KR20180133484A - 향상된 유전자 전달 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 타겟 세포의 유전자 전달 또는 그외 유전자 변형이 내피 세포의 존재 하에 또는 타겟 세포와 내피 세포의 공-배양 이후에 수행되거나, 또는 타겟 세포와 내피 세포의 공-배양이 유전자 전달 공정 중에 손상될 수 있는 세포를 "구제"하기 위해 유전자 전달 직후에 수행되는, 타겟 세포에 대한 개선된 유전자 전달 방법 또는 유전자 변형 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 유전자 전달은 형질감염에 의해 수행된다. 일 구현예에서, 유전자 전달은 형질도입에 의해 수행되며, 일 구현예에서, 내피 세포는 장기-특이적인 내피세포이다. 일 구현예에서, 내피 세포는 E4ORF1을 발현하는 내피 세포 (E4ORF1+ EC)이다. 일 구현예에서, 타겟 세포는 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포이다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2016년 4월 15일자 미국 가출원 번호 62/323,476 및 2016년 10월 1일자 미국 가출원 번호 62/403,110에 대해 우선권을 주장하며, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
원용에 의한 포함
원용에 의한 병합을 허용하는 법을 가진 국가들에 대해서는, 본원에 인용된 모든 참조문헌들 (비-배타적인 예로, 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 문헌)은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 본원에 인용 또는 언급된 모든 제품에 대한 모든 제조사의 설명서 또는 카탈로그 역시 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 8,465,732에 제시된 많은 교시 내용들이 본 발명과 함께 이용되거나 또는 본 발명과 함께 사용되도록 개조될 수 있다. 이에, 미국 특허 8,465,732의 전체 내용은 원용에 의해 본원에 명확하게 포함된다. 원용에 의해 본원에 포함되는 문헌 또는 그 문헌의 모든 교시 내용이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다.
아데노바이러스의 초기 4 (E4) 영역은 6개 이상의 오픈 리딩 프레임 (E4ORF)을 포함한다. E4 전체 영역이 혈관신생을 조절하고, 내피 세포의 생존을 증진하는 것으로 이미 확인된 바 있다 (Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66). 또한, E4 전체 영역 중, E4ORF1 서열이 내피 세포에서 이러한 생물학적 작용을 담당한다는 것도 밝혀져 있다 (미국 특허 8,465,732 및 Seandel et al. (2008) PNAS 105(49):19288-93). 이미, E4ORF1을 발현하도록 조작된 내피 세포가 다양한 공동-배양 방법에 특히 유용한 것으로 확인된 바 있다 - 이 방법을 이용해 조혈 줄기 세포 등의 다양한 줄기 세포 등의, 배양 유지 및 증식시키기 어려운 다양한 여러가지 세포 타입의 증폭을 유지시킬 수 있다 (미국 특허 8,465,732, 및 Seandel et al. (2008), PNAS, 105(49):19288-93).
유전자 테라피, 예를 들어 유전자 편집 기술을 이용한 유전자 테라피는 수많은 유전자 장애 및 질병에 맞서기 위한 유망한 잠재적인 해법을 제공해준다. 그러나, 이 분야에서 극복해야 할 주된 장애물은, 이식을 위해 충분한 수의 자가 세포를 효과적으로 유전자 조작할 수 있고, 또한 치료학적으로 효과적일 가능성이 매우 높은 타입의 세포를 변형시킬 수 있어야 한다는 것이다. 혈액 장애에 대한 유전자 테라피의 경우, 이러한 세포 타입으로는 조혈 줄기 세포 (HSC) 및 조직-특이적인 재군락성 (repopulating) 줄기 세포와 전구 세포 등이 있다. 이러한 중요한 조혈 줄기 세포 집단에 대해 유전자-교정 및 또 다른 유전자 테라피 기술을 이용하여, 몇몇 혈액적인 장애들을 보다 효과적으로 치료할 수 있다. 그러나, 불행하게도, 이들 세포 및 기타 세포에서 유전자-교정 시도는 지금까지 거의 비-효율적인 것으로 입증되었다.
몇몇 세포 형질도입 및 형질감염 기술 (예, 전기천공)들은 상당한 세포 스트레스와 세포 손상을 유발하며, 종종 세포 사멸을 초래한다. 이와 같이, 성공적으로 형질도입되거나 또는 형질감염된 세포 중 일부만 생존한다. 이는 줄기 세포에 유전자를 전달하는데 특히 문제가 되며, 또한 건강하고 생존가능한 세포 형질도입체 또는 형질감염체가 다량 요구되는 이용 분야에서 특히 문제가 된다.
본 발명은, 부분적으로는, 본원의 "실시예" 부분에서 추가로 기술된, 새로운 발견 사실과 공정을 토대로 한다.
예를 들어, 특정 "타겟 세포"에의 유전자 전달 효율 및/또는 줄기 세포를 포함하여 성공적으로 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포의 수율을, 유전자 전달이 내피 세포와의 공-배양으로 수행되는 경우, 예를 들어, E4ORF1 유전자를 발현하는 내피 세포 (E4ORF1+ EC) 등의 생체외 배양에 최적화된 내피 세포와의 공-배양으로 수행되는 경우에, 현저하게 높일 수 있다는 것을, 인지하게 되었다.
출원인이 인지하고 있는 한, 내피 세포, 보다 구체적으로는 E4ORF1+ EC가, 다른 "타겟" 세포 타입 (예, E4ORF1+ EC와 공-배양된 세포)에의 유전자 전달 효율 및/또는 성공적으로 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포의 수율, 및/또는 유전자 전달 공정 중에 손상된 세포의 "구제 (rescue)" 능력에 미치는 효과는 아직까지 발표된 바 없다. 또한, 유전자 전달 방법이 내피 세포, 특히 E4ORF1+ EC의 존재 하에 수행되는 경우, 유전자 전달 효율 및/또는 성공적으로 형질도입 또는 형질감염된 세포의 수율에 유해한 영향을 미치지 않으며, 심지어 향상시킬 수 있다는 사실은, 반-직관적인 것으로 보인다 - 그 이유는, 통상의 지식인이라면, 내피 세포 (예, E4ORF1+ EC)가 타겟 세포에 의해 흡수될 수도 있는 유전 물질을 흡수함으로써, 타겟 세포로의 전체 유전자 전달 효율을 현저하게 감소시키고 및/또는 성공적으로 형질도입된 또는 형질감염된 세포의 수율을 현저하게 낮출 것으로 예상하기 때문이다. 그러나, 본원에 제시된 결과는, 그렇지 않다는 것을 보여준다. 반대로, 본원에 제시된 결과는, 타겟 세포에의 유전자 전달 효율 및/또는 성공적으로 형질도입 또는 형질감염된 세포의 수율이, 타겟 세포 단독 배양물에서 보다, - 심지어 배양물에 전달되는 유전 물질의 총량이 동일하고 배양물내 타겟 세포의 상대적인 비율이 감소된 경우에도 - 내피 세포, 특히 E4ORF1+ EC도 포함하는 배양물에서 훨씬 더 높다는 것을, 보여준다. 이러한 발견을 토대로, 본 발명은 새롭고 개선된 유전자 전달 방법과 이러한 방법에 이용가능한 다양한 조성물을 제공한다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명은, (a) 타겟 세포를 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)와 공-배양하는 단계, 및 (b) 타겟 세포를, 유전자 전달/유전자 편집에 사용가능한 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 타겟 세포와 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)의 공-배양 단계가 (i) 타겟 세포를 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자와 접촉시키기 전에, (ii) 타겟 세포와 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자의 접촉과 동시에, (iii) 타겟 세포와 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자를 접촉시킨 후, 또는 (iv) 이들의 임의 조합으로 수행되는, 타겟 세포에 대한 유전자 전달 방법을 제공한다.
이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 유전자 전달은 유전자 편집 공정의 일부이며, 또한 타겟 세포를 유전자 편집에 사용가능한 하나 이상의 분자와 접촉시키는 단계를 수반할 수 있다.
이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 타겟 세포는 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)와 공-배양되며 (예, 이들은 타겟 세포와 동일 용기에 존재하거나 및/또는 접촉됨), 동시에 타겟 세포는 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자와 접촉된다.
이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 타겟 세포는, 타겟 세포를 하나 이상의 외인성 핵산 분자 및/또는 기타 분자와 접촉시키기 전에, 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)와 적어도 12시간, 또는 적어도 24시간 (1일), 또는 적어도 36시간, 또는 적어도 48시간 (2일) 또는 적어도 60시간, 또는 적어도 72시간 (3일) 또는 적어도 84시간, 또는 적어도 96시간 (4일) 공-배양된다.
이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 타겟 세포와 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)의 공-배양은, 유전자 전달 공정 중에 발생되는 임의의 손상으로부터 타겟 세포를 신속하게 "구제하기" 위해, 유전자 전달/유전자 편집에 사용가능한 하나 이상의 외인성 핵산 분자 또는 기타 분자와 접촉시킨 후 즉시, 개시된다. 이런 맥락에서, 용어 "즉시"는 "접촉" 단계 완료 후 30분 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 타겟 세포와 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)의 공-배양은 "접촉" 단계 완료 후 15분 이내, 또는 10분 이내, 또는 5분 이내, 또는 3분 이내, 또는 2분 이내, 또는 1분 이내에 개시된다. "접촉" 단계의 완료 시기는 사용되는 유전자 전달 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 유전자 전달이 전기천공에 의해 달성되는 경우, "접촉" 단계는 전기 펄스가 끝났을 때 완료되며, 타겟 세포는 전기 펄스가 끝난 후 내피 세포와 공-배양되게 배치되어야 한다. 이와 유사하게, 유전자 전달이 타겟 세포를 리포펙션 시약과 접촉시켜 달성되는 경우, "접촉" 단계는 리포펙션 시약이 (배지 교체에 의해) 제거되는 시점에 완료되며, 타겟 세포는 리포펙션 시약의 제거 후 내피 세포와 공-배양되도록 배치되어야 한다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 타겟 세포는, 접촉 단계가 완료된 후, 적어도 2시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간 (1일), 또는 적어도 48시간 (2일) 또는 적어도 72시간 (3일) 또는 적어도 96시간 (4일) 또는 적어도 120시간 (5일) 또는 적어도 144시간 (6일) 또는 적어도 168시간 (7일) 또는 적어도 192시간 (8일) 또는 적어도 240시간 (10일) 또는 적어도 288시간 (12일)간 계속 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)와 공-배양된다.
일부 구현예에서, 공-배양 공정에서, 타겟 세포 : 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)의 비율은 약 1:1이다. 일부 구현예에서, 공-배양 공정에서, 타겟 세포 : 내피 세포 (예, E4ORF1+ 내피 세포)의 비율은 약 2:1 내지 약 1:2이다. 일부 구현예에서, 타겟 세포 : 내피 세포의 비율은 약 10:1, 또는 약 9:1, 또는 약 8:1, 또는 약 7:1, 또는 약 6:1, 또는 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5, 또는 약 1:6, 또는 약 1:7, 또는 약 1:8, 또는 약 1:9, 또는 약 1:10이다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 상기한 내용은 공-배양이 개시되는 시점의 타겟 세포와 내피 세포의 비율이다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 이는 타겟 세포가 하나 이상의 외인성 핵산 분자 또는 기타 분자와 접촉되는 시점의, 타겟 세포와 내피 세포의 비율이다.
