（ＨＳＰＣのみ、または、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と共培養したＨＳＰＣ）を、メチルセルロース中において、各条件に対し、６ウェルディッシュのうち２つのウェルに、２週間プレーティングした。ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ装置を用いて、プレーティングされた１０００個の細胞当たりの、コロニーの頻度を定量および識別した。図８Ａは、全てのタイプのコロニーの定量を示す棒グラフである（軸はコロニーの総数を示す）。図８Ｂは、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）を図示する棒グラフである（軸はＢＦＵ−Ｅコロニーの数を示す）。図８Ｃは、顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）を定量する棒グラフである（軸は、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの数を示す）。図８Ｄは、顆粒球・赤血球・マクロファージ・巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を定量する棒グラフである（軸は、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図９。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、エレクトロポレーションの間に、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と共培養した場合に増加する。実施例に記載したように、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのために、全体で１０００個の細胞（ＨＳＰＣのみ、または、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と共培養したＨＳＰＣ）を、メチルセルロース中において、各条件に対し、６ウェルディッシュのうち２つのウェルに、２週間プレーティングした。ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ装置を用いて、プレーティングされた１０００個の細胞当たりの、コロニーの頻度を定量および識別した。顆粒球・赤血球・マクロファージ・巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の割合を定量する目的で、コロニーを生じないＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在を説明するように、データを正規化した。棒グラフは、増殖した生成物全体における、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの頻度を表す。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１０。造血細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された４５０，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）２５で形質導入した。形質導入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。造血細胞上のＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて培養物中の造血性の含有量を決定して、血球計数器による計測と組み合わせて、棒グラフで提示される収量を得た（軸は百万の単位で細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１１Ａ−Ｂ。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された４５０，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）２５で形質導入した。形質導入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。フローサイトメトリーを用いて、細胞数を定量した。蛍光抗体を用いて造血幹細胞および前駆細胞上のＣＤ３４およびＣＤ４５を特定して、培養物中のＨＳＰＣ含有量を決定した。ＧＦＰ発現は、形質導入に成功した細胞を示した。フローサイトメトリーによる定量および血球計数器を用いた計測の後、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ全体の収量を図１１Ａの棒グラフに提示し、トランスフェクトに成功したＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの収量を、図１１Ｂの棒グラフに提示している。軸は百万の単位で、細胞数を示す。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１２Ａ−Ｂ。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋幹細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された４５０，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）２５で形質導入した。形質導入は、ＧＦＰを発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。フローサイトメトリーを用いて、細胞数を定量した。造血幹細胞上のＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４およびＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中の幹細胞含有量を決定した。ＧＦＰ発現は形質導入に成功した細胞を表した。フローサイトメトリーによる定量および血球計数器を用いた計測の後に、幹細胞全体の収量を図１２Ａの棒グラフに提示し（軸は百万の単位で細胞数を示す）、形質導入に成功した幹細胞の収量を図１２Ｂの棒グラフに提示している（軸は細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１３。造血細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された３００，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）５０で形質導入した。形質導入は、ＧＦＰを発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。造血細胞上のＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中の造血性の含有量を決定し、血球計数器による計測と組み合わせて、棒グラフで提示される細胞収量を決定した（軸は百万の単位で細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１４Ａ−Ｂ。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された３００，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）５０で形質導入した。該形質導入は、ＧＦＰを発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、Ｄ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。フローサイトメトリーを用いて、細胞数を定量した。造血幹細胞および前駆細胞上のＣＤ３４およびＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中のＨＳＰＣ含有量を決定した。ＧＦＰ発現は形質導入に成功した細胞を表した。フローサイトメトリーによる定量および血球計数器による計測の後、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ全体の収量を図１４Ａの棒グラフに提示し、トランスフェクトに成功したＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの収量を、図１４Ｂの棒グラフに提示している（軸は百万の単位で細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

図１５Ａ−Ｂ。ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋幹細胞全体の収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の使用により、レンチウイルス形質導入の間に増加する。動員末梢血から単離された３００，０００個のＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）５０で形質導入した。該形質導入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する導入遺伝子を送達した。刺激、形質導入、および回復／増殖フェーズの間、ＣＤ３４＋細胞を、刺激および形質導入段階の間サイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。フローサイトメトリーを用いて、細胞数を定量した。造血幹細胞上のＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４およびＣＤ４５を特定する蛍光抗体を用いて、培養物中の幹細胞の含有量を決定した。ＧＦＰ発現は形質導入に成功した細胞を表した。フローサイトメトリーによる定量および血球計数器による計測の後、幹細胞全体の収量を図１５Ａの棒グラフに提示し、形質導入に成功した幹細胞の収量を、図１５Ｂの棒グラフに提示している（軸は細胞数を示す）。ここに明記されていない全ての条件は、実施例に明記されている。

詳細な説明
本特許開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」のセクションは、本発明の主な実施形態のうちいくつかを記載している。「詳細な説明」のセクションは、本発明の組成物および方法に関連する特定のさらなる説明を提供するものであり、本特許開示の他の全てのセクションと併せて読むことが意図されている。さらに、当業者には明らかであるが、本特許開示の全体を通して記載された様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、かつ、組み合わせることが意図されている。本明細書で記載される特定の実施形態のこれらの組み合わせは、本発明の範囲内に入ることが意図されている。

特定の定義を以下に提供する。他の用語は、本特許開示の他の部分で定義されるか、それらが用いられる文脈から明らかな意味を有するか、または、当業界における通常の意味に従って用いられる。

本明細書で使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、数値に関して使用する場合、記載する値の＋または−２０％以内を意味する。

「培養する」という用語は本明細書で使用する場合、様々な種類の培地上または培地中での細胞の繁殖を指す。「共培養する」は、様々な種類の培地上または培地中での２つ以上の異なる型の細胞の繁殖を指し、例えば、いくつかの実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣと、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）が共培養され得る。

「操作された」という用語は本明細書で細胞に関して使用する場合、記載される表現型（例えばＥ４ＯＲＦ１^＋）をもたらすように、または、記載される核酸分子またはポリペプチドを発現するように、人間によって操作された細胞を指す。「操作された細胞」という用語は、天然の細胞を包含することを意図せず、その代わりに、例えば、組換え核酸分子を含む細胞、または別の方法で人工的に（例えば、遺伝子改変によって）変更された細胞（この変更は、例えば、細胞が、変更されなければ発現しないポリペプチドを発現するように、または細胞が、操作されていない内皮細胞で観察されるよりも実質的に高いレベルでポリペプチドを発現するように、なされる）を包含することが意図される。