일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 10% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 20% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 30% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 40% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 50% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 60% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 65% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 70% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 75% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 80% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 85% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 90% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 약 95% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다.
일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 우수한 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 10% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 20% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 30% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 40% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 50% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 60% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 70% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 80% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 90% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 100% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 150% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 200% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 250% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 약 300% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다.
일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 예를 들어, 내피 세포와 공-배양된 타겟 세포 및 내피 세포와 공-배양하지 않는 타겟 세포에 공급되는 외인성 핵산 분자의 양이 동일 (또는 거의 동일)하거나, 및/또는 타겟 세포를 형질감염 또는 형질도입하기 위해 이용가능한 외인성 핵산 분자의 양이 공-배양하는 내피 세포의 존재로 인해 감소되는 이유로, 심지어 형질감염 또는 형질도입 효율의 감소가 예상되는 조건에서도, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비슷한 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다.
일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 예를 들어, 내피 세포와 공-배양된 타겟 세포 및 내피 세포와 공-배양되지 않은 타겟 세포에 공급되는 외인성 핵산 분자의 양이 동일 (또는 거의 동일)하거나, 및/또는 타겟 세포를 형질감염 또는 형질도입하기 위해 이용가능한 외인성 핵산 분자의 양이 공-배양하는 내피 세포의 존재로 인해 현저하게 감소되는 이유로, 심지어 형질감염 또는 형질도입 효율의 대폭 저하가 예상되는 조건에서도, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 겨우 약 10%, 또는 약 20%, 또는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50% 정도만 감소된, 비슷한 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다.
일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과 보다 우수한 성공적으로 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포의 수율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 10% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 20% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 30% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 40% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 50% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 60% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 70% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 80% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 90% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 100% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 150% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 200% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 250% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 300% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 400% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 500% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 600% 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 방법은, 내피 세포와 공-배양하지 않을 경우에 수득되는 결과와 비교해, 약 600% 보다 높은 타겟 세포 형질도입 또는 형질감염 효율을 달성한다.
일부 구현예에서, 이러한 유전자 전달 방법의 공-배양 단계는 대기 산소 조건 (atmospheric oxygen condition) 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자 전달 방법의 공-배양 단계는 정상 산소 조건 (normoxic condition) 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자 전달 방법의 공-배양 단계는 저산소 조건 (hypoxic condition) 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자 전달 방법의 공-배양 단계는 고도 저산소 조건 (severely hypoxic condition) 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자 전달 방법의 공-배양 단계는 산소 18% 내지 0.1% 범위의 산소 농도에서 수행된다.
본 발명의 개선된 유전자 전달 방법은, 예를 들어 타겟 세포의 게놈내 특정 부위에 "유전자-교정된" 핵산 서열을 전달하기 위해 부위-특이적인 뉴클레아제를 사용하여, 타겟 유전자의 "유전자 편집"을 수행하는데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 전술한 방법은 또한 타겟 세포를 서열-특이적인 뉴클레아제와 같은 하나 이상의 외인성 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 뉴클레아제로는, 비-배타적으로, 메가뉴클레아제 (meganucleases), 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 작동자-기반의 뉴클레아제 (transcription activator-like effector-based nuclease, TALEN) 및 CRISPR-Cas 시스템 뉴클레아제 등이 있다.
본 발명의 유전자 전달 방법은, 임의의 원하는 타겟 세포 타입에 외인성 핵산을 전달하거나 및/또는 유전자 변형시키기 위해, 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 타겟 세포는, 비-배타적인 예로, 림프구, T 세포, B 세포, NK 세포, 골수 세포, 내분비 세포, 간엽 세포 또는 표피 세포와 같이, 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 타겟 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포이며, 비-배타적인 예로, 만능성 줄기 세포 - 예, 배아 줄기 세포 (ES 세포) 또는 유도된 만능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 조직- 또는 장기-제한된 줄기 또는 전구 세포, 즉 특정 세포 계통 또는 조직 계통으로 운명이 결정된 줄기 세포 또는 전구 세포이다. 예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 타겟 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC) 또는 조혈 줄기 또는 전구 세포 (HSPC)이다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, HSC 또는 HSPC CD34-양성 (CD34+)이다. 일부 구현예에서, HSC 또는 HSPC는 골수, 말초혈, 제대혈, 양수 또는 그외 줄기 세포 소스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 임의의 적합한 타입의 내피 세포가 전술한 및 본원의 도처에 기술된 유전자 전달 방법에 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 내피 세포 및 타겟 세포는 동일 조직 또는 장기로부터 유래된다. 전형적으로, 내피 세포는 일차 혈관 내피 세포 (primary vascular endothelial cell)와 같은 혈관 내피 세포, 예를 들어 조혈 장기 시스템의 일부인 제정맥 내피 세포 또는 UVEC 세포이다. 바람직하게는, 내피 세포는 인간 제정맥 내피 세포 또는 "HUVEC"와 같은 인간 내피 세포이다. 바람직하게는, 타겟 세포는 조혈 줄기 및/또는 전구 세포이다.
타겟 세포를 유전자 편집에 유용한 하나 이상의 외인성 핵산 분자 또는 기타 분자와 접촉시키는 단계는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 이용해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이 단계는 형질감염에 의해, 예를 들어 리포좀-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, DEAE 덱스트란-매개 형질감염, 전기천공, 칼슘 포스페이트 침강 (precipitation), 미세주입법 또는 미세입자 충격 (micro-particle bombardment)을 이용해 수행된다. 다른 구현예들에서, 이 단계는 바이러스를 이용한 형질도입에 의해, 예를 들어, 렌티바이러스-매개 형질도입, 아데노바이러스-매개 형질도입, 레트로바이러스-매개 형질도입, 아데노-부속 바이러스-매개 형질도입 또는 헤르페스바이러스-매개 형질도입을 이용해 수행된다.
전술한 방법을 이용해 타겟 세포에 전달되는 핵산 분자는 바람직한 임의의 핵산 분자일 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 치료학적으로 유용한 단백질 또는 마커 단백질 또는 임의의 그외 바람직한 단백질을 코딩할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 마찬가지로, 전달되는 핵산 분자는 단백질을 코딩하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 타겟 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 "유전자-교정된" 단편과 같이, 예를 들어 타겟 세포에서 유전자 결함을 교정하는데 사용하기 위한, 단백질의 단편을 코딩할 수 있다. 일부 이러한 방법에서, 유전자-교정된 서열을 사용해, 예를 들어, 비-배타적인 보다 바람직한 예로 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN 및/또는 CRISPR-Cas를 비롯하여, 하나 이상의 유전자-편집/유전자-교정 기법을 이용해 타겟 세포의 게놈내 돌연변이 서열을 치환할 수 있다.
본원의 전술한, 그리고 도처에 기술된 다양한 방법들은 "유전자 변형된 타겟 세포"를 구축한다. 이러한 유전자 변형된 타겟 세포가 바람직하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 변형된 타겟 세포는 인간 또는 인간을 제외한 개체 등의 이를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 개체는 타겟 세포에 대한 질환 또는 장애, 예를 들어 유전 질환 또는 장애 및/또는 타겟 세포 집단의 결함을 발생시키는 질환 또는 장애를 가질 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 유전자 변형된 타겟 세포는 HSC 또는 HSPC이며, 조혈계 세포에서 발병하는 질환 또는 장애를 가진 개체에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 개체는 골수파괴 처치 (myeloablative treatment)에 의해 유발된 조혈 결함을 가질 수 있다. 다른 구현예들에서, 이러한 개체는 혈액병, 감염성 면역결핍, T 세포에 대한 감염성 질환, 유전성 면역결핍 (genetic immunodeficiency), 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency), 적혈구에 대한 유전 질환 및/또는 빈혈, 예를 들어 겸상 세포 빈혈, 판코니 빈혈 또는 지중해 빈혈 (thalassemia)을 가질 수 있다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, 타겟 세포는 개체에 동종이계일 수 있다. 다른 구현예에서, 타겟 세포는 개체의 자가 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 본원의 방법을 이용해 제조된 유전자 변형된 타겟 세포 및/또는 이러한 유전자 변형된 타겟 세포를 포함하는 조성물, 예를 들어 치료학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 이러한 구현예들과 그외 구현예들은 본원의 다른 부분들에서 추가로 설명된다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 본원에 기술된 다양한 구현예들에 대한 일부 변형 및 조합들은 본 발명의 범위에 포함된다.
도 1A-B. 형질도입 공정 개시 전 E4ORF1+ 인간 제정맥 내피 세포 (UVEC 세포) 상에서 CD34+ 세포의 증식은 전체 조혈 세포 및 CD34+ 세포의 증가된 배수 증식을 달성한다. 도 1A - 8일 후 CD45+ (전체) 조혈 세포의 배수 증식. 도 1B - 8일 후 CD34+ 조혈 세포의 배수 증식 ("사전-형질도입" 샘플 - 백색 막대. "동시-형질도입" 샘플 - 회색 막대. "증식 후-형질도입" 샘플 - 검정색 막대). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 2A-B. 형질도입 공정 개시 전 E4ORF1+ UVEC 세포 상에서 CD34+ 세포의 증식은 세포 집단의 형질도입 효율을 증가시킨다. 도 2A - 8일 후 적색 형광 단백질 (RFP)-표지 세포의 % (백색 막대 - 전체 세포 집단에 대한 %; 검정색 막대 - CD34+ 세포 집단에 대한 %). 도 2B - 8일 후 전체 CD34+ 세포 및 전체 RFP+/CD34+ 세포. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 3A-B. E4ORF1+ UVEC 세포 상에서의 CD34+ 세포 증식은 사이토카인 농도 증가에 따라 개선된다. 도 3A - 7일 후 CD45+ (전체) 조혈 세포의 배수 증식. 도 3B - 7일 후 CD34+ 조혈 세포의 배수 증식 ("동시-형질도입" 샘플 - 백색 막대. "분리-형질도입" 샘플 - 검정색 막대). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 4A-B. 형질도입 효율은 형질도입이 E4ORF1+ UVEC 공-배양과 조합하여 이루어질 때 CD34+ 세포에서 증가한다. 도 4A - 7일 후 % BFP-표지된 세포 - 전체 세포 집단. 도 4B - 7일 후 % BFP-표지된 세포 - CD34+/CD45+ 세포 집단 ("동시-형질도입" 샘플 - 백색 막대. "분리-형질도입" 샘플 - 검정색 막대). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 5. E4ORF1+ UVEC 세포와의 공-배양 및 CD34+ 세포의 형질도입을 조합한 경우, 사이토카인의 농도를 증가시키면 형질전환 효율 증가 및 형질도입된 CD34+ 세포 집단의 전체 세포 수율 증가가 달성된다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 6. 전체 조혈 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포와 전기천공을 이용할 때 증가한다. 이동성 말초혈 (mPB)로부터 단리된 CD34+ 세포 500,000개를 형질감염시켰다. 형질감염은 전기천공을 통해 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 플라스미드를 전달하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 함량을 측정하고, 헤모사이토미터 카운트와 조합하여 여기에 나타낸 수율을 구하였다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 7A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 전기천공 및 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용하는 경우에 증가된다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 500,000개를 형질감염시켰다. 형질감염은 전기천공을 통해 GFP-발현하는 플라스미드를 전달하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 조혈 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 HSPC 카운트를 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질감염된 세포임을 의미한다. 유세포 측정을 통한 정량화 및 헤모사이토미터를 이용한 세포 수 측정 후, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 7A에 도시한 막대 그래프에 나타내고 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다), 성공적으로 형질감염된 CD45+ CD34+ HSPC 수율은 도 7B에 도시한 막대 그래프에 나타낸다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 8A-D. 전기천공 공정 중에 HSPC를 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양하는 경우, 콜로니 형성 단위 (CFU)가 증가한다. 실시예에 기술한 바와 같이, 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석을 위해, 전체 세포 1000개 (HSPC 단독 또는 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양한 HSPC)를 6웰 디쉬의 웰 2개에 2주간 메틸셀룰로스 중의 각 조건에서 접종하였다. Stem Vision 장치를 사용해, 접종한 세포 1000개 당 콜로니 수를 정량 및 식별하였다. 도 8A는 모든 타입의 콜로니 정량 결과를 나타낸 막대 그래프이다 (축은 콜로니의 총 수이다). 도 8B는 모세포 형성 단위 (Blast Forming Unit)-적혈구 콜로니 (BFU-E)를 도시한 막대 그래프이다 (축은 BFU-E 콜로니 개수이다). 도 8C는 콜로니 형성 단위-과립구 대식세포 (CFU-GM)의 정량 결과를 도시한 막대 그래프이다 (축은 CFU-GM 콜로니 개수이다). 도 8D는 콜로니 형성 단위-과립구 적혈구 대식세포 거핵세포 (CFU-GEMM) 정량 결과를 나타낸 막대 그래프이다 (축은 CFU-GEMM 콜로니 개수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 9. 전기천공 중에 HSPC를 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양할 경우 콜로니 형성 단위 (CFU)가 증가한다. 실시예에 기술한 바와 같이, 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석을 위해, 전체 세포 1000개 (HSPC 단독 또는 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양한 HSPC)를 6웰 디쉬의 웰 2개에 2주간 메틸셀룰로스 중의 각 조건에서 접종하였다. Stem Vision 장치를 사용해, 접종한 세포 1000개 당 콜로니 수를 정량 및 식별하였다. 콜로니 형성 단위-과립구 적혈구 대식세포 거핵세포 (CFU-GEMM)의 비율을 정량하기 위해, 콜로니가 형성되지 않은, E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하는 경우에 대해서 표준화하였다. 막대 그래프는 전체 증식된 생성물에서 CFU-GEMM의 빈도를 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 10. 전체 조혈 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 양을 측정하고, 헤모사이토미터 카운트와 조합하여 막대 그래프에 나타낸 수율을 구하였다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 11A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입 동안에 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 형광 항체를 사용해 조혈 줄기 및 전구 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하고, 배양물의 HSPC 함량을 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 의미한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운터로 정량한 후, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 11A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 CD45+ CD34+ HSPC의 수율은 도 11B의 막대 그래프에 표시한다. 축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 12A-B. 전체 CD45+ CD34+ CD38- CD45RA- CD49f+ 줄기 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 형광 항체를 사용해 조혈 줄기 세포 상의 CD38, CD45RA, CD49f, CD34 및 CD45를 동정하고, 배양물의 줄기 세포 함량을 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 의미한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운터로 정량한 후, 전체 줄기 세포의 수율을 도 12A의 막대 그래프 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다)에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 줄기 세포의 수율은 도 12B의 막대 그래프 (축은 세포 수이다)에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 13. 전체 조혈 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입으로 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 함량을 확인하고, 헤모사이토미터 카운트와 합하여 막대 그래프 (축은 백만개 단위의 세포 수이다)로 나타낸 세포 수율을 구한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 14A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입으로 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포 수를 정량하였다. 조혈 줄기 및 전구 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 HSPC 함량을 확인하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 표시한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운트를 이용한 정량화를 실시하여, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 14A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 CD45+ CD34+ HSPC의 수율은 도 14B의 막대 그래프에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 15A-B. 전체 CD45+ CD34+ CD38- CD45RA- CD49f+ 줄기 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입은 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L)에 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포 수를 정량하였다. 조혈 줄기 세포 상의 CD38, CD45RA, CD49f, CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 줄기 세포의 양을 확인하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 표시한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운트를 이용한 정량화를 실시하여, 전체 줄기 세포 수율을 도 15A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 줄기 세포의 수율은 도 15B의 막대 그래프 (축은 세포의 수이다)에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 2A-B. 형질도입 공정 개시 전 E4ORF1+ UVEC 세포 상에서 CD34+ 세포의 증식은 세포 집단의 형질도입 효율을 증가시킨다. 도 2A - 8일 후 적색 형광 단백질 (RFP)-표지 세포의 % (백색 막대 - 전체 세포 집단에 대한 %; 검정색 막대 - CD34+ 세포 집단에 대한 %). 도 2B - 8일 후 전체 CD34+ 세포 및 전체 RFP+/CD34+ 세포. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 3A-B. E4ORF1+ UVEC 세포 상에서의 CD34+ 세포 증식은 사이토카인 농도 증가에 따라 개선된다. 도 3A - 7일 후 CD45+ (전체) 조혈 세포의 배수 증식. 도 3B - 7일 후 CD34+ 조혈 세포의 배수 증식 ("동시-형질도입" 샘플 - 백색 막대. "분리-형질도입" 샘플 - 검정색 막대). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 4A-B. 형질도입 효율은 형질도입이 E4ORF1+ UVEC 공-배양과 조합하여 이루어질 때 CD34+ 세포에서 증가한다. 도 4A - 7일 후 % BFP-표지된 세포 - 전체 세포 집단. 도 4B - 7일 후 % BFP-표지된 세포 - CD34+/CD45+ 세포 집단 ("동시-형질도입" 샘플 - 백색 막대. "분리-형질도입" 샘플 - 검정색 막대). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 5. E4ORF1+ UVEC 세포와의 공-배양 및 CD34+ 세포의 형질도입을 조합한 경우, 사이토카인의 농도를 증가시키면 형질전환 효율 증가 및 형질도입된 CD34+ 세포 집단의 전체 세포 수율 증가가 달성된다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 6. 전체 조혈 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포와 전기천공을 이용할 때 증가한다. 이동성 말초혈 (mPB)로부터 단리된 CD34+ 세포 500,000개를 형질감염시켰다. 형질감염은 전기천공을 통해 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 플라스미드를 전달하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 함량을 측정하고, 헤모사이토미터 카운트와 조합하여 여기에 나타낸 수율을 구하였다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 7A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 전기천공 및 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용하는 경우에 증가된다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 500,000개를 형질감염시켰다. 형질감염은 전기천공을 통해 GFP-발현하는 플라스미드를 전달하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 조혈 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 HSPC 카운트를 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질감염된 세포임을 의미한다. 유세포 측정을 통한 정량화 및 헤모사이토미터를 이용한 세포 수 측정 후, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 7A에 도시한 막대 그래프에 나타내고 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다), 성공적으로 형질감염된 CD45+ CD34+ HSPC 수율은 도 7B에 도시한 막대 그래프에 나타낸다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 8A-D. 전기천공 공정 중에 HSPC를 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양하는 경우, 콜로니 형성 단위 (CFU)가 증가한다. 실시예에 기술한 바와 같이, 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석을 위해, 전체 세포 1000개 (HSPC 단독 또는 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양한 HSPC)를 6웰 디쉬의 웰 2개에 2주간 메틸셀룰로스 중의 각 조건에서 접종하였다. Stem Vision 장치를 사용해, 접종한 세포 1000개 당 콜로니 수를 정량 및 식별하였다. 도 8A는 모든 타입의 콜로니 정량 결과를 나타낸 막대 그래프이다 (축은 콜로니의 총 수이다). 도 8B는 모세포 형성 단위 (Blast Forming Unit)-적혈구 콜로니 (BFU-E)를 도시한 막대 그래프이다 (축은 BFU-E 콜로니 개수이다). 도 8C는 콜로니 형성 단위-과립구 대식세포 (CFU-GM)의 정량 결과를 도시한 막대 그래프이다 (축은 CFU-GM 콜로니 개수이다). 도 8D는 콜로니 형성 단위-과립구 적혈구 대식세포 거핵세포 (CFU-GEMM) 정량 결과를 나타낸 막대 그래프이다 (축은 CFU-GEMM 콜로니 개수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 9. 전기천공 중에 HSPC를 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양할 경우 콜로니 형성 단위 (CFU)가 증가한다. 실시예에 기술한 바와 같이, 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질감염 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석을 위해, 전체 세포 1000개 (HSPC 단독 또는 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양한 HSPC)를 6웰 디쉬의 웰 2개에 2주간 메틸셀룰로스 중의 각 조건에서 접종하였다. Stem Vision 장치를 사용해, 접종한 세포 1000개 당 콜로니 수를 정량 및 식별하였다. 콜로니 형성 단위-과립구 적혈구 대식세포 거핵세포 (CFU-GEMM)의 비율을 정량하기 위해, 콜로니가 형성되지 않은, E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하는 경우에 대해서 표준화하였다. 막대 그래프는 전체 증식된 생성물에서 CFU-GEMM의 빈도를 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 10. 전체 조혈 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 양을 측정하고, 헤모사이토미터 카운트와 조합하여 막대 그래프에 나타낸 수율을 구하였다 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다). 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 11A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입 동안에 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 형광 항체를 사용해 조혈 줄기 및 전구 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하고, 배양물의 HSPC 함량을 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 의미한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운터로 정량한 후, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 11A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 CD45+ CD34+ HSPC의 수율은 도 11B의 막대 그래프에 표시한다. 축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 12A-B. 전체 CD45+ CD34+ CD38- CD45RA- CD49f+ 줄기 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 450,000개를, 감염 다중도 (MOI) 25로 형질도입하였다. 형질도입으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포의 수를 정량하였다. 형광 항체를 사용해 조혈 줄기 세포 상의 CD38, CD45RA, CD49f, CD34 및 CD45를 동정하고, 배양물의 줄기 세포 함량을 측정하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 의미한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운터로 정량한 후, 전체 줄기 세포의 수율을 도 12A의 막대 그래프 (축은 백만개 단위로 나타낸 세포 수이다)에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 줄기 세포의 수율은 도 12B의 막대 그래프 (축은 세포 수이다)에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 13. 전체 조혈 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입으로 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 조혈 세포 상의 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 조혈계 세포의 함량을 확인하고, 헤모사이토미터 카운트와 합하여 막대 그래프 (축은 백만개 단위의 세포 수이다)로 나타낸 세포 수율을 구한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 14A-B. 전체 CD45+ CD34+ HSPC 세포 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입으로 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L) 단독 (C/C/C로 표시됨)에 노출시키거나, 또는 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인을 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포 수를 정량하였다. 조혈 줄기 및 전구 세포 상의 CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 HSPC 함량을 확인하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 표시한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운트를 이용한 정량화를 실시하여, 전체 CD45+ CD34+ HSPC 수율을 도 14A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 CD45+ CD34+ HSPC의 수율은 도 14B의 막대 그래프에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
도 15A-B. 전체 CD45+ CD34+ CD38- CD45RA- CD49f+ 줄기 세포의 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포를 이용한 렌티바이러스 형질도입시 증가한다. 이동성 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포 300,000개를, 감염 다중도 (MOI) 50으로 형질도입하였다. 형질도입은 GFP-발현하는 전이유전자를 전달하였다. 자극, 형질도입 및 회복/증식 단계 동안에, CD34+ 세포를 자극 및 형질도입 단계 동안에 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L)에 노출시킨 후 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회수하거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포가 존재하였다 (E/E/E). 유세포 측정으로 세포 수를 정량하였다. 조혈 줄기 세포 상의 CD38, CD45RA, CD49f, CD34 및 CD45를 동정하기 위한 형광 항체를 사용해 배양물의 줄기 세포의 양을 확인하였다. GFP 발현은 성공적으로 형질도입된 세포를 표시한다. 유세포 측정 및 헤모사이토미터 카운트를 이용한 정량화를 실시하여, 전체 줄기 세포 수율을 도 15A의 막대 그래프에 표시하고, 성공적으로 형질도입된 줄기 세포의 수율은 도 15B의 막대 그래프 (축은 세포의 수이다)에 표시한다. 여기에 명시되지 않은 조건들은 모두 실시예에서 언급된다.