「増殖」または「増殖する」という用語は、細胞または細胞培養の文脈で、本明細書で使用する場合、初期集団の細胞からの、ある特定の型の細胞（例えば、ＨＳＰＣなどの「標的細胞」）の数の増加を指す。増殖に使用される初期細胞は、増殖の結果生じる細胞と同一である必要はない。例えば、増殖細胞は、初期集団の細胞の成長および／または分化によって産生され得る。

「遺伝子改変」または「遺伝子改変された」は、細胞の正常なヌクレオチド配列に対する、任意の付加、欠失、または破壊を指し、「遺伝子編集」を含むが、これに限定されない。遺伝子改変は、一般的には「遺伝子送達」方法を用いて実施される。

「遺伝子送達」は、任意の外因性核酸分子の細胞への送達を指す。本発明に包含される遺伝子送達方法は、「形質導入」方法（すなわち、標的細胞への核酸のウイルス媒介移入）、および「トランスフェクション」方法（すなわち、標的細胞への核酸の非ウイルス媒介移入）を含むが、これらに限定されない。

「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄系樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球細胞を含む造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能な、クローン原性の自己再生多能性細胞を指す。造血系の他の細胞と同様に、ＨＳＣは、一般的には、細胞マーカーの特徴的なセットの存在によって規定される。

「造血幹細胞または前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、本明細書で使用する場合、上記で定義するようなＨＳＣ、並びに造血系の全ての細胞型へ最終的に分化することが可能である多能性非自己再生前駆細胞、および造血系のある特定の細胞型へ分化することが可能な寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）および単能性前駆細胞を包含する。ＨＳＰＣは、本明細書の他の部分で定義される、ＣＭＰ、ＭＰ、ＭＥＰおよびＧＭＰを含む。

本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、天然であるか合成的にもたらされるかに関わらず、天然の状態で会合している少なくとも１つの他の生成物または組成物から分離された生成物（例えば細胞）または組成物を指す。

本明細書で使用する場合、「組換え」という用語は、分子生物学および遺伝子工学の方法（分子クローニングなど）を用いて、人間によって（機械によることを含む）生成された核酸分子であって、そうでなければ天然に存在しないヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。従って、組換え核酸分子は、天然に（例えば、生物のゲノム中に）存在する核酸分子と区別されるべきである。従って、対応するゲノムＤＮＡ配列中に見出される介在イントロン配列を伴わない、ｍＲＮＡ配列の相補的ＤＮＡ、すなわち、「ｃＤＮＡ」のコピーを含む核酸分子は、組換え核酸分子と見なされるだろう。例として、組換えＥ４ＯＲＦ１核酸分子は、Ｅ４ＯＲＦ１コード配列が、天然のアデノウイルスゲノムにおいては通常会合していないプロモーターおよび／または他の遺伝子要素に作動可能に連結されたものを含み得る。

「自己再生」という用語は、分裂して親細胞と同一の（例えば、自己再生の）特性を有する少なくとも１つの娘細胞を生成する、細胞の能力を指す。第２の娘細胞は、特定の分化経路に進むものであり得る。例えば、自己再生造血幹細胞は、分裂して、１つの娘幹細胞と、骨髄系またはリンパ系経路の分化に向かう別の娘細胞とを形成する。分化の方向が決定された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞は、一般的には自己再生能力を失っており、細胞分裂により、より分化の進んだ（すなわち、限定された）表現型を示す２つの娘細胞を産生する。

「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、特に示されている場合を除いて、ヒトおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物、並びにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよび他の哺乳動物種を指す。

「実質的に純粋」という語句は、細胞集団に関して本明細書で使用する場合、細胞集団全体を構成する細胞のうち、ある特定の型（例えば、１つ以上の特定の細胞マーカーの発現、形態学的特性、または機能的特性によって決定される）の細胞の集団、または２つ以上の異なる細胞型が一緒に使用される実施形態においては特定の（複数の）型の細胞の集団の占める割合が、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％であることを指す。従って、「実質的に純粋な細胞集団」は、細胞集団において、特定の型でない細胞の占める割合が、約５０％よりも少ない、好ましくは約２０〜２５％よりも少ない、より好ましくは約１０〜１５％よりも少ない、最も好ましくは約５％よりも少ないことを指す。

本明細書で記載される本発明の実施形態のいくつかは、例えば、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを発現する操作された内皮細胞、すなわちＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ）である、内皮細胞を包含する。これらの細胞は、Ｅ４ＯＲＦ１をコードする核酸分子を含む。Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチドおよび／またはＥ４ＯＲＦ１をコードする核酸分子は、本明細書で記載される、または、当業界で公知の、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有してよく、あるいは、かかるアミノ酸またはヌクレオチド配列の、変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントである、アミノ酸またはヌクレオチド配列を有してよいが、かかる変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントが、本明細書に記載される機能特性のうち１つ以上を有するか、それらを有するポリペプチドをコードすることが条件である（かかる機能特性は、培養中に内皮細胞の維持または増殖を助ける能力、および／または培養中に別の標的細胞型（ＨＳＰＣなど）の増殖を助ける能力、および／または別の標的細胞型（ＨＳＰＣなど）への遺伝子移入効率を改善する能力を含むが、これらに限定されない）。

アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを包含するこれらの実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス２、３、５、７、９、１１、１２、１４、３４、３５、４６、５０または５２型などの任意の好適なアデノウイルス型または株に由来し得る。いくつかの好ましい実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス５型に由来する。かかるアデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードする核酸配列は、当業界において周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの周知の公的に利用可能なデータベースにおいて入手可能である。例えば、好適な配列として、下記が挙げられる：ヒトアデノウイルス９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＩ０５９９１）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ８９９７７）、ヒトアデノウイルス４６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＸ７０９４６）、ヒトアデノウイルス５２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＫ３５０６５）、ヒトアデノウイルス３４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５０８）、ヒトアデノウイルス１４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３１４６）、ヒトアデノウイルス５０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５５４）、ヒトアデノウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１９６）、ヒトアデノウイルス１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１４１）、ヒトアデノウイルス３５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００６０７）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５７０）、ヒトアデノウイルス１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５３３）、ヒトアデノウイルス１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００４７４）、ヒトアデノウイルス３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＢ １７７９２）、およびヒトアデノウイルス５型（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ１２５８７）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される内皮細胞は、アデノウイルスＥ４領域由来の他の配列を有さない、Ｅ４ＯＲＦ１核酸またはアミノ酸配列を含み、例えば、特定の実施形態では、内皮細胞はＥ４ＯＲＦ１配列を含むが、Ｅ４領域全体、または、Ｅ４領域全体に由来する他のＯＲＦ（Ｅ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４、および／またはＥ４ＯＲＦ５など）を含まない。しかしながら、他の実施形態では、本明細書に記載される内皮細胞は、Ｅ４ＯＲＦ１配列を、Ｅ４領域に由来する１つ以上の他の核酸またはアミノ酸配列（Ｅ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４、またはＥ４ＯＲＦ５配列など）、あるいは、それらの変異体、突然変異体、またはフラグメントと共に含み得る。