본원의 "발명의 내용", "도면", "도면의 간단한 설명", "실시예" 및 "청구항" 부분들은 본 발명의 주요 구현예들 중 일부를 기술한다. "발명에 대한 구체적인 내용" 부분에서는 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 구체적인 설명을 제시하며, 본원의 다른 모든 부분들과 연계하여 읽히도록 의도된다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 본원 전체에 기술된 여러가지 구현예들은 다양한 여러 방식으로 조합될 수 있으며, 그렇게 의도된다. 본원에 기술된 구체적인 구현예들에 대한 이러한 조합은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
몇몇 정의들이 하기에 제공된다. 그외 용어들도 본원의 도처에서 정의되며, 그 용어가 사용된 문맥에서 명확한 의미를 가지거나, 또는 당해 기술 분야에서의 그 용어에 대한 통상적인 의미로 사용된다.
본원에서, "약" 및 "대략"이라는 용어들은 수치 값에 대해 사용되는 경우 언급된 값에서 ± 20%를 의미한다.
본원에서, 용어 "배양"은 다양한 유형의 배지 상에서 또는 배지 내에서의 세포 증식을 의미한다. "공-배양"은 다양한 유형의 배지 상에서 또는 배지 내에서 2종 이상의 구분되는 타입의 세포들을 증식시키는 것을 의미하며, 예를 들어, 일부 구현예에서, E4ORF1+ EC와 조혈 줄기 또는 전구 세포 (HSPC)를 공-배양할 수 있다.
용어 "조작된"은, 본원에서 세포와 관련하여 사용되는 경우, 사람에 의해 조작되어 언급된 표현형 (예, E4ORF1+)을 가지거나 또는 언급된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 지칭한다. 용어 "조작된 세포"는 천연적으로 생기는 세포를 포함하는 것을 의도하진 않지만, 대신, 예를 들어, 발현하지 않는 폴리펩타이드를 발현하게 되거나, 또는 비-조작된 내피 세포에서 관찰되는 수준 보다 실질적으로 높은 수준으로 폴리펩타이드를 발현하게 되도록, 예를 들어, 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 인공적으로 변이된 (예, 유전자 변형에 의해) 세포를 포괄하는 것으로 의도된다.
세포 또는 세포 배양물과 관련하여, 본원에서 용어 "증식 (expansion)" 또는 증식하는 (expanding)"은 세포의 초기 집단으로부터 특정 세포 타입 (예, "타겟 세포", 예를 들어 HSPC)의 세포의 수적 증가를 의미한다. 증식에 사용되는 초기 세포는 증식의 결과로서 수득되는 세포와 동일하여야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 증식된 세포는 세포의 초기 집단의 생장 및 분화에 의해 생성될 수 있다.
"유전자 변형" 또는 "유전자-변형된"은 세포의 정상적인 뉴클레오티드 서열의 또는 이에 대한 임의의 부가, 결손 또는 파괴를 의미하며, 비-배타적인 예로 "유전자 편집"을 포함한다. 유전자 변형은 전형적으로 "유전자 전달 방법"을 이용하여 수행된다.
"유전자 전달"은 임의의 외인성 핵산 분자를 세포에 전달하는 것을 의미한다. 본 발명에 포함되는 유전자 전달 방법으로는 "형질도입" 방법 (즉, 바이러스-매개 핵산의 타겟 세포로의 전달) 및 "형질감염" 방법 (즉, 타겟 세포로의 핵산의 비-바이러스 매개 전달) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 B 세포, T 세포, NK 세포, 림프성 수지상 세포, 골수성 수지상 세포, 과립구, 대식세포, 거핵세포 및 적혈구 세포 등의, 조혈계의 모든 세포 타입들로 궁극적으로 분화할 수 있는 클론형성능 (clonogenic)을 가진 자가-재생성 만능 세포를 지칭한다. 조혈계의 다른 세포와 같이, HSC는 전형적으로 특징적인 세포 마커 세트의 존재에 의해 정의된다.
본원에서, "조혈 줄기 또는 전구 세포" 또는 "HSPC"는 전술한 HSC 뿐만 아니라 궁극적으로 조혈계의 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 다능성의 비-자가-재생성 전구 세포, 및 조혈계의 특정 세포 타입으로 분화할 수 있는 올리고포텐트 (oligopotent) 및 단분화성 (unipotent) 전구 세포를 망라한다. HSPC는 본원의 도처에 정의된 CMP, MP, MEP 및 GMP를 포함한다.
본원에서 용어 "단리된"은 천연 또는 합성에 의해 제조되었든 간에 천연적으로 생성된 상태에서 조합된 하나 이상의 다른 산물 또는 조성물로부터 분리된, 산물 (예, 세포) 또는 조성물을 지칭한다.
본원에서, 용어 "재조합"은 분자 생물학 및 유전자 조작 (예, 분자 클로닝) 방법을 이용해 인간 (장치 사용 포함)에 의해 제조되며; 천연적으로 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 지칭한다. 즉, 재조합 핵산 분자는 자연에, 예를 들어, 유기체의 게놈에 존재하는 핵산 분자와 구분하기 위한 것이다. 상보적인 DNA 또는 대응되는 게놈 DNA 서열에서 발견되는 임의의 개지된 인트론 서열이 없는 mRNA 서열의 "cDNA" 카피를 포함하는 핵산 분자는, 따라서 재조합 핵산 분자로 간주될 것이다. 예를 들어, 재조합 E4ORF1 핵산 분자는 천연 아데노바이러스 게놈에서 본래 코딩 서열과 조합되지 않은 프로모터 및/또는 다른 유전자 요소와 작동가능하게 연결된 E4ORF1 코딩 서열을 포함할 수 있다.
"자가-재생"은 세포가 분열하여 부모 세포와 동일한 특징을 가진 하나 이상의 딸 세포를 만들 수 있는 능력 (예, 자가-재생)을 지칭한다. 2번째 딸 세포는 특정 분화 경로로 이행될 수 있으며, 예를 들어, 자가-재생성 조혈 줄기 세포는 분열하여, 골수성 또는 림프성 경로로의 운명이 결정된 하나의 딸 줄기 세포와 또 다른 딸 세포를 형성한다. 운명 결정된 전구 세포는 전형적으로 자가-재생력을 상실하며, 세포 분열시 보다 분화된 (즉, 제한된) 표현형을 나타내는 딸 세포 2개를 만든다.
용어 "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 언급된 경우를 제외하고는 인간 등의 포유류 및 인간을 제외한 영장류 뿐만 아니라 토끼, 랫, 마우스, 염소, 돼지 및 기타 포유류 종들을 지칭한다.
본원에서, 세포 집단에 대한 "실질적으로 순수한"이라는 표현은, (예, 하나 이상의 특정 세포 마커, 형태적 특징 또는 기능적 특징의 발현에 의해 결정되는 바와 같이) 특정 타입의 세포들로 된 집단을 지칭하거나, 또는 2종 이상의 서로 다른 세포 타입들이 함께 사용되는 구현예일 경우에는, 전체 세포 집단을 구성하는 세포들 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75-80%, 더 바람직하게는 적어도 약 85-90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 특정 타입 (복수)인 집단을 지칭한다. 즉, "실질적으로 순수한 세포 집단"은 특정 타입 또는 타입들이 아닌 세포를 약 50% 미만, 바람직하게는 약 20-25% 미만, 더 바람직하게는 약 10-15% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만으로 포함하는 세포 집단을 지칭한다.
본원에 기술된 본 발명의 구현예들 중 일부는 내피 세포, 예를 들어, 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 내비 세포 - 즉 E4ORF1+ 내피 세포 (E4ORF1+ EC)를 수반한다. 이러한 세포는 E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. E4ORF1 폴리펩타이드 및/또는 E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자는, 당해 기술 분야에 공지되거나 또는 본원에 명시된 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있거나, 또는 상기한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편인 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며 - 단 이러한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 (비-배타적으로, 배양시 내피 세포의 유지 증식을 유지시키는 능력 및/또는 배양시 다른 타겟 세포 타입 (예, HSPC)의 증식을 유지시키는 능력, 및/또는 다른 타겟 세포 타입 (예, HSPC)으로의 유전자 전달 효율을 개선시키는 능력을 포함하여) 본원에 기술된 기능적 특성들 중 하나를 가진 폴리펩타이드를 가지거나 또는 이를 코딩한다.