ポリペプチドおよび／または核酸分子に関連する本明細書に記載される全ての実施形態において、いくつかの実施形態では、これらのポリペプチドおよび／または核酸分子は、本明細書に具体的に記載されるか、当業界で（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの好適な配列データベースにおいて）知られるのと同じアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、かかる配列の変異体、誘導体、突然変異体またはフラグメント、例えばかかる配列に対して８５％よりも高い配列同一性を有する変異体、誘導体、突然変異体またはフラグメントであるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、変異体、誘導体、突然変異体またはフラグメントは、公知の配列に対して約８５％の同一性、または公知の配列に対して約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、公知のヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体またはフラグメントであって、公知のヌクレオチド配列に対して、長さが、ヌクレオチド約５０個分、またはヌクレオチド約４５個分、またはヌクレオチド約４０個分、またはヌクレオチド約３５個分、またはヌクレオチド約３０個分、またはヌクレオチド約２８個分、ヌクレオチド２６個分、ヌクレオチド２４個分、ヌクレオチド２２個分、ヌクレオチド２０個分、ヌクレオチド１８個分、ヌクレオチド１６個分、ヌクレオチド１４個分、ヌクレオチド１２個分、ヌクレオチド１０個分、ヌクレオチド９個分、ヌクレオチド８個分、ヌクレオチド７個分、ヌクレオチド６個分、ヌクレオチド５個分、ヌクレオチド４個分、ヌクレオチド３個分、ヌクレオチド２個分、またはヌクレオチド１個分異なるものが使用される。いくつかの実施形態では、公知のアミノ酸配列の変異体、誘導体、突然変異体またはフラグメントであって、公知のアミノ酸配列に対して、長さが、アミノ酸約５０個分、またはアミノ酸約４５個分、またはアミノ酸約４０個分、またはアミノ酸約３５個分、またはアミノ酸約３０個分、またはアミノ酸約２８個分、アミノ酸２６個分、アミノ酸２４個分、アミノ酸２２個分、アミノ酸２０個分、アミノ酸１８個分、アミノ酸１６個分、アミノ酸１４個分、アミノ酸１２個分、アミノ酸１０個分、アミノ酸９個分、アミノ酸８個分、アミノ酸７個分、アミノ酸６個分、アミノ酸５個分、アミノ酸４個分、アミノ酸３個分、アミノ酸２個分、またはアミノ酸１個分異なるものが使用される。

本明細書に記載される核酸分子は、所望の用途に応じた様々な他の核酸配列、遺伝子もしくはコード領域［例えば、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子または発現タグ（例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列など）］、相同組換えに有用な配列、または望ましい可能性がある任意の他のヌクレオチド配列もしくは遺伝子を含有するコンストラクトにおいて、使用することができる。本明細書に記載されるポリペプチドは、単独で、または融合タンパク質の一部として発現させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、発現を可能にするために、１つ以上のプロモーターの制御下に置くことができる。所望の細胞型において核酸配列の発現を駆動させることができる任意のプロモーターを用いることができる。好適なプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、およびＭＭＬプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、アデノウイルゲノム由来、またはその変異体であってよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、核酸配列の発現を所望によりオンまたはオフにすることができるように、誘導プロモーターの制御下に置くことができる。例えばテトラサイクリン誘導発現系またはホルモン誘導発現系などの任意の好適な誘導発現系を使用することができる。例えば、本発明の核酸分子は、必要な時に発現させることができ、続いて所望の成果が達成されたら、オフに切り替えることができる。発現をオンまたはオフにする能力は、インビボ適用、例えば、本明細書に記載される方法を用いて産生される遺伝子改変標的細胞のインビボ適用にとって、特に有用であり得る。

本明細書に記載される核酸分子は、天然のヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、細胞内で安定であり、細胞内で直接にタンパク質発現／産生を導くのに使用され得る合成改変ＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡを含み得る。ＤＮＡが使用される実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内で発現を可能にする（および／または促進、増強もしくは調節する）１つ以上の好適なプロモーターおよび／または調節因子に作動可能に連結されてもよく、また、１つ以上の好適なベクターまたはコンストラクト中に存在してもよい。

本発明のポリペプチドおよび核酸分子の取扱い、操作および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来の技術を用いて実施してよい。かかる技術は、当業界において周知である。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed.”, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989、Methods of Enzymologyのシリーズ (Academic Press, Inc.)、または、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の取扱い、操作および発現において用いる好適な技術に関するガイダンスの任意の他の標準的な教本の教示を参照してよい。Ｅ４ＯＲＦ１配列の取扱いまたは発現に関するさらなる局面が、米国特許第８，４６５，７３２号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、標的細胞への遺伝子送達の改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、任意の好適なトランスフェクションシステムまたは任意の好適な形質導入システムなどの、当業界で公知の任意の好適な遺伝子送達システムを用いることができる。

本発明に従い用いることができるトランスフェクション方法には、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃が含まれるが、これらに限定されない。

用いることができる形質導入方法には、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入およびヘルペスウイルス媒介形質導入が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、標的細胞型に影響を及ぼす疾病や疾患に関与することが知られているか、関与することが疑われる遺伝子の補正バージョン、または、標的細胞において提供すること、または標的細胞を用いて投与または送達することが望ましい他の任意の遺伝子、例えば治療的に有用な遺伝子などの、補正バージョンを含むように、標的細胞は遺伝子改変されてよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、操作されたヌクレアーゼを利用して、標的細胞のゲノムにおいて所望のヌクレオチド配列を挿入、欠失、または置換するゲノム編集技術などの、ゲノム編集技術の実施において利用されてよく、または、ゲノム編集技術と関連して利用されてよい。一般的には、かかるヌクレアーゼは、ゲノム中に部位特異的二重鎖切断を引き起こし、非相同末端結合または相同組換えを用いて修復される。遺伝子編集技術において現在用いられている、これらのヌクレアーゼの４つの主なファミリー、すなわち、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターベースヌクレアーゼ（すなわち「ＴＡＬＥＮ」）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）がある。

本発明の方法は、内皮細胞（ＥＣ）、例えばＥ４ＯＲＦ１を発現するように操作された内皮細胞（すなわち、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ）の使用を包含する。かかる内皮細胞は、当業界で公知の、内皮細胞の任意の好適な供給源に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、内皮細胞は血管内皮細胞である。いくつかの実施形態では、内皮細胞は初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞などの哺乳動物細胞、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタもしくは他の哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、内皮細胞は初代ヒト内皮細胞である。いくつかの実施形態では、内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ）である。使用することができる他の好適な内皮細胞には、米国特許第８，４６５，７３２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に、Ｅ４ＯＲＦ１発現に好適であると既に記載されているものを含む。

本発明の操作された内皮細胞は、様々な形態で存在してよく、または様々な形態で提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、単離された細胞の集団などの、細胞の集団を含んでよい。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、インビトロの細胞の集団を含んでよい。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、実質的に純粋な細胞の集団を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、細胞集団全体を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が、本発明の操作された内皮細胞であろう。いくつかの実施形態では、操作された内皮細胞は、操作された細胞および１つ以上のさらなる構成成分を含有する組成物の形態で提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載される操作された内皮細胞の集団を、生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地などの担体溶液と共に含む組成物を提供し得る。いくつかの実施形態では、かかる組成物は、操作された内皮細胞の集団と、ヒト対象などの対象への投与に好適な担体溶液とを含む治療用組成物であってよい。所望であれば、他の治療的に許容される薬剤を含むことができる。当業者であれば、目的の用途に応じて、治療用組成物中に含まれるのに好適な薬剤を容易に選択することができる。

細胞を培養する方法は、当業界において周知であり、任意の好適な細胞培養方法を使用することができる。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋細胞は、他の内皮細胞を培養するのに有用であることが知られている方法、または例えば米国特許第８，４６５，７３２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、Ｅ４ＯＲＦ１発現内皮細胞の培養に有用であることが知られている方法を使用して培養することができる。いくつかの実施形態では、本発明の操作された内皮細胞は、血清の非存在下で、または外因性成長因子の非存在下で、または血清および外因性成長因子の両方の非存在下で培養し得る。また、本発明の操作された内皮細胞は、冷凍保存し得る。R. Ian FreshneyによるCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000)（「Freshney」）（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法などの、細胞培養および細胞冷凍保存のための様々な方法が当業者に公知である。

いくつかの実施形態では、本発明は、共培養方法において、他の細胞の生存、増殖、およびまたは遺伝子改変を助けるための、初代内皮細胞、内皮前駆細胞、またはＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣフィーダー細胞の使用を包含する。例えば、一実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの集団を、ＨＳＰＣおよびＨＳＰＣなどの幹細胞または前駆細胞の成長、増殖、または遺伝子改変を助けるフィーダー細胞として使用し得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの集団と、標的細胞の集団とを培養するための共培養方法を提供する。かかる共培養方法は、同じ培養容器中で、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの集団と、標的細胞の集団とを一緒に培養することを含んでよい。いくつかのこれらの実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣは、培養容器の表面上にフィーダー細胞層を形成してよく、標的細胞は、フィーダー細胞層上に配置されてよい。別の実施形態では、本発明は、標的細胞を培養する方法であって、標的細胞を、Ｅ４ＯＲＦ１＋細胞の培養物から得られる馴化培地と接触させることを含む方法を提供する。

本発明はまた、本明細書に記載される様々な方法を実施するためのキットを提供する。かかるキットは、ヌクレオチド配列、ベクター、内皮細胞、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞、コントロールの操作されていない内皮細胞、標的細胞（ＨＳＰＣなどの）、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣまたは標的細胞を維持または増殖するのに有用な培地または組成物、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される構成成分のいずれかを含有してよい。かかるキットはいずれも、場合により、使用説明書、容器、培養容器等を含んでもよい。キットにラベルを付けてよく、ラベルは、キットの内容物の使用に関する説明または他の情報を提供する任意の文書または記録物［電子的またはコンピューターが読める形態（例えば、ディスク、光ディスク、メモリーチップまたはテープ）であってよい］を含み得る。

本発明の特定の局面は、下記の非限定的な実施例においてさらに説明され得る。本発明の特定の実施形態の前述の説明と同様に、実施例における説明は、例示および説明のために提示されていることに留意されたい。それらは網羅的であること、または、開示された詳細な形態に本発明を限定することを意図するものではない。むしろ本明細書に記載される特定の実施形態の多くの変更および変形が、本特許出願の教示に照らして可能である。本明細書中に提示された実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最もよく説明するために選択され、記載されたものであり、それによって、当業者が企図された特定の用途に適するように、様々な変更を加えて本発明および様々な実施形態を最も有効に利用できるようにするものである。

実施例
下記の実施例で生成されたデータのうちいくつかは、図面で提供されている。さらに、本特許開示の図面の詳細な説明のセクションは、実施された実験および生成されたデータに関する追加の詳細を含む、これらの実施例に関連する特定の追加情報を含有している。本実施例は、図面の詳細な説明および図面自体と併せて読むことが意図されている。
実施例１
ＨＳＰＣの増殖およびウイルス形質導入に及ぼす、Ｅ４ＯＲＦ１＋共培養の影響
ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋ＨＳＰＣを増殖および形質導入させる能力に及ぼすＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞の影響を評価するために、実験を実施した。下記の３つの異なるプロトコールを用いて、ＣＤ３４＋細胞（Ｌｏｎｚａ）に、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を形質導入して、６ウェルプレートでＥ４ＯＲＦ１＋臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ）培養物上で増殖させた。

プロトコール１では、ＨＳＰＣ−Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ共培養開始の２４時間前に、形質導入を開始した（「前形質導入（Ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」）。

プロトコール２では、ＨＳＰＣ−Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ共培養と同時に、形質導入を実施した（「並行形質導入（Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」）。

プロトコール３では、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣと４８時間共培養し、その後、浮遊ＨＳＰＣを形質導入のために空のウェルに移し（２４時間）、形質導入した後に、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣと共培養した（「増殖形質導入（Ｅｘｐａｎｄｅｄ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」）。
上記プロトコールのそれぞれにおいて、細胞培養は、低酸素条件下で実施した。また、それぞれのプロトコールにおいて、およそ１００，０００個の造血細胞（そのうち９５，０００個が、フローサイトメトリーによりＣＤ３４＋であると決定された）を空のウェル（プロトコール１）または、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞でコンフルエントになるよう予め播種したウェル（プロトコール２および３）のいずれかに、プレーティングした。６ウェルプレートの１つのウェルでコンフルエントに存在するＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の数は、約３００，０００細胞である。培地は、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯサイトカインを伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）で構成されていた。形質導入事象は、２４時間で構成され、その間、細胞はＲＦＰおよびポリブレンを発現するように操作されたレンチウイルスと共にインキュベートした。次いで、形質導入された細胞を回収し、遠心沈殿し、サイトカインを含む新鮮な培地に懸濁させ、コンフルエントなＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上に再度プレーティングした。培養培地（サイトカインを含む）をその後２日ごとに交換した。３つの全てのプロトコールにおいて、細胞を合計８日間増殖させ、８日目で細胞を回収し、計数し、ＦＡＣＳ分析のためにＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体で染色した。