아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 수반하는 이러한 구현예에서, 사용되는 폴리펩타이드 서열은, 인간 아데노바이러스 2형, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 34, 35, 46, 50, 또는 52와 같이, 임의의 적합한 아데노바이러스 타입 또는 균주로부터 유래될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 사용되는 폴리펩타이드 서열은 인간 아데노바이러스 타입 5로부터 유래된다. 이러한 아데노바이러스 폴리펩타이드의 아미노산 서열과, 상기한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 유전자은행 데이타베이스와 같이 잘 알려진 공개적으로 이용가능한 데이타베이스에서 입수가능하다. 예를 들어, 적절한 서열로는 하기를 포함한다: 인간 아데노바이러스 9 (유전자은행 등재 번호 CAI05991), 인간 아데노바이러스 7 (유전자은행 등재 번호 AAR89977), 인간 아데노바이러스 46 (유전자은행 등재 번호 AAX70946), 인간 아데노바이러스 52 (유전자은행 등재 번호 ABK35065), 인간 아데노바이러스 34 (유전자은행 등재 번호 AAW33508), 인간 아데노바이러스 14 (유전자은행 등재 번호 AAW33146), 인간 아데노바이러스 50 (유전자은행 등재 번호 AAW33554), 인간 아데노바이러스 2 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000196), 인간 아데노바이러스 12 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000141), 인간 아데노바이러스 35 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000607), 인간 아데노바이러스 7 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000570), 인간 아데노바이러스 1 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000533), 인간 아데노바이러스 11 (유전자은행 등재 번호 AP.sub.--000474), 인간 아데노바이러스 3 (유전자은행 등재 번호 ABB 17792), 및 인간 아데노바이러스 타입 5 (유전자은해 등재 번호 D12587).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 내피 세포는, 아데노바이러스 E4 영역의 다른 서열이 없는, E4ORF1 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하며 - 예를 들어, 특정 구현예에서, 내피 세포는 E4ORF1 서열을 포함하지만 전체 E4 영역 또는 전체 E4 영역 유래의 다른 ORP - 예를 들어 E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4 및/또는 E4ORF5를 포함하지 않는다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 기술된 내피 세포는, E4ORF1 서열을, E4 영역으로부터 유래되는 하나 이상의 다른 핵산 또는 아미노산 서열, 예를 들어 E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4, E4ORF5 또는 E4ORF6 서열, 또는 이의 변이체, 돌연변이 또는 단편과 함께 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자에 대해 본원에 기술된 모든 구현예들에서, 일부 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자는, 당해 기술 분야 (예, 유전자은행 데이타베이스와 같이 공개된 서열 데이타베이스)에 공지되거나 또는 본원에 구체적으로 언급된 것과 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 분자는, 상기한 서열의 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편, 예를 들어 상기한 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 가진 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편인, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 공지된 서열과 약 85%의 서열 동일성을 가지거나, 또는 공지된 서열과 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 구현예에서, 공지된 뉴클레오티드 서열과 비교해, 뉴클레오티드 약 50개, 또는 뉴클레오티드 약 45개, 또는 뉴클레오티드 약 40개, 또는 뉴클레오티드 약 35개, 또는 뉴클레오티드 약 30개, 또는 뉴클레오티드 약 28개, 또는 뉴클레오티드 약 26개, 또는 뉴클레오티드 약 24개, 또는 뉴클레오티드 약 22개, 또는 뉴클레오티드 약 20개, 또는 뉴클레오티드 약 18개, 또는 뉴클레오티드 약 16개, 또는 뉴클레오티드 약 14개, 또는 뉴클레오티드 약 12개, 또는 뉴클레오티드 약 10개, 또는 뉴클레오티드 약 9개, 또는 뉴클레오티드 약 8개, 또는 뉴클레오티드 약 7개, 또는 뉴클레오티드 약 6개, 또는 뉴클레오티드 약 5개, 또는 뉴클레오티드 약 4개, 또는 뉴클레오티드 약 3개, 또는 뉴클레오티드 약 2개, 또는 뉴클레오티드 약 1개 길이 차이가 존재하는, 공지된 뉴클레오티드 서열에 대한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편이 사용된다. 일부 구현예에서, 공지된 아미노산 서열과 비교해, 아미노산 약 50개, 또는 아미노산 약 45개, 또는 아미노산 약 40개, 또는 아미노산 약 35개, 또는 아미노산 약 30개, 또는 아미노산 약 28개, 또는 아미노산 약 26개, 또는 아미노산 약 24개, 또는 아미노산 약 22개, 또는 아미노산 약 20개, 또는 아미노산 약 18개, 또는 아미노산 약 16개, 또는 아미노산 약 14개, 또는 아미노산 약 12개, 또는 아미노산 약 10개, 또는 아미노산 약 9개, 또는 아미노산 약 8개, 또는 아미노산 약 7개, 또는 아미노산 약 6개, 또는 아미노산 약 5개, 또는 아미노산 약 4개, 또는 아미노산 약 3개, 또는 아미노산 약 2개, 또는 아미노산 약 1개 길이 차이가 존재하는, 공지된 뉴클레오티드 서열에 대한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편이 사용된다.
본원에 기술된 핵산 분자는, 원하는 용도에 따라, 다양한 다른 핵산 서열, 유전자 또는 코딩 영역, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 리포터 유전자 또는 발현 테그 (예, GFP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열), 상동적인 재조합에 이용가능한 서열 또는 바람직할 수 있는 임의의 기타 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 포함하는, 구조체에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 폴리펩타이드는 단독으로 또는 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 발현을 허용하기 위한 하나 이상의 프로모터의 통제 하에 있을 수 있다. 원하는 세포 타입에서 핵산 서열의 발현을 구동시킬 수 있는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 예로는 CMV, SV40, RSV, HIV-Ltr 및 MML 프로모터 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 프로모터는 아데노바이러스 게놈 유래 프로모터 또는 이의 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 서열은 유도성 프로모터의 통제 하에 배치되어, 핵산 서열의 발현을 필요에 따라 구동하거나 (turn on) 또는 중단 (turn off)시킬 수 있다. 임의의 적절한 유도성 발현 시스템, 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 발현 시스템 또는 호르몬 유도성 발현 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열은 이것이 필요한 동안 발현시킨 다음, 원하는 성과가 달성되었을 때, 발현을 중단시킬 수 있다. 발현을 구동시키거나 또는 중단시키는 능력은 특히 생체내 이용에 - 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 이용해 제조된 유전자 변형된 타겟 세포의 생체내 이용에 유용할 수 있다.
본원에 기술된 핵산 서열은 자연적으로 생성된 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산 분자는, 세포내에서 안정적이며 세포내에서 직접 단백질의 발현/생산을 지시하기 위해 사용될 수 있는, 변형된 합성 RNA와 같은, RNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 DNA를 포함할 수 있다. DNA가 사용되는 구현예에서, DNA 서열은 세포내에서 발현을 허용 (및/또는 촉진, 강화 또는 규제)하기 위해 하나 이상의 적절한 프로모터 및/또는 조절 인자와 작동가능하게 연결될 수 있으며, 하나 이상의 적절한 벡터 또는 구조체에 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 핵산 분자의 취급, 조작 및 발현은 분자 생물학 및 세포 생물학의 통례적인 기법들을 이용해 수행할 수 있다. 이러한 기법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 일 예로 Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), 또는 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열의 취급, 조작 및 발현에 사용하기에 적합한 기법에 대한 지침을 제공하는 임의의 다른 표준 문서에 기술된 교시 내용을 들 수 있다. E4ORF1 서열의 취급 또는 발현에 대한 추가적인 측면들은 미국 특허 제 8,465,732에 기술되어 있으며, 이 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 타겟 세포에 유전자 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 유전자 전달 시스템, 예를 들어 임의의 적절한 형질감염 시스템 또는 임의의 적합한 형질도입 시스템이 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 이용될 수 있는 형질감염 방법으로는 리포좀-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, DEAE 덱스트란-매개 형질감염, 전기천공, 뉴클레오펙션 (nucleofection), 칼슘 포스페이트 침강, 미세주입법 및 미세입자 충격 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 이용될 수 있는 형질도입 방법으로는 렌티바이러스-매개 형질도입, 아데노바이러스-매개 형질도입, 레트로바이러스-매개 형질도입, 아데노-부속 바이러스-매개 형질도입 및 헤르페스바이러스-매개 형질도입 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 타겟 세포는, 타겟 세포 타입에 발생하는 질환 또는 장애에 참여하거나 또는 참여하는 것으로 의심되는 것으로 알려진 유전자의 교정된 버전, 또는 타겟 세포에 제공하거나 또는 타겟 세포를 이용해 투여 또는 전달하는 것이 바람직할 수 있는 치료학적으로 유용한 유전자와 같은 임의의 다른 유전자를 포함하도록, 유전자 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 타겟 세포의 게놈에서 원하는 뉴클레오티드 서열을 삽입, 결손 또는 치환하기 위해 조작된 뉴클레아제를 사용하는 게놈 편집 기법 등과 같은, 유전자 편집 기술의 이행에 이용되거나 또는 유전자 편집 기술과 함께 이용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 뉴클레아제는, 비-상동적인 말단-연결 (non-homologous end-joining) 또는 상동적인 재조합을 이용해 수리되는, 게놈내 부위-특이적인 이중 가닥 절단 (site-specific double-strand break)을 만든다. 현재 게놈 편집 기술에 사용되는 이러한 뉴클레아제에는 주요 타입 4종이 존재한다 - 즉, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자에 기반한 뉴클레아제 또는 "TALEN" 및 CRISPR-Cas 시스템 뉴클레아제 (예, Cas9).
본 발명의 방법은 내피 세포 (EC), 예를 들어 E4ORF1을 발현하도록 조작된 내피 세포 - 즉 E4ORF1+ EC의 사용을 포함한다. 이러한 내피 세포는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 내피 세포 소스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 내피 세포는 혈관 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 일차 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 포유류 세포, 예를 들어, 인간 또는 인간을 제외한 영장류 세포, 또는 토끼, 랫, 마우스, 염소, 돼지 또는 그외 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 일차 인간 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 제정맥 내피 세포 (UVEC), 예를 들어, 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)이다. 사용될 있는 또 다른 적절한 내피 세포는 미국 특허 제 8,465,732에서 E4ORF1-발현에 적합한 것으로 이미 언급된 것을 포함하며, 상기 미국 특허 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 조작된 내피 세포는 다양한 형태로 존재하거나 또는 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 단리된 세포 집단 등의 세포 집단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 시험관내 세포 집단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 실질적으로 순수한 세포 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전체 세포 집단을 구성하는 세포들 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75-80%, 더 바람직하게는 적어도 약 85-90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 본 발명의 조작된 내피 세포일 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 내피 세포는 조작된 세포와 하나 이상의 부가적인 구성 성분을 포함하는 조성물 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 내피 세포의 집단을 생리 식염수, 세포 현탁 매질, 세포 배양 배지 등과 같은 담체 용액과 함께 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 조작된 내피 세포의 집단과 인간 개체와 같은 개체에 투여하기에 적합한 담체 용액을 포함하는, 치료학적 조성물일 수 있다. 그외 치료학적으로 허용가능한 물질이 필요에 따라 포함될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 의도한 용도에 따라 치료학적 조성물에 포함시킬 적절한 물질을 쉽게 선택할 수 있다.
세포의 배양 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 임의의 적절한 세포 배양 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, E4ORF1+ 세포는 다른 내피 세포를 배양하는데 이용가능한 것으로 공지된 방법, 또는 예를 들어, 미국 특허 제 8,465,732에 기술된 바와 같이 E4ORF1-발현성 내피 세포를 배양하는데 이용가능한 것으로 공지된 방법으로 배양할 수 있으며, 상기 미국 특허 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 내피 세포는 혈청의 부재 하에, 또는 외인성 성장인자의 부재 하에, 또는 혈청과 외인성 성장인자의 부재 하에 배양될 수 있다. 본 발명의 조작된 내피 세포는 또한 냉동보존될 수 있다. 세포 배양 및 세포 냉동보존을 위한 다양한 방법들이 Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000) by R. Ian Freshney ("Freshney")에 개시된 방법과 같이 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 공-배양 방법에서 다른 세포 (예, 타겟 세포)의 생존, 증식 및/또는 유전자 변형을 지지하기 위해, 일차 내피 세포, 내피 전구 세포 또는 E4ORF1+ EC 피더 세포의 사용을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, E4ORF1+ EC 집단을 피더 세포로 사용하여, HSPC 및 HSPC 등의 줄기 또는 전구 세포의 배양, 증식 또는 유전자 변형을 뒷받침할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 E4ORF1+ EC 집단 및 타겟 세포의 집단을 공-배양하는 방법을 제공한다. 이러한 공-배양 방법은, E4ORF1+ EC 집단과 타겟 세포 집단을 동일한 배양 용기에서 함께 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예들에 대한 일부 구현예에서, E4ORF1+ EC가 배양 용기의 표면 위에 피더 세포 층을 형성할 수 있으며, 타겟 세포는 이 피더 세포 층 상에 배치될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 타겟 세포를 E4ORF1+ 세포의 배양으로부터 수득한 컨디셔닝화된 배지 (conditioned medium)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 타겟 세포 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 다양한 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는, 비-배타적인 예로, 뉴클레오티드 서열, 벡터, 내피 세포, E4ORF1+ 내피 세포, 대조군 비-조작된 내피 세포, 타겟 세포 (예, HSPC), E4ORF1+ EC 또는 타겟 세포를 유지 또는 증식시키기 위해 사용가능한 배지 또는 조성물, 또는 이들의 임의 조합을 비롯하여, 본원에 언급된 임의의 구성 성분을 포함할 수 있다. 이러한 키트들 모두 선택적으로 사용 설명서, 용기, 배양 용기 등을 포함할 수 있다. 키트에 라벨이 동봉되며, 라벨로는 키트 내용물의 사용 설명 또는 기타 사용 정보를 제공해주는, 전자 또는 컴퓨터 판독가능한 형태 (예, 디스크, 광학 디스크, 메모리 칩 또는 테이프)일 수 있는 임의의 필기 매체 또는 기록 매체 (recorded material)를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 측면들은 후술한 비-제한적인 실시예에서 추가로 설명될 수 있다. 실시예에 기술된 내용 뿐만 아니라 본 발명의 구체적인 구현예들에 대한 전술한 설명들은 예시적이고 설명의 목적으로만 제공된 것임에 유념하여야 한다. 이들 설명은 본 발명을 기술된 정확한 형태로 제한하거나 또는 전용하고자 의도한 것은 아니다. 오히려, 본원에 기술된 구체적인 구현예들에 대해 본원의 교시 내용에 비추어 여러가지 수정 및 변형을 가할 수 있다. 본원에 제시된 구현예들은, 본 발명의 원리 및 이의 실무적 용도를 가장 잘 설명하여, 당업자가 의도한 구체적인 용도에 맞게 본 발명 및 다양한 수정이 적용된 다양한 구현예들을 가장 잘 활용할 수 있도록 하기 위해, 선택하여, 기술되었다.
실시예
아래 실시예에서 수득한 데이타 일부는 도면에 제시된다. 또한, 본 발명의 도면의 간단한 설명에는, 수행된 실험과 수득한 데이타에 대한 추가적인 상세 설명과 더불어, 이들 실시예에 대한 구체적인 정보가 포함되어 있다. 이들 실시예들은 도면의 간단한 설명 및 도면 자체와 함께 읽도록 의도된다.
실시예
1
HSPC의
증식 & 바이러스 형질도입에 대한
E4ORF1
+ 공-배양 효과
CD34+/CD45+ HSPC의 증식 및 형질도입 능력에 대한 E4ORF1+ 내피 세포의 효과를 분석하기 위한 실험을 수행하였다. CD34+ 세포 (Lonza)에 적색 형광 단백질 (RFP)을 형질도입하고, 다음과 같은 3가지 프로토콜에 따라 6웰 플레이트에서 E4ORF1+ 제정맥 내피 세포 (UVEC) 위에서 증식시켰다:
프로토콜 1에서는, HSPC - E4ORF1+ UVEC 공-배양을 개시하기 24시간 전에 형질도입을 개시하였다 ("사전-형질도입").
프로토콜 2에서는, HSPC - E4ORF1+ UVEC 공-배양과 동시에 형질도입을 개시하였다 ("동시-형질도입").
프로토콜 3에서는, HSPC를 E4ORF1+ UVEC와 48시간 공-배양한 다음, 부유하는 HSPC를 형질도입 (24시간)을 위해 빈 웰로 이동시킨 다음, 형질도입 후 HSPC를 E4ORF1+ UVEC와 공-배양하였다 ("증식 후-형질도입").
각각의 프로토콜에서, 세포 배양은 저산소 조건에서 수행하였다. 또한, 각 프로토콜에서, 조혈 세포 약 100,000개 (이중 95,000개가 유세포 측정에 의해 CD34+로 확인됨)를 빈 웰 (프로토콜 1) 또는 E4ORF1+ UVEC 세포가 컨플루언시로 미리-접종된 웰 (프로토콜 2 및 3)에 넣었다. 6웰 플레이트의 하나의 웰에 컨플루언시로 존재하는 E4ORF1+ UVEC 세포의 수는 약 300,000개이다. 배지는 StemMACS HSC 증식 배지 (제조사 Miltenyi Biotec) + 100 ng/ml의 SCF, Flt3 및 TPO 사이토카인으로 구성되었다. 형질도입은, 세포를 REP 조작된 렌티바이러스 및 폴리브렌과 배양하는, 24시간으로 구성되었다. 이 후, 형질도입된 세포를 수집하여, 스핀 다운 후 사이토카인이 첨가된 신선한 배지에 현탁하여, E4ORF1+ UVEC 컨플루언트 배양물 위에 다시 접종하였다. (사이토카인이 첨가된) 배양 배지를 이후 2일마다 교체하였다. 3가지 프로토콜 모두, 세포는 총 8일간 증식시켰으며, 이후 세포를 수집하여, 계수하고, FACS 분석을 위해 CD34 및 CD45를 항체로 염색하였다.
E-CEL UVEC 세포와의 공-배양하는 조건에서 형질도입을 수행하였을 때, CD34+ 세포 단독 형질도입과 비교해, 전체 조혈 세포와 CD34+ 하위-집단 (즉, HSPC)에서 우수한 배수 증식이 관찰되었다 (도 1). 아울러, 이들 세포의 증식 잠재력은 형질도입 공정을 개시하기 전에 48시간 공-배양한 후 더욱 증가하였다. 마찬가지로, 가장 효과적인 형질도입 방법은, 형질도입 공정을 개시하기 전에 조혈 세포를 E4ORF1+ UVEC 세포와 48시간 공-배양하는 방법인 것으로 확인되었다 (도 2). 중요한 점은, 이러한 결과들이, 특히 2가지 방법에서 CD34+ 하위집단이 가장 효율적으로 형질도입되고 (도 2A), 형질도입된 집단이 최대 증식을 나타냄 (도 2B)을, 의미한다는 것이다. 요컨대, 이들 데이타는, CD34+ 조혈 세포를 E4ORF1+ UVEC 세포와의 공동-배양에 적응시키는 것이 형질도입된 세포 집단의 전체 세포 수율과 형질도입 효율을 모두 급격하게 높인다는 것을, 시사해준다.
실시예
2
바이러스 형질도입
효율에 대한 부유 분획
& 사이토카인의 효과
형질도입 효율에 대한 CD34+ 조혈 세포의 '부유 분획'의 제거 효과와 사이토카인 농도가 형질도입 효율에 영향을 미치는 지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
CD34+ 세포 (Lonza)에 청색 형광 단백질 (BFP)을 형질도입하고, 6웰 플레이트에서 E4ORF1+ UVEC 배양물 상에서 하기 4가지 프로토콜에 따라 증식시켰다:
프로토콜 1 및 3에서는, HSPC를 E4ORF1+ UVEC 배양물 상에서 96시간 증식시킨 후 HSPCS를 BFP를 발현하도록 조작된 렌티바이러스와 24시간 배양하여 형질도입을 수행하였으며, 이때에도 HSPC는 E4ORF1+ EC 피더 층 상에 유지시켰다. 그런 후, HSPC를 E4ORF1+ UVEC 배양물 위에서 다시 2일간 증식시켰다. 이들 프로토콜에 따라 수득한 결과는 도면에 "동시-형질도입" 결과로서 표시된다.
프로토콜 2 및 4에서는, HSPC를 E4ORF1+ UVEC 배양물 상에서 96시간 증식시킨 후 부유 분획을 빈 웰로 옮기고, HSPCS를 BFP를 발현하도록 조작된 렌티바이러스와 24시간 배양하여 형질도입을 수행하였다. 형질도입 후, HSPC를 E4ORF1+ EC 배양물 상에서 다시 2일간 배양하였다. 이들 프로토콜에 따라 수득한 결과는 도면에 "분리-형질도입" 결과로서 표시된다.
프로토콜 1 및 2에서 사용한 세포 배양 배지는 StemMACS HSC 증식 배지 (제조사 Miltenyi Biotec) + SCF, Flt3 및 TPO 사이토카인 각각 100 ng/ml로 구성되었다 - 도면에는 "사이토카인 정상 농도"로 표시됨. 프로토콜 3 및 4에서 사용한 세포 배양 배지는 StemMACS HSC 증식 배지 (제조사 Miltenyi Biotec) + SCF 및 Flt3 각각 300 ng/ml + TPO 및 IL-6 각각 100 ng/ml + IL-3 20 ng/ml로 구성되었다 - 도면에는 "사이토카인 고 농도"로 표시됨.
전술한 각각의 프로토콜에서, 세포 배양들 모두 저산소 조건에서 수행하였다. 또한, 조혈 세포 100,000개 (유세포 측정에 따르면 CD34+ 세포 95,000개를 포함함)를 E4ORF1+ UVEC 세포의 컨플루언트 층에 접종하였다. 6웰 플레이트의 하나의 웰에 컨플루언시로 존재하는 E4ORF1+ UVEC 세포의 수는 약 300,000개이다. 조혈 세포 / E4ORF1+ EC의 96시간 공-배양 후, 샘플을 BFP를 발현하도록 조작된 렌티바이러스 및 폴리브렌과 24시간 인큐베이션하는 형질도입에 착수하였다. 그런 후, 형질도입된 세포를 수집하여, 스핀 다운 후 (지정된 바와 같이 사이토카인이 첨가된) 신선한 배지에 현탁하여, E4ORF1+ UVEC 배양물 위에 접종하였다. (사이토카인이 첨가된) 배양 배지를 이후 2일마다 교체하였다. 모든 샘플 증식은 총 7일간 지속하였으며, 그 후 세포를 수집하여, 계수하고, FACS 분석을 위해 CD34 및 CD45를 항체로 염색하였다.
예상된 바와 같이, 전체 조혈 세포 집단과 CD34+ 조혈 세포 하위 집단 둘다, 사이토카인을 더 많이 사용하였을 때 우수한 배수 증식을 나타내었다 (도 3). E4ORF1+ UVEC 배양물의 존재 하에 형질도입한 조혈 세포 집단과, E4ORF1+ EC 배양물의 부재 하에 형질도입한 조혈 세포 집단 간에는, 배수 증식에 약간의 차이가 존재하였다. 놀랍게도, 형질도입 효율은, E4ORF1+ UVEC 세포 존재 하에 형질도입하는 것이, 형질도입시 E4ORF1+ UVEC 배양물로부터 일시적으로 분리된 조혈 세포에 형질도입하는 경우 보다 우수하였다 (도 4). 즉, 바이러스를 잠재적으로 흡수/격리 (sequester)할 수 있는 제2 세포 타입 (즉, E4ORF1+ UVEC)이 형질도입시 존재함에서 불구하고, 조혈 세포, 특히 CD34+ / HSPC 세포 분획은 E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 형질도입하였을 때 여전히 더 높은 바이러스 흡수력을 보였다. 사이토카인 농도는 형질도입 효율에 거의 영향을 미치지 않았지만 (도 4), 사이토카인의 농도를 높이면 전체적으로 더 많은 수의 형질도입된 CD34+ 세포가 수득되었으며, 이는 형질도입된 CD34+ CD45+ 세포의 수적 증가 또는 세포 증식 증가가 그 이유일 수 있다 (도 5). 요컨대, 이들 결과는, E4ORF1+ UVEC 배양물의 존재 하에 HSPC를 형질도입하는 것이 형질도입 효율을 개선할 수 있으며, 형질도입된 세포의 수 역시 증식시 사용되는 사이토카인 농도를 증가시킴으로써 더욱 증가시킬 수 있다는 것을, 보여준다.
실시예 1 및 2에서 확인된 데이타는, 특정 타겟 세포, 예를 들어, HSPC와 E4ORF1+ EC의 공-배양이 유전자 전달 효율을 현저하게 개선할 수 있다는 것을 입증해준다. 구체적으로, 본원에 제시된 결과들은, 유전자-편집 분야에서 큰 난제인, HSPC의 바이러스 형질도입이, E4ORF1+ EC 공-배양 시스템을 이용해 현저하게 개선할 수 있다는 것을, 입증해준다. E4ORF1+ UVEC 세포의 존재는 중요한 줄기 세포 집단에서의 전체적인 CD34+/CD45+ HSPC 수율 및 형질도입 효율을 증가시킨다. 이러한 E4ORF1+ EC 공-배양의 2가지 이점은, 다양한 유전자 전달 방법의 효율을, 예를 들어, 유전자 편집 및/또는 유전자 테라피 목적으로, 개선하는 새로운 수단임을 의미할 수 있다.
실시예
3
후속적인 EC 공-배양에 의한 형질감염된 세포의 구제
전기천공에 의해 형질감염된 세포와 같이 형질감염된 또는 형질도입된 세포는 형질감염 또는 형질도입 후 EC와 함께 배양할 수 있다. 이러한 후속적인 공-배양은 형질감염 또는 형질도입 과정에 의해 손상된 세포를 "구제"할 수 있어, 형질감염된 또는 형질도입된 세포의 세포 사멸 및 소실을 낮출 수 있다. 이러한 공-배양은, 형질감염 또는 형질도입 단계가 착수된 후 "즉시" (이 용어가 본원에 정의된 바와 같이) 개시되어야 하며, 타겟 세포의 회복 (recovery)이 가능한 충분한 시간 동안 지속하여야 한다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 "구제"가 2가지 세포 집단 (즉, 형질도입된/형질감염된 세포와 EC) 간의 세포-세포 접촉의 결과로서, 및/또는 안지오크린 (angiocrine) 인자 및 사이토카인과 같이 EC에 의해 분비되는 용해성 인자에 형질전이된/형질감염된 세포를 노출시킨 결과로서, 발생할 수 있는 것으로 생각된다. 2가지 세포 집단의 공-배양은 또한 형질도입된 또는 형질감염된 세포의 증식을 촉진 및/또는 증가시킬 수 있다.
사용되는 EC는 임의 유래의 EC일 수 있다. 장기-특이적인 EC (즉, 형질도입된/형질감염된 세포가 유래된 동일 장기로부터 유래된 EC)를 사용할 수 있다. 또한, E4ORF1+ EC를 사용할 수 있다.
실시예
4
전기천공에 의한
HSPC의
증식 & 형질감염에 대한
E4ORF1
+ 공-배양 효과
목표: E4ORF1+ 내피 세포의 공-배양 하에, 플라스미드 GFP를 인간 이동성 말초혈 (mPB) CD34+ 세포에 형질감염시키는 전기천공 시스템 (Lonza 4D-뉴클레오펙터 시스템)의 효과를 조사하고자 한다.
실험 설계: 세포 배양은 달리 언급되지 않은 한 5% 산소 및 37℃에서 수행하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안 CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L)에 단독으로 노출시키거나 (C/C/C로 표시됨), 자극 및 형질감염 단계 동안 사이토카인을 접촉시킨 다음 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회복시키거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안, 즉 자극 단계, 형질감염 단계 및 회복 단계 동안에 E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 수행하였다 (E/E/E). 0일에, 인간 mPB CD34+ 세포 (AllCells) 1,500,000개를 저-결합성 부착 6웰 디쉬의 2개의 웰 (500K/웰)과 사전-컨디셔닝화된 E4ORF1+ UVEC 6웰 디쉬의 웰 1개 (500K)에, 모두 사이토카인 (100 ng/ml SCF, Flt3 및 TPO)이 첨가된 StemMACS HSC 증식 배지 (Miltenyi Biotec) 중에 접종하였다. 1일 (24시간 후)에, 샘플들 모두 수집하고, 스핀 다운한 후 카운트를 측정하였다. 세포를 Nucleofector 용액 및 maxGFP 플라스미드 (Lonza)에 재현탁하였다. 샘플을 전기천공하고, 다음과 같이 접종하였다: #1: 첫번째 저-결합성 웰은 새로운 저-결합 웰로 투입하였다 (C/C/C). #2: 두번째 저-결합성 웰은 E4ORF1+ UVEC 웰로 투입하였다 (C/C/E). #3: E4ORF1+ UVEC 웰은 두번째 E-CELE4ORF1+ UVEC 웰에 투입하였다 (E/E/E). 모든 샘플은 사이토카인 (100 ng/ml SCF, Flt3 및 TPO)이 첨가된 StemMACS HSC 증식 배지에서 계속 배양하였다. 이후 플레이트를 5% 산소 인큐베이터에 37℃에서 96시간 동안 두었으며 (형질감염 후 48시간에 신선한 배지와 사이토카인을 다시 공급함), 이때 세포 카운트, 유세포 측정 및 CFU 분석으로 분석하였다. E4ORF1+ EC가 사용된 각 경우에는, 각 웰에 존재하는 이 세포는 약 300,000개였으며, 즉, 공-배양 및 형질감염/형질도입은 E4ORF1+ EC의 컨플루언트 단층의 존재 하에 수행하였다 (6웰 플레이트의 하나의 웰에서 컨플루언시 상태인 EC의 개수는 약 300,00개임).
결과: 전체 분석에서, EC 상에 증식시킨 전체 조혈 세포 (도 6), 특히 CD34+ 세포 (도 7A)가 가장 우수한 전체 증식 (6.4배 증가)을 나타내었고, 다음으로 형질감염 직후 EC에서 증식시킨 CD34+ 세포 (2.7배 증가)였다. EC 없이 형질감염 및 증식시킨 CD34+ 세포가 전체적으로 증식이 가장 낮았다 (0.7배 증가). 특히, CD34+ 집단의 형질감염 효율은 EC의 존재로 인한 부정적인 영향을 받지 않았다 (각각 E/E/E 샘플의 형질감염된 CD34+ 세포 78% vs C/C/C 샘플의 형질감염된 CD34+ 73% 및 C/C/E샘플의 형질감염된 CD34+ 76%, 형질감염된 CD34+의 전체 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포에의 노출 증가에 따라 특히 더 높음) - (도 7B). 샘플들 모두 CFU 분석에서 전체 콜로니 형성에는 양성이었지만 (도 8A), EC의 존재 하에 증식시킨 CD34+ 세포만 다능성 전구 세포 (MMP)임을 의미하는 GEMM을 형성하는 것으로 확인되었으며 (도 8D 및 도 9), 이는 증식시킨 집단에 존재하였다.
결론: EC E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 CD34+ 세포의 형질감염 및 이후 증식은, 전체 세포 및 형질감염된 세포의 수율 측면에서, 공정 중에 EC 집단의 개입을 지연시키거나 또는 완전히 배제한 경우와 비교해, 가장 우수한 결과를 달성한다. 또한, 형질감염 효율은 형질감염 동안에 EC 집단의 존재가 놀랍게도 부정적으로 작용하지 않았다. 마지막으로, EC와 공-배양한 샘플에 대한 CFU 분석에서 GEMM 콜로니 형성의 존재는, EC가 증식 중에 CD34+ 세포의 MPP 집단을 유지시키는데 중요한 역할을 한다는 것을, 입증해준다. 이러한 결과는, 조혈 세포의 형질감염시 E4ORF1+ UVEC 세포를 사용하면 이러한 세포를 사용하지 않고 수행한 유전자-전달과 비교해, 개선할 수 있다는 것을, 보여준다.
실시예
5
E4ORF1
+
UVEC
플랫폼에서 원숭이 인간을 제외한 영장류
mPB
CD34+에
lenti
-
GFP의
형질도입
목표: E4ORF1+ UVEC 공-배양 하에 인간을 제외한 영장류 mPB CD34+의 형질도입 효율 및 증식 분석
실험 설계: 증식 분석은 5% 산소 조건 하에 수행하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L)에 단독으로 노출시키거나 (C/C/C로 표시됨), 자극 및 형질감염 단계 동안 사이토카인을 접촉시킨 다음 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회복시키거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 수행하였다 (E/E/E). 인간을 제외한 영장류 mPB CD34+ 세포 450,000개를 다음과 같이 배치하였다: #1) 레트로넥틴 코팅된 웰 1개 (6웰 포맷); #2) 레트로넥틴 코팅된 웰 1개 (6웰 포맷); #3) 컨플루언트 E4ORF1+ UVEC 세포 웰 1개 (6웰 포맷). 3가지 샘플 모두 CD34+ 세포의 접종은 0일에 수행하였으며, 100 ng/ml의 SCF, Flt3 및 TPO이 첨가된 StemMACS HSC 증식 배지 (Miltenyi Biotec)에서 수행하였다. (24시간 후) 1일에, 샘플들 모두에 신선한 배지와 사이토카인을 재공급하고; 또한 GFP 렌티바이러스를 MOI 25로 3가지 샘플 모두에 첨가하였다. (형질도입 후 24시간) 2일에, 샘플 #1은 새로운 레트로넥틴 코팅된 웰로 이동시켰다. 샘플 #2 및 #3은 미리 E4ORF1+ UVEC 세포가 각각 접종된 새 웰로 이동시켰다. 모든 샘플에 신선한 배지와 사이토카인을 재-공급하였다. (형질도입 후 72시간) 4일에, 모든 샘플에 신선한 배지와 사이토카인을 재-공급하였다. (형질도입 후 120시간) 6일에, 세포를 레트로넥틴으로 코팅된 웰 (샘플 #1) 또는 E4ORF1+ UVEC 세포 웰 (샘플 #2 및 #3)에 신선한 배지 및 사이토카인 존재 하에 이동시켰다. (형질도입 후 168시간) 8일에, 모든 샘플에 신선한 배지와 사이토카인을 재공급하였다. (형질도입 후 192시간) 10일에, 모든 샘플들을 세포 카운트 측정 및 (FACS) 염색을 위해 수집하였다. E4ORF1+ EC가 사용된 각 경우에, 각 웰에 존재하는 이 세포는 약 300,000개였으며, 즉 공-배양 및 형질감염/형질도입을 E4ORF1+ EC 컨플루언트 단층의 존재 하에 수행하였다 (6웰 플레이트의 웰 1개에서, 컨플루언시 상태의 EC 개수는 약 300,000개임).
결과: 전체적인 분석에서 EC 상에서 증식시킨 전체 조혈 세포 (도 10), 특히 CD34+ 세포 (도 11, 좌)가, GFP의 형질도입 직후에 EC 상에서 증식시킨 CD34+ 세포 (48배 증가)와 비교해, 전반적으로 더 우수한 증식 (62배 증가)을 나타내었다. EC의 부재 하에 GFP 형질도입과 증식을 수행한 CD34+ 세포에서는 전체적으로 가장 낮은 증식 (7배 증가)이 관찰되었다. CD34+ 집단의 형질도입 효율 (도 11)은, EC 존재로 인해 약간 감소하였다 (E/E/E 샘플의 경우 형질도입된 CD34+ 세포 42% vs C/C/C 샘플의 경우 형질도입된 CD34+ 세포 60%). 흥미롭게도, EC 부재 하에 형질도입한 후 EC와 공-배양한 CD34+ 세포 역시 형질도입 효율에 약간의 감소가 관찰되었다 (CD34+ 형질도입 효율 51%, C/C/E 샘플). 그러나, CD34+ 형질도입된 세포의 전체 수율은 E4ORF1+ UVEC 세포와 공-배양하였을 때 더 높았다 (도 11 B). 비슷한 경향은 표현형 줄기 세포 집단의 형질도입 효율에서 관찰되었다 (CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD49f+ 세포로 측정): E/E/E 샘플 - 21%; C/C/E 샘플 - 24%; C/C/C 샘플 - 38%. 도 12). 특히, C/C/C 샘플 (세포 ~300,000개)과 비교해, E/E/E 샘플 (세포 ~900,000개) 및 C/C/E 샘플 (세포 ~850,000개)의 경우, 형질도입된 줄기 세포의 수가 현저하게 증가하였다 (도 12B).
결론: 원숭이 CD34+ 세포, 특히 CD34+ 줄기 세포의 형질도입 효율은, 형질도입 시 EC가 존재하는 경우 보다 약간 낮았지만, 형질도입에서의 이러한 일부 감소는 EC를 공정의 일부로 사용하였을 때 증식된 생성물내 이들 세포의 현저한 수적 증가에 의해 상쇄되었다. 따라서, 예를 들어 MOI 증가를 통해 형질도입 공정의 조건을 수정함으로써, E4ORF1+ UVEC 세포 플랫폼이 제공하는 세포의 전체 수율의 현저한 증가를 유지하면서도 형질도입 효율 증가를 달성할 수 있다.
실시예
6
E4ORF1
+
UVEC
세포 플랫폼을 이용한 인간
mPB
CD34+ 세포에
lenti
-
GFP의
형질도입.
목표: E-E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 lenti GFP를 형질도입할 경우 인간 mPB CD34+ 세포의 형질도입 효율 및/또는 증식 잠재력에 대한 효과 분석.
실험 설계: 증식 분석은 5% 산소 조건 하에 수행하였다. 자극, 형질감염 및 회복/증식 단계 동안, CD34+ 세포를 사이토카인 (SCF, TPO, Flt3-L)에 단독으로 노출시키거나 (C/C/C로 표시됨), 자극 및 형질감염 단계 동안 사이토카인을 접촉시킨 다음 E4ORF1+ UVEC 세포와의 직접 공-배양으로 회복시키거나 (C/C/E), 또는 전체 3단계 동안 E4ORF1+ UVEC 세포의 존재 하에 수행하였다 (E/E/E). 인간 mPB CD34+ 세포 (AllCells) 300,000개를 다음과 같이 배치하였다: #1) 레트로넥틴 코팅된 웰 1개 (6웰 포맷); #2) 컨플루언트 E4ORF1+ UVEC 세포 웰 1개 (6웰 포맷). 샘플 #1 및 #2에서 CD34+ 세포의 접종은 0일에 수행하였으며, 100 ng/ml의 SCF, Flt3 및 TPO이 첨가된 StemMACS HSC 증식 배지 (Miltenyi Biotec)에서 수행하였다. (24시간 후) 1일에, 이들 샘플에 신선한 배지와 사이토카인을 재공급하고; 또한 GFP 바이러스를 MOI 50으로 샘플 #1 및 #2에 첨가하였다. (형질도입 후 24시간) 2일에, 각 샘플을 신선한 E4ORF1+ UVEC 세포 상에서 신선한 배지 및 사이토카인로 이동시켰다. (형질도입 후 72시간) 4일에, 세포에 신선한 배지와 사이토카인을 재-공급하였다. (형질도입 후 120시간) 6일에, 세포를 카운팅 및 염색 (FACS)을 위해 수집하였다. E4ORF1+ EC가 사용된 각 경우에, 각 웰에 존재하는 이 세포는 약 300,000개였으며, 즉 공-배양 및 형질감염/형질도입을 E4ORF1+ EC 컨플루언트 단층의 존재 하에 수행하였다 (6웰 플레이트의 웰 1개에서, 컨플루언시 상태의 EC 개수는 약 300,000개임).
결과: 전체 분석에서 EC 상에서 증식시킨 전체 조혈 세포 (도 13), 특히 CD34+ 세포 (도 14A)가, GFP의 형질도입 직후에 EC 상에서 증식시킨 CD34+ 세포 (7.9배 증가)와 비교해, 전반적으로 더 우수한 증식 (21.5배 증가)을 나타내었다. CD34+ 집단의 형질도입 효율은 EC 존재로 인해 약간 감소하였다 (E/E/E 샘플의 경우 형질도입된 CD34+ 세포 61% vs C/C/C 샘플의 경우 형질도입된 CD34+ 세포 81% - 도 14B). 마찬가지로, 표현형 줄기 세포 집단의 형질도입 효율 (CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD49f+ 세포로 측정) 역시 C/C/C 샘플 (92%)과 비교해 E/E/E 샘플 (74%)에서 약간 낮게 관찰되었다 (도 15). 특히 E/E/E 샘플의 경우, C/C/E 샘플과 비교해, 형질도입된 줄기 세포가 3배 높게 관찰되었다 (도 15B).
결론: CD34+ 줄기 세포의 렌티바이러스-매개 형질도입 효율이 형질도입 시 EC가 존재하는 경우 보다 약간 낮았지만 (74%, E/E/E vs 92%, C/C/E), 이러한 일부 감소는 증식 공정으로 수득되는 성공적으로 형질도입된 줄기 세포의 현저한 수적 증가에 의해 상쇄되었다 (형질전환된 줄기 세포 ~100,000개, E/E/E vs 형질전환된 줄기 세포 ~36,000개, C/C/E). 높은 형질도입 효율 (예, >70%)과 높은 세포 수율이 여전히 이 플랫폼의 최종 목표이지만, 형질도입 조건을 추가로 조작하여, 후속적인 필수 세포 집단의 증식을 저해하지 않고 추가로 형질도입 효율을 개선할 수 있다 (예, >90%).
***
본 발명은 첨부된 청구항에 의해 추가로 기술된다.
Claims (50)
- 타겟 세포에 유전자를 전달하는 유전자 전달 방법으로서,
(a) 상기 타겟 세포를 내피 세포와 공-배양 (co-culturing)하는 단계, 및
(b) 상기 타겟 세포를 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 타겟 세포를 상기 내피 세포와 공-배양하는 단계가,
i. 상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계 전에, 또는
ii. 상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계와 동시에, 또는
iii. 상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계 이후에, 또는
iv. 상기 i, ii 및 iii의 임의의 조합으로 개시되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포는 유전자 편집에 유용한 하나 이상의 분자와도 접촉되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 E4ORF1+ 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공-배양하는 단계가 정상 산소 조건 (normoxic condition) 하에 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공-배양하는 단계가 저산소 조건 (hypoxic condition)하에 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공-배양하는 단계가 고도 저산소 조건 (severely hypoxic condition)하에 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 공-배양하는 단계가 0.1% 내지 18% 범위의 산소 농도에서 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 전달 방법. - 제8항에 있어서,
상기 뉴클레아제가 메가뉴클레아제 (meganucleases), 징크 핑거 (zinc finger) 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 작동자-기반의 뉴클레아제 (transcription activator-like effector-based nuclease, TALEN) 및 CRISPR-Cas 시스템 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포가 분화된 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포 (progenitor cell)인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포가 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell, HSC)인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포가 조혈 줄기 또는 전구 세포 (hematopoietic stem or progenitor cell, HSPC)인, 유전자 전달 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 HSC 또는 HSPC가 CD34+인, 유전자 전달 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 HSC 또는 HSPC가 골수, 말초혈 또는 제대혈로부터 유래되는 것인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포가 골수 유래의 CD34+ HSC 또는 HSPC인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 혈관 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 일차 혈관 내피 세포 (primary vascular endothelial cell)인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 포유류 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 인간 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 완전히 분화된 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 장기-특이적인 (organ-specific) 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 유사 분열 비활성 (mitotically inactivated)인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 제정맥 (umbilical vein) 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 내피 세포가 인간 제정맥 내피 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계가 형질감염에 의해 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제26항에 있어서,
상기 형질감염이 리포좀-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, DEAE 덱스트란-매개 형질감염, 전기천공 (electroporation), 뉴클레오펙션 (nucleofection), 칼슘 포스페이트 침강 (calcium phosphate precipitation), 미세주입법 (microinjection) 또는 미세입자 충격 (micro-particle bombardment)인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 타겟 세포를 상기 하나 이상의 외인성 핵산 분자와 접촉시키는 단계가 형질도입에 의해 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제28항에 있어서,
상기 형질도입이 렌티바이러스-매개 형질도입, 아데노바이러스-매개 형질도입, 레트로바이러스-매개 형질도입, 아데노-부속 바이러스-매개 형질도입 (adeno-associated virus-mediated transduction) 또는 헤르페스바이러스-매개 형질도입을 이용해 수행되는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산 분자가 플라스미드 벡터에 존재하는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산 분자가 바이러스 벡터에 존재하는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산 분자가 상기 타겟 세포의 유전자 결함을 교정하기 위한 유전자 교정된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
유전자 변형된 타겟 세포를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체가 포유류인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체가 인간인, 유전자 전달 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체가 상기 타겟 세포에 대한 질환 또는 장애를 앓고 있는, 유전자 전달 방법. - 제36항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 유전 질환 또는 장애 (genetic disease or disorder)인, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 개체가 상기 타겟 세포의 결함을 가진, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 유전자 변형된 타겟 세포를 상기 타겟 세포에 대한 유전 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 타겟 세포가 HSC 또는 HSPC이고,
상기 개체가 조혈계의 세포에 대한 질환 또는 장애를 앓고 있는, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 개체가 조혈 줄기 세포의 이식이 필요한 개체인, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 개체가 골수파괴성 처치 (myeloablative treatment)에 의해 유발된 조혈 결함을 가진 개체인, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 개체가 대사 질환, 신경계 질환, 암, 자가면역 질환, 감염 질환, 혈액 질환, 감염성 면역결핍, T 세포에 대한 감염성 질환, HIV, 유전성 면역결핍 (genetic immunodeficiency), 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency), 산필립포 (Sanfilippo) 질병, 적혈구에 대한 유전 질환, 빈혈, 겸상 세포 빈혈, 판코니 빈혈 및 지중해 빈혈 (thalassemia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 앓고 있는, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 타겟 세포가 상기 개체의 동종이계인, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 타겟 세포가 상기 개체의 자가 세포인, 유전자 전달 방법. - 제33항에 있어서,
상기 타겟 세포가 상기 개체에 대해 이종성 (xenogeneic) 세포인, 유전자 전달 방법. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 이용해 제조된 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 이용해 제조된 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 이용해 제조된 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포 및 내피 세포를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 이용해 제조된 형질감염된 또는 형질도입된 타겟 세포 및 E4ORF1+ 내피 세포를 포함하는 조성물.
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