造血細胞全体とＣＤ３４＋亜集団（すなわちＨＳＰＣ）の両方が、ＣＤ３４＋細胞を単独で形質導入した場合と比較して、Ｅ−ＣＥＬ ＵＶＥＣ細胞と共培養する設定で形質導入プロセスが行われた場合に、より高い増殖倍率を示した（図１）。さらに、これらの細胞の増殖能力（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、形質導入プロセスを開始させる前の、４８時間の共培養後に、さらに増加した。同様に、最も効率的な形質導入プロセスは、形質導入手順を開始させる前に、造血細胞をＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と４８時間共培養した場合であることが判明した（図２）。重要なことに、これらの結果は、特にＣＤ３４＋亜集団が最も効果的に形質導入され（図２Ａ）、形質導入された集団の最大の増殖を示したことを示している（図２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ３４＋造血細胞をＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞との共培養に順応させることにより、形質導入された細胞集団の、形質導入効率および細胞の全産出量の両方が劇的に増加することを示唆する。

実施例２
ウイルス形質導入効率に及ぼす、浮遊画分およびサイトカインの影響
形質導入効率に及ぼす、ＣＤ３４＋造血細胞の「浮遊画分」の除去の影響を決定するために、および、サイトカイン濃度が形質導入効率に影響を与えるかどうかを決定するために、実験を実施した。

下記の４つの異なるプロトコールを用いて、ＣＤ３４＋細胞（Ｌｏｎｚａ）に、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を形質導入して、６ウェルプレートでＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上で増殖させた。

プロトコール１および３において、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上で９６時間増殖させ、続いて、ＨＳＰＣを依然としてＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣフィーダー層上に置いたまま、ＨＳＰＣを、ＢＦＰを発現するように操作されたレンチウイルスと共に、２４時間インキュベートすることにより形質導入した。ＨＳＰＣをその後、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上で、さらに２日間増殖させた。これらのプロトコールを用いて得られた結果は、図面において、「同時形質導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」の結果と称される。

プロトコール２および４において、ＨＳＰＣをＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上で９６時間増殖させ、続いて、浮遊画分を空のウェルに移動させ、ＢＦＰを発現するように操作されたレンチウイルスと共に、ＨＳＰＣを２４時間インキュベートすることにより形質導入した。形質導入期間後、ＨＳＰＣを、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上で、さらに２日間培養した。これらのプロトコールを用いて得られた結果は、図面において、「分離形質導入」の結果と称される。

プロトコール１または２で用いた細胞培養培地は、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌのサイトカインＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯを伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）で構成されていた（図面において、「標準サイトカイン用量（ｎｏｒｍ ｃｙｔｏ ｄｏｓｅ）」と称される）。プロトコール３または４で用いた細胞培養培地は、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＦｌｔ３、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯおよびＩＬ−６、並びに２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）で構成されていた（図面において、「高サイトカイン用量（ｈｉｇｈ ｃｙｔｏ ｄｏｓｅ）」と称される）。

上記プロトコールのそれぞれにおいて、全ての細胞培養は、低酸素条件下で実施した。また、これら４つのそれぞれのプロトコールにおいて、１００，０００個の造血細胞（フローサイトメトリーにより決定された、９５，０００個のＣＤ３４＋細胞を含む）をＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞のコンフルエント層にプレーティングした。６ウェルプレートの１つのウェルでコンフルエントに存在するＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の数は、約３００，０００細胞である。９６時間の造血細胞／Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ共培養の後、サンプルを、ＢＦＰおよびポリブレンを発現するように操作されたレンチウイルスとインキュベートする２４時間から構成される形質導入事象を開始した。次いで、形質導入されたサンプルを回収し、遠心沈殿し、新鮮な培地（示したように、サイトカインを含む）に再懸濁させ、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物上にプレーティングした。培地（サイトカインを含む）をその後２日ごとに交換した。全てのサンプルについて増殖は合計７日間続き、その後細胞を回収し、計数し、ＦＡＣＳ分析のためにＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体で染色した。

予想通り、造血細胞集団全体と、ＣＤ３４＋造血細胞亜集団の両方が、より高いサイトカイン用量を用いた場合に、より高い増殖倍率を示した（図３）。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物の存在下で形質導入された造血細胞集団の増殖倍率は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの非存在下で形質導入されたものと比較して、ほとんど差異がないようであった。しかしながら、驚くべきことに、形質導入効率は、形質導入が、形質導入事象中にＥ４ＯＲＦ１ＵＶＥＣ培養物から一時的に分離された造血細胞で実施された場合よりも、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下で実施された場合の方が高かった（図４）。このように、形質導入ステップ中に、潜在的にウイルスを吸収／捕捉（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ）する可能性がある第２の細胞型（すなわち、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ）が存在するにもかかわらず、造血細胞、特にＣＤ３４＋／ＨＳＰＣ細胞画分は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下で形質導入された場合でも、より高いウイルス取り込み能力を示した。サイトカイン投与は形質導入効率にほとんど影響を与えなかったが（図４）、より高いサイトカイン用量を使用すると、細胞増殖の増加および／または形質導入されたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞の数の増加に起因し得ることであるが、形質導入されたＣＤ３４＋細胞の全体の数が増加した（図５）。まとめると、これらの結果は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ培養物の存在下でＨＳＰＣを形質導入することは、ウイルス形質導入効率を改善できること、および、形質導入された細胞の数は、増殖中に用いられるサイトカイン用量の増加によってさらに増強することができることを示唆している。

実施例１および２で提示したデータは、ＨＳＰＣなどの特定の標的細胞を、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣと共培養することにより、遺伝子移入の効率を有意に改善できることを示している。特に、本明細書で提示される結果は、遺伝子編集分野での大きなハードルであるＨＳＰＣのウイルス形質導入が、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ共培養システムを用いることで有意に改善できることを示している。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在は、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋ＨＳＰＣの全収量、およびこの重要な幹細胞集団における形質導入効率を、共に増加させる。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ共培養のこの二重の利点は、例えば遺伝子編集および／または遺伝子治療の目的で、様々な遺伝子移入方法の効率を改善するための新規な手段となり得る。

実施例３
後続のＥＣ共培養による、トランスフェクトされた細胞の救助
エレクトロポレーションによりトランスフェクトされた細胞などの、トランフェクトまたは形質導入された細胞は、トランスフェクションまたは形質導入の後に、ＥＣと培養することができる。かかる後続の共培養は、トランスフェクションまたは形質導入プロセスにより損傷を受けた細胞を「救助」することができ、トランスフェクト、または形質導入された細胞の細胞死および損失を減少させる。かかる共培養は、トラスフェクションまたは形質導入ステップが開始された後、（この特許明細書に定義されているように）「直ちに」開始され、そして標的細胞の回収を可能にするのに十分な時間継続すべきである。理論に縛られることを望むものではないが、かかる「救助」は、２つの細胞集団（すなわち、形質導入／トランスフェクトされた細胞およびＥＣ）間の細胞間接触の結果として、および／または、形質導入／トランスフェクトされた細胞を、アンジオクライン因子およびサイトカインなどの、ＥＣによって分泌される可溶性因子に曝露した結果として、起こり得ると考えられている。２つの細胞集団の共培養はまた、形質導入またはトランスフェクトされた細胞の増殖を促進および／または増加させることができる。

用いられるＥＣは、任意の所望のＥＣであることができる。臓器特異的ＥＣ（すなわち、形質導入／トランスフェクトされた細胞が由来するのと同じ臓器に由来するＥＣ）を用いることができる。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣもまた、用いることができる。

実施例４
エレクトロポレーションによるＨＳＰＣの増殖およびトランスフェクションに及ぼす、Ｅ４ＯＲＦ１＋共培養の影響
目的：Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞との共培養の状況下で、プラスミドＧＦＰをヒト動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトするための、エレクトロポレーションシステム（Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）の影響を試験すること。
実験デザイン：細胞培養は、特に明記しない限り、５％酸素および３７℃で行った。ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階（すなわち、刺激段階、トランスフェクション段階、および回復段階）の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。０日目に、１，５００，０００個のヒトｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌより入手）を、低結合吸着の６ウェルディッシュ（１ウェルあたり５００Ｋ）のうち２つのウェルに、および、予め馴化されたＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣの６ウェルディッシュ（５００Ｋ）のうち１つのウェルにプレーティングした。これらは全てサイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯ）を伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）であった。１日目（２４時間後）に、全てのサンプルを回収し、遠心沈殿し、計数した。細胞は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびｍａｘＧＦＰプラスミド（Ｌｏｎｚａより入手）に再懸濁される。サンプルをエレクトロポレーションし、以下のようにプレーティングした：♯１：第１の低結合ウェルは新しい低結合ウェルに移した（Ｃ／Ｃ／Ｃ）。♯２：第２の低結合ウェルはＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣウェルに移した（Ｃ／Ｃ／Ｅ）。♯３：Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣウェルは、第２のＥ−ＣＥＬＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣに移した（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。全てのサンプルは、サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯ）を伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）で培養を継続した。次いで、プレートを、３７℃で９６時間、５％酸素のインキュベーターに置き（トランスフェクションの４８時間後に新鮮な培地とサイトカインを再び与えた）、９６時間目に、それらを細胞計測、フローサイトメトリー、およびＣＦＵアッセイで解析した。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを使用する各場合において、各ウェルに３００，０００個のこれらの細胞が存在した。すなわち、共培養およびトランスフェクト／形質導入は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣのコンフルエントな単層の存在下で行われた（６ウェルプレートのうち１つのウェルにおいてコンフルエントなＥＣの数は、約３００，０００個である）。

結果：アッセイ全体においてＥＣ上で増殖した造血細胞全体（図６）および特にＣＤ３４＋細胞（図７Ａ）は、全体の増殖が最も大きく（６．４倍増加）、トランスフェクション事象直後のＥＣ上でのＣＤ３４＋細胞の増殖が続いた（２．７倍増加）。ＥＣの非存在下でトランスフェクションして増殖させたＣＤ３４＋細胞は、完全に最少の増殖（０．７倍増加）を示した。注目すべきことに、ＣＤ３４＋集団のトランスフェクション効率は、ＥＣ細胞の存在により悪影響を受けず（７８％のＣＤ３４＋細胞がＥ／Ｅ／Ｅサンプルにおいてトランスフェクトされ、これに対し、Ｃ／Ｃ／ＣおよびＣ／Ｃ／Ｅサンプルでは、それぞれ、７３％のＣＤ３４＋および７６％のＣＤ３４＋がトランスフェクトされた）、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞への曝露が増加するにつれて、トランスフェクトされたＣＤ３４＋の全収量が顕著に増加した（図７Ｂ）。全てのサンプルがＣＦＵアッセイにおける全コロニー形成に陽性であったが（図８Ａ）、ＥＣ細胞の存在下で増殖されたＣＤ３４＋細胞のみがＧＥＭＭ形成を示し（図８Ｄおよび図９）、このことは、これらの増殖された集団に多能性前駆細胞（ＭＭＰ）が存在することを示している。

結論：ＥＣ Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の存在下でのＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションおよびその後の増殖は、プロセス中のＥＣ集団の遅れた介入または完全な省略と比較して、細胞全体およびトラスフェクトされた細胞の最大収量をもたらす。さらに、驚くべきことに、トランスフェクション効率は、トランスフェクション事象の間、ＥＣ集団の存在によって悪影響を受けない。最後に、ＥＣと共培養したサンプルについての、ＣＦＵアッセイにおけるＧＥＭＭコロニー形成の存在は、ＥＣが、増殖プロセスの間、ＣＤ３４＋細胞のＭＰＰ増殖の維持において、重要な役割を果たすことを示す。これらの結果は、このトランスフェクトした造血細胞を用いる場合に、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞を導入することは、これらの細胞の非存在下で行われる遺伝子送達と比較して改善を提供し得ることを示す。

実施例５
Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣプラットフォームを用いた、レンチ−ＧＦＰによる、サル非ヒト霊長類ｍＰＢ ＣＤ３４＋の形質導入
目的：Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ共培養の状況下で、非ヒト霊長類ｍＰＢ ＣＤ３４＋の形質導入効率および増殖を評価すること。

実験デザイン：増殖アッセイは、５％酸素で実施した。ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。４５０，０００個の非ヒト霊長類ｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞を、それぞれ以下のようにプレーティングした：♯１）を、レトロネクチンをコートした１つのウェル（６ウェル形式）に；♯２）を、レトロネクチンをコートした１つのウェル（６ウェル形式）に；♯３）を、コンフルエントなＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の１つのウェル（６ウェル形式）に、プレーティングした。３つの全てのサンプルの最初のＣＤ３４＋プレーティングは０日目に開始し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯを伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）中で行われた。１日目（２４時間後）に、全てのサンプルに新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた；さらに、感染効率（ＭＯＩ）２５でＧＦＰレンチウイルスを３つの全てのサンプルに添加した。２日目（形質導入の２４時間後）に、サンプル♯１を、新しいレトロネクチンをコートしたウェルに移した。サンプル♯２および♯３は、既にそれぞれＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞を播種した１つの新しいウェルに移した。全てのサンプルに、新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた。４日目（形質導入の７２時間後）に、全てのサンプルに新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた。６日目（形質導入の１２０時間後）に、細胞を、新しいレトロネクチンをコートしたウェル（サンプル♯１）、または、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞のウェル（サンプル♯２および♯３）のいずれかに、新鮮な培地およびサイトカイン中で移した。８日目（トランスフェクションの１６８時間後）に、全てのサンプルに、新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた。１０日目（トランスフェクションの１９２時間後）に、全てのサンプルを、細胞計測および（ＦＡＣＳのための）染色のために回収した。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを使用する各場合において、各ウェルに３００，０００個のこれらの細胞が存在した。すなわち、共培養およびトランスフェクト／形質導入は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣのコンフルエントな単層の存在下で行われた（６ウェルプレートのうち１つのウェルにおいてコンフルエントなＥＣの数は、約３００，０００個である）。

結果：アッセイ全体においてＥＣ上で増殖した造血細胞全体（図１０）および特にＣＤ３４＋細胞（図１１左）は、ＧＦＰによる形質導入直後にＥＣ上で増殖したＣＤ３４＋細胞（４８倍増加）と比較して、より大きな全体の増殖（６２倍増加）を示した。ＥＣの非存在下でＧＦＰにより形質導入して増殖させたＣＤ３４＋細胞は、完全に最少の増殖（７倍増加）を示した。ＣＤ３４＋集団の形質導入効率（図１１）は、ＥＣ存在下でわずかに減少した（Ｅ／Ｅ／Ｅサンプルにおいて４２％のＣＤ３４＋細胞がトランスフェクトされ、これに対し、Ｃ／Ｃ／Ｃサンプルにおいて６０％のＣＤ３４＋細胞がトランスフェクトされた）。興味深いことには、ＥＣ非存在下で形質導入されたが、その後続いてＥＣ細胞上で共培養されたＣＤ３４＋細胞もまた、形質導入効率のわずかな減少を示した（Ｃ／Ｃ／Ｅサンプルにおいて、５１％のＣＤ３４＋がトランスフェクトされた）。しかしながら、ＣＤ３４＋のトランスフェクトされた細胞の全収量は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と共培養した場合に、より多かった（図１１Ｂ）。表現型幹細胞集団（ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋細胞により測定される）の形質導入効率についても、同様の傾向が認められた：Ｅ／Ｅ／Ｅサンプル−２１％；Ｃ／Ｃ／Ｅサンプル−２４％；Ｃ／Ｃ／Ｃサンプル−３８％（図１２）。注目すべきことに、Ｃ／Ｃ／Ｃサンプル（約３００，０００個）と比較して、Ｅ／Ｅ／Ｅサンプル（約９００，０００個の細胞）およびＣ／Ｃ／Ｅサンプル（約８５０，０００個の細胞）において、形質導入された幹細胞の数の有意な増加が見られた（図１２Ｂ）。

結論：形質導入事象の間にＥＣが存在すると、サルＣＤ３４＋細胞、より具体的には、ＣＤ３４＋幹細胞の形質導入効率はわずかに減少したが、形質導入におけるわずかな減少は、ＥＣがプロセスの一部にあった場合には、増殖した生成物におけるこれらの細胞の数の顕著な増加により、相殺された。従って、例えばＭＯＩの上昇によって形質導入事象の条件を変更することにより、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞プラットフォームがもたらす細胞の全収量の有意な増加を依然として維持しながら、形質導入効率の上昇を達成し得る。

実施例６
Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞プラットフォームを用いた、レンチ−ＧＦＰによるヒトｍＰＢ ＣＤ３４＋の形質導入
目的：Ｅ−Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞存在下でレンチＧＦＰにより形質導入した場合の、ヒトｍＰＢ ＣＤ３４＋の形質導入効率および／または増殖能力への影響を決定すること。

実験デザイン：増殖アッセイは、５％酸素で実施した。ＣＤ３４＋細胞を、刺激、トランスフェクション、および回復／増殖フェーズの間、サイトカインのみ（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ）に曝すか（Ｃ／Ｃ／Ｃと表される）、ＣＤ３４＋細胞を、刺激およびトランスフェクション段階の間サイトカインに曝し、その後Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞と直接的に共培養して回復させるか（Ｃ／Ｃ／Ｅ）、あるいは、ＣＤ３４＋細胞を、３つの全ての段階の間、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ存在下に置いた（Ｅ／Ｅ／Ｅ）。３００，０００個のヒトｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓより入手）を、以下のようにそれぞれプレーティングした：♯１）を、レトロネクチンをコートした１つのウェル（６ウェル形式）に；♯２）を、コンフルエントなＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞の１つのウェルにプレーティングした。サンプル♯１および♯２の最初のＣＤ３４＋プレーティングは０日目に開始し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、およびＴＰＯを伴うＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製造）中で行った。１日目（２４時間後）に、両サンプルに新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた；さらに、感染効率（ＭＯＩ）５０でＧＦＰウイルスをサンプル♯１および♯２に添加した。２日目（形質導入の２４時間後）に、各サンプルを新鮮な培地およびサイトカイン中の、新鮮なＥ４ＯＲＦ１＋ＵＶＥＣ細胞上に移した。４日目（形質導入の７２時間後）に、細胞に新鮮な培地およびサイトカインを再度与えた。６日目（形質導入の１２０時間後）に、計測および染色（ＦＡＣＳ）のために回収した。Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを使用する各場合において、各ウェルに３００，０００個のこれらの細胞が存在した。すなわち、共培養およびトランスフェクト／形質導入は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣのコンフルエントな単層の存在下で行われた（６ウェルプレートのうち１つのウェルにおいてコンフルエントなＥＣの数は、約３００，０００個である）。

結果：アッセイ全体においてＥＣ上で増殖した造血細胞全体（図１３）および特にＣＤ３４＋細胞（図１４Ａ）は、ＧＦＰによる形質導入直後のＥＣ上で増殖したＣＤ３４＋細胞（７．９倍増加）と比較して、より大きな全体の増殖（２１．５倍増加）を示した。ＣＤ３４＋集団の形質導入効率は、ＥＣの存在により、わずかに減少した（Ｅ／Ｅ／Ｅサンプルにおいて６１％のＣＤ３４＋細胞がトランスフェクトされ、これに対し、Ｃ／Ｃ／Ｅサンプルにおいて８１％のＣＤ３４＋細胞がトランスフェクトされた、図１４Ｂ）。同様に、表現型幹細胞集団（ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋細胞により測定される）の形質導入効率もまた、Ｃ／Ｃ／Ｃサンプル（９２％）に対して、Ｅ／Ｅ／Ｅサンプル（７４％）において、わずかに低かった（図１５）。注目すべきことに、Ｃ／Ｃ／Ｅサンプルと比較して、Ｅ／Ｅ／Ｅサンプルにおいて、形質導入された幹細胞の数において３倍の増加が見られた（図１５Ｂ）。

結論：ＥＣが形質導入事象の間に存在する場合、ＣＤ３４＋幹細胞のレンチ媒介形質導入の効率はわずかに低かったが（Ｃ／Ｃ／Ｅについて９２％に対し、Ｅ／Ｅ／Ｅについて７４％）、この穏やかな減少は、増殖プロセスの終了時に生成された、形質導入に成功した幹細胞の大幅な増加によって相殺された（約３６，０００個のＣ／Ｃ／Ｅの形質導入された幹細胞に対し、約１００，０００個のＥ／Ｅ／Ｅの形質導入された幹細胞）。依然として、高い形質導入効率（例えば、＞７０％）および細胞の高収量がこのプラットフォームの最終目標であるが、形質導入条件のさらなる操作は、この重要な細胞集団のその後の増殖を妨げることなく、形質導入効率をさらに改善する上で（例えば、＞９０％）、役立ち得る。

本発明は、以下の特許請求の範囲によって、さらに記載される。

Claims (50)

1. 標的細胞に遺伝子送達する方法であって、
   （ａ）標的細胞を内皮細胞と共培養すること、および
   （ｂ）標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子と接触させること
   を含み、ここで標的細胞を内皮細胞と共培養するステップを、
   ｉ．標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子と接触させる前、または
   ｉｉ．標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子と接触させるのと同時、または
   ｉｉｉ．標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子または分子と接触させた後、または
   ｉＶ．これらの任意の組み合わせ
   のいずれかに開始させる、方法。
2. 標的細胞をまた、遺伝子編集に有用な１つ以上の分子と接触させる、請求項１に記載の方法。
3. 内皮細胞がＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 共培養ステップを正常酸素圧条件下で実施する、請求項１に記載の方法。
5. 共培養ステップを低酸素条件下で実施する、請求項１に記載の方法。
6. 共培養ステップを著しい低酸素条件下で実施する、請求項１に記載の方法。
7. 共培養ステップを０．１％〜１８％の範囲の酸素レベルで実施する、請求項１に記載の方法。
8. さらに標的細胞を１つ以上の外因性ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
9. 該ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 標的細胞が分化細胞である、請求項１に記載の方法。
11. 標的細胞が幹細胞または前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
12. 標的細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
13. 標的細胞が造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
14. ＨＳＣまたはＨＳＰＣがＣＤ３４＋である、請求項１２または１３に記載の方法。
15. ＨＳＣまたはＨＳＰＣが骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する、請求項１２または１３に記載の方法。
16. 標的細胞が骨髄由来ＣＤ３４＋ＨＳＣまたはＨＳＰＣである、請求項１に記載の方法。
17. 内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
18. 内皮細胞が初代血管内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
19. 内皮細胞が哺乳動物内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
20. 内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
21. 内皮細胞が完全に分化した内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
22. 内皮細胞が臓器特異的内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
23. 内皮細胞が有糸分裂不活性である、請求項１に記載の方法。
24. 内皮細胞が臍帯静脈内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
25. 内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
26. 標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子と接触させるステップが、トランスフェクションにより実施される、請求項１に記載の方法。
27. トランスフェクションがリポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、または微粒子銃を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 標的細胞を１つ以上の外因性核酸分子と接触させるステップが、形質導入により実施される、請求項１に記載の方法。
29. 形質導入が、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入またはヘルペスウイルス媒介形質導入を用いて実施される、請求項２８に記載の方法。
30. 該核酸分子がプラスミドベクターに存在する、請求項１に記載の方法。
31. 該核酸分子がウイルスベクターに存在する、請求項１に記載の方法。
32. 該核酸分子が、標的細胞中の遺伝子欠損を補正するための、遺伝子補正されたヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
33. 該遺伝子改変標的細胞を、それを必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
34. 対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
35. 対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
36. 対象が標的細胞に影響を与える疾病または疾患を有する、請求項３３に記載の方法。
37. 疾病または疾患が遺伝性の疾病または疾患である、請求項３６に記載の方法。
38. 対象が標的細胞の欠損を有する、請求項３３に記載の方法。
39. 標的細胞に影響を与える遺伝性の疾病または疾患を有する対象に、該遺伝子改変標的細胞を投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
40. 標的細胞がＨＳＣまたはＨＳＰＣであり、対象が造血系の細胞に影響を与える疾病または疾患を有する、請求項３３に記載の方法。
41. 対象が造血幹細胞移植を必要とする、請求項３３に記載の方法。
42. 対象が骨髄破壊的処置により引き起こされる造血発生の欠損を有する、請求項３３に記載の方法。
43. 対象が、代謝疾患、神経疾患、がん、自己免疫疾患、感染性疾患、血液疾患、感染性免疫不全、Ｔ細胞に影響を及ぼす感染性疾患、ＨＩＶ、遺伝的免疫不全、重症複合免疫不全症、サンフィリッポ症、赤血球に影響を及ぼす遺伝性疾病、貧血、鎌状赤血球貧血、ファンコニ貧血、およびサラセミアからなる群から選択される疾病または疾患を有する、請求項３３に記載の方法。
44. 標的細胞が、対象に対して同種異系である、請求項３３に記載の方法。
45. 標的細胞が、対象に対して自家である、請求項３３に記載の方法。
46. 標的細胞が、対象に対して異種である、請求項３３に記載の方法。
47. 請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を用いて産生された、トランスフェクト、または形質導入された標的細胞。
48. 請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を用いて産生された、トランスフェクト、または形質導入された標的細胞を含む組成物。
49. 請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を用いて産生された、トランスフェクト、または形質導入された標的細胞と、内皮細胞とを含む組成物。
50. 請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を用いて産生された、トランスフェクト、または形質導入された標的細胞と、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞とを含む組成物。