KR20220032561A - 하전된 표면을 사용하여 유도 만능 줄기 세포로부터 다중 계통을 생산하는 방법 - Google Patents

하전된 표면을 사용하여 유도 만능 줄기 세포로부터 다중 계통을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 유도 만능 줄기 세포로부터 선조 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 선조 세포는 내피 세포, 혈관 주위 세포, 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC), 중간엽 줄기 세포 (MSC), 조혈 전구 세포 (HPC), 미세 아교 세포 또는 신경 전구 세포 (NPC)를 포함한다.

Description

하전된 표면을 사용하여 유도 만능 줄기 세포로부터 다중 계통을 생산하는 방법
본 출원은 2019년 6월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/861,640, 2019년 6월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/865,806 및 2020년 6월 12일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 63/038,564에 대한 이익을 주장하며, 이들의 전문은 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유도 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
사람 만능 줄기 세포 (human pluripotent stem cell: hPSC)는 재생 의학 및 의약품 개발에서의 적용을 위한 강력한 공급원을 제공한다. 지난 10년 동안, 복수의 성장 구성 요소, 세포외 매트릭스 및/또는 영양 세포 층을 사용하여 iPSC로부터 다중 계통을 생성하여 시험관내 모델을 개선하고 다양한 계통의 개발 초기 단계를 조사하기 위한 잠재적으로 강력한 도구를 제공하기 위한 다양한 방법이 개발되었다.
특정 세포 유형으로의 효율적인 시험관내 분화는 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 잠재적 사용에 대한 핵심이다. 계통 특이적 분화를 위한 주요 성공 요인은 한정 조건의 사용, 말기 세포의 우수한 표현형 및 기능적 특성화, 분화 과정 길이의 재현성 및 비용을 포함한다.
따라서, 사람 만능 줄기 세포의 계통 특이적 분화를 위한 효율적인 방법에 대한 당해 분야의 요구가 여전히 남아 있다.
발명의 개요
본 개시 내용의 특정 실시 형태는 (a) 상기 iPSC를 세포외 매트릭스 단백질의 부재하에 하전된 표면 상에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 iPSC를 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell: MSC) 또는 조혈 전구 세포 (hematopoietic precursor cell: HPC)로 분화시키는 단계를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)를 분화시키는 시험관내 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 하전된 표면은 양으로 하전된다. 특정 양태에서, 상기 양으로 하전된 표면은 아민 표면 또는 폴리 L 라이신 표면이다. 구체적인 양태에서, 상기 양으로 하전된 표면은 질소 함유 작용기를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 하전된 표면은 음으로 하전된다. 특별한 양태에서, 상기 음으로 하전된 표면은 카복실 표면이다. 특정 양태에서, 상기 음으로 하전된 표면은 산소 함유 작용기를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 하전된 표면은 중합체성 표면이다. 예를 들어, 상기 중합체성 표면은 폴리스티렌 표면이다. 특정 양태에서, 상기 하전된 표면은 양으로 하전된 기 및 음으로 하전된 기를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 양으로 하전된 기는 질소 함유 기이며, 상기 음으로 하전된 기는 산소 함유 기이다.
특정 양태에서, 상기 iPSC는 무혈청 한정 배지에서 배양된다. 일부 양태에서, 분화는 블레비스타틴 또는 ROCK 억제제, 예를 들어, H1152의 존재하에 배양하는 것을 포함한다. 특별한 양태에서, 상기 방법은 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 매트리겔 (ATRIGEL™), 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴 또는 콜라겐이 없거나 본질적으로 없다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에, TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA의 파괴된 발현을 갖도록 상기 iPSC를 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 특별한 양태에서, 조작은 TAL 뉴클레아제를 사용하여 TREM2의 엑손 2에 삽입/결실을 도입하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 MeCP2의 파괴된 발현은 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 추가로 한정된다. 특정 양태에서, 상기 파괴된 발현은 A53T와 같은 미스센스 점 돌연변이에 기인한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 상기 선조 세포를 내피 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 단계 (a)는 아민 표면 상에서 배양하여 선조 세포를 생성하는 것을 포함하며, 단계 (b)는 내피 분화 배지의 존재하에 카복실 표면 상에서 배양하여 내피 세포를 생성하는 것을 포함한다. 특별한 양태에서, 상기 내피 세포는 CD31에 대해 양성이다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 내피 세포를 뇌 미세 혈관 내피 세포 (brain microvascular endothelial cell: BMEC)로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 상기 내피 세포를 림프관 내피 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 상기 방법은 상기 선조 세포를 MSC로 분화시키는 단계를 포함한다. 구체적인 양태에서, 분화는 상기 선조 세포를 MSC 배지의 존재하에 아민 표면 상에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 MSC는 CD73, CD44 및 CD105에 대해 양성이다. 특정 양태에서, 상기 분화된 세포 중 적어도 90%는 CD73에 대해 양성이다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 MSC를 혈관 주위 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 MSC는 세포외 단백질의 부재하에 세포 주위 세포 배지의 존재하에 배양된다. 일부 양태에서, 상기 혈관 주위 세포는 NG2, PDGFRβ 및 CD146에 대해 양성이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 상기 선조 세포를 HPC로 분화시키는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 HPC를 미세 아교 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 양태에서, 분화는 상기 HPC를 미세 아교 세포 분화 배지의 존재하에 중성으로 하전된 표면 또는 초저 부착 표면 상에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지는 IL34, TGF 및 MCSF를 포함한다. 일부 양태에서, 분화는 정상 산소에서의 배양을 포함한다. 일부 양태에서, 분화는 20~25일 동안이다. 특별한 양태에서, 상기 미세 아교 세포는 CD45, CD11b 및 CD33에 대해 양성이다. 특정 양태에서, 상기 분화된 세포 중 적어도 50% (예를 들어, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 50~60%, 60~70%, 또는 80~90%)는 CD11b에 대해 양성이다. 일부 양태에서, 상기 분화된 세포 중 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)는 CD33에 대해 양성이다.
특정 양태에서, 상기 방법은 상기 세포의 정제를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 정제는 MACS를 수행하는 것으로 추가로 한정된다.
특별한 양태에서, 상기 방법은 의약품 제조 및 품질관리 기준 (good-manufacturing practice: GMP)을 준수한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 저산소 조건하에 수행된다. 구체적인 양태에서, 상기 iPSC는 사람 유래이다.
또 다른 실시 형태에서, P2RY12, CX3CR1, TMEM119, IBA-1 및 TREM2에 대해 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 90~93%, 93~96%, 또는 96~100%) 양성인 미세 아교 세포 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 미세 아교 세포 집단은 상기 실시 형태의 방법에 의해 생산된다. 일부 양태에서, 상기 미세 아교 세포 집단은 TREM2, APOE, CD33, BIN, ABCA7, SNPS 또는 신경 퇴행 관련 유전자형을 갖는 질병 관련 iPSC 공여자로부터 생성된다. 특정 양태에서, 상기 미세 아교 세포 집단은 TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA의 파괴된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 TREM2의 파괴된 발현은 TREM2 발현의 동형 접합 녹아웃 (konck-out)으로서 추가로 한정된다. 특정 양태에서, 상기 MeCP2의 파괴된 발현은 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 추가로 한정된다. 일부 양태에서, 상기 SCNA의 파괴된 발현은 A53T와 같은 미스센스 점 돌연변이에 기인한다.
추가의 실시 형태는 테스트 화합물을 본 발명의 실시 형태의 미세 아교 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는, 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서 상기 미세 아교 세포 집단은 아밀로이드-베타에 추가로 도입된다. 특정 양태에서, 상기 미세 아교 세포 집단은 LPS에 추가로 도입된다.
또 다른 실시 형태는 본 발명의 실시 형태의 방법에 의해 생산된 혈관 주위 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
더 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 실시 형태의 방법에 의해 생성된 미세 아교 세포, 혈관 주위 세포 및 BMEC를 포함하는 혈액-뇌-장벽 모델이 본 출원에서 제공된다.
추가의 실시 형태는 (a) iPSC를 HPC로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 HPC를 CD34 양성 세포에 대해 분류하는 단계; 및 (c) 상기 HPC를 미세 아교 세포 분화 배지에서 배양하여 미세 아교 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 미세 아교 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 HPC는 본 발명의 실시 형태에 따라 분화된다. 특정 양태에서, 분류는 CD34 자성 비드를 사용하는 것을 포함한다. 특별한 양태에서, 상기 방법은 CD43 양성 세포에 대해 HPC를 분류하는 단계를 포함하지 않는다. 특별한 양태에서, 상기 방법은 ECM 단백질을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지는 IL-34, TGFβ1 또는 M-CSF를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지는 200 ng/mL IL-34, 100 ng/mL TGFβ1 및 50 ng/mL M-CSF를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포는 48 시간 마다 미세 아교 세포 분화 배지를 공급받는다.
특별한 양태에서, 미세 아교 세포 집단 내의 상기 세포 중 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 90~93%, 93~96%, 또는 96~100%)는 TREM 양성이다. 일부 양태에서, 상기 HPC 중 적어도 10% (예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 10~15%, 15~20%, 또는 20~30%)는 미세 아교 세포로 분화된다.
특정 양태에서, 상기 단계 (b)의 배양은 96웰 형식으로 수행된다. 특정 양태에서, 상기 단계 (b)의 배양은 하전된 표면 상에서 수행된다. 일부 양태에서, 상기 하전된 표면은 양으로 하전된다. 예를 들어, 상기 양으로 하전된 표면은 아민 표면이다. 다른 양태에서, 상기 하전된 표면은 음으로 하전된다. 예를 들어, 상기 음으로 하전된 표면은 카복실 표면이다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 CD200 및/또는 프랙탈카인을 포함하는 배지에서 상기 미세 아교 세포 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 상기 미세 아교 세포를 냉동 보존하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 HPC는 TREM2의 파괴된 발현을 갖도록 조작된 iPSC로부터 분화된다. 특정 양태에서, 조작은 TAL 뉴클레아제를 사용하는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 냉동 보존된 미세 아교 세포는 pHrodo 세균 입자에 대한 식세포 기능을 보유한다. 특별한 양태에서, 상기 냉동 보존된 미세 아교 세포는 해동 후 성숙되고 자극제에 반응하고 상청액 배지에서 인터루킨, 케모카인 및 면역 조절 리간드를 분비할 수 있다.
추가의 실시 형태는 (a) 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 배지에서 iPSC를 사전 조건화하는 단계; (b) 상기 iPSC를 NPC로 분화시키는 단계를 포함하는, iPSC로부터 신경 선조 세포 (neural precursor cell: NPC)를 생산하는 시험관내 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은 SMAD 신호 전달의 억제를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 iPSC는 단계 (a) 전에 저산소 조건하에 유지된다. 특정 양태에서, 상기 iPSC는 ROCK 억제제의 존재하에 씨딩된 (seeded) 다음, 단계 (a) 전에 ROCK 억제제의 부재하에 배양된다.
특정 양태에서, 상기 GSK3 억제제는 CHIR99021, BIO 또는 SB-216763이다. 특별한 양태에서, 상기 GSK3 억제제는, 예를 들어, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM 또는 μM, 특히, 3 μM의 농도의 CHIR99021이다. 일부 양태에서, 상기 사전 조건화는 2~4일, 예를 들어, 1, 2 또는 3일 동안이다.
일부 양태에서, 상기 단계 (a) 및/또는 단계 (b)의 iPSC는 세포외 매트릭스 (extracellular matrix: ECM) 단백질 코팅된 표면 상에서 배양된다. 특정 양태에서, 상기 ECM 단백질은 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴이다. 구체적인 양태에서, 상기 ECM 단백질은 라미닌 또는 비트로넥틴이다.
특정 양태에서, 단계 (a) 및 단계 (b)는 정상 산소 조건하에 수행된다. 일부 양태에서, 분화는 상기 iPSC를 ECM 단백질 코팅된 표면 상에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 ECM 단백질은 라미닌 또는 비트로넥틴이다. 일부 양태에서, 분화는 상기 iPSC를 ROCK 억제제의 존재하에 초저 부착 플레이트 또는 스피너 플라스크 (spinner flask) 상에서 배양하는 것을 포함한다. 특별한 양태에서, 단계 (b)는 5 내지 10일, 예를 들어, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 수행된다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 NPC에서 Tra-162, CD56, CD15, Sox1, 네스틴, β3 마이크로글로불린 및/또는 Pax-6의 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 NPC 중 적어도 70% (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 70~80%, 80~90%, 또는 90~100%)는 CD56에 대해 양성이다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 NPC를 성상 교세포 또는 뉴런으로 추가로 분화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태는 미세 아교 세포 조건화 배지에서 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 검출은 ELISA를 수행하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 미세 아교 세포는 동종 동계로 조작된 iPSC, 또는 질병 관련 SNP 또는 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래된다. 일부 양태에서, 상기 미세 아교 세포는 본 발명의 실시 형태 또는 이의 양태의 방법에 의해 생산된다. 특정 양태에서, 대조군과 비교하여 가용성 TREM2의 증가된 수준은 알츠하이머병 또는 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 질환을 검출한다.
추가의 실시 형태는 본 발명의 실시 형태 또는 이의 양태의 방법에 의해 생성된 미세 아교 세포를 복수의 후보 제제와 접촉시키는 단계, 및 사이토카인 및/또는 케모카인 수준 및/또는 아밀로이드 베타 식세포 기능을 측정하는 단계를 포함하는, 고속 처리 스크리닝을 수행하여 치료제를 식별하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 미세 아교 세포는 동종 동계로 조작된 iPSC 계통으로부터 유래된 냉동 보존된 미세 아교 세포, 질병 관련 SNP를 발현하는 공여자로부터 유래된 미세 아교 세포, 또는 신경 퇴행과 관련된 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래된 미세 아교 세포이다. 일부 양태에서, 상기 사이토카인 및/또는 케모카인은 IL6, IL10, IL3, TNFα, IL13, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CX3CL1/프랙탈카인, CXCL1/GROα, CXCL10/IP-10, CXCL2/GROβ 및 IL-8/CXCL8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 실시 형태 및 이의 양태의 미세 아교 세포와 내피 세포, 혈관 주위 세포, 성상 교세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 공동 배양물이 또한 본 출원에서 제공된다. 또 다른 실시 형태는 사람 뇌 발달을 모방하기 위한 공동 배양물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상과 범위 내에서의 다양한 변경 및 변형이 상세한 설명으로부터 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내지만 단지 예시로서만 제공된다는 것을 이해해야 한다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양태들을 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 출원에서 제시된 구체적인 실시 형태들에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: 2D 및 3D HPC 분화 과정의 개략도.
도 2: 2D 또는 3D HPC 분화 과정으로부터 유도된 6 일차 HPC로부터 내피 세포의 유도에 대한 개략도.
도 3: CD31+ MACS를 사용하지 않고 연속 계대 정제를 사용하여 생성된 내피 세포의 특성화.
도 4a~4b: (도 4a) 재플레이팅 종료시 세포의 형태. 상기 내피 세포는 재플레이팅 계대 2 또는 3의 종료시 냉동 보존될 수 있다. (도 4b) 내피 세포의 유도에 사용되는 배지 제형.
도 5a~5d: (도 5a) MSC 분화 과정의 개요. (도 5b) MSC 생성을 위한 배지 제형. (도 5c) 지방 세포, 골 세포 및 연골로의 MSC의 삼중 계통 분화를 나타내는 개략도. (도 5d) 6 일차 MSC 선조 세포의 표현형 특성화.
도 6: 아민 표면 상에서 순수한 MSC 집단의 출현. 냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 6 일차 분화 종료시 살아있는 배양물을 아민 하전된 표면 플레이트 상에 1 uM H1152 (또는 블레비스타틴)의 존재하에 MSC 배지의 존재하에 놓는다. 상기 배양물을 P4에서 정상 산소 및 정상 조직 배양 플레이트로 전환시켰다. P5에서 MSC의 순도 사양에 도달하였다.
도 7: 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재에 대해 염색된 세포. 냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 6 일차 분화 종료시 살아있는 배양물을 아민 하전된 표면 플레이트 상에 1 uM H1152 (또는 블레비스타틴)의 존재하에 MSC 배지에 배치한다. 상기 배양물을 P5에서 정상 산소 및 정상 조직 배양 플레이트로 전환시켰다. P6에서 MSC의 순도 사양에 도달하였다.
도 8a~8c: (도 8a) 삼중 계통 잠재력. MSC로부터 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포를 생성하기 위한 다양한 단계. (도 8b) MSC의 삼중 계통 잠재력, 골 세포에 대한 알리자린 레드 염색, 연골 세포에 대한 알시안 블루 및 지방 세포에 대한 오일 레드 O를 나타내는 사진. (도 8c) MSC 분화 배지에 1,000개 세포/cm2로 플레이팅하고 10~14일 동안 격일로 공급된 MSC. 크리스탈 바이올렛을 사용하여 염색된 플레이트 및 계수된 총 콜로니.
도 9a~9h: MSC의 혈관 주위 세포로의 전환. (도 9a) iCell MSC를 iPSC 유도 혈관 주위 세포로 전환하는 과정의 개략도. (도 9b) iPSC 유도 혈관 주위 세포를 생성하기 위한 배지 제형. (도 9c) iCell MSC, iPSC 유도 혈관 주위 세포 및 ScienCell 일차 사람 뇌 혈관 주위 세포 (human brain vascular pericyte: HBVP)에서 공지된 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대한 유세포 계측 비교. 해동시 iCell MSC에 대한 혈관 주위 세포 마커가 없었으며, 혈관 주위 세포 배지에서 P1의 종료시까지 혈관 주위 세포 마커가 획득되었다. iPSC 유도 혈관 주위 세포는 일차 HBVP 보다 높은 혈관 주위 세포 특이적 마커의 순도를 나타낸다. (도 9d) 명시야 현미경 검사를 통한 iPSC 유도 MSC (P2), iPSC 유도 혈관 주위 세포 (P1) 및 ScienCell 일차 HBVP의 형태. (도 9e) 표현형 및 마커 발현을 기반으로 하는 PC1 및 PC2 혈관 주위 세포 서브타입 사이의 차이점을 기술하는 표. (도 9f) 혈관 주위 세포 서브타입 특이적 마커 CD274, VCAM1, 데스민, DLK1 및 αSMA 뿐만 아니라 일반적인 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ, NG2, CD13 및 CD146에 대해 해동 직후와 해동 후 5일에 iPSC 유도 혈관 주위 세포를 유동 세포 계측을 통해 염색하였다. iPSC 유도 혈관 주위 세포는 수축성 혈관 주위 세포, 서브타입 PC2의 시그니처를 나타낸다. (도 9g) 식세포 작용 검정에서 iPSC 유도 혈관 주위 세포의 IncuCyte 라이브 이미화 시스템 이미지. iPSC 유도 혈관 주위 세포는 대조군 수준 초과의 스태필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 생체 입자의 관찰 가능한 식세포 활성을 나타낸다. (A) iPSC 유도 혈관 주위 세포 단독 대조군. (B) iPSC 유도 혈관 주위 세포 + NucGreen Dead 488 (NG) 시약 대조군. (C) iPSC 유도 혈관 주위 세포 + 스태필로코커스 아우레우스 pHrodo Red 생체 입자 (BP). (D) iPSC 유도 혈관 주위 세포 + NucGreen Dead 488 시약 (NG) + 스태필로코커스 아우레우스 pHrodo Red 생체 입자 (BP). 세포 씨딩 후 36일 16 시간 시점에서 촬영된 모든 이미지. (도 9h) IncuCyte 소프트웨어에 의해 분석된 총 적색 물체 통합 강도를 통한 식세포 활성의 정량화.
도 10a~10g: 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)의 생성. (도 10a) 뇌 미세 혈관 내피 세포 생성의 개략도. (도 10b) ECRA 배지의 조성. (도 10c) Glut1/CD31의 공동 발현에 의한 BMEC의 유세포 계측 분석. (도 10d) 13 일차에 P 당단백질 (녹색) 발현을 갖는 BMEC의 면역 조직 화학 염색. 핵을 Hoechst3342로 염색하고, 이미지를 ImageXpress (Molecular Devices, LLC)에 의해 200X 배율로 캡처하였다. (도 10e) 플레이팅 후 수일에 걸쳐 TEER 값을 측정하는 BMEC의 기능적 특성화. (도 10f) 사전 조건화 단계 및 ECM을 사용하지 않는 하전된 표면 상의 플레이팅을 포함하는 대체 방법을 사용하여 뇌 미세 혈관 내피 세포를 생성하는 개략도. 하전된 표면 상에서 BMEC 생성을 유도하기 위한 변형 배지의 설명. (도 10g) 상이한 하전된 표면 상에서 분화하는 7 일차 분화 뇌 미세 혈관 내피 세포를 수확하고, CD31, p 당단백질 및 Glut-1 발현의 존재 및 만능성 마커 (TRA-181) 발현의 부재에 대해 염색에 의해 순도를 정량화하였다.
도 11: 3D 분화 과정을 사용한 HPC의 규모 확대 및 CD34 + 자성 비드를 사용한 후속 정제. CD34 자성 비드를 사용한 HPC의 규모 확대 및 분류에 대한 도식적 설명. 수동 및 CliniMACS 매개성 분리를 통한 분류 과정의 효율성이 예시되어 있다. 실행 당 HPC의 실제 순도 (분류된 분획 중 CD34 양성 세포의 백분율로 측정) 및 과정의 효율성이 개략적으로 서술되어 있다.
도 12: 미세 아교 세포 분화를 위한 배지 제형.
도 13a~13b: (도 13a) CD34+ 분류된 HPC로부터 미세 아교 세포의 유도에 대한 도식적 설명. HPC를 미세 아교 세포 분화 배지 (MDM)에 넣었다. 배양물에 48 시간 마다 MDM 또는 2X MDM을 공급하였다. 배양물을 분화 12 일차에 분할하고, 2D 분화를 23 일차까지 계속하였다. 상기 세포를 23 일차에 수확하고, 미세 아교 세포 배양물에 대한 순도 마커의 존재에 대해 염색하였다. 나머지 배양물을 냉동 보존하였다. 미세 아교 세포 배양물의 순도를 냉동 보존 전후에 정량화하였다. (도 13b) 미세 아교 세포 분화 배지 및 미세 아교 세포 분화 배지가 도시되어 있다.
도 14: 냉동 보존 전후의 MDM 배지 존재하의 미세 아교 세포 순도 평가. 분화 23 일차의 미세 아교 세포 배양물을 수확하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 나머지 세포를 제어 속도 냉동기를 사용하여 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 두 세트의 경우, 유세포 계측에 의한 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현 (도 14 좌측) 뿐만 아니라 CX3CR1 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현.
도 15의 A~C: 수동 대 제어 속도 냉동기를 사용한 냉동 보존 후 미세 아교 세포의 회수. HPC를 배지에 넣고 MDM의 존재하에 미세 아교 세포 분화를 개시하였다. 수동 동결 프로토콜 또는 제어 속도 냉동기 (control rate freezer: CRF)를 사용하여 상기 세포를 분화 20 일차 (도 15의 A), 23 일차 (도 15의 B) 및 26 일차 (도 15의 C)에 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포를 1 주일 동안 액체 질소로 옮겼다. 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 성숙 배지 (microglia maturation medium: MMM)에 넣었다. 48 시간 마다 새로운 성숙 배지를 배양물에 공급하였다. 상기 세포를 해동 후 3, 5, 7, 10, 12 및 14 일차에 수확하고, 초기 플레이팅 수에 대한 생존 세포의 회수를 정량화하였다.
도 16: HPC를 미세 아교 세포로 전환하는 효율. 냉동 보존된 HPC를 MDM (N=4)의 존재하에 미세 아교 세포로 분화시켰다. 입력 HPC 및 출력 미세 아교 세포의 총 생존 수를 정량화하였다. 미세 아교 세포 분화 23 일차에 존재하는 TREM2 양성 세포의 순도 및 절대 수를 입력 생존 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기반으로 과정 효율을 계산하였다.
도 17의 A~C: 해동시, 해동후 3 일 및 해동후 10 일에 수동으로 또는 제어 속도 냉동기의 존재하에 20 일차 (도 17의 A), 23 일차 (도 17의 B) 및 26 일차 (도 17의 C) 냉동 보존된 미세 아교 세포의 순도 분석. 20, 23 및 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 성숙 배지에서 3, 5, 7, 10 및 12일 동안 플레이팅하였다. 유세포 계측법에 의한 Pu1, IBA, CX3CR 및 P2RY12 발현의 존재에 대해 상기 세포를 염색하였다.
도 18의 A~B: 스태필로코커스 아우레우스 생체 입자에 의한 식세포 작용 검정을 설정하기 위한 해동 후 수동으로 또는 제어 속도 냉동기의 존재 하에 0 일차 (도 18의 A) 및 3 일차 (도 18의 B) 냉동 보존된 미세 아교 세포의 생존 수동 혈구계 세포 수.
도 19: 수동 또는 제어 속도 냉동기를 사용하여 분화 20 일차, 23 일차 및 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포의 기능적 특성화. 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지의 존재하에 96웰 플레이트 중에 15,000개 생존 세포/웰로 플레이팅하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo Red 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에서 촬영하였다. 제어 속도 냉동기 방법을 통해 냉동 보존된 세포는 (보다 높은 세포 생존력으로 인해) 보다 강력한 식세포 작용을 나타낸다. 수동 냉동 보존 방법은 (보다 낮은 세포 생존으로 인해) 모든 조건에서 식세포 작용의 감소/우측 이동된 속도를 나타냈다.
도 20: IncuCyte 시스템 상에서 라이브 이미징을 통해 평가된 살아있는 14 일차 미세 아교 세포 및 수동 또는 제어 속도 냉동기를 사용하여 분화 20 일차, 23 일차 및 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포의 기능적 특성화. 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 3일 동안 MMM에 플레이팅하였다. 3일의 종료시 생존 세포 수를 도 18의 B에 기재된 바와 같이 결정하였다. 15,000개의 생존 세포를 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지 (MMM)의 존재하에 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 상기 세포에 48 시간 마다 50 μl의 새로운 MMM 배지를 공급하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo Red 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 최대 5, 7 및 14일까지 다양한 시점에서 촬영하였다. 수동 냉동 보존 방법은 (보다 낮은 세포 생존으로 인해) 모든 조건에서 식세포 작용의 감소/우측 이동된 속도를 나타냈다.
도 21: 식세포 효율 비를 해동 후 샘플에서 식세포 적혈구 수를 총 세포 수의 수를 나누어 결정하였다.
도 22: pHrodo 아밀로이드 베타를 사용한 냉동 보존된 미세 아교 세포의 기능적 특성화. 23 일차에 냉동 보존된 세 아교 세포를 해동하고, 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지의 존재하에 96웰 플레이트 중에 15,000개 생존 세포/웰로 플레이팅하였다. 상기 세포를 pHrodo 아밀로이드 베타로 처리하였다. 대조군 세트는 어떠한 pHrodo 아밀로이드 베타도 없는 배지에 세포를 포함하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 최대 24 시간까지 다양한 시점에서 촬영하였다.
도 23의 A~B: ECM의 부재하에 스크리닝 적용 가능한 96웰 형식에서 미세 아교 세포로의 HPC 분화의 소형화. 미세 아교 세포로의 HPC 분화 (도 23의 A) 및 실험에서 사용된 다양한 하전된 표면의 도식적 표현. 초저 부착 (ultra-low attachment: ULA), 조직 배양 (Tissue Culture: TC) 및 비조직 배양 (Non-tissue culture: Non-TC) 용기 (도 23의 B).
도 24의 A~B: 다양한 하전된 표면의 존재하에 23 일차 미세 아교 세포의 최종 단계 순도 분석. 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 분화 배지의 존재하에 96웰 프리마리아 플레이트 또는 초저 부착, 조직 배양 (TC) 또는 비-조직 배양 (Non-TC) 플레이트 상에 냉동 보존된 HPC를 20,000~35,000개 생존 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 분화의 다음 23일 동안 매 48 시간 마다 웰 당 50 MDM의 MDM 배지를 상기 세포에 공급하였다. 23 일차에 차가운 PBS로 상기 세포를 수확하고, 자동화 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화하였다. 상기 세포를 CD11b, CD45, CD33, TREM2의 표면 발현 및 TREM2, IBA, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색하였다.
도 25a~25b: 냉동 보존된 미세 아교 세포에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인. 23 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 MDM 배지에 해동하고, 50,000개 세포/웰로 프리마리아 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 100 ng/ml LPS 및 50 ng/ml 인터페론 감마로 자극을 시작하기 전에 세포를 3일 동안 플레이팅하였다. 자극을 24 시간 동안 삼중복으로 수행하였다. 상청액을 회전시켜 세포와 잔해물 제거하고, 즉시 -20℃에 두었다. 상기 상청액을 다중 Luminex 검정에서 분석하였다. 다중 WT 배치의 평균 (도 25a)과 WT, 동형 접합 및 이형 접합 TREM2 녹아웃 (KO), MECP2 HM 및 A53T-SNCA 조작된 계통 (도 25b)이 도시되어 있다.
도 26: 동형 접합 및 이형 접합 TREM2 녹아웃 (KO), MECP2 및 A53T-SNCA 조작된 계통의 여러 배치로부터 유도된 냉동 보존된 미세 아교 세포를 세포내 마커 PU.1, IBA-1, CX3CR1, P2RY12 및 TMEM119 뿐만 아니라 CD11b, CD45, TREM2의 표면 발현의 존재에 대해 염색하였다. 조작된 iPSC 계통은 유세포 계측에 의해 TREM2의 유사한 발현을 나타냈다.
도 27a~27b: (도 27a) 야생형 (WT), 이형 접합 (HT) 및 동형 접합 (HO) TREM2 KO 조작된 iPSC로부터 유도된 냉동 보존된 미세 아교 세포에서 가용성 TREM2의 방출. 단순 단계 ELISA (AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형 접합 및 동형 접합 KO 돌연변이체의 조건 배지로부터 가용성 TREM2 (sTREM2)의 수준을 정량화하였다. WT 및 TREM2 KO 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트 중의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3 일차 및 해동 후 7 일차에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3일 및 5일에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다. (도 27b) 야생형 (WT), MECP2 HM 및 A53T-SNCA 조작된 iPSC로부터 유도된 냉동 보존된 미세 아교 세포에서 가용성 TREM2의 방출. Simple Step ELISA (AbCam)를 사용하여 WT, MECP2 HM 및 A53T-SNCA 조작된 계통의 조건 배지로부터 가용성 TREM2 (sTREM2)의 수준을 정량화하였다. 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트 중의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3일 및 해동 후 7일에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3일 및 5일에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다.
도 28: WT, HT 및 HO TREM2 KO 조작된 미세 아교 세포 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO의 생존 동력학을 연구하기 위한 배지 제형의 목록. 32개의 다양한 변형의 사이토카인 제형을 함유하는 미세 아교 세포 기본 배지 250 μl의 96웰 플레이트에 미세 아교 세포를 웰 당 15,000개의 생존 세포 밀도로 넣었다. 세포 생존의 동력학을 IncuCyte 시스템 상에서 캡처하였다. 2 방울/mL로 희석된 NucGreen Dead를 다양한 배지 조성으로 세포를 함유하는 모든 웰에 첨가하여 시간 경과에 따른 사멸 세포의 수를 캡처하였다. 이미지를 8 시간 마다 캡처하고, 실험을 어떠한 간헐적 공급도 없이 72 시간 동안 계속하였다.
도 29a~29c: WT (도 29a), 1185 HT TREM2 KO (도 29b), 1187 HO TREM2 KO (도 29c) 미세 아교 세포 생존 동력학.
도 30의 A~C: WT (도 30의 A), 1185 HT TREM2 KO (도 30의 B), 1187 HO TREM2 KO (도 30의 C) 2개의 사이토카인을 갖는 미세 아교 세포 생존 동력학.
도 31의 A~C: WT (도 31의 A), 1185 HT TREM2 KO (도 31의 B), 1187 HO TREM2 KO, (도 31의 C) 3개의 사이토카인을 갖는 미세 아교 세포 생존 동력학.
도 32의 A~C: WT (도 32의 A), 1185 HT TREM2 KO (도 32의 B), 1187 HO TREM2 KO (도 32의 C) 4개의 사이토카인을 갖는 미세 아교 세포 생존 동력학.
도 33의 A~E: WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포를, 250 μl의 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 A) 또는 MMM (도 33의 B) 또는 IL-34로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 32의 C) 또는 IL-34로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 D) 또는 MCSF로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 D) 또는 IL-34로만 보충된 기본 배지 (도 33의 C) 또는 MSCF, 또는 IL-34와 MCSF의 조합 (도 33의 E)의 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 세포의 밀도로 넣었다. 세포 생존의 동력학을 IncuCyte 시스템 상에서 캡처하였다. 2 방울/mL로 희석된 NucGreen Dead를 다양한 배지 조성으로 세포를 함유하는 모든 웰에 첨가하여 시간 경과에 따른 사멸 세포의 수를 캡처하였다. 이미지를 8 시간 마다 캡처하고, 실험을 어떠한 간헐적 공급도 없이 7일 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물 중의 사멸 세포를 정량화한다.
도 34a~34h: pHrodo Red 라벨링된 세균성 생체 입자 및 pHrodo Red 아밀로이드 베타로 23 일차에 냉동 보존된, WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포의 기능적 특성화. WT, 1185 HT TREM2KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포를, 250 μl의 MMM (도 34a~34b), 또는 MSCF만 (도 34c~34d) 또는 IL-34 (도 34e~34f) 또는 IL-34와 MCSF의 조합 (도 34g~34h)으로 보충된 MDM 기본 배지 (AKA 미세 아교 세포 기본 배지)의 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 세포/cm2의 밀도로 해동 후 3일 동안 플레이팅하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관) (도 34a, 34c, 34e, 34g) 또는 pHrodo 아밀로이드 베타 (도 34b, 34d, 34f, 34h)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 최대 30 시간까지 다양한 시점에서 촬영하였다. WT 및 조작된 미세 아교 세포는 해동 후 식세포 기능을 나타냈다. 동력학 및 식세포 작용 효율은 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포 사이에 다양하였다.
도 35: 단순화된 성숙 배지에서 미세 아교 세포 배양물의 순도. 성숙 배지에서 2개의 중요한 (IL-34, MSCF) 사이토카인의 조합으로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 또는 MMM의 존재하에 23 일차에 냉동 보존된 야생형 (WT) 미세 아교 세포의 해동 후 순도. 상기 세포를 수확하여 해동 후 3, 7 및 14 일차에 순도를 정량화하고, 상기 세포를 수확하고 유세포 계측에 의한 마커의 세포 표면 및 세포내 염색을 위해 상기 세포를 염색함으로써 분화 과정의 종료시에 CD45, CD33, TREM2, CD11b, CX3CR1, P2RY12, TMEM119, IBA의 순도를 결정하였다. 냉동 보존된 미세 아교 세포는 MSCF 및 IL-34로 보충된 성숙 배지에서 생존력, 순도를 유지한다. 이러한 단순화된 배지는 TREM 뇌 오르가노이드를 발달시키기 위한 뉴런 및 성상 교세포와 함께 냉동 보존된 미세 아교 세포의 공동 배양 적용에 가치있을 것이다.
도 36a~36b: (도 36a) 냉동 보존된 미세 아교 세포의 스크리닝 실험을 나타내는 개략도. (도 36b) 스크리닝에서 테스트된 화합물의 표.
도 37a~37d: GW501516 (도 37a), 류세틴 L41 (도 37b), 피세아타놀 (도 37c) 및 아젤리라곤 (도 37d)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 38a~38d: J147 (도 38a), 디부트릴-cAMP (도 38b), 이스라디핀 (도 38c) 및 벡사로텐 (도 38d)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 39a~39e: SB-431542 (도 39a), SP600125 (도 39b), GW2580 (도 39c), PP2 (도 39d) 및 SB239063 (도 39e)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 40a~40d: LPS 자극에 의한 GW501516 (도 40a), 류세틴 L41 (도 40b), 피세아타놀 (도 40c) 및 아젤리라곤 (도 40d)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 41a~41e: LPS 자극에 의한 J147 (도 41a), 디부트릴-cAMP (도 41b), 이스라디핀 (도 41c), 벡사로텐 (도 41d) 및 SB-43152 (도 41e)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 42a~42d: LPS 자극에 의한 SP600125 (도 41a), GW2580 (도 42b), PP2 (도 42c) 및 SB239063 (도 42d)의 미세 아교 세포 스크리닝 실험의 결과.
도 43: 미세 아교 세포 스크리닝 실험 결과의 요약.
도 44a~44g: (도 44a) ATP/BzATP 모든 흔적을 갖는 미세 아교 세포 - 비. (도 44b) ATP/BzATP 샘플 흔적을 갖는 미세 아교 세포 - 비. (도 44c) 미세 아교 세포에서 BzATP에 대한 반응. (도 44d) 미세 아교 세포에서 ADP에 대한 차등 반응. (도 44e) P2X7 길항제 AZ11645373의 존재하에 100 μM BzATP와의 반응. (도 44f) P2X7 길항제 A438079의 존재하에 100 μM BzATP와의 반응. (도 44g) AZD1283 (P2Y12 수용체의 강력한 길항제)의 존재하에 미세 아교 세포에서 기능적 ADP 의존적 반응을 입증하기 위한 용량 의존적 반응.
도 45a~45b: ANH 및 질병 관련 미세 아교 세포로부터 유래된 냉동 보존된 미세 아교 세포에서 가용성 TREM2의 방출을, 단순 단계 ELISA (AbCam)를 사용하여 해동 후 3 일차 (도 45a) 또는 7 일차 (도 45b)에 수집된 조건 배지로부터 정량화하였다. ANH 및 DAM 관련 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트 중의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3일 및 해동 후 7일에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3일 및 5일에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다.
도 46a~46j: ANH 및 iPSC 공여자 패널로부터 유래된 질병 관련 미세 아교 세포로부터 유도된 냉동 보존된 미세 아교 세포에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인. 23 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 MDM 배지에 해동하고, 50,000개 세포/웰로 프리마리아 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 100 ng/ml LPS 또는 IL-4 + dBu-cAMP로 자극을 시작하기 전에 세포를 3일 동안 플레이팅하였다. 자극을 24 시간 동안 삼중복으로 수행하였다. 상청액을 회전시켜 세포와 잔해물 제거하고, 즉시 -20℃에 두었다. 상기 상청액을 다중 Luminex 검정에서 분석하였다. LPS에 의한 자극시, M1 분석물 (도 46a), M2 분석물 (도 46b), 인터루킨 (도 46c), 케모카인 (도 46d) 및 기타 분석물 (도 46e)의 방출. IL-4 + dBu-cAMP에 의한 자극시, M1 분석물 (도 46f), M2 분석물 (도 46g), 인터루킨 (도 46h), 케모카인 (도 46i) 및 기타 분석물 (도 46j)의 방출.
도 47a~47j: pHrodo 라벨링된 스태필로코커스 아우레우스 생체 입자 및 아밀로이드 베타를 사용하는 AHN 및 질병 관련 미세 아교 세포의 식세포 기능의 입증: 냉동 보존된 AHN 및 질병 관련 미세 아교 세포를 384웰 폴리-D-라이신 플레이트의 웰 당 5,000개의 세포로 플레이팅하였다. 스태필로코커스 아우레우스 생체 입자를 0.5 μg/mL로 각 웰에 첨가하고, 아밀로이드 베타를 1 μM/웰로 첨가하였다. IncuCyte Live-Cell Analysis System을 사용하는 총 적색 물체 통합 강도를 사용하여 스태필로코커스 아우레우스 생체 입자 및 아밀로이드 베타의 식세포 작용의 동력학을 정량화하였다. (도 47a) (ANH, 스태필로코커스 아우레우스), (도 47b) (ANH, 아밀로이드 베타), (도 47c) (R47H 대 ANH, 스태필로코커스 아우레우스), (도 47d) (R47H 대 ANH, 아밀로이드 베타), (도 47e) (CD33 대 ANH, 스태필로코커스 아우레우스), (도 47f) (CD33 대 ANH, 아밀로이드 베타), (도 47g) (ABCA7 대 ANH, 스태필로코커스 아우레우스), (도 47h) (ABCA7 대 ANH, 아밀로이드 베타), (도 47i) (APOE 이소형 대 ANH, 스태필로코커스 아우레우스), (도 47j) (APOE 이소형 대 ANH, 아밀로이드 베타).
도 48a~48d: (도 48a) 이중 SMAD 억제를 사용하지 않고 iPSC로부터 신경 전구 세포 (NPC)를 생성하는 방법에 대한 도식적 설명. 관련된 다양한 단계와 사용된 배지의 구성이 설명되어 있다. (도 48b) 3개의 iPSC 계통에 걸친 NPC 출현의 동력학 요약. 분화 과정의 상이한 날에 다능성 마커의 감소 및 NPC 특이적 마커의 출현. 유세포 계측에 의해 세포 표면 염색 및 세포내 염색으로 수행된 순도의 정량화. (도 48c) 배양물의 여러 계대에 걸쳐 NPC로부터 유도된 성상 교세포에 대한 염색. 유세포 계측에 의해 세포 표면 및 세포내 염색으로 정량화된 성상 교세포의 순도. (도 48d) 세포내 유세포 계측에 의한 NPC의 뉴런으로의 분화 및 말기 뉴런의 순도 정량화.
도 49: iPSC 유도 세포 계통의 유도에 적합한 표면의 요약.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용은 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 및 조혈 전구 세포 (HPC)와 같은 다중 계통의 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 하전된 표면을 사용하여 iPSC를 다양한 계통 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 분화 방법은 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 부재하에 있을 수 있고 MSC 및 내피 세포의 생산과 같은 계대 배양에 의한 자가 정제를 가능하게 한다.
추가의 실시 형태에서, 내피 세포를 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC) 또는 림프관 내피 세포로 분화시키고 MSC를 혈관 주위 세포로 분화시키고 HPC를 미세 아교 세포로 분화시키는 방법이 재공된다. 상기 과정은 MACS 정제 또는 ECM 단백질 사용과 같은 정제 없이 내피 세포 및 MSC를 효율적으로 생성할 수 있게 한다. 상기 과정은 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)을 준수하도록 맞게 조정될 수 있다.
내피 세포는 혈관, 림프관 및 모세 혈관을 형성하는 인체 내의 상호 연결된 세포의 네트워크를 구성한다. 내피 세포는 영양소 물질의 흐름을 조절하고, 다양한 생물학적 활성 분자를 생성하고, 이에 반응하고, 혈관 독성, 혈관 투과성, 및 조직 허혈증의 치료 및 이식편의 생체 공학을 비롯한 치료학적 용도를 위한 화합물 및 약물을 스크리닝하기 위한 도구 공간에서의 잠재적인 용도를 제공한다. 내피 세포를 유도하는데 사용되는 다수의 프로토콜이 있다. 거의 모든 과정은 내피 세포의 순수한 배양을 생성하기 위해 CD31 마이크로비드를 사용하는 자성 활성화 세포 분류 (magnetic-activated cell sorting: MACS) 분리를 필요로 한다.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용은 2단계 과정에 의해 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC와 같은 iPSC로부터 순수한 내피 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. iPSC 세포는 양으로 하전된 아민 표면 상에서 조혈 선조 세포 (hemogenic progenitor cell: HPC)로 전환된 후 음으로 하전된 카복실 표면의 존재하에 내피 세포의 추가 증식 및 후속 정제를 겪을 수 있다. 상기 내피 세포는 어떠한 MACS 정제 단계도 없이 혈원성 (hemogenic) 내피 세포에 의해 유도될 수 있다. 상기 세포는 고순도로 CD31/CD144/CD105를 발현하며, 순도를 유지하기 위해 증식되고 초기 및 후기 계대에서 냉동 보존될 수 있다.
성체 사람 조직으로부터 단리된 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 시험관 내에서 증식하고 다능성을 유지할 수 있어 재생 의학을 위한 매력적인 세포 공급원이 된다. 그러나, 현재 준비 체제 하에서 자기 재생의 이용 가능성과 능력은 제한적이다. iPSC는 이제 MSC와 유사한 대체 세포 공급원을 제공한다. 따라서, 본 개시 내용의 특정 실시 형태는 GMP 양립 가능한 조건을 사용하여 양으로 하전된 아민 표면 상에서 중배엽 분화를 개시함으로써 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC와 같은 iPSC로부터 MSC를 분화시키는 방법을 제공한다. 이러한 과정에 의해 유도된 MSC는 MSC 계통에 대한 모든 순도 마커를 발현할 뿐만 아니라 자기 재생 및 다능성을 표시한다. 이러한 세포들은 임상 적용을 위해 규모 확대될 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 본 개시 내용은 MSC를 혈관 주위 세포 (PC)로 분화시키는 방법을 제공한다. 벽 세포로도 또한 공지된 혈관 주위 세포는 혈액 미세 혈관 (즉, 모세 혈관, 세동맥 및 세정맥)을 감싸며, 일반적으로 혈관 신생에서 조직적 또는 구조적 역할을 하는 것으로 이해된다. 위치, 형태, 유전자 또는 단백질 발현 패턴, 혈관 주변 밀도를 비롯한 여러 기준을 사용하여 미성숙 및 성숙 혈관 주위 세포를 식별한다. 일반적으로, 본 출원에서 제공된 방법에 따라 수득된 혈관 주위 세포는 PDGFRβ, 데스민 (DES), CD13 (ANPEP; 알라닐(막) 아미노펩티다아제), α-SMA, RGS5 (G-단백질 신호 전달 5의 조절 인자), NG2 (CSPG4로도 또한 공지됨; 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4), CD248 (엔도시알린), ANG-1, CD146, CD44, CD90 및 CD13 (이들에 한정되는 것은 아님)과 같은 공지된 혈관 주위 세포 분자 마커의 발현을 기반으로 식별될 수 있다.
미세 아교 세포는 뇌 발달, 항상성 및 면역 조절에 중요한 역할을 수행하는 중추 신경계의 선천성 면역 세포이다. 이들은 사람의 태아 및 일차 조직으로부터 획득하기 어렵다. 따라서, 본 개시 내용의 추가의 실시 형태는 한정 조건하에 에피솜적으로 재프로그래밍된 iCell HPC와 같은 HPC로부터 사람 iPSC 유도 미세 아교 세포 (iMGL)의 생성, 특성화 및 냉동 보존을 위한 방법을 제공한다. 냉동 보존된 iMGL은 순도를 유지하고 면역 조절 사이토카인 및 식세포 작용 pHrodo Red 라벨링된 세균 생체 입자 및 아밀로이드 베타 응집체를 분비한다. 본질적으로 무한한 양의 iMGL을 생성할 수 있는 능력은 정상 및 질병 상태에서 미세 아교 세포의 역할에 대한 사람 신경 과학 탐색을 가속화시킬 큰 가능성을 가지고 있다.
TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA에서 파괴를 갖는 미세 아교 세포가 본 출원에서 추가로 제공된다. 환자 유래 iPSC로부터 유도된 이러한 미세 아교 세포는 2D 또는 3D 오르가노이드 시스템에서 사람 미세 아교 세포, 뉴런, 성상 교세포 사이의 복잡한 상호 작용을 이해하고 신경 퇴행성 질환을 모방하는 보다 정확한 모델을 생성하는 시험관내 도구를 제공한다.
또한, SMAD 신호 전달의 억제 없이 iPSC를 신경 전구 세포 (NPC)로 분화시키는 방법이 본 출원에서 제공된다. 이러한 NPC는 iPSC 유도 미세 아교 세포와 공동 배양되어 정상 및/또는 질병 특이적 iPSC 세포로부터 유래된 접시에서 사람의 뇌 발달과 신경 계통, 미세 아교 세포, 내피 세포, 혈관 주위 세포 및 성상 교세포 사이의 복잡한 세포간 상호 작용을 모방하는 장기 공동 배양 검정을 생성할 수 있다. 상기 iPSC는 NPC를 생성하기 위한 분화의 개시 전에 저산소 조건하에 유지될 수 있다. 신경 전구체 분화를 개시하기 위해, iPSC는 ECM 코팅된 표면 상에 ROCK 억제제 또는 블레비스타틴의 존재하에 씨딩될 수 있다. 상기 세포는 ROCK 억제제의 부재하에 다음 48 시간 동안 배지에 놓여질 수 있다. 다음으로, 상기 세포는 정상 산소 조건하에 배지를 매일 교체하면서 72 시간 동안 GSK3 억제제로 보충된 DMEMF12 배지에서 사전 조건화된다. 세포를 사전 조건화 단계의 종료시에 수확하고, ROCK 억제제 또는 블레비스타틴의 존재하에 초저 부착 플레이트 또는 스피너 플라스크를 사용하여 ECM 코팅된 플레이트 상에서 2D 형식으로 또는 3D 응집체로서 다시 플레이팅할 수 있다. 배양물은 NPC를 생성하는 정상 산소 조건하에 다음 8일 동안 N2로 보충된 E6 배지를 격일로 공급받을 수 있다. NPC의 생성과 관련된 다양한 단계는 도 45a에 요약되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학에 사용될 수 있다. 뇌 오르가노이드 또는 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier: BBB) 모델의 생산을 위해 본 발명의 세포 (예를 들어, MSC, 내피 세포, 신경 전구 세포 및 혈관 주위 세포)를 사용하는 방법이 또한 본 출원에서 제공된다.
I. 정의
본 출원의 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원의 청구항(들)에서 사용되는 "한" 또는 "하나"라는 단어는, "~을 포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 명백하게 대안만을 지칭하는 것으로 명시되지 않거나, 본 개시 내용이 대안만 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있다고 하더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
"본질적으로"라는 용어는 방법 또는 조성물이 명시된 단계 또는 물질과 이러한 방법 및 조성물의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들만을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 특정 물질 또는 재료가 "실질적으로 없는" 조성물 또는 배지는 상기 물질 또는 재료를 ≤ 30%, ≤ 20%, ≤ 15%, 보다 바람직하게는 ≤ 10%, 보다 더 바람직하게는 ≤ 5%, 가장 바람직하게는 ≤ 1% 함유한다.
본 출원에서 사용되는 "실질적으로" 또는 "대략"이라는 용어는 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않고 허용 가능하게 변할 수 있는 임의의 양적 비교, 값, 측정 또는 기타 표현을 수정하는데 적용될 수 있다.
"약"이라는 용어는 일반적으로 명시된 값을 측정하기 위해 표준 분석 기법을 사용하여 결정될 때 명시된 값의 표준 편차 이내를 의미한다. 상기 용어는 또한 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
특정 구성 요소와 관련하여, 본 출원에서 사용되는 "본질적으로 없는"은, 특정 구성 요소가 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서만 또는 미량으로만 존재하는 것을 의미하는 것으로 본 출원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 인해 생성된 특정 구성 요소의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 구성 요소의 양을 표준 분석 방법으로 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
"무피더" 또는 "피더 독립적인"은 본 출원에서 피더 세포 층에 대한 대체물로서 사이토카인 및 성장 인자 (예를 들어, TGFβ, bFGF, LIF)로 보충된 배양물을 지칭하는데 사용된다. 따라서, "무피더" 또는 피더 독립적인 배양 시스템 및 배지는 만능 세포를 배양하여 미분화 및 증식 상태로 유지하는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 무피더 배양물은 동물계 매트릭스 (예를 들어, MATRIGEL™)를 이용하거나, 또는 피브로넥틴, 콜라겐 또는 비트로넥틴과 같은 기질 상에서 성장한다. 이러한 접근법들은 사람 줄기 세포가 마우스 섬유 아세포 "피더 층"에 대한 필요 없이 본질적으로 미분화 상태로 남아 있도록 해준다.
"피더 층"은 본 출원에서 배양 접시의 바닥 상에서와 같은 세포의 코팅층으로서 정의된다. 상기 피더 세포는 배양 배지로 영양분을 방출하여 만능 줄기 세포와 같은 다른 세포가 부착할 수 있는 표면을 제공할 수 있다.
배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건과 관련하여 사용될 때의 "한정된" 또는 "완전 한정된" 이라는 용어는 거의 모든 성분들의 화학 조성과 양이 공지된 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건을 지칭한다. 예를 들어, 한정 배지는 소태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 사람 혈청 알부민에서와 같이 한정되지 않은 인자들을 함유하지 않는다. 일반적으로, 한정 배지는 재조합 알부민, 화학적으로 한정된 지질 및 재조합 인슐린으로 보충된 기본 배지 (예를 들어, 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium: DMEM), F12, 또는 아미노산, 비타민, 무기염, 완충제, 항산화제 및 에너지원을 함유하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배지 1640)를 포함한다. 완전 한정 배지의 예는 Essential 8™ 배지이다.
사람 세포와 함께 사용되는 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 시스템의 경우, "무이종 (Xeno-Free: XF)"라는 용어는 사용되는 재료가 비사람 동물 유래가 아닌 조건을 지칭한다.
"치료" 또는 "치료하는"은, (1) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 억제하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상의 추가 진행을 저지하는 것), (2) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 개선하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 임의의 측정 가능한 감소를 달성하는 것을 포함한다.
"예방적으로 치료하는"은, (1) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 발병 위험을 감소 또는 경감시키는 것, 및/또는 (2) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 병리 또는 증상의 발병을 지연시키는 것을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "환자" 또는 "대상체"라는 용어는 살아있는 포유 동물 유기체, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니피그 또는 이들의 형질 전환 종을 의미한다. 특정 실시 형태에서, 상기 환자 또는 대상체는 영장류이다. 사람 환자의 비제한적인 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.
해당 용어가 명세서 및/또는 청구항에서 사용되는 용어 "효과적인"은 원하거나 예상되거나 의도된 결과를 달성하기에 적절한 것을 의미한다. 환자 또는 대상체를 화합물로 치료하는 맥락에서 사용될 때의 "유효량", "치료적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 질환을 치료 또는 예방하기 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 상기 질환에 대한 치료 또는 예방을 달성하기에 충분한 양인 화합물의 양을 의미한다.
본 출원에서 일반적으로 사용되는 "약제학적으로 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비에 적합하고, 사람 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭한다.
"유도 만능 줄기 세포 (iPSC)"는 인자들 (본 출원에서는 재프로그래밍 인자로서 지칭함)의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생산된 세포이다. iPSC는 태아, 출산후, 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 이용하여 생산될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4 (종종 Oct 3/4로서 언급), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
"세포외 매트릭스 단백질"이라는 용어는 주변 세포에 구조적 및 생화학적 지지체를 제공하는 분자를 의미한다. 상기 세포외 매트릭스 단백질은 재조합일 수 있으며, 또한 이의 단편 또는 펩타이드를 지칭한다. 예로는 콜라겐 및 황산 헤파린이 포함된다.
"3차원 (3D) 배양"은 생물학적 세포가 3차원 모두에서 성장하거나 주위와 상호 작용하도록 허용되는 인공적으로 생성된 환경을 지칭한다. 상기 3D 배양은 생물 반응기, 세포가 회전 타원체로 성장할 수 있는 작은 캡슐, 또는 비-부착성 배양 플레이트와 같은 다양한 세포 배양 용기에서 성장될 수 있다. 특별한 양태에서, 상기 3D 배양은 스캐폴드가 없다. 대조적으로, "2차원 (2D)" 배양은 부착 표면 상의 단층과 같은 세포 배양을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 유전자의 "파괴"는, 파괴의 부재하의 유전자 산물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상 유전자에 의해 암호화되는 1종 이상의 유전자 산물의 발현의 제거 또는 감소를 지칭한다. 예시적인 유전자 산물은 mRNA 및 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 산물을 포함한다. 일부 경우에서의 파괴는 일시적 또는 가역적이고, 다른 경우에서는 영구적이다. 일부 경우에서의 파괴는, 절단된 또는 비-기능적 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고, 기능적 또는 전장 단백질 또는 mRNA를 생산한다. 본 출원의 일부 실시 형태에서, 유전자 활성 또는 기능은, 발현과 대조적으로, 파괴된다. 유전자 파괴는 일반적으로 인위적인 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합물 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 DNA 수준에서와 같은 유전자의 핵산 또는 유전자와 관련된 핵산의 파괴에 의해 유도된다. 유전자 과괴를 위한 예시적인 방법으로는 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예를 들어, 유전자 편집이 포함된다. 이의 예로는 일반적으로 발현의 일시적 감소를 초래하는 RNAi, siRNA, shRNA 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술 뿐만 아니라, 예를 들어, 파쇄의 유도 및/또는 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 초래하는 유전자 편집 기술이 포함된다. 이의 예로는 삽입, 돌연변이 및 결실이 포함된다. 파괴는 전형적으로 유전자에 의해 암호화되는 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 억제 및/또는 완전 부재를 초래한다. 예시적인 이러한 유전자 파괴는 전체 유전자의 결실을 비롯하여 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임 이동 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹인 (knock-in), 녹아웃이다. 이러한 파괴는 암호화 영역에서, 예를 들어, 1종 이상의 엑손에서 일어날 수 있으며, 예를 들어, 정지 코돈의 삽입에 의해 전장 산물, 기능성 산물, 또는 임의의 산물의 생성 불능을 초래한다. 이러한 파괴는 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해서 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있다. 유전자 파괴에는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 비롯하여 유전자 표적화가 포함된다.
II. iPSC 분화 방법
A. HPC
상기 iPSC는 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 8,372,642에 기재된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 HPC로 분화될 수 있다. 하나의 방법에서, BMP-4, VEGF, Flt-3 리간드, IL-3 및 GM-CSF의 조합을 사용하여 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시 형태에서, 분화용 iPSC를 제조하기 위한 제1 배지, BMP-4, VEGF 및 FGF를 포함하는 제2 배지에 배양 세포 배양물을 연속적으로 노출시킨 후 Flt-3 리간드, SCF, TPO, IL-3 및 IL-6을 포함하는 제3 배지에서 배양시키면 만능 세포를 HPC 및 조혈 세포로 분화시킬 수 있다. 제2 한정 배지는 또한 헤파린을 포함할 수도 있다. 또한, BMP-4 및 VEGF를 함유하는 배지 중에 FGF-2 (50 ng/ml)를 포함시키면 만능 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하는 효율을 증진시킬 수 있다. 또한, 제1 한정 배지 중에 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제 (예를 들어, CHIR99021, BIO 및 SB-216763)를 포함시키면 HPC의 생산을 추가로 증진시킬 수 있다.
일반적으로, 만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화는 한정 또는 비한정 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 한정 조건은 생산되는 세포를 사람 대상체에 투여하도록 의도되는 실시 형태에서 일반적으로 바람직할 것이다. 조혈 줄기 세포는 한정 조건 (예를 들어, TeSR 배지 사용)하에 만능 줄기 세포로부터 유도될 수 있으며, 조혈 세포는 만능 세포로부터 유도된 배상체로부터 생산될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 만능 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유 아세포 상에서 공동 배양된 후 분화될 수 있다.
만능 세포는 분화 과정의 일부로서 배상체 또는 응집체를 형성하도록 허용될 수 있다. 분화를 유도하기 위한 "배상체" (EB) 또는 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 사람 만능 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 수반하며, 사람 만능 줄기 세포가 내배엽, 외배엽 및 중배엽를 나타내는 다수의 조직 유형으로 자발적이고 무작위적으로 분화하도록 허용한다. 따라서, 3차원 EB는 일부 분획의 조혈 세포 및 내피 세포를 생산하는데 사용될 수 있다.
응집체 형성을 촉진하기 위해, RA 보충 없이 0.05% N2 및 1% B-27, 200 mM의 1-글루타민, 0.05 mg/ml의 아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 염 (Asc 2-P) (WAKO) 및 4.5×10-4 MTG로 보충된 25% 햄의 변형 F12 (Cellgro) 및 75% IMDM (Gibco)으로 이루어진 무혈청 분화 (SFD) 배지 중에서 밤새 항온처리하기 위해 세포들을 저부착 플레이트로 옮길 수 있다. 다음날, 세포들을 각 웰로부터 수거하여 원심분리시킬 수 있다. 이어서, 세포들을 분화의 처음 4일 동안 약 50 ng/ml의 골 형성 인자 (BMP4), 약 50 ng/ml의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 50 ng/ml의 zb FGF로 보충된 SFD 기본 배지로 이루어진 "EB 분화 배지" 중에 재현탁시켰다. 분화 5 일차에, 배지를 50 ng/ml 줄기 세포 인자 (SCF), 약 50 ng/ml의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/ml의 인터루킨-6 (IL-6), 50 ng/ml의 인터루킨-3 (IL-3), 50 ng/ml의 트롬보포이에틴 (TPO)이 보충된 SFD 배지를 포함하는 제2 배지로 대체한다. 상기 세포들은 새로운 분화 배지에 의해 48 시간 간격으로 절반을 공급받는다. 배지의 변경은 5분 동안 300 g로 분화 배양물의 회전 속도를 감속시키고, 상기 분화 배지의 부피의 절반을 흡인시키고, 이를 새로운 배지로 보충함으로써 수행된다. 특정 실시 형태에서, EB 분화 배지는 약 BMP-4 (예를 들어, 약 50 ng/ml), VEGF (예를 들어, 약 50 ng/ml) 및 임의로 FGF-2 (예를 들어, 약 25~75 ng/ml 또는 약 50 ng/ml)를 포함할 수 있다. 상청액을 흡인시키고 새로운 분화 배지로 대체시킬 수 있다. 대안으로, 세포들은 새로운 배지로 2일 간격으로 절반을 공급받을 수 있다. 세포들을 분화 과정 동안 상이한 시점에서 수거할 수 있다.
조혈 전구 세포는 한정 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다. 한정 배지를 사용하여 만능 세포를 조혈 CD34+ 줄기 세포로 분화시키는 방법은, 예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 출원 US 12/715,136호에 기재되어 있다. 이러한 방법들은 본 개시 내용과 함께 사용될 수 있을 것이다.
예를 들어, 한정 배지는 조혈 CD34+ 분화를 유도하는데 사용될 수 있다. 한정 배지는 성장 인자 BMP4, VEGF, Flt-3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 만능 세포는 BMP-4, VEGF 및 임의로 FGF-2를 포함하는 제1 한정 배지 중에서 배양된 후, (Flt-3 리간드, IL-3 및 GMCSF) 또는 (Flt-3 리간드, IL-3, IL-6 및 TPO)를 포함하는 제2 배지 중에서 배양될 수 있다. 제1 및 제2 배지는 또한 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2 및/또는 TPO 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 실질적으로, 저산소 조건 (예를 들어, 20% 미만의 O2)은 조혈 또는 내피 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다.
세포들은 기계적 또는 효소적 수단을 통해 (예를 들어, 트립신 또는 TrypLETM을 사용하여) 실질적으로 개별화될 수 있다. ROCK 억제제 (예를 들어, H1152 또는 Y-27632)도 또한 배지 중에 포함될 수 있다. 이러한 접근법들은, 예를 들어, 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있는 것으로 기대된다.
특정 실시 형태에서, 실질적인 저산소 조건은 만능 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자가 인식하고 있는 바와 같이, 약 20.8% 미만의 대기 산소 함량은 저산소인 것으로 간주될 것이다. 배양물 중 사람 세포는 주위 공기와 비교하여 산소 함량이 감소된 대기 조건에서 성장할 수 있다. 이러한 상대적인 저산소 상태는 배양 배지에 노출된 대기 산소를 감소시켜 달성될 수 있다. 배아 세포는 전형적으로 산소 감소 조건, 일반적으로 약 1% 내지 약 6%의 대기 산소 및 주위 수준의 이산화탄소 하에 생체내에서 발달한다. 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 저산소 조건은 특정 배아의 발달 조건의 양태를 모방할 수 있을 것으로 기대된다. 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이, 저산소 조건은 특정 실시 형태에서 사용되어 유도 만능 세포가 HPC와 같은 보다 분화된 세포 유형으로 추가로 분화하는 것을 촉진시킬 수 있다.
하기 저산소 조건은 만능 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시 형태에서, 저산소 대기는 약 5%의 산소 기체를 포함한다.
임의의 주어진 조혈 선조세포 확장에 사용되는 특정 배지와 무관하게, 사용되는 배지는 바람직하게는 약 0.1 ng/ml 내지 약 500 ng/mL, 보다 통상적으로는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml의 농도의 1종 이상의 사이토카인으로 보충된다. 적절한 사이토카인으로는 c-kit 리간드 (KL) (스틸 인자 (StI), 비만 세포 성장 인자 (MGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로도 또한 호칭됨), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11, MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO 및 flk2/flk3 리간드 (Flt2L 또는 Flt-3L)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특히, 배양물은 SCF, Flt-3L 및 TPO 중 적어도 1종을 포함할 것이다. 보다 구체적으로는, 배양물은 SCF, Flt-3L 및 TPO를 포함할 것이다.
하나의 실시 형태에서, 사이토카인은 배지 중에 함유되고, 배지 관류에 의해 보충된다. 대안으로, 생물반응기 시스템이 사용되는 경우, 사이토카인은 배지 관류를 하지 않고 별도의 유입구 포트를 통해 농축액으로서 별도로 첨가될 수 있다. 사이토카인이 관류하지 않고 첨가되는 경우, 이들은 전형적으로 생물반응기 내의 부피의 1/10 내지 1/100과 동일한 양의 10× 내지 100× 용액으로 첨가될 것이며, 새로운 사이토카인은 대략 2 내지 4일 간격으로 첨가된다. 또한, 새로운 농축 사이토카인도 또한 관류된 배지 중의 사이토카인에 추가하여 별도로 첨가될 수 있다.
예시적인 HPC 분화 방법
2D HPC 분화: iPSC는 E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지될 수 있으며, 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응될 수 있다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴으로 보충된 무혈청 한정 (Serum Free Defined: SFD) 배지의 존재하에 0.25 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅한다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가한다. 다음 날, 새로운 배지를 교환하여 블레비스타틴을 제거한다. 분화 과정의 5 일차에, 상기 세포를 5 U/ml의 헤파린과 함께 50 ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 넣는다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급한다. 전체 과정을 저산소 조건하에 하전된 아민 플레이트 상에서 수행한다. HPC를 CD43/CD34 세포 및 CFU의 존재에 의해 정량화한다.
3D HPC 분화: 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 μM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152로 보충된 무혈청 한정 (SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5 백만개의 세포/ml의 밀도로 스피너 플라스크에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 교환하였다. 분화 과정의 5 일차에, 상기 세포를 5~10 U/ml의 헤파린과 함께 50 ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 넣었다. 상기 세포들은 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 공급받았다. 전체 과정은 저산소 조건하에 수행되었다. HPC는 CD43/CD34의 존재에 의해 정량화되었다. HPC는 CD34 비드를 사용하여 분류된 MACS이다.
B. 유전자 파괴
특정 양태에서, TREM2, MeCP2 및/또는 SCNA 유전자 발현, 활성 또는 기능은 PSC (예를 들어, ESC 또는 iPSC)와 같은 세포에서 파괴된다. 일부 실시 형태에서, 상기 유전자 파괴는 유전자의 파괴, 예를 들어, 녹아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임 이동 돌연변이, 예를 들어, 이중 대립 유전자 프레임 이동 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 예를 들어, 하나 이상의 엑손 또는 부분, 및/또는 녹인에 영향을 미침으로써 수행된다. 예를 들어, 상기 파괴는 DNA 결합 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 아연 집게 뉴클레아제 (zinc finger nuclease: ZFN) 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 및 RNA 가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, 유전자 또는 이의 일부의 서열을 표적화하도록 특별히 설계된 CRISPR 관련 뉴클레아제 (CRISPR-associated nuclease: Cas)를 비롯한 서열 특이적 또는 화적화된 뉴클레아제에 의해 영향을 받을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 파괴는 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 일부 양태에서, 상기 유전자는 이의 발현이 유전자 파괴의 부재 또는 파괴에 영향을 미치도록 도입된 성분의 부재하의 발현과 비교하여 적어도 약 20, 30 또는 40%, 일반적으로는 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%까지 감소되도록 파괴된다.
일부 실시 형태에서, 상기 변경은 일시적이거나 가역적이어서 유전자의 발현이 나중에 회복된다. 다른 실시 형태에서, 상기 파괴는 가역적이거나 일시적이지 않으며, 예를 들어, 영구적이다.
일부 실시 형태에서, 유전자 파괴는 전형적으로 표적화 방식으로 유전자에서 하나 이상의 이중 가닥 파손 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파손의 유도에 의해 수행된다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 뉴클레아제, 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 유전자 표적화된 뉴클레아제에 의해 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 파손은 유전자의 코딩 영역, 예를 들어, 엑손에서 유도된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 유도는 코딩 영역의 N-말단 부분 근처에서, 제1 엑손에서, 제2 엑손에서, 또는 후속 엑손에서 일어난다.
일부 양태에서, 상기 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 비-상동 말단 접합 (non-homologous end-joining: NHEJ) 또는 상동성 지정 복구 (homology-directed repair: HDR)와 같은 세포 복구 과정을 통해 복구된다. 일부 양태에서, 상기 복구 과정은 오류가 발생하기 쉬우며, 유전자의 완전한 녹아웃을 초래할 수 있는 프레임 이동 돌연변이, 예를 들어, 이중 대립 유전자 프레임 이동 돌연변이와 같은 유전자의 파괴를 초래한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 파괴는 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 유도하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 파괴는 조기 정지 코돈의 존재를 초래한다. 일부 양태에서, 삽입, 결실, 전위, 프레임 이동 돌연변이 및/또는 조기 정지 코돈의 존재는 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 붕괴를 초래한다.
일부 실시 형태에서, 유전자 파괴는 안티센스 기법을 사용하여, 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 (shRNA), 및/또는 리보자임을 사용하여 유전자의 발현을 선택적으로 억제하거나 진압함으로써 달성된다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상동인 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 사용하는 RNAi 기술이다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사된 mRNA의 한 영역과 상동/상보적이거나, 상이한 영역과 상동/상보적인 복수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 양태에서, siRNA는 폴리시스트론성 작제물에 포함된다. 특별한 양태에서, 상기 siRNA는 내인성 mRNA로부터 야생형 및 돌연변이 단백질 번역 둘 다를 억제한다.
일부 실시 형태에서, 상기 파괴는 유전자에 특이적으로 결합하거나 이와 하이브리드화하는 DNA 표적화 분자, 예를 들어, DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산, 또는 이를 함유하는 복합체, 화합물 또는 조성물을 사용하여 달성된다 . 일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 DNA 결합 도메인, 예를 들어, 아연 집게 단백질 (zinc finger protein: ZFP) DNA 결합 도메인, 전사 활성 인자 유사 단백질 (transcription activator-like protein: TAL) 또는 TAL 이펙터 (TAL effector: TALE) DNA 결합 도메인, 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) DNA 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 아편 집게, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은, 예를 들어, 자연 발생 아연 집게 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 집게 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,140,081; US 6,453,242; 및 US 6,534,261을 참조하고; 국제공개공보 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; 및 WO 03/016496, 및 미국 출원공개 US 2011/0301073을 또한 참조한다.
일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자, 복합체 또는 조합은 DNA 결합 분자 및 유전자의 억제 또는 파괴를 용이하게 하는 이펙터 도메인과 같은 하나 이상의 추가의 도메인을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 유전자 파괴는 DNA 결합 단백질 및 이종 조절 도메인 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다. 일부 양태에서, 도메인은, 예를 들어, 전사 인자 도메인, 예를 들어, 활성화제, 리프레서, 공동 활성화제, 공동 리프레서, 사일런서, 종양 유전자, DNA 복구 효소 및 이의 관련 인자 및 변경 유전자, DNA 재배열 효소 및 이의 관련 인자 및 변경 유전자, 염색질 관련 단백질 및 이의 변경 유전자, 예를 들어, 키나아제, 아세틸라아제 및 데아세틸라아제, 및 DNA 변형 효소, 예를 들어. 메틸트랜스퍼라아제, 토포아이소머라아제, 헬리카아제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 이들의 관련 인자 및 변경 유전자를 포함한다. 예를 들어, DNA 결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 세부 사항에 대해 미국 출원공개 US 2005/0064474; US 2006/0188987; 및 US 2007/0218528 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 일부 양태에서, 상기 추가의 도메인은 뉴클레아제 도메인이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 유전자 파괴는 뉴클레아제와 같은 비특이적 DNA 절단 분자에 융합되거나 이와 복합체화된 서열 특이적 DNA 결합 도메인으로 구성된 뉴클레아제 및 뉴클레아제 함유 복합체 또는 융합 단백질과 같은 조작된 단백질을 사용하여 유전자 또는 게놈 편집에 의해 용이하게 실시된다.
일부 양태에서, 이러한 표적화된 키메라 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 함유 복합체는 표적화된 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 유도하여 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 말단 연결 (nonhomologous end joining: NHEJ) 및 상동성 유도 복구 (homology-directed repair: HDR)를 비롯한 세포성 DNA 복구 기전을 자극함으로써 정확한 유전자 변형을 수행한다. 일부 실시 형태에서, 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN), TALE 뉴클레아제 (TALEN), 및 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease: RGEN), 예를 들어, CRISPR 관련 (CRISPR-associated: Cas) 단백질 또는 메가뉴클레아제이다.
일부 실시 형태에서, 공여자 핵산, 예를 들어, 유전자 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 공여자 플라스미드 또는 핵산을 제공하고, DSB의 도입 후 유전자 편집 부위에서 HDR에 의해 삽입한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 유전자의 파괴와 항원 수용체, 예를 들어, CAR의 도입을 동시에 수행하여, 유전자를 유전자 CAR 인코딩 핵산의 녹인 또는 삽입에 의해 부분적으로 파괴한다.
일부 실시 형태에서, 어떠한 공여자 핵산도 제공되지 않는다. 일부 양태에서, DSB의 도입 후 NHEJ 매개성 복구는, 예를 들어, 미스센스 돌연변이 또는 프레임 이동을 생성함으로써 유전자 파괴를 유발할 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이를 초래한다.
1. ZFP 및 ZFN
일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된 DNA 결합 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 아연 집게 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화제 유사 단백질 (TAL)을 포함한다. 예로는 ZFN, TALE 및 TALEN이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 아연 집게 단백질 (ZFP) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 아연 집게를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 거대 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다. 아연 집게 DNA 결합 단백질이라는 용어는 종종 아연 집게 단백질 또는 ZFP로 축약된다. ZFP 중에서, 개별 집게의 조립에 의해 생성된 전형적으로 9~18개 뉴클레오타이드 길이의 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다.
ZFP로는, 단일 집게 도메인이 약 30개 아미노산 길이이고 단일 베타 회전의 2개의 시스테인과 함께 아연을 통해 배위 결합된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6개의 집게를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들이 포함된다. 일반적으로, ZFP의 서열 특이성은 아연 집게 인식 나선 상의 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 ZFP 또는 ZFP 함유 분자는 자연 발생적이 아니며, 예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 양태에서, MeCP2의 파괴는 유전자의 제1 표적 부위를 제1 ZFP와 접촉시켜 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 일부 실시 형태에서, 상기 유전자의 표적 부위는 6개의 집게 및 조절 도메인을 포함하는 융합 ZFP와 접촉되어 유전자의 발현을 억제한다.
일부 실시 형태에서, 상기 접촉 단계는 상기 유전자 내의 제2 표적 부위를 제2 ZFP와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 및 제2 표적 부위는 인접한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 ZFP는 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 상기 제1 ZFP는 조절 도메인 또는 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 ZFP는 융합 단백질이며, 각각은 조절 도메인을 포함하거나 각각은 적어도 2개의 조절 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조절 도메인은 전사 리프레서, 전사 활성화제, 엔도뉴클레아제, 메틸 트랜스퍼라아제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 또는 히스톤 데아세틸라아제이다.
일부 실시 형태에서, 상기 ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 핵산을 지질:핵산 복합체로 또는 네이키드 핵산으로 세포에 먼저 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 실시 형태에서, 상기 ZFP는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, 상기 ZFP는 약한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 업스트림이다. 일부 양태에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접한다. 일부 양태에서, 상기 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 다운스트림의 RNA 폴리머라아제 정지 부위에 인접한다.
일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 아연 집게 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있는 적어도 하나의 liS형 제한 효소 및 하나 이상의 아연 집게 결합 도메인 유래의 절단 도메인 (또는 절단 도메인 절반)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 절단 도메인은 liS형 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터 유래한다. Fok I은 일반적으로 한 가닥 상의 이의 인식 부위 유래의 9개 뉴클레오타이드 및 다른 가닥 상의 이의 인식 부위 유래의 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다.
일부 실시 형태에서, ZFN은 조작된 세포에 존재하는 유전자를 표적화한다. 일부 양태에서, 상기 ZFN은, 예를 들어, 유전자의 코딩 영역 내의 예정된 부위에서 이중 가닥 파손 (double strand break: DSB)을 효율적으로 생성한다. 대표적인 표적화된 영역은 엑손, N 말단 영역을 인코딩하는 영역, 제1 엑손, 제2 엑손, 및 프로모터 또는 인핸서 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 ZFN의 일시적인 발현은 조작된 세포에서 표적 유전자의 매우 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진한다. 특히, 일부 실시 형태에서, 상기 ZFN의 전달은 50%를 초과하는 효율로 유전자의 영구적인 파괴를 초래한다.
많은 유전자 특이적인 조작된 아연 집게는 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와의 협력으로 아연 집게 작제를 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여 연구자들이 아연 집게 작제 및 검증을 전체적으로 우회할 수 있도록 하며, 수천 개의 단백질에 대해 구체적으로 표적화된 아연 집게를 제공한다 (문헌 [Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]). 일부 실시 형태에서, 상업적으로 이용 가능한 아연 집게를 사용하거나 맞춤 설계한다.
2. TAL, TALE 및 TALEN
일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 전사 활성화제 유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질에서와 같이 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) 전사 활성제 유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을 포함하며, 예를 들어, 미국 출원공개 US 2011/0301073 (그 전문이 본 출원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 상기 반복 도메인은 동족 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" ("반복"으로도 또한 지칭됨)는 전형적으로 33~35개 아미노산 길이이며, 자연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 TALE 반복 단위는 전형적으로 반복의 위치 12 및/또는 13에서 반복 가변 잔기 (RVD)를 구성하는 1 또는 2개의 DNA 결합 잔기를 포함한다. 이러한 TALE의 DNA 인식을 위한 자연 (표준) 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 사이토신 (C)에 결합하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A에 결합하고, NN이 G 또는 A에 결합하고, NO가 T에 결합하고, 비정규 (비정형) RVD가 또한 공지되어 있도록 결정되었다. 미국 출원공개 US 2011/0301073을 참조한다. 일부 실시 형태에서, TALE는 표적 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 어레이의 설계에 의해 임의의 유전자에 표적화될 수 있다. 상기 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
일부 실시 형태에서, 상기 분자는 TALE 뉴클레아제 (TALEN)와 같은 DNA 결합 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, 상기 TALEN은 TALE로부터 유래된 DNA 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시 형태에서, TALEN은 유전자에서 표적 서열을 인식하고 절단한다. 일부 양태에서, DNA의 절단은 이중 가닥 파손을 초래한다. 일부 양태에서, 상기 파손은 상동 재조합 또는 비-상동 말단 접합 (NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열의 변화를 초래하는 불완전한 복구 과정이다. 일부 양태에서, 복구 메커니즘은 직접 재연결 (문헌 [Critchlow and Jackson, 1998])을 통해 또는 소위 마이크로상동성 매개 말단 연결을 통해 2개의 DNA 말단 중 남은 것의 재결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, NHEJ를 통한 복구는 작은 삽입 또는 결실을 초래하며, 유전자를 파괴하여 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 일부 양태에서, 절단 유도된 돌연변이 유발 사례, 즉, NHEJ 사례에 연속적인 돌연변이 유발 사례가 발생한 세포는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 동정 및/또는 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, TALE 반복체는 유전자를 특이적으로 표적화하기 위해 조립된다. 18,740개의 사람 단백질 코딩 유전자를 표적화하는 TALEN의 라이브러리가 작제되었다. 맞춤 설계된 TALE 어레이는 Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA) 및 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)를 통해 상업적으로 이용 가능하다.
일부 실시 형태에서, 상기 TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 인코딩되는 이식 유전자로서 도입된다. 일부 양태에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용한 세포의 동정 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수 있다.
3. RGEN (CRISPR/Cas 시스템)
일부 실시 형태에서, 상기 파괴는 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (RGEN)를 통한 파괴와 같은 하나 이상의 DNA 결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 파괴는 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR 관련 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr (트랜스 활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr 메이트 (mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA 가공된 부분 직접 반복체 및 "직접 반복체" 포함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 또한 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 비롯하여 CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성의 지시에 관여하는 전사물 및 기타 요소를 통칭하여 지칭한다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레아제 기능성 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유도될 수 있다.
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (고정 tracrRNA와 표적 서열에 대해 특이적인 crRNA의 융합 포함)를 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에서의 표적 부위는 상보적 염기쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화한다. 상기 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM) 서열의 바로 5' 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개의 뉴클레오타이드를 변형하여 표적 DNA 서열에 상응하도록 함으로써 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, "표적 서열"은, 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 일반적으로 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.
CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 파손 (double stranded break: DSB)을 유도한 후 본 출원에서 논의된 바와 같은 방해를 유도할 수 있다. 다른 실시 형태에서, "니카아제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 틈새 도입하는데 사용된다. 쌍을 이룬 니카아제는, 예를 들어, 특이성을 개선하기 위해 사용될 수있으며, 각각은 틈새의 도입시에 5' 오버행이 동시에 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 실시 형태에서, 촉매적 불활성 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제 물질 또는 활성화제와 같은 이종 이펙터 도메인에 융합된다.
상기 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 세포의 소기관내와 같은 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리 뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함)의 형성은 표적 서열의 내부 또는 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 이내)의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 tracr 서열 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)은 또한, 예를 들어, 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대해 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 하이브리드화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 상기 tracr 서열은 CRISPR 복합체의 하이브리드화 및 이의 형성에 참여하기에 충분한 tracr 메이트 서열에 대한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터가 세포 내로 도입됨으로써, CRISPR 시스템의 요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 구성 요소는 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 벡터로 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성 요소를 제공한다. 상기 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 부위"로도 또한 지칭됨)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다.
벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 또한 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체, 또는 이들의 변형 버전이 포함된다. 이러한 효소는 공지되어 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에 (S. pneumonia) 유래)일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내와 같은 표적 서열의 위치에 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터가 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되는 CRISPR 효소를 인코딩함으로써, 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 1개 또는 2개의 가닥을 절단하는 능력이 결여될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에 있는 아스파테이트-투-알라닌 치환 (D10A)은 Cas9를 2개의 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 나카아제 (단일 가닥을 절단함)로 전환한다. 일부 실시 형태에서, Cas9 니카아제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 2개의 가닥이 틈새 도입되고 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용되도록 한다.
일부 실시 형태에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 사람, 마우스, 래트, 래빗, 개 또는 비사람 영장류를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 포유 동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이러한 유기체로부터 유래될 수있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 본래 아미노산 서열을 유지하면서 본래 서열 중 적어도 하나의 코돈을 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하여 관심 대상 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향 (유기체들 사이의 코돈 사용법의 차이)은 결국 그 중에서도 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨지는 전령 RNA (mRNA)의 번역 효율성과 종종 상관 관계가 있다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 코돈 최적화를 기반으로 조정될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시 형태에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.
최적 정렬은 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변환 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용 가능)이 포함된다.
상기 CRISPR 효소는 1종 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및, 임의로, 임의의 2개의 도메인들 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 제한 없이 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 다음 활성들 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (influenza hemagglutinin: HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그가 포함된다. 리포터 유전자의 예로는 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (glutathione-5- transferase: GST), 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 베타갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (cyan fluorescent protein: CFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein: YFP), 및 자가 형광 단백질을 포함하는 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein: BFP)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. CRISPR 효소는 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein: MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 도메인 융합 및 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다.
C. 하전된 세포 표면
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 세포 배양을 위한 하전된 표면에 관한 것이다. 상기 하전된 표면은 아민 표면 또는 질소 함유 작용기와 같이 양으로 하전되거나, 카복실 표면 또는 산소 함유 작용기와 같이 음으로 하전될 수 있다. 상기 세포 표면은 배양 용기의 표면 전하를 변경하도록 처리될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 표면은 음으로 하전된 작용기와 양으로 하전된 작용기를 모두 포함하는 표면과 같이 중성으로 하전되어 있다. 예를 들어, 코닝 프리마리아 (CORNING PRIMARIA®) 표면은 폴리스티렌 표면 상에 산소 함유 (음으로 하전된) 작용기와 질소 함유 (양으로 하전된) 작용기의 독특한 혼합물을 특징으로 한다. 상기 표면은 전통적인 TC 표면 상에서 배양할 때 불량한 부착 또는 제한된 분화 잠재력을 나타낼 수 있는 세포의 성장을 지원한다. 일부 양태에서, 상기 표면은 ULA 표면 코팅을 포함한다. 예를 들어, 코닝 초저 부착 표면은 친수성이며 중성으로 하전된 공유 결합된 하이드로겔 층이다. 단백질 및 기타 생체 분자는 소수성 또는 이온 상호 작용을 통해 폴리스티렌 표면에 수동적으로 흡착하기 때문에, 이러한 하이드로겔은 자연적으로 이러한 힘을 통해 비특이적 고정을 억제하여 후속 세포 부착을 억제한다. 이러한 표면은 매우 안정적이고 세포독성이 없고 생물학적으로 불활성이고 분해되지 않는다. HPC로부터 미세 아교 세포의 생성을 지원할 수 있는 다른 예는 다음을 포함한다: 코닝 CellBIND 배양 (미국 특허 US 6,617,152)은 고에너지 마이크로파 플라즈마를 사용하여 폴리스티렌 표면에 보다 많은 산소를 도입하여 전통적인 플라즈마 또는 코로나 방전 처리된 표면과 비교하여 표면의 안정성을 증가시키면서 보다 친수성(습윤성)이 되도록 한다. 코닝 Synthemax 자가 코팅 기질은 RGD 모티브와 플랭킹 서열을 포함하는 무동물의 독특한 합성 비트로넥틴 기반 펩타이드이다. 상기 합성 펩타이드는 최적의 세포 결합 및 신호 전달을 위해 펩타이드를 수동 코팅, 배향 및 제시하기 위해 중합체 백본에 공유적으로 결합된다.
상기 세포 배양 표면은 플라즈마 중합 필름으로 코팅될 수 있다. 상기 플라즈마 중합의 공급원은 하나 이상의 단량체이다. 유용한 중합 가능한 단량체는 불포화 유기 화합물, 예를 들어, 올레핀 아민, 할로겐화 올레핀, 올레핀계 카복실산 및 카르복실레이트, 올레핀계 니트릴 화합물, 산소화 올레핀 및 올레핀계 탄화수소를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 올레핀은 비닐 및 알릴 형태를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 사이클로헥산, 사이클로펜탄 및 사이클로프로판과 같은 사이클릭 화합물이 사용될 수 있다.
당해 분야의 통상의 기술자들에 의해 인식되는 바와 같이, 다양한 플라즈마 중합 기술을 이용하여 하나 이상의 단량체를 세포 배양 표면 상에 침착시킬 수 있다. 바람직하게, 양으로 하전된 중합 필름을 표면 상에 증착한다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 플라즈마 중합 표면은 함께 사용되는 단백질에 따라 음전하를 가질 수 있다. 아민은 바람직하게는 중합체의 단량체 공급원으로서 사용된다. 일부 실시 형태에서, 상기 플라즈마 중합 단량체는 기상 단량체의 중합을 개시하기 위한 에너지를 제공하고 얇은 중합체 필름이 배양 용기 상에 침착되도록 하는 기체 방전을 생성하기 위해 플라즈마 공급원을 사용하여 제조된다. 글로우 방전 방법에 의해 기체 플라즈마를 포함할 수 있는 사이클릭 화합물이 이용될 수 있다. 예를 들어, 1,2-디아미노사이클로헥산과 같은 이러한 사이클릭 화합물의 유도체는 또한 기체 플라즈마에서 일반적으로 중합 가능하다.
중합 가능한 단량체의 혼합물이 사용될 수 있다. 또한, 중합 가능한 단량체는 일반적으로 그 자체로 중합 가능한 것으로 간주되지 않는 다른 기체 (예를 들어, 아르곤, 질소 및 수소)와 블렌딩될 수 있다.
부착성 배양에 유용한 임의의 배양 용기가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시 내용에 의해 고려되는 바람직한 세포 배양 용기 형태는 멀티웰 플레이트 (예를 들어, 6웰, 12웰 및 24웰 플레이트), 접시 (예를 들어, 페트리 접시), 테스트 튜브, 배양 플라스크, 롤러 병, 튜브 또는 셰이커 플라스크 등을 포함한다.
상기 세포 배양 표면을 위한 재료로는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 폴리카보네이트); 유리; 미세다공성 필터 (예를 들어, 셀룰로오스, 나일론, 유리 섬유, 폴리에스테르 및 폴리카보네이트); 중공 섬유 튜브 또는 마이크로 담체 비드를 포함할 수 있는 배치식 또는 연속식 세포 배양 또는 유전자 조작에 사용되는 생물 반응기 (예를 들어, 생물 반응기)를 위한 재료; 폴리테트라플루오로에틸렌 (Teflon®), 세라믹 및 관련 중합체 재료가 포함된다.
특별한 양태에서, 상기 세포 배양물은 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 매트리겔, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 링크 단백질, 뼈 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 언둘린, 에필리그린 및 칼리닌과 같은 세포외 매트릭스 단백질이 없거나 본질적으로 없다.
D. HPC의 미세 아교 세포로의 분화
미세 아교 세포는 뇌 발달, 항상성 및 면역 조절에 중요한 역할을 수행하는 중추 신경계의 선천성 면역 세포이다. 이들은 사람의 태아 및 일차 조직으로부터 획득하기 어렵다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 한정 조건하에 에피솜적으로 재프로그래밍된 HPC로부터 사람 iPSC 유도 미세 아교 세포 (iMGL)의 생성, 특성화 및 냉동 보존을 위한 방법을 기재한다. 냉동 보존된 iMGL은 순도를 유지하고 면역 조절 사이토카인 및 식세포 작용 pHrodo Red 라벨링된 세균 생체 입자 및 아밀로이드 베타 응집체를 분비한다. 본질적으로 무한한 양의 iMGL을 생성할 수 있는 능력은 정상 및 질병 상태에서 미세 아교 세포의 역할에 대한 사람 신경 과학 연구를 가속화시킬 큰 가능성을 가지고 있다.
예시적인 방법에서, 새롭거나 냉동 보존된 HPC를 해동하고, FLT-3 리간드 및 IL-3을 포함하는 미세 아교 세포 분화 배지에 플레이팅한다. 상기 세포를 10~50 K/cm2, 예를 들어, 20~35 K/cm2의 밀도로 플레이팅할 수 있다. 상기 미세 아교 세포 분화 배지는 IL-34, TGFβ1 또는 M-CSF를 포함할 수 있다. 상기 배양은 매트리겔 코팅된 플레이트 또는 하전된 표면, 예를 들어, 프리마리아 플레이트 또는 초저 부착 플레이트 또는 조직 배양 플레이트 (TC) 또는 비조직 배양 플레이트 (Non-TC) 상에서 수행될 수 있으며, 96웰 플레이트 (예를 들어, 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 분화 배지)와 같이 고처리량일 수 있다. 상기 세포는 분화의 다음 23일 동안 2X 미세 아교 세포 분화 배지 (MDM)의 웰 당 50 μl 배지를 매 48 시간 마다 절반 공급받을 수 있다. 구체적인 양태에서, 상기 분화는 매트리겔 (MATRIGEL®)과 같은 ECM 단백질의 부재하에 수행된다. 23 일차에 차가운 PBS로 상기 세포를 수확하고, 자동화 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화한다. 상기 세포를 CD11b, CD11c, CD45, CD33, TREM-2의 표면 발현 및 TREM-2, IBA, CX3CR1, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색하였다.
E. 내피 세포
E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시킬 수 있다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (SFD) 배지의 존재하에 0.25 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅할 수 있다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가할 수 있다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급할 수 있다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행할 수 있다. 분화의 종료시에 수확된 세포를 냉동 보존하거나 25 k/cm2의 밀도로 카복실 표면 상에 다시 플레이팅하여 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지의 존재하에 내피 분화를 개시할 수 있다.
예시적인 방법에서, 냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 생 배양물을 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지 및 저산소 조건의 존재하에 카복실 표면 상에 25 k/cm2로 플레이팅한다. 플레이팅 후 24 시간에 내피 배지의 새로운 공급을 상기 세포에 제공하고, 이들이 밀집도에 도달할 때까지 배양물에 48 시간 마다 공급한다. 세포가 밀집도에 도달하는데 5~6일 걸릴 수 있다. TrypLE Select를 사용하여 상기 세포를 수확하고, 표면 내피 마커 CD31, CD105 및 CD144에 대해 염색하고, 내피 배지를 갖는 카복실 표면에 25 k/cm2로 플레이팅하고, 저산소 인큐베이터 조건에 놓는다. 분할 후 2, 4, 6 일차에 상기 세포에 내피 배지의 완전 공급을 제공한다. 7 일차에, 상기 세포를 수확하고, 염색하고, 동일한 방식으로 3회 더 다시 플레이팅한다.
일부 실시 형태에서, 상기 내피 세포는 뇌 미세 혈관 내피 세포로 전환된다. 예시적인 방법에서, 생 또는 냉동 보존된 HPC (예를 들어, BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD의 존재하에 아민 표면 상에서 유도된 7 일차 HPC)를 ECRA 배지 (사람 내피 SFM [Gibco], 1% 혈소판 부족 혈장 유래 소 혈청 [Fisher], 20 ng/mL bFGF [Promega], 10 uM 레티노산)와 함께 피브로넥틴 (예를 들어, 50~200 μg/mL, 특히 100 μg/mL) 및 콜라겐 I (예를 들어, 100~500 μg/mL, 특히 400 μg/mL)을 함유하는 ECM에 플레이팅한다. 상기 세포를 50~100 k/cm2, 특히 75 k/cm2의 밀도로 플레이팅할 수 있다. 상기 배양물을 저산소 인큐베이터 조건하에 유지할 수 있다. 밀집될 때까지 격일로 ECRA 배지를 상기 배양물에 공급할 수 있다. 그 다음, 예를 들어, TrypLE를 사용하여 밀집된 배양물을 수확한다. PECAM-1 (CD31) 및 GLUT-1을 검출하기 위해 염색을 수확된 세포에 대해 수행할 수 있다. 수확된 배지를, 예를 들어, ECRA 배지를 함유하는 트랜스웰 (Transwell) 삽입물 상에 다시 플레이팅하고, 저산소 인큐베이터 조건하에 넣을 수 있다. 밀집될 때까지 격일로 ECRA 배지를 상기 배양물에 공급할 수 있다. 밀집된 배양물을 경내피 전기 저항 (transendothelial electrical resistance: TEER)에 대해 테스트할 수 있다.
F. 중간엽 세포
일부 실시 형태에서, 상기 iPSC는 MSC로 분화된다. 예를 들어, 도 5c는 MSC를 생성하기 위한 2D HPC 분화 과정의 개략도를 도시한 것이다. E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시킨다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 10 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (Serum Free Defined: SFD) 배지의 존재하에 0.25 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅한다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가한다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급한다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행한다. 분화 6 일차 또는 7 일차의 종료시, 상기 세포를 GMP-MSC 배지에 넣는다. 상기 세포를 밀집도까지 성장시키고, 각 계대의 종료시에 수확한 다음, 5 uM 블레비스타틴 또는 10 uM H1152로 보충된 GMP-MSC 배지에서 50 K/cm2의 밀도로 아민 표면 상에 다시 플레이팅하여 MSC의 성장 및 증식을 선택적으로 가능하게 한다.
일부 양태에서, 냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 6 일차 분화 종료시 살아있는 배양물을 아민 하전된 표면 플레이트 상에 10 uM H1152 (또는 블레비스타틴)의 존재하에 MSC 배지의 존재하에 놓는다. 플레이팅 후 24 시간에 MSC 배지의 새로운 공급을 상기 세포에 제공하고, 이들이 밀집도에 도달할 때까지 배양물에 48 시간 마다 공급한다. 세포가 밀집도에 도달하는데 5~6일 걸렸다. TrypLE를 사용하여 상기 세포를 수확하고, 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재에 대해 염색한다. 저산소 조건하에 상기에서 기재된 과정 및 아민 표면을 사용하여 신생 배양물을 3회 계대한다. 상기 배양물을 P4에서 정상 산소 및 정상 조직 배양 플레이트로 전환시킨다.
일부 양태에서, 상기 MSC는 혈관 주위 세포로 추가로 분화될 수 있다. 예시적인 방법에서, MSC를 ScienCell 혈관 주위 세포 배지 (카탈로그: 1201) 중에 (예를 들어, 조직 배양 플라스틱 (Tissue Culture Plastic: TCP) 6웰 플레이트 상에서 1~20 k/cm2, 특히 10 k/cm2의 세포 밀도로) 씨딩하고, 정상 산소 인큐베이터 조건하에 놓았다. 상기 배양물은 밀집될 때까지 격일로 ScienCell 혈관 주위 세포 배지를 공급받을 수 있다. 예를 들어, TrypLE를 사용하여 밀집된 배양물을 수확할 수 있다. 수확된 세포에 대해 염색을 수행하여 신경 아교 세포 항원 2/콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (NG2) 및 PDGFR-베타 (CD140b)를 검출할 수 있다. 수확된 세포를 ScienCell 혈관 주위 세포 배지 중에 (예를 들어, TCP 6웰 플레이트 상에서 1~20 k/cm2, 특히 10 k/cm2의 세포 밀도로) 다시 플레이팅할 수 있다. 상기 배양물은 밀집될 때까지 격일로 ScienCell 혈관 주위 세포 배지를 공급받고, 수확되고, 언급된 바와 같이 염색될 수 있다. 그 다음, 배양물에서 순도의 확장 및 유지가 있을 때까지 세포를 다시 플레이팅한다. 또한, 상기 세포는 CD146, CD49a, CD166, CD54, CD73, CD105, CD13, CD56, CD49d 및/또는 CD44의 존재에 대해 양성 염색될 수 있다.
G. 분화 배지
세포는 각각의 특정 세포 집단의 성장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 탄소원, 질소원 및 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 증식 배지 중에서 배양한다. 상기 배지는 또한 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제 물질, 피루브산, 완충제, pH 지시약 및 무기염을 포함할 수도 있다. 예시적인 증식 배지는 줄기 세포 성장을 증진시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어, 비필수 아미노산 및 비타민으로 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 최소 필수 배지 이글 (MEM) 알파 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함한다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 대안으로, 상기 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에서, 상기 성장 배지는 본 출원에서 배양물 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제형으로 지칭되는 "녹아웃 혈청 대체물"을 포함할 수 있다. 녹아웃 혈청 대체물은, 예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허공개 US 2002/0076747에 개시되어 있다. 바람직하게는, 상기 PSC는 완전 한정된 무피더 배지 중에서 배양된다.
일부 실시 형태에서, 상기 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물로는 알부민 (예를 들어, 지질 풍부 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어, 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해 산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 등가물을 적절하게 함유하는 물질이 포함될 수 있다. 혈청에 대한 대체물은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 녹아웃 (KNOCKOUT™) 혈청 대체물 (KSR), 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco) 및 GLUTAMAX™ (Gibco)을 포함한다.
다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나의 실시 형태에서, 상기 세포는 37℃에서 배양된다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 상기 수치에서 추론 가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
H. 냉동 보존
본 출원에서 개시된 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포는 과정의 임의의 단계, 예를 들어, I기, II기 또는 III기에 냉동 보존될 수 있으며, 예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2012/149484 A2호를 참조한다. 상기 세포를 기질과 함께 또는 기질 없이 냉동 보존할 수 있다. 여러 실시 형태에서, 보관 온도는 약 -50℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -70℃, 약 -70℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -90℃, 약 -90℃ 내지 약 -100℃ 범위 및 이들의 중첩 범위이다. 일부 실시 형태에서, 저온은 냉동 보존된 세포의 보관 (예를 들어, 유지)를 위해 사용된다. 여러 실시 형태에서, 액체 질소 (또는 이와 유사한 다른 액체 냉각제)는 세포를 보관하는데 사용된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 세포는 약 6 시간 이상 동안 보관된다. 추가의 실시 형태, 상기 세포는 약 72 시간 보관된다. 여러 실시 형태에서, 상기 세포는 48 시간 내지 약 1 주일 보관된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주, 또는 8주 동안 보관된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월 동안 보관된다. 더 긴 시간 동안 세포를 저장할 수도 있다. 상기 세포는 별도로 또는 본 출원에서 개시된 임의의 기질과 같은 기질 상에서 냉동 보존될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 추가의 동결 방지제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 하나 이상의 동결 방지제, 예를 들어, DM80, 혈청 알부민, 예를 들어, 사람 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 냉동 보존 용액 중에서 냉동 보존될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 용액은 약 1 %, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 용액은 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 7%, 약 6% 내지 약 8%, 약 7% 내지 약 9%, 또는 약 8% 내지 약 10%의 디메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시 형태에서, 상기 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
세포는, 예를 들어, 냉동 보존 동안 약 1 ℃/분으로 냉각될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 냉동 보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 또는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 1℃/분으로 냉각시키기 전에 4℃로 냉각된다. 냉동 보존된 세포는 사용을 위한 해동 전에 액체 질소의 증기상으로 이동될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, 상기 세포가 일단 약 -80℃에 도달하면, 이들은 액체 질소 보관 장소로 이동된다. 냉동 보존은 또한 제어 속도 냉동기 (controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수 있다. 냉동 보존된 세포는, 예를 들어, 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서, 전형적으로는 약 37℃의 온도에서 해동될 수 있다.
III. 사용 방법
본 개시 내용은 다수의 다중 계통의 세포가 생성될 수 있는 방법을 제공한다. 이들 세포 집단은 다수의 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적에 사용될 수 있다. 이들로는, 몇 가지 예를 들자면, 생체내 세포의 이식 또는 삽입; 시험관내 세포독성 화합물, 발암원, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 스크리닝; 간 질환 및 감염의 메커니즘의 규명; 약물 및/또는 성장 인자가 작동하는 메커니즘의 연구; 환자에서의 암의 진단 및 모니터링; 유전자 요법; 및 생물학적 활성 산물의 제조가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
A. 약제학적 조성물
본 발명의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형도 또한 본 출원에서 제공된다.
따라서, 본 발명에 따라 대상체에게 투여하기 위한 세포 조성물은 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 임의의 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택되는 투여 경로에 따라 좌우된다.
본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 세포)을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012])와 혼합하여 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화 방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당류, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본 출원의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체로는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 추가로 포함된다. rHuPH20을 비롯한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 출원공개 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들어, 콘드로이티나아제와 조합된다.
B. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 배포
일부 실시 형태에서, 제조, 유통 또는 사용시 어느 때라도 존재하는 세포를 포함하는 시약 시스템이 제공된다. 상기 키트는 동일한 게놈을 종종 공유하는 미분화된 만능 줄기 세포 또는 다른 분화된 세포 유형과 조합하여 본 개시 내용에 기재된 세포의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 각 세포형은 동일한 단체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 단체들의 관리 하에, 동시에 또는 다른 시점에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 용기로 포장될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의로 기계론적 독성학과 같은 원하는 목적에 대한 서면 설명서와 함께 적합한 용기 내에 포장될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 세포의 제조를 위한 하나 이상의 배지 및 성분들을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 시약 시스템은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 적절히 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 구성성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 적어도 하나가 포함된다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 상기 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 것이다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 키트의 성분들은 건조 분말로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 구성성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시 내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐된 상태로 키트 구성 성분(들)을 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기들로는 원하는 바이알들을 보존하는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한 인쇄형 또는 전자 포맷, 예를 들어, 디지털 포맷의 사용 설명서를 포함할 수 있다.
IV. 실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 수많은 변경이 개시된 특정 실시 형태에서 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1 - 내피 세포의 생성
E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시켰다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (Serum Free Defined: SFD) 배지의 존재하에 0.25 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가한다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급한다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행한다. 상기 세포를 분화의 종료시에 수확하고, 냉동 보존하거나 25 k/cm2의 밀도로 카복실 표면 상에 다시 플레이팅하여 VascuLife VEGF 내피 배지 또는 SFD 내피 배지의 존재하에 내피 분화를 개시할 수 있다.
냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 생 배양물을 1 μM H1152 및 저산소 조건의 존재하에 VascuLife VEGF 내피 배지의 존재하의 카복실 표면 상에 25 k/cm2로 플레이팅한다. 플레이팅 후 24 시간에 VascuLife의 새로운 공급을 상기 세포에 제공하고, 이들이 밀집도에 도달할 때까지 배양물에 48 시간 마다 공급하였다. 세포가 밀집도에 도달하는데 5~6일 걸렸다. 최소 교반 또는 피펫팅으로 Accumax를 사용하여 상기 세포를 수확하고, 표면 내피 마커 CD31, CD105 및 CD144에 대해 염색하고, VascuLife + H1152를 갖는 카복실 표면에 25 k/cm2로 플레이팅하고, 저산소 인큐베이터 조건에 놓는다. 분할 후 2, 4, 6 일차에 상기 세포에 VascuLife의 완전 공급을 제공하였다. 7 일차에, 상기 세포를 수확하고, 염색하고, 동일한 방식으로 3회 더 다시 플레이팅하였다. 히스토그램은 각 재플레이팅 단계에서 증가하는 내피 세포의 순도를 나타낸다. CD31+ MACS를 사용하지 않고 연속 계대 정제를 사용하여 순수한 내피 세포를 생성하였다. 상기 내피 세포를 재플레이팅 계대 3의 종료시 냉동 보존할 수 있다 (도 3).
실시예 2 - 중간엽 줄기 세포의 생성
도 5c는 MSC를 생성하기 위한 2D HPC 분화 과정의 개략도를 도시한 것이다. E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시켰다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (Serum Free Defined: SFD) 배지의 존재하에 0.25 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가하였다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급하였다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행하였다. 분화 6/7 일차의 종료시, 상기 세포를 GMP-MSC 배지에 넣었다. 전구체 집단의 표현형을 수확 후 분석하였다 (도 5c). 상기 세포를 밀집도까지 성장시키고, 각 계대의 종료시에 수확한 다음, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 GMP-MSC 배지에서 50 K/cm2의 밀도로 아민 표면 상에 다시 플레이팅하여 MSC의 성장 및 증식을 선택적으로 가능하게 하였다.
3D/2D HPC 분화로부터의 냉동 보존된 6 일차 HPC 또는 2D HPC 분화로부터 출현하는 6 일차 분화의 종료시의 생 배양물을 아민 하전된 표면 플레이트 상에 1 uM H1152의 존재하에 MSC 배지의 존재하에 놓는다. 플레이팅 후 24 시간에 MSC 배지의 새로운 공급을 상기 세포에 제공하고, 이들이 밀집도에 도달할 때까지 배양물에 48 시간 마다 공급하였다. 세포가 밀집도에 도달하는데 5~6일 걸렸다. TrypLE를 사용하여 상기 세포를 수확하고, 표면 MSC 마커 CD73, CD44, CD105, CD49d 및 내피 마커 CD31 및 CD144의 부재에 대해 염색하였다. 저산소 조건하에 상기에서 기재된 과정 및 아민 표면을 사용하여 신생 배양물을 3회 계대하였다. 상기 배양물을 P4에서 정상 산소 및 정상 조직 배양 플레이트로 전환시켰다. P6에서 MSC의 순도 사양에 도달하였다 (도 6, 7). 골세포, 연골 세포 및 지방 세포를 생성하는 삼중 계통 잠재력을 입증하기 위해, P3에서 냉동 보존된 MSC를 해동하고, 도 8a에서 기술된 바와 같이 계통 특이적 분화 매트릭스에 넣었다 (도 8b). 냉동 보존된 MSC의 클론 증식 능력을 10 cm 조직 배양 플레이트에 1000개 세포/cm2의 밀도로 MSC를 플레이팅하여 입증하였다. 세포에 격일로 배지를 교체하면서 2주 동안 MSC 배지를 공급하였다. 출현하는 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 점수를 매겼다 (도 8c).
실시예 3 - MSC로부터 혈관 주위 세포의 생성
iCell MSC 및 iPSC 유도 혈관 주위 세포를 50% 밀집도로 샘플링하고, 공지된 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대해 유세포 계측으로 분석하였다. 냉동 보존된 MSC를 해동하고, MSC 유지 배지 (도 9a) 중에 세포외 매트릭스 (ECM)를 함유하지 않는 6웰 플레이트에 35,000개 세포/cm2로 플레이팅하였다. 상기 세포를 밀집도에 도달하도록 하고, 상기 세포를 SFD 혈관 주위 세포 배지 (SFD Pericyte Medium: SPM) 중에 세포외 매트릭스 (ECM)를 함유하지 않는 6웰 플레이트에 15,000개 세포/cm2로 다시 레이팅하였다 (도 9a; 도 9b).
1차 사람 뇌 혈관 주위 세포 (Human Brain Vascular Pericyte: HBVP) (ScienCell # 1200)를 해동하고, 혈관 주위 세포 배지 (ScienCell # 1201) 중에 5,000개 세포/cm2로 폴리-L-오르니틴 코팅된 6웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이러한 세포를 분화 과정에서 양성 대조군으로서 사용하였다. ScienCell HBVP, iCell MSC 및 iPSC 유도 혈관 주위 세포를 공지된 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146에 대해 유세포 계측으로 분석하였다 (도 9c). 해동시 iCell MSC의 혈관 주위 세포 마커가 없었다. HBVP 및 iPSC 유도 혈관 주위 세포는 공지된 혈관 주위 세포 마커 PDGFRβ, NG2 및 CD146의 발현을 나타내며, iPSC 유도 혈관 주위 세포는 ScienCell HBVP 보다 더 높은 순도를 갖는다 (도 9c). iPSC 유도 혈관 주위 세포는 ScienCell HBVP와 유사한 형태를 나타낸다 (도 9d).
이들의 기능에 근거하여, 혈관 주위 세포는 표현형으로 PC1 (전염증성) 또는 PC2 (수축성)로 분류될 수 있다 (문헌 [Rustenhoven et al., 2017]). 두 서브타입의 시그니처는 도 9e에 기술되어 있다. 해동 후, iPSC 유도 혈관 주위 세포를 PC1 및 PC2 마커 CD274, VCAM1, 칼포닌, 데스민, DLK1 및 αSMA에 대한 유세포 계측을 통해 서브타입화하였다 (도 9f). iPSC 유도 혈관 주위 세포는 수축성 혈관 주위 세포, 서브타입 PC2의 시그니처를 나타낸다.
만성 및 급성 BBB 모델에서 볼 수 있는 비특이적 식세포 흡수에 추가하여, 혈관 주위 세포는 또한 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 특정 거대 분자의 제거를 처리하여 신경 미세 환경을 특이적으로 조절한다 (문헌 [Winkler et al., 2014]). SPM에서 PDL 코팅 (Greiner # 655946)을 갖는 96웰 플레이트에 iPSC 유도 혈관 주위 세포를 15,000개 세포/cm2로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 3일 동안 상기 세포를 방치한 후 사멸 지시약 NucGreen Dead 488 (Invitrogen # R37109) 및 스태필로코커스 아우레우스 pHrodo Red 생체 입자 (Invitrogen # A10010)를 세포에 첨가하였다. 상기 플레이트를 1 개월 이상 동안 IncuCyte 라이브 이미징 시스템에 놓고 배지 (동일한 농도의 생/사 생체 입자 시약 포함)를 매주 공급하였다. iPSC 유도 혈관 주위 세포는 대조군 초과의 스태필로코커스 아우레우스 생체 입자의 관찰 가능한 식세포 활성을 나타낸다.
실시예 4 - 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)의 생성
E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 뇌 미세 혈관 내피 세포를 생성하기 위한 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시켰다. 생 또는 냉동 보존된 HPC (예를 들어, BMP4, VEGF 및/또는 FGF2, 예를 들어, BMP4 및 FGF2로 보충된 SFD의 존재하에 아민 표면 상에서 유도된 6 일차 HPC)를 ECRA 배지 (사람 내피 SFM (Gibco), 1% 혈소판 부족 혈장 유래 소 혈청 (Fisher), 20 ng/mL bFGF (Promega), 10 uM 레티노산)와 함께 피브로넥틴 (예를 들어, 50~200 μg/mL, 특히 100 μg/mL) 및 콜라겐 IV (예를 들어, 100~500 μg/mL, 특히 400 μg/mL)을 함유하는 ECM에 플레이팅하였다. 상기 세포를 50~100 k/cm2, 특히 75 k/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 상기 배양물에 매일 공급하고, 저산소 인큐베이터 조건하에 유지하였다. 밀집될 때까지 격일로 ECRA 배지를 상기 배양물에 공급하였다. 그 다음, 예를 들어, TrypLE를 사용하여 밀집된 배양물을 수확한다. PECAM-1 (CD31) 및 GLUT-1을 검출하기 위해 염색을 수확된 세포에 대해 수행하여 BMEC의 동일성을 확인하였다 (도 10b). 수확된 배지를, 예를 들어, ECRA 배지를 함유하는 트랜스웰 (Transwell) 삽입물 상에 다시 플레이팅하고, 저산소 인큐베이터 조건하에 둔다. (도 10a). 밀집될 때까지 격일로 ECRA 배지를 상기 배양물에 공급할 수 있다. 밀집된 배양물을 유세포 계측 (도 10c) 및 면역 세포 화학 (도 10d) 및 경내피 전기 저항 (TEER)에 의해 P-gp, CD105, Glu-1 및 CD31 발현의 존재에 대해 테스트하고, 블랭크 배지와 비교할 수 있다 (도 10e). 면역 조직 화학을 위해 세포를 200 μl의 DPBS로 3회 세척한 다음, 4℃에서 밤새 토끼 항-P-gp 항체 (차단 완충액 (DPBS 중의 10% FBS, 0.01% TritonX) 중의 1:50)와 함께 인큐베이션하였다. 200 μl의 DPBS로 3회 세척한 후, P-gp를 이차 항체 (1:1000, Donkey 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen))로 염색하였다. 핵을 Hoechst3342 (Thermo Fisher)로 염색하였다. 이미지를 ImageXpress (Molecular Devices, LLC)에 의해 200X 배율로 캡처하였다.
실시예 5 - 미세 아교 세포의 생성
E8의 존재하에 매트리겔 또는 비트로넥틴 상에서 유지된 iPSC를 적어도 5~10회 계대 동안 저산소 조건에 적응시켰다. 2D HPC 분화: 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (Serum Free Defined: SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5 백만개의 세포/웰의 밀도로 아민 배양 접시에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 배양물에 첨가하였다. 다음 날, 전체 배지 교환을 수행하였다.
분화 과정의 5 일차에, 상기 세포를 5 U/ml의 헤파린과 함께 50 ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 넣었다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급하였다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행하였다. HPC를 CD43/CD34 세포의 존재에 의해 정량화하였다.
3D HPC 분화: 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 uM 블레비스타틴 또는 1 uM H1152로 보충된 무혈청 한정 (SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5 백만개의 세포/ml의 밀도로 스피너 플라스크에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 교환하였다. 분화 과정의 5 일차에, 상기 세포를 5 U/ml의 헤파린과 함께 50ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 넣었다. 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급하였다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행하였다. HPC를 CD43/CD34의 존재에 의해 정량화하였다. 상기 과정 개요 및 효율성은 (도 11)에 예시되어 있으며, 배지 조성은 (도 12)에 나열되어 있다.
HPC를 미세 아교 세포 분화 배지 MDM 또는 2X-MDM에 넣었다 (도 11). 배양물에 48 시간 마다 공급하였다. 분화 23 일차에 미세 아교 세포 배양물에 대한 순도 마커를 냉동 보존 전후에 정량화하였다 (도 13a, 도 13b).
23 일차에 생 및 냉동 보존된 미세 아교 세포 배양물을 순도에 대해 평가하였다. 분화 23 일차의 미세 아교 세포 배양물을 수확하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 나머지 세포를 제어 속도 냉동기를 사용하여 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 두 세트의 경우, 유세포 계측에 의한 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현 (도 14 좌측) 뿐만 아니라 CX3CR1 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현 (도 14 우측). 상기 결과는 냉동 보존된 미세 아교 세포가 냉동 보존 후에도 순도를 유지한다는 것을 나타냈다.
HPC를 배지에 넣고 MDM의 존재하에 미세 아교 세포 분화를 개시하고, 간헐적 공급을 2X-MDM로 수행하였다. 수동 동결 프로토콜 또는 제어 속도 냉동기 (CRF)를 사용하여 상기 세포를 분화 20 일차, 23 일차 및 26 일차에 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 세포를 1 주일 동안 액체 질소로 옮겼다. 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 성숙 배지 (MMM)에 넣었다. 48 시간 마다 새로운 미세 아교 세포 성숙 배지를 배양물에 공급하였다. 상기 세포를 해동 후 3, 5, 7, 10, 12 및 14 일차에 수확하고, 초기 플레이팅 수에 대한 생존 세포의 회수를 정량화하였다 (도 15의 A~C).
냉동 보존된 HPC를 MDM의 존재하에 미세 아교 세포로 분화시켰다. 입력 HPC 및 출력 미세 아교 세포의 총 생존 수를 정량화하였다. 미세 아교 세포 분화 23 일차에 존재하는 TREM2 양성 세포의 순도 및 절대 수를 입력 생존 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기반으로 과정 효율을 계산하였다 (도 16).
분화 20 일차, 23 일차 또는 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 미세 아교 세포 성숙 배지 (MMM)에서 해동하고, 48 시간 마다 새로운 배지를 공급하였다. 총 생존력 및 절대 세포 수를 해동 후 3 일차, 7 일차 및 10 일차에 정량화하였다. 상기 데이터는 26 일차 미세 아교 세포에 비해 23 일차 미세 아교 세포에서 보다 높은 해동 후 회수를 나타냈다 (도 17의 A~C).
다음으로, 분화 과정의 20 일차, 23 일차 및 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포에 대해 기능성 평가를 수행하였다. 상기 세포를 해동하고, 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지의 존재하에 96웰 플레이트 중에 15,000개 생존 세포/웰로 플레이팅하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo Red 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에서 촬영하였다. 제어 속도 냉동기 방법을 통해 냉동 보존된 세포는 (보다 높은 세포 생존력으로 인해 (도 19)) 보다 강력한 식세포 작용을 나타낸다.
상기 기능성 평가를 해동 후 나중 시점으로 확장하였다. IncuCyte 시스템 상에서 라이브 이미징을 통해 평가되는 수동 또는 제어 속도 냉동기를 사용하여 분화의 20 일차, 23 일차 및 26 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포에 대해 해동 후 5 일차, 7 일차 및 14 일차에 식세포 잠재력을 평가하였다. 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 3일 동안 MMM에 플레이팅하였다. 3일의 종료시 생존 세포 수를 도 18의 B에 기재된 바와 같이 결정하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌화 또는 비-옵소닌화 pHrodo Red 생체 입자를 갖는 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지 (MMM)의 존재하에 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 세포를 플레이팅하고, 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 5, 7 및 14일까지 다양한 시점에서 촬영하였다. 수동 냉동 보존 방법은 (보다 낮은 세포 생존으로 인해) 모든 조건에서 식세포 작용의 감소/우측 이동된 속도를 나타냈다.
식세포 지수는 세균 및 식세포 현탁액의 제한된 인큐베이션 기간 동안 식세포 당 분해된 세균 수를 계산하여 결정되는 식세포 활성의 척도이다. 라벨링된 세균 입자를 포식하는 냉동 보존된 미세 아교 세포의 능력을 식세포 작용 적색 물체 수/총 생 세포의 수의 비로 정량화하였다. 이러한 비를 식세포 지수 (도 21)로 결정하였다.
냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 성숙 배지의 존재하에 96웰 플레이트 중에 15,000개 생존 세포/웰로 플레이팅하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo Red 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 해동 후 최대 5일까지 다양한 시점에서 촬영하였다. 제어 속도 냉동기 방법을 통해 냉동 보존된 세포는 (보다 높은 세포 생존력으로 인해 (도 22)) 보다 강력한 식세포 작용을 나타낸다.
다음으로, 미세 아교 세포로의 HPC 분화를 ECM의 부재하에 스크리닝 적용에 적합한 96웰 형식에서 추가로 발달시켰다. 초저 부착 (ULA), 조직 배양 (TC) 및 비조직 배양 (Non-TC) 용기 상에서 분화를 수행하였다 (도 23의 A). 웰 당 200 μl의 미세 아교 세포 분화 배지의 존재하에 96웰 프리마리아 플레이트 또는 초저 부착, 조직 배양 (TC) 또는 비-조직 배양 (Non-TC) 플레이트 상에 냉동 보존된 HPC를 20,000~35,000개 생존 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다 (도 23의 B). 분화의 다음 23일 동안 매 48 시간 마다 웰 당 50 MDM의 MDM 배지를 상기 세포에 공급하였다. 23 일차에 차가운 PBS로 상기 세포를 수확하고, 자동화 세포 계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 정량화하였다. 상기 세포를 CD11b, CD45, CD33, TREM2의 표면 발현 및 TREM2, IBA, P2RY12 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 염색하였다 (도 24의 A~B).
[표 1]
하전된 표면 상에서 미세 아교 세포를 생성하는 과정 효율성
Figure pct00001
냉동 보존된 미세 아교 세포에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인. 23 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 MDM 배지에 해동하고, 50,000개 세포/웰로 프리마리아 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 100 ng/ml LPS 및 50 ng/ml 인터페론 감마로 자극을 시작하기 전에 세포를 3일 동안 플레이팅하였다. 자극을 24 시간 동안 삼중복으로 수행하였다. 상청액을 회전시켜 세포와 잔해물 제거하고, 즉시 -20℃에 두었다. 상기 상청액을 다중 Luminex 검정에서 분석하였다.
실시예 6 - 신경 퇴행성 질환을 모방하는 변이체 생성을 위한 iPSC 조작
엑손 2에 삽입 및 결실을 도입하여 TREM2 기능을 파괴하였으며, 이는 프레임 이동 및 조기 번역 종료를 초래한다. TAL-뉴클레아제 (하기 TREM2 쌍)를 엑손 2 내의 아미노산 58을 중심으로 하는 DNA 서열에 결합하도록 설계하였다. 조작에 사용된 세포주는 FCDI iPSC 계통 01279.107이었다. SV40 프로모터의 제어하에 블라스티시딘 내성을 발현하는 공동 선택 플라스미드 및 TAL 뉴클레아제 mRNA를 125V/950uF 설정을 갖는 BioRad Gene Pulser Xcell 시스템을 사용하여 세포 내로 전기 천공하였다. 상기 세포를 플레이팅하고, 전기 천공 후 1 및 2 일차에 짧은 블라스티시딘 선택을 적용하였다. 생존 세포를 성장시킨 다음, 전기 천공 후 7 일차에 단일 세포를 96웰 플레이트로 분류하였다. 약 2주 후, 81개의 클론을 선택하고, PCR 및 서열 분석으로 유전자형 분류하였다.
서열 분석된 81개 클론 중에서, 7개는 서열 변형을 나타냈다. 3개의 클론은 1개의 염기쌍의 삽입을 갖는 1개의 대립 유전자를 포함하고, 3개의 클론은 1개의 염기쌍의 결실을 갖는 1개의 대립 유전자를 포함하고, 1개의 클론은 1개의 염기쌍의 삽입을 포함하는 1개의 대립 유전자 및 4개의 염기쌍의 결실을 포함하는 1개의 대립 유전자를 갖는 복합 이형 접합체이었다. 7번째 클론은 프레임 이동을 도입할 것으로 예상되지 않은 24개 염기쌍의 결실을 포함하였다. 클론을 확장시키고, 냉동 보존하고, 서열 확인 및 핵형 분석을 실시하였다. 미세 아교 세포로 분화한 후, 2개의 주요 클론을 이형 접합 또는 동형 접합 파괴의 예로서 선택하였다. 이형 접합 클론 01279.1185는 1 bp 삽입을 갖는 대립 유전자를 포함하여 TREM2의 60번 위치에서 프레임 이동을 일으키고 45개의 다음 미노산 후에 종결을 초래한다. 동형 접합 클론 01279.1187은 59번 위치에 1 bp 프레임 이동 삽입 및 나중에 16개 아미노산 종결을 갖는 대립 유전자가 포함하였으며, 2번째 대립 유전자는 59번 위치에 4 bp 결실을 가져 나중에 프레임 이동 및 46개 아미노산 종료를 초래한다.
[표 2]
표적 서열
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
실시예 7 - 신경 퇴행을 모방하는 추가의 동종 동계로 조작된 계통의 생성:
뉴클레아제 매개성 상동 재조합 및 공여체 올리고 SJD 14-133에 의해 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC 01279를 유전적으로 조작하여 파킨슨병 모델을 성성하였다. 생성된 iPSC는 53번 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 변경된 SNP rs104893877을 포함하고 있어 알파-시누클레인 유전자 (SNCA)의 A53T 변이체 뿐만 아니라 SNCA A53T iPSC 계통을 생성하는 2개의 침묵 돌연변이를 초래하였다.
레트 증후군 연구를 위한 동종 동계로 조작된 모델은 뉴클레아제 매개성 상동 재조합 및 공여자 플라스미드 p1553을 사용하여 생성되었다. 공여자 플라스미드 p1553은 메틸 CpG 결합 도메인 앞에 일련의 정지 코돈을 삽입한 후 LoxP 부위에 의해 플랭킹되는 PGKp-PuromycinR-SV40pA 선택 카세트를 삽입하였다. 모계 계통 01279로부터 유래된 MECP2 HM 계통은 레트 증후군에 대한 질병 모델을 제공하였다.
동종 조작된 iPSC로부터 HPC 및 미세 아교 세포의 생성: 01279로부터 유래된 SNCA A53T 및 MECP2 HM 조작된 계통과 함께 01279 iPSC로부터 유래된 동형 접합 및 이형 접합 TREM2 KO iPSC을 E8 및 매트리겔의 존재하에 유지하였으며, 이들을 10회 계대 배양하여 저산소 조건에 적응시켰다. 상기 세포를 핵형으로 분류하고, iPSC 은행을 제조하여 3D HPC 분화 프로토콜을 통해 HPC 분화를 개시하였다. 세포를 밀집도 이하의 iPSC로부터 분할하고, 5 μM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152로 보충된 무혈청 한정 (SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5 백만개의 세포/ml의 밀도로 스피너 플라스크에 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24 시간에, 50 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2로 보충된 SFD 배지를 교환한다. 분화 과정의 5 일차에, 상기 세포를 5~10 U/ml의 헤파린과 함께 50 ng/ml Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 넣는다. 13 일차 분화 과정 전체에 걸쳐 48 시간 마다 상기 세포들에 공급한다. 전체 과정을 저산소 조건하에 수행한다. HPC는 CD43/CD34의 존재에 의해 정량화되었다. CD34 비드를 사용하여 MACS 분류 후 HPC를 냉동 보존한다. 냉동 보존된 HPC를 해동하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 23일 분화 과정에 세포를 놓음으로써 미세 아교 세포를 생성하였다.
23 일차 야생형 및 TREM 조작된 클론으로부터 냉동 보존된 미세 아교 세포를 해동하고, CD45와 함께 TREM-2 발현의 존재를 유세포 계측에 의해 정량화하였다 (도 26).
동종 동계로 조작된 계통으로부터 유도된 냉동 보존 23 일차 미세 아교 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 유세포 계측에 의한 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현 뿐만 아니라 CX3CR1 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현을 정량화하기 위해 상기 세포들을 염색하였다. 도 26은 4개의 동종 동계로 조작된 iPSC 모두 전체에 걸쳐 수득된 순도를 요약한다. 그 결과는 분화 프로토콜의 변경 없이 동종 동계로 조작된 iPSC로부터 고순도 미세 아교 세포의 생성을 나타낸다.
단순 단계 ELISA (AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형 접합 및 동형 접합 KO 돌연변이체로부터 수집된 조건 배지로부터 해동 후 미세 아교 세포에 의해 분비된 가용성 TREM2 (sTREM2) 단백질의 수준을 정량화하였다 (도 27a). WT 및 TREM2 KO 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트 중의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3 일차 및 해동 후 7 일차에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3 일차 및 5 일차에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다. 그 데이터는 WT, 이형 접합 TREM2 KO 및 동형 접합 KO 미세 아교 세포 사이의 가용성 TREM2 수준의 차이를 나타냈다. 본 검정은 WT 및 TREM2 조작된 iPSC를 구별하는 기능성 검정으로서 사용될 수 있다.
단순 단계 ELISA (AbCam)를 사용하여 WT 및 TREM2 이형 접합 및 동형 접합 KO 돌연변이체, MECP2HM 및 SNCA-A53T로부터 수집된 조건 배지로부터 해동 후 미세 아교 세포에 의해 분비된 가용성 TREM2 (sTREM2) 단백질의 수준을 정량화하였다 (도 27a). WT 및 TREM2 KO 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3 일차 및 해동 후 7 일차에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3 일차 및 5 일차에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다. 그 데이터는 WT, 이형 접합 TREM2 KO 및 동형 접합 KO 미세 아교 세포 사이의 가용성 TREM2 수준의 차이를 나타냈다. 본 검정은 WT 및 TREM2 조작된 iPSC를 구별하는 기능성 검정으로서 사용될 수 있다. 방출 가용성 TREM2는 A53T-SNCA 미세 아교 세포에서 손상된 반면, MECP2HM 미세 아교 세포는 배지에서 방출된 sTREM 수준의 임의의 변경을 나타냈다 (도 27b).
동종 동계로 조작된 냉동 보존된 미세 아교 세포에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인. WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO A53T-SNCA 및 MeCP2HM 미세 아교 세포로부터 유도된 23 일차에 냉동 보존된 미세 아교 세포를 MDM 배지에 해동하고, 50,000개 세포/웰로 프리마리아 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 100 ng/ml LPS로 자극을 시작하기 전에 세포를 3일 동안 플레이팅하여 M1 매개성 반응을 검사하였다. 자극을 24 시간 동안 삼중복으로 수행하였다. 상청액을 회전시켜 세포와 잔해물 제거하고, 즉시 -20℃에 두었다. 상기 상청액을 다중 Luminex 검정에서 분석하였다. 이러한 멀티플렉스 Luminex 검정의 결과를 도 27c에서 히트 맵으로서 캡처한다. 조작된 계통은 ANH 대조군과 비교하여 보다 높은 수준의 IL-6을 분비하였다. TREM2 HZ 및 TREM2 H2O 및 MeCP2HM 미세 아교 세포는 ANH와 비교하여 보다 적은 TNF 알파를 방출하였지만 IL6 수준을 증가시켰다. A53T-SNCA 미세 아교 세포는 AHN 대조군 미세 아교 세포와 비교하여 유사한 수준의 IL-6 및 TNF 알파를 방출하였다.
모든 조작된 계통은 M1 자극 (LPS)으로 처리될 때 M2 사이토카인 IL-10을 방출하였다. MECP2HM 미세 아교 세포는 AHN 대조군 미세 아교 세포와 비교하여 보다 적은 IL-10을 방출하였다 (도 27e). AHN 및 조작된 미세 아교 세포는 LPS 자극에 대응하여 CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3 알파, CCL4/MIP-1 베타, CCL5/RANTES, CX3CL1/프랙칼카인, CXCL1/GRO 알파, CXCL10/IP-10, CXCL2/GRO베타, IL-8/CXCL8을 방출할 수 있었다. 사이토카인 방출 수준에서 몇 가지 고유한 차이가 있었다. TREM2HO는 알츠하이머병 (AD) 발병 동안 방출되는 주요 분석물인 CCL4의 최고 수준을 나타냈다. MECP2HM, TREM2HZ 및 TREM2HO 미세 아교 세포는 보다 높은 수준의 CXCL1/GRO를 방출하였는데, 이는 미생물 사멸을 보조하고 식세포 작용 동안 염증 반응을 유발하기 위해 보조 세포 유형 과립구를 모집하려는 시도를 시사하며, MECPHM 미세 아교 세포는 IL-8/CXC18의 자발적 분비를 나타냈다. 이러한 분석물은 뇌 손상에서 증가하며, 전염증성 프로테아제 및 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 유도한다. MECPHM 미세 아교 세포는 보다 높은 수준의 IL-6을 분비하였다. 이러한 결과들은 MECPHM이 전염증 반응을 위해 준비된다는 것을 시사한다. 조작된 및 AHN 미세 아교 세포는 LPS에 대응하여 배지에서 유사한 수준의 PDL-1, CD40, FLT-3 및 PDGFAA를 방출하였다.
냉동 보존된 미세 아교 세포를 성숙 배지에서 해동하고, 스크리닝 실험을 수행하기 전에 48 시간 동안 회수하였다 (도 36). TREM2 WT 및 TREM2 HOKO로부터의 5,000개의 미세 아교 세포를 24 시간 동안 40 uL의 배지에서 384웰 플레이트의 웰 당 플레이팅하였다. 제1 세트 (플레이트 1)에서, 상기 세포들을 1 μM 최종 농도로 화합물로 전처리하였다. 상기 세포들을 화합물로 처리한 후 24 시간에, pHrodo 라벨링된 아밀로이드-베타를 1 μM의 최종 농도로 플레이트 1에 첨가하고, 식세포 작용을 96 시간 동안 IncuCyteS3 상에서 캡처하였다 (도 37~39). 제2 세트 (플레이트 2)에서, 상기 세포들을 24 시간 동안 플레이팅한 후 1 μg/mL의 최종 농도로 1 ug/ml LPS로 처리하였다 (도 40~42). LPS에 대한 노출 후 24 시간 및 초기 플레이팅 후 48 시간에 pHrodo 라벨링된 아밀로이드-베타를 1 μM의 최종 농도로 플레이트 2에 첨가하였다. IncuCyte를 사용하여 세포를 최대 96 시간 동안 시간 당 1회 이미지화하였다. 식세포 데이터를 총 적색 물체 통합 강도 (Total Red Object Integrated Intensity) X μM2/이미지로서 캡처하였다. 모든 처리에 대한 최종 부피는 일정하게 유지되었다. 스크리닝의 결과는 도 43에 요약되어 있다.
성숙 배지에서 해동 후 미세 아교 세포 생존에 필요한 사이토카인을 이해하기 위해, 32개의 상이한 배지 제형으로 개략적인 매트릭스를 계획하였다 (도 28). WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포를 250 μl의 미세 아교 세포 기본 배지 또는 MMM, 또는 성숙 배지에서 단일 사이토카인 (도 29), 2개의 사이토카인 (도 30), 3개의 사이토카인 (도 31) 또는 4개의 사이토카인 (도 32)으로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지의 96웰 플레이트에 15,000개 생존 세포의 밀도로 넣었다. 세포 생존의 동력학을 IncuCyte 시스템 상에서 캡처하였다. 2 방울/mL로 희석된 NucGreen Dead를 다양한 배지 조성으로 세포를 함유하는 웰에 첨가하여 시간 경과에 따른 사멸 세포의 수를 캡처하였다. 이미지를 8 시간 마다 캡처하고, 실험을 어떠한 간헐적 공급도 없이 72 시간 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물 중의 사멸 세포를 정량화한다.
도WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포를, 250 μl의 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 A) 또는 MMM (도 33의 B), IL-34로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 26c), IL-34로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 D), MCSF로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 (도 33의 D), 또는 IL-34로만 보충된 기본 배지 (도 33의 C) 또는 MSCF, 또는 IL-34와 MCSF의 조합 (도 33의 E)의 96웰 플레이트에 15,000개의 생존 세포의 밀도로 넣었다. 세포 생존의 동력학을 IncuCyte 시스템 상에서 캡처하였다. 2 방울/mL로 희석된 NucGreen Dead를 다양한 배지 조성으로 세포를 함유하는 웰에 첨가하여 시간 경과에 따른 사멸 세포의 수를 캡처하였다. 이미지를 8 시간 마다 캡처하고, 실험을 어떠한 간헐적 공급도 없이 7일 동안 계속하였다. NucGreen Dead의 강도는 배양물 중의 사멸 세포를 정량화한다.
pHrodo Red 라벨링된 세균성 생체 입자 및 pHrodo Red 아밀로이드 베타로 23 일차에 냉동 보존된, WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포에 대해 기능적 특성화를 평가하였다. WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포를, 250 μl의 MMM (도 33의 A~B), 또는 MSCF만 (도 33의 C~D) 또는 IL-34 (도 33의 E~F) 또는 IL-34와 MCSF의 조합 (도 33의 G~H)으로 보충된 MDM 기본 배지 (AKA 미세 아교 세포 기본 배지)의 96웰 플레이트에 15,000~30,000개의 생존 세포/cm2의 밀도로 해동 후 3일 동안 플레이팅하였다. 희석된 1 μg/웰의 옵소닌 처리되거나 옵소닌 처리되지 않은 pHrodo 생체 입자 (Thermo Fisher # A10010, 바이알 당 2 mg; -20℃에서 보관) (도 33의 A, C, E, G) 또는 pHrodo 아밀로이드 베타 (도 33의 B, D, F, H)로 상기 세포를 처리하였다. 상기 플레이트를 IncuCyte 상에 놓고, 식세포 작용의 이미지를 최대 30 시간까지 다양한 시점에서 촬영하였다. WT 및 조작된 미세 아교 세포는 해동 후 식세포 기능을 나타냈다. 동력학 및 식세포 작용 효율은 WT, 1185 HT TREM2 KO, 1187 HO TREM2 KO 미세 아교 세포 사이에 다양하였다.
성숙 배지에서 2개의 중요한 (IL-34, MSCF) 사이토카인의 조합으로 보충된 미세 아교 세포 기본 배지 또는 MMM의 존재하에 23 일차에 냉동 보존된 야생형 (WT) 미세 아교 세포의 해동 후 순도를 결정하였다 (도 35). 상기 세포를 수확하여 해동 후 3, 7 및 14 일차에 순도를 정량화하고, 상기 세포를 수확하고 유세포 계측에 의한 마커의 세포 표면 및 세포내 염색을 위해 상기 세포를 염색함으로써 분화 과정의 종료시에 CD45, CD33, TREM2, CD11b, CX3CR1, P2RY12, TMEM119, IBA의 순도를 결정하였다. 냉동 보존된 미세 아교 세포는 MSCF 및 IL-34로 보충된 성숙 배지에서 생존력, 순도를 유지한다. 이러한 단순화된 배지는 TREM 뇌 오르가노이드를 발달시키기 위한 뉴런 및 성상 교세포와 함께 냉동 보존된 미세 아교 세포의 공동 배양 적용에 가치있을 것이다.
실시예 8 - 환자 유래 iPSC로부터의 질병 관련 미세 아교 세포 생성
최근 유전학 연구에 따르면, 여러 미세 아교 세포 풍부한 유전자의 다형성이 알츠하이머병 (AD), 파킨슨병 (PD) 및 여러 신경 퇴행성 질환의 발병 위험 변화와 관련이 있는 것으로 나타났다. GWAS 연구의 위험 관련 SNP 목록을 요약하면, APOE 이소형을 따라 TREM2, CD33 및 ABCA7에서 돌연변이를 나타내는 공여자로부터 말기 미세 아교 세포 패널을 생성하였다. 환자 유래 iPSC로부터 유도된 냉동 보존된 미세 아교 세포는 2D 또는 3D 오르가노이드 시스템에서 사람 미세 아교 세포, 뉴런, 성상 교세포 사이의 복잡한 상호 작용을 이해하고 신경 퇴행성 질환을 모방하는 보다 정확한 모델을 생성하는 시험관내 도구를 제공한다 (문헌 [McQuade et al., 2019]).
에피솜적으로 재프로그래밍된 AHN 및 질병 특이적 iPSC로부터 HPC 생성: 정상 및 질병 특이적 공여자로부터 생성된 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC를 조혈 세포 및 후속적으로 미세 아교 세포로의 분화를 위한 원재료에 대해 은행을 제조하기 전에 E8/매트리겔을 사용하여 적어도 5~10회 계대 동안 저산소에 적응시켰다. iPSC 패널의 유전자형은 표 4에 기재되어 있다. 모든 공여자로부터 유래된 iPSC를 핵형으로 분류하고, iPSC 은행을 제조하고 실시예 5에서 기재된 바와 같이 3D HPC 분화 프로토콜을 수행하여 HPC 분화를 개시하였다. 냉동 보존된 HPC를 해동하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 23일 분화 과정에 세포를 놓음으로써 미세 아교 세포를 생성하였다. 다양한 공여자로부터 유도된 냉동 보존 23 일차 미세 아교 세포를 해동하고, 미세 아교 세포 특이적 마커의 존재에 대해 염색하였다. 유세포 계측에 의한 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현 뿐만 아니라 CX3CR1 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2 및 TMEM119의 세포내 발현에 대해 상기 세포들을 염색하였다. 표 5는 모든 AHN 및 질병 관련 미세 아교 세포 (disease associated microglia: DAM) 전체에 걸쳐 수득된 순도를 요약한다. 그 결과는 분화 프로토콜의 변경 없이 건강하고 질병 특이적 공여자 패널로부터 고순도 미세 아교 세포의 생성을 나타낸다.
[표 4]
겉보기에 건강한 정상 (Apparently Healthy Normal: ANH) 및 질병 관련 미세 아교 세포 (DAM) 패널로부터 냉동 보존된 미세 아교 세포의 생성
Figure pct00004
[표 5]
겉보기에 건강한 정상 (ANH) 및 알츠하이머병 (AD) 공여자 샘플의 미세 아교 세포 순도의 개요
Figure pct00005
단순 단계 ELISA (AbCam)를 사용하여 iPSC 공여자 패널에서 생성된 미세 아교 세포로부터 수집된 조건 배지로부터 해동 후 미세 아교 세포에 의해 분비된 가용성 TREM2 (sTREM2) 단백질의 수준을 정량화하였다 (도 45). 겉보기에 건강한 정상 공여자 및 질병 특이적 공여자로부터 생성된 미세 아교 세포를 해동하고, 96웰 프리마리아 플레이트의 성숙 배지에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 해동 후 3 일차 및 해동 후 7 일차에 소비된 배지를 수집하였다. 해동 후 3 일차 및 5 일차에 새로운 성숙 배지를 배양물에 절반 공급하였다.
데이터는 R47H 유전자형을 나타내는 공여자로부터 유래된 미세 아교 세포의 다양한 샘플들 사이의 가용성 TREM2 수준의 차이를 나타냈으며, 해동 후 3 일차에 가용성 TREM 수준의 최고 수준을 나타냈고 해동 후 7 일차에도 높게 유지되었다. 이러한 공여자는 무증상이므로 AHN으로 분류되었지만, iPSC 유도 미세 아교 세포는 높은 수준의 sTREM을 분비하였다. 이러한 데이터는 알츠하이머병 환자의 뇌척수액에서 관찰된 높은 수준의 sTREM2와 일치하며, 이러한 돌연변이 상태와 관련이 있다 (문헌 [Cheng et al., 2016]). 이러한 데이터는 신경 퇴행성 질환의 발병에 대해 스크리닝하는 예측 키트를 설계하는데 iPSC 유도 미세 아교 세포를 사용하는 강력한 예이다. AD의 발병을 나타내는 APOE4/4/ 유전자형을 갖는 젊은 공여자는 동일한 유전자형을 갖는 나이든 공여자와 비교하여 높은 수준의 가용성 TREM을 나타냈다. CD33 또는 ABCA7 유전자 중 SNP의 존재는 상청액 배지에서 가용성 TREM의 방출을 증진시키는 것으로 보이지 않았다. AHN 공여자 12068은 해동 후 3 일차 및 7 일차에 높은 수준의 가용성 TREM을 나타냈다.
신경 염증은 많은 신경 퇴행성 질환의 진행 및 발병 기전에 기여한다. 뇌의 상주 미세 아교 세포와 성상 교세포는 자극과 미세 환경에 따라 뇌에서 전염증 및 항염증 역할을 모두 수행할 수 있는 사이토카인을 방출한다. 전염증 프로파일과 항염증 프로파일 사이의 이러한 변동은 AD 및 기타 신경 퇴행성 질환의 발병과 관련이 있다. 질병 관련 미세 아교 세포 (DAM)에 의해 방출되는 사이토카인 및 케모카인의 수준을 정량화하기 위해, 냉동 보존된 AHN 및 DAM 미세 아교 세포를 MDM 배지에 해동하고, 50,000개 세포/웰로 프리마리아 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. M1 매개성 반응을 확인하기 위해 100 ng/ml LPS로 또는 M2 특이적 반응을 촉발하기 위해 10 uM dBu-cAMP 및 10 ng/ml IL-4로 자극을 시작하기 전에 세포를 3일 동안 플레이팅하였다. 자극을 24 시간 동안 삼중복으로 수행하였다. 상청액을 회전시켜 세포와 잔해물 제거하고, 즉시 -20℃에 두었다. 상기 상청액을 다중 Luminex 검정에서 분석하였다. 이러한 멀티플렉스 Luminex 검정의 결과를 도 27c에서 히트 맵으로서 캡처한다.
케모카인 CCL1 ,CCL2 , CCL3, CCL4, CCL8, CCL11, CCL13,CCL17, CCL18, CCL20, CCL22, CCL24는 화학 유인 물질의 역할을 하고, 골수 세포, 과립구, 림프계 세포 또는 신경 전구 세포를 염증 부위로의 동원을 매개하고, 식세포 반응을 증진시키고, 일반적으로 알츠하이머병 (AD) 또는 다발성 경화증에서 상향 조절된다. LPS 또는 dBu-cAMP에 대응하여 APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 으로부터 유도된 미세 아교 세포는 AHN 계통과 비교하여 보다 높은 수준의 이러한 모든 분석물을 방출하였다. 배수 증가는 다양한 미세 아교 세포 유전자형들 사이에서 0.1 내지 최대 7배까지 다양하였다. 질병 관련 미세 아교 세포의 이러한 데이터는 AD 뇌 샘플에서 CCL2 및 CCL5 발현의 증가를 나타내는 초기 발견을 뒷받침한다. 뇌와 뇌척수액 (CSF)에서의 CCL2 발현은 Westin 등에 의해 AD 중증도의 신뢰 가능한 예측 변수로서 보고되었다.
APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유도 미세 아교 세포는 M2 분극과 관련된 염증 및 염증 질환의 마커인 가용성 CD163을 약간 상승된 수준으로 방출하였다. sCD163의 방출은 단핵구 과다 활성화를 방지하고 전염증성 사이토카인 TNF-알파, IL-1베타, IL-6 및 IL-8의 분비를 감소시킨다. 유사한 경향이 신경 염증 동안 조직 리모델링에 역할을 하는 키티나아제-3에서 관찰되었다 (문헌 [Melief et al., 2012], [Minett et al., 2016]).
PD-L1과 이의 수용체 PD-1은 T 세포 활성화, 내성 및 면역 매개성 조직 손상 사이의 균형을 조절하는 억제 신호를 유도한다. LPS에 대응하여, APOE E4/E4 유래 미세 아교 세포는 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 어떠한 증가도 나타내지 않았다. TREM2 R47H, APOE E2/E4 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유도 미세 아교 세포는 AHN 계통과 비교하여 증가를 나타냈다. IL-4 + dBu-cAMP에 대응하여, APOE E4/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A는 AHN 계통에 비해 약간의 증가를 나타내는 반면, APOE E2/E4 유도 미세 아교 세포는 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 7배 증가를 나타냈다.
APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유도 미세 아교 세포는 신경 염증 동안 TNF-알파 및 산화 질소 수준을 감소시켜 화학 주성, 생존을 촉진하고 신경 보호를 증진시키는 가용성 케모카인, 가용성 프랙탈카인을 약간 상승된 수준을 방출하였다.
APOE E4/E4, AP0E E2/E4 및 ABCA7 G1527A 유도 미세 아교 세포는 LPS와 dBu-cAMP 둘 다에 반응하여 높은 수준의 CXCL1/GRO 알파를 방출한 반면, TREM2 R47H 및 CD33 유도 미세 아교 세포는 방출된 이러한 사이토카인 수준의 미미한 증가를 나타냈으며, 이는 이러한 분석물과 APOE 및 ABCA7 유전자형의 상관 관계를 시사한다. 최근 연구에 따르면, CXCL1은 AD 발병에서 염증 반응에 기여할 수 있지만, 이러한 질병의 발병 기전에서 알츠하이머병에 소인을 부여하는 잠재적인 유전적 요인으로 작용하지 않는다. 생리학적 조건에서, CX3CR1은 활성화를 제한하여 미세 아교 세포의 항상성을 유지한다. 자극 후 방출된 이러한 사이토카인의 높은 수준은 APOE 또는 ABCA7 G1527A 유전자형과 관련된 질병 관련 미세 아교 세포에서 항상성 기능을 보존하기 위해 CX3CR1에 의한 회수 기전의 시작을 나타낸다. 대안으로, APOE E4/E4 및 ABCA7 G1527A 활성화 미세 아교 세포에 의해 분비되는 높은 수준의 CX3CR1은 신경 퇴행을 촉진하는 신호일 수 있다 (문헌 [Atagi et al., 2015]; [Wolfe et al., 2018]).
APOE E4/E4 및 AP0E E2/E4 유도 미세 아교 세포는 LPS 및 IL4/dBu-cAMP 둘 다에 반응하여 높은 수준의 IL-6을 방출하는 반면, 다른 모든 유전자형은 AHN과 유사한 수준의 IL-6을 분비하였다. IL-6 분비는 과립구를 유인하고, 세포 매개 체액성 Th2 반응을 촉진하며, 염증을 촉발시킨다. 이러한 기전은 다시 APOE E4/E4 유전자형과 관련된 보다 큰 신경 염증을 뒷받침한다.
ABCA7 G1527A 유래 미세 아교 세포는 LPS에 반응하여 높은 수준의 IL-1 베타 및 IL-1 알파를 방출하는 반면, 다른 유전자형은 AHN 미세 아교 세포와 유사한 수준을 분비하였다.
APOE E4/E4, AP0E E2/E4 및 ABCA7 G1527A 유래 미세 아교 세포도 또한 dBu-cAMP 보다 LPS에 반응하여 높은 수준의 IL-8/CXCL8을 방출하였다. ABCA7 G1527A 유래 미세 아교 세포는 높은 수준의 IL-8을 방출하였으며, 이는 뇌 손상에 기여하는 전염증 반응의 시작을 시사한다.
미세 아교 세포는 또한 Aβ 침착을 제거하고 알츠하이머병 과정을 제한하여 알츠하이머병에서 신경 보호 역할을 수행할 수 있는 단백질 가수분해 효소와 매트릭스 메탈로프로테이나아제를 분비한다. APOE E4/E4, AP0E E2/E4, TREM2 R47H, ABCA7 G1527A 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 유도 미세 아교 세포는 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 MMP-9 및 MMP-12의 약간 상승된 수준을 방출하였다.
R47H TREM2 유래 미세 아교 세포는 LPS 또는 M1 자극에 의해 자극되었을 때 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 7배 이상 더 많은 IL-12 p70을 방출하였다. 한편, AP0E E2/E4는 IL4+ dBu-cAMP 또는 M2 자극에 대응하여 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 7배 이상 더 많은 IL-12 p70을 방출하였다. 다른 유전자형은 IL-12 분비의 수준에서 약간 증가를 나타냈다. 일차 미세 아교 세포는 감염 동안 또는 CNS의 Th1 세포 매개성 자가 면역 질환에서 면역 반응을 제어하기 위해 뇌에서 IL-12를 생성한다. R47H TREM2 유래 미세 아교 세포에 의한 IL-12의 증가된 수준은 NK-세포 및 T 세포의 세포독성 활성의 강력한 활성화를 시사한다.
마지막으로, APOE E4/E4, AP0E E2/E4, ABCA7 G1527A 유래 미세 아교 세포는 유사하거나 약간 높은 수준의 IL-13, IL-18, IL-23 및 알파 시누클레인 수준을 방출하였으며, 이는 이러한 분석물과 상기에서 언급된 유전자형의 상관 관계 부족을 시사한다.
신경 염증은 알츠하이머병 (AD) 발병 및 진행에 중요한 기여자이다. 여러 염증 매개체의 조합은 특정 SNP 돌연변이와 관련된 고유한 특징을 생성한다. 질병 특이적 공여자 유래의 iPSC 유도 미세 아교 세포는 돌연변이 관련 유전자형 및 다양한 미세 아교 세포 SNP와 관련된 주요 시그니처 사이토카인을 결정하는데 사용될 수 있었다.
미세 아교 세포의 식세포 기능은 신경 보호 효과를 보존하는데 중요하다. 미세 아교 세포 매개성 식세포 작용은 질병 특이적 SNP 또는 돌연변이에 의해 손상될 수 있으며, 이는 결국 뇌의 중요한 항상성 기전에 영향을 미칠 수 있다. 질병 관련 미세 아교 세포 (DAM)의 식세포 기능을 pHrodo 라벨링된 스태필로코커스 아우레우스 세균 및 아밀로이드 베타의 존재하에 평가하여 미세 아교 세포의 식세포 기능에 대한 질병 관련 SNP의 역할을 비교하였다. 이러한 기능은 고속 처리량 스크리닝 적용에 사용될 수 있다.
이러한 미세 아교 세포 발현된 질환 관련 유전자 중에서, 골수 세포 2 (TREM2) 및 APO E 이소형 상에서 발현되는 촉발 수용체를 인코딩하는 유전자의 서열 변이체는 AD에 대한 이례적 위험 증가와 관련이 있다. APOE는 뇌에서 일차 콜레스테롤 담체이며, 지질 수송, 콜레스테롤 항상성 및 시냅스 안정성에 필수적인 역할을 한다. 항-ApoE 면역 요법은 Aβ 응집 및 제거에서 ApoE의 역할을 추가로 뒷받침하는 아밀로이드 축적 및 침착을 억제한다. ApoE 발현은 질병 관련 미세 아교 세포에서 상당히 상향 조절되는 것으로 나타났다. ApoE4/E4 이소형은 시험관 내에서 운동성과 식세포 거동을 상향 조절하여 미세 아교 세포 생리학에 본질적으로 영향을 미치는 것으로 나타났다. ApoE4/E4 과발현은 다른 이소형과 대조적으로 A베타의 감소된 흡수를 나타냈다. 신경 퇴행에서 3번째로 흔한 주요 ApoE 이소형인 ApoE2의 역할은 가족성 AD에서 질병의 발병을 지연시키는 것으로 나타났다. iPSC 유도 미세 아교 세포 기능에 대한 ApoE 이소타입 특이적 효과는 지금까지 철저히 조사되지 않았다.
TREM2는 지질을 감지하고 미엘린 식세포 작용을 매개한다. TREM2의 기능 상실 (loss-of-function: LOF) 변이체는 아밀로이드 플라크 씨딩 증가, 아밀로이드 클러스터링 감소와 관련되어 있으며, ApoE와의 상호 작용 추가는 신호 전달 캐스케이드를 유발하여 기능 손상과 함께 아밀로이드 플라크에서 미세 아교 세포 클러스터링 및 ApoE 축적 감소를 초래한다.
질병 관련 미세 아교 세포 (DAM)의 식세포 기능을 스태필로코커스 아우레우스 세균 및 아밀로이드 베타의 존재하에 평가하여 미세 아교 세포의 식세포 기능에 대한 질병 관련 SNP의 역할을 비교하였다.
동일한 계통에서, ATP 결합 카세트 수송체 A7 (ABCA7)은 게놈 전체 관련 연구에서 후기 발병 알츠하이머병의 감수성 인자로서 식별되었다. ABCA7은 식세포 작용을 매개하고 막 수송에 영향을 미치는 것으로 나타났다. ABCA7은 AD와 강하게 관련되어 있다. 아밀로이드-베타의 식세포 제거가 Abca7-/-마우스에서 손상되었다. ABCA7에서 G1527A 치환과 관련된 미스센스 변이체를 보유한 환자로부터 유래된 iPSC는 BCA7이 변경된 식세포 기능에 대한 뇌의 A베타 항상성 조절에 역할을 한다는 것을 제공한다.
CD33은 미세 아교 세포에서 식세포 작용의 조절을 통해 알츠하이머병 (AD) 감수성과 연결된 면역 조절 수용체이다. TREM2는 미세 아교 세포 생리 및 대사를 조절하는데 있어 CD33의 다운스트림에서 상호 작용하므로, WT 및 CD33 rs3865444 SNP를 발현하는 iPSC 유도 미세 아교 세포는 손상된 식세포 기능과 관련된 CD33의 역할을 검증하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Caldeira et al., 2017]).
냉동 보존된 AHN 및 DAM 미세 아교 세포를 해동하고, 성숙 배지에서 3일 동안 배양하고, pHrodo 라벨링된 아밀로이드 베타 및 pHrodo 스태필로코커스 아우레우스에 노출시켰다. IncuCyte 생 세포 분석 시스템을 사용하여 식세포 작용의 동력학을 측정하였다. 총 적색 물체 통합 강도를 사용하여 기능성 반응을 정량화하였다.
TREM2 R47H 미세 아교 세포 및 ABCA7-G1527A 미세 아교 세포는 AHN 미세 아교 세포와 비교하여 스태필로코커스 아우레우스 세균에 대한 강력한 식세포 능력을 나타냈다. CD33 (rs429358 SNP 보유) 미세 아교 세포는 AHN 미세 아교 세포와 비교하여 스태필로코커스 아우레우스 세균에 대한 유사한 식세포 능력을 나타냈다. TREM2 R47H 미세 아교 세포, ABCA7-G1527A 미세 아교 세포 및 CD33 (rs429358 SNP 보유) 미세 아교 세포는 AHN 미세 아교 세포와 비교하여 아밀로이드 베타의 존재하에 식세포 작용의 강도 감소를 나타냈다.
CW13030EE1 APOE 4/4는 AHN 미세 아교 세포와 비교하여 스태필로코커스 아우레우스 및 아밀로이드 베타에서 보다 높은 식세포 작용 강도를 나타냈다. CW13098AA1 APOE 4/4는 AHN 미세 아교 세포와 비교하여 스태필로코커스 아우레우스 및 아밀로이드 베타 모두에서 보다 낮은 식세포 작용 강도를 나타냈다. CW13005AA1 APOE 2/4 미세 아교 세포는 AHN 유래 미세 아교 세포와 비교하여 아밀로이드 베타에 대한 강력한 식세포 능력과 스태필로코커스 아우레우스에 대한 식세포 작용 감소를 나타냈다. CW13074AA1 APOE 4/4 미세 아교 세포는 AHN 미세 아교 세포와 스태필로코커스 아우레우스에 대한 유사한 식세포 작용 경향, 및 AHN 미세 아교 세포주에 대한 아밀로이드 베타에 대한 약간 상승된 식세포 작용을 나타냈다.
항상성, 전염증성 및 항염증성 미세 아교 세포 서브타입을 표적화하는 유전적 변경에 대한 포괄적인 이해는 새로운 생물학적 통찰력을 제공하며 신경 퇴행성 질환에 대한 면역 조절 치료 접근법에 대한 표적 우선순위 지정을 용이하게 할 수 있다.
실시예 9 - 미세 아교 세포의 추가 특성화
ATP 및 ADP와 같은 세포외 뉴클레오타이드는 "퓨린성 신호 전달" 경로라고 하는 수용체 매개성 경로를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 조직 항상성, 상처 치유, 신경 퇴행, 면역, 염증 및 암과 같은 생리학적 과정은 퓨린성 신호 전달에 의해 조절된다. 세포외 ATP 및 P2 수용체는 미세 아교 세포 활성화 메커니즘에 중요하다. P2X 수용체는 ATP 또는 이의 유도체에 결합하는 이온성 (ionotrophic) 수용체이다. P2Y 수용체 중 하나는 ADP에 반응하는 G-단백질 결합 수용체이다. 병리학적 조건에서, ATP와 같은 뉴클레오타이드는 손상된 세포로부터 방출되거나 누출되며, "나를 발견하라" 또는 "나를 먹어라"라는 신호로서 기능하여 미세 아교 세포에 의한 과정 확장, 화학 주성 및 식세포 작용을 유발한다. P2 수용체 활성화는 또한 인터루킨-1b (IL-1b), 인터루킨-6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 비롯한 미세 아교 세포로부터 사이토카인 생산을 유도한다. 이러한 전염증 매개체는 성상 교세포에서 G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 발현 및 기능을 역학적으로 변화시키는 것으로 나타났다.
미세 아교 세포의 퓨린성 수용체 반응을 특성화하였다. 미세 아교 세포를 미세 아교 세포 분화 배지에서 해동시키고, 200,000개 세포/웰의 세포 현탁액으로 재구성하였다. 384웰 플레이트의 웰 당 15 μl의 미세 아교 세포 현탁액을 첨가하였다. 상기 세포를 상이한 용량 (0~1000 nM)의 BzATP 및 ADP로 처리하였다. BzATP 및 ADP에 대한 반응을 또한 AZ11645373 (P2X7 길항제) 및 AZD1283 (P2Y12 수용체의 강력한 길항제)의 존재하에 측정하였다. 모든 처리의 경우, 상기 화합물 또는 억제제의 4X 스톡 10 ul를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포를 검정 전 30분 동안 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 화합물에 노출시켰다. 한 병의 FLPR 칼슘-6을 검정 완충액 B로 11 ml로 재구성하고, 15 μl의 염료 용액을 상기 화합물의 존재하에 세포 현탁액에 첨가하였다. 상기 세포를 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하고, FDSS μCELL 시스템 상에서 이미징을 수행하였다.
도 44a는 ATP/BzATP 모든 흔적을 갖는 미세 아교 세포를 도시하며, 도 44b는 ATP/BzATP 샘플 흔적을 갖는 미세 아교 세포를 도시한 것이다. 도 44c~44f는 P2X7 길항제 AZ11645373의 존재하에 BzATP, ADP, BzATP, 및 P2X7 길항제 A438079의 존재하에 BzATP에 대한 미세 아교 세포의 반응을 도시한 것이다. 도 44g는 AZD1283의 존재하에 미세 아교 세포에서 기능적 ADP 의존적 반응을 입증하기 위한 용량 의존적 반응을 도시한 것이다.
실시예 10 - iPSC로부터 신경 전구 세포의 생성
시험관내 질병 모델의 성공적인 개발은 환자 유래 iPSC로부터 유도된 대량의 말기 계통의 이용 가능성에 의존한다. 신경 전구 세포 (NPC)는 뉴런과 아교 세포를 생성하는 능력을 갖는 자기 재생 선조 세포이다 (문헌 [Breunig et al., 2011]). 일차 신경 세포 및 iPSC로부터 NPC를 생성하기 위한 다양한 효율을 갖는 많은 확립된 프로토콜이 있다 (문헌 [Shi et al., 2012a], [Shi et al., 2012b]). 최근 프로토콜의 대부분은 SMAD 신호 전달 경로의 억제에 의존한다. 본 출원은 이중 SMAD 억제 경로를 사용하지 않고 외배엽을 향한 iPSC의 자발적 드리프트를 활용하여 다양한 iPSC 계통 전체에 걸쳐 NPC를 생성하는 간단한 프로토콜을 기재한다. 이러한 세포 유형을 생성하는 근거는 이를 iPSC 유도 미세 아교 세포와 쌍을 이루어 정상 및/또는 질병 특이적 iPSC 세포로부터 유래된 접시에서 사람의 뇌 발달과 신경 계통, 미세 아교 세포, 내피 세포, 혈관 주위 세포 및 성상 교세포 사이의 복잡한 세포간 상호 작용을 모방하는 장기 공동 배양 검정을 생성하는 것이다.
본 연구에서, 다중 에피솜적으로 재프로그래밍된 iPSC 계통을 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴 코팅된 플레이트와 E8 배지에서 유지하였다. 신경 전구 세포를 생성하기 위한 분화의 개시 전에 상기 iPSC를 저산소 조건하에 유지하였다. 신경 전구체 분화를 개시하기 위해, iPSC를 수확하고, ROCK 억제제의 존재하에 E8 배지를 사용하여 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트에 15 K/cm2로 씨딩하였다. 상기 세포를 ROCK 억제제의 부재하에 다음 48 시간 동안 배지에 두었다. 다음 단계는 정상 산소 조건하에 배지를 매일 교체하면서 72 시간 동안 3 uM의 CHIR로 보충된 DMEMF12 배지에 iPSC 배양물을 두는 것을 포함하는 사전 조건화 단계를 포함하였다. 사전 조건화 단계 종료시에 세포를 수확하고, 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트 상에서 30 K/cm2로 2D 형식으로 다시 플레이팅하거나 ROCK 억제제의 존재하에 ml 당 0.3 백만개 세포의 밀도로 초저 부착 플레이트 또는 스피너 플라스크를 사용하여 3D 응집체를 생성하였다. 상기 배양물에 정상 산소 조건하에 다음 8일 동안 N2로 보충된 E6 배지를 격일로 공급하였다. 분화 14 일차에, 상기 배양물을 수확하고, TrypLE를 사용하여 개별화하였다. 유세포 계측을 위한 세포 표면 염색에 의한 Tra-162, CD56, CD15의 존재 및 유세포 계측을 위한 세포내 염색에 의한 Sox1, 네스틴, β3 마이크로글로불린 및 Pax-6 발현의 존재에 대해 상기 세포들을 염색하하였다. NPC의 생성과 관련된 다양한 단계는 도 45a에 요약되어 있다. 3개의 iPSC 계통에 걸친 다양한 분화일에 NPC 마커의 출현은 도 45b에 요약되어 있다. 이러한 방법에 의해 유도된 NPC에 대한 마커로서 CD56을 사용하였다. 상기 세포를 CS10을 사용하여 냉동 보존하였으며, 이들은 해동 후 순도 및 증식 잠재력을 유지하였다. 성상 교세포 및 Pan 뉴런을 생성하기 위해 NPC를 다운스트림 분화 프로토콜에 두었다.
Julia 등에 의해 개략적으로 서술된 프로토콜에 따라 NPC로부터 성상 교세포를 분화시켰다. 14 일차에, Science 세포 성상 교세포 배지 (Science Cell Astrocyte Medium)에서 15 k/cm2로 매트리겔 코팅된 6웰 플레이트 상에 NPC 세포를 플레이팅하였다. 상기 플레이트에 격일로 전체 배지 교환을 제공하였다. 6일 마다, 또는 배양물이 약 90% 밀집되었을 때, 상기 플레이트를 Accumax를 사용하여 수확하고, 매트리겔 코팅된 6웰 플레이트 상에 15 k/cm2로 다시 플레이팅하였다. 4회 계대를 위해 상기에서 기재된 바와 같이 배양물에 공급하고 다시 플레이팅하였다. 4회 계대의 종료시, 상기 배양물을 표면 마커 CD44 및 글루타메이트 아스파르테이트 수송체 (glutamate aspartate transporter: GLAST), 및 세포내 마커 아교 세포 원섬유성 산성 단백질 (Glial fibrillary acidic protein: GFAP), 흥분성 아미노산 수송체 1 (Excitatory amino acid transporter 1: EAAT1), 글루타민 신세타아제 (Glutamine Synthetase: GS), 아쿠아포린 4 (AQP4) 및 S100 칼슘 결합 단백질 B (S100β)에 대해 염색하였다 (도 45c).
Slosarek 등에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 14 일차에 NPC로부터 피질 글루타메이트성 뉴런을 생성하였다. 1 μM 사이클릭 AMP, 10 ng/ml 뇌 유래 신경 영양 인자 (brain-derived neurotrophic factor: BDNF) 및 10 ng/ml 아교 세포 유래 신경 영양 인자 (glial-derived neurotrophic factor: GDNF)로 보충된 E6 배지에 NPC를 30일 동안 플레이팅하였다. 추가의 30일 동안 상기 배지를 피질 신경 분화 배지 (E6 배지, 1 μM 사이클릭 AMP, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 100 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자-I 및 2% B27 보충제)로 후속적으로 변경하였다 (문헌 [Brennand et al., 2011]). 피질 글루타메이트성 뉴런이 다양한 iPSC 계통에 대해 14~36 일차 사이에 관찰되었다. β3 튜불린, MAP2 발현의 존재에 대해 염색에 의해 뉴런 배양물의 순도를 확인하였다.
* * *
본 출원에서 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 개시 내용을 고려하여 과도한 실험 없이도 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시 형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본 출원에 기재된 방법들, 이들의 단계들 또는 이들의 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 작용제가 본 출원에서 기재된 작용제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고 문헌
하기 참고 문헌들은, 본 출원에서 제시된 것들을 보완하는 예시적인 절차 또는 기타 세부 사항을 제공하는 정도까지, 본 출원에 참조로 구체적으로 포함된다.
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Claims (122)

  1. 하기 단계들을 포함하는, 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)를 분화시키는 시험관내 방법:
    (a) 상기 iPSC를 세포외 매트릭스 단백질의 부재하에 하전된 표면 상에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 iPSC를 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell: MSC) 또는 조혈 전구 세포 (hematopoietic precursor cell: HPC)로 분화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하전된 표면이 양으로 하전된 표면인, 시험관내 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양으로 하전된 표면이 아민 표면 또는 폴리 L 라이신 표면인, 시험관내 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 양으로 하전된 표면이 질소 함유 작용기를 포함하는, 시험관내 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하전된 표면이 음으로 하전된 표면인, 시험관내 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 음으로 하전된 표면이 카복실 표면인, 시험관내 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 음으로 하전된 표면이 산소 함유 작용기를 포함하는, 시험관내 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하전된 표면이 양으로 하전된 기 및 음으로 하전된 기를 포함하는, 시험관내 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 양으로 하전된 기가 질소 함유 기이고, 상기 음으로 하전된 기가 산소 함유 기인, 시험관내 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하전된 표면이 중합체성 표면인, 시험관내 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 중합체성 표면이 폴리스티렌 표면인, 시험관내 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 무혈청 한정 배지에서 배양되는, 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분화가 블레비스타틴 또는 ROCK 억제제의 존재하에 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 H1152인, 시험관내 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 매트리겔 (MATRIGEL™), 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴 및/또는 콜라겐의 부재하에 수행되는, 시험관내 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에, TREM2의 발현의 파괴된 발현을 갖도록 상기 iPSC를 조작하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  17. 제16항에 있어서, 조작이 TAL 뉴클레아제를 사용하여 TREM2의 엑손 2에 삽입 및 결실을 도입하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)의 파괴된 발현을 갖도록 상기 iPSC를 조작하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 MeCP2의 파괴된 발현이 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 추가로 한정되는, 시험관내 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 알파-시누클레인 (SNCA)의 파괴된 발현을 갖도록 상기 iPSC를 조작하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 SCNA의 파괴된 발현이 미스센스 점 돌연변이에 기인하는, 시험관내 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 미스센스 점 돌연변이가 A53T인, 시험관내 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 선조 세포를 내피 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (a)가 아민 표면 상에서 배양하여 선조 세포를 생성하는 것을 포함하고, 단계 (b)가 내피 분화 배지의 존재하에 카복실 표면 상에서 배양하여 내피 세포를 생성하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 내피 세포가 CD31에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 세포를 뇌 미세 혈관 내피 세포 (brain microvascular endothelial cell: BMEC)로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 세포를 림프관 내피 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 선조 세포를 MSC로 분화시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
  29. 제28항에 있어서, 분화가 상기 선조 세포를 MSC 배지의 존재하에 아민 표면 상에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 MSC가 CD73, CD44 및 CD105에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 분화된 세포 중 적어도 90%가 CD73에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  32. 제28항에 있어서, 상기 MSC를 혈관 주위 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 MSC가 세포외 단백질의 부재하에 세포 주위 세포 배지의 존재하에 배양되는, 시험관내 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 혈관 주위 세포가 NG2, PDGFRβ 및 CD146에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 선조 세포를 HPC로 분화시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 HPC를 미세 아교 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  37. 제36항에 있어서, 분화가 상기 HPC를 미세 아교 세포 분화 배지의 존재하에 중성으로 하전된 표면 또는 초저 부착 표면 상에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지가 IL34, TGF 및 MCSF를 포함하는, 시험관내 방법.
  39. 제37항에 있어서, 분화가 정상 산소에서의 배양을 포함하는, 시험관내 방법.
  40. 제37항에 있어서, 분화가 20~25일 동안인, 시험관내 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 미세 아교 세포가 CD45, CD11b 및 CD33에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 분화된 세포 중 적어도 50%가 CD11b에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 분화된 세포 중 적어도 90%가 CD33에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계 (b)가 세포의 정제를 포함하지 않는, 시험관내 방법.
  45. 제44항에 있어서, 정제가 MACS를 수행하는 것으로 추가로 한정되는, 시험관내 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 의약품 제조 및 품질관리 기준 (good-manufacturing practice: GMP)을 준수하는, 시험관내 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 저산소 조건하에 수행되는, 시험관내 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 사람 유래인, 시험관내 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)~(d) 중 하나 이상이 무이종 (xeno-free) 조건, 무피더 (feeder-free) 조건 및/또는 조건 배지 무함유 조건하에 수행되는, 시험관내 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)~(d)가 각각 무이종 조건, 무피더 조건 및/또는 조건 배지 무함유 조건하에 수행되는, 시험관내 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 단계 (a)~(d)가 각각 한정 조건하에 수행되는, 시험관내 방법.
  52. TREM2, P2RY12, TMEM119, IBA-1 및/또는 CX3CR1에 대해 적어도 90% 양성인 미세 아교 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 미세 아교 세포 집단이 iPSC로부터 분화되는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는, 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 TREM2, APOE, CD33, BIN, ABCA7, SNPS, 또는 신경 퇴행과 관련된 유전자형을 갖는 질병 관련 iPSC 공여자로부터 생성되는, 조성물.
  55. 제52항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 TREM2의 파괴된 발현을 갖는, 조성물.
  56. 제53항에 있어서, 상기 TREM2의 파괴된 발현이 TREM2 발현의 동형 접합 녹아웃으로서 추가로 한정되는, 조성물.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)의 파괴된 발현을 갖는, 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 MeCP2의 파괴된 발현이 MeCP2 단백질의 절단된 돌연변이체로서 추가로 한정되는, 조성물.
  59. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 알파-시누클레인 (SNCA)의 파괴된 발현을 갖는, 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 SCNA의 파괴된 발현이 미스센스 점 돌연변이에 기인하는, 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 미스센스 점 돌연변이가 A53T인, 조성물.
  62. 테스트 화합물을 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 미세 아교 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는, 테스트 화합물을 스크리닝하는 방법.
  63. 제56항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 아밀로이드-베타에 추가로 도입되는, 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단이 LPS에 추가로 도입되는, 방법.
  65. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 혈관 주위 세포 집단을 포함하는 조성물.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 미세 아교 세포, 혈관 주위 세포 및 BMEC를 포함하는 혈액-뇌-장벽 모델.
  67. 하기 단계들을 포함하는, 미세 아교 세포를 생성하는 방법:
    (a) iPSC를 HPC로 분화시키는 단계; 및
    (b) 상기 HPC로부터 CD34 양성 세포를 선택하는 단계; 및
    (c) 상기 HPC를 미세 아교 세포 분화 배지에서 배양하여 미세 아교 세포 집단을 생성하는 단계.
  68. 제67항에 있어서, 상기 HPC가 제1항에 따라 분화되는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 선택이 CD34 양성 세포에 대한 분류를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 분류가 CD34 자성 비드를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제67항에 있어서, 상기 방법이 CD43 양성 세포에 대해 HPC를 분류하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  72. 제67항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지가 IL-34, TGFβ1 또는 M-CSF를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 분화 배지가 200 ng/mL IL-34, 100 ng/mL TGFβ1 및 50 ng/mL M-CSF를 포함하는, 방법.
  74. 제67항에 있어서, 상기 세포가 48 시간 마다 미세 아교 세포 분화 배지를 공급받는, 방법.
  75. 제67항에 있어서, 상기 방법이 ECM 단백질을 포함하지 않는, 방법.
  76. 제67항에 있어서, 상기 미세 아교 세포 집단 내의 상기 세포 중 적어도 90%가 TREM 양성인, 방법.
  77. 제67항에 있어서, 상기 HPC 중 적어도 10%가 미세 아교 세포로 분화되는, 방법.
  78. 제67항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양이 96웰 형식으로 수행되는, 방법.
  79. 제67항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양이 하전된 표면 상에서 수행되는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 하전된 표면이 양으로 하전되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 양으로 하전된 표면이 아민 표면인, 방법.
  82. 제79항에 있어서, 상기 하전된 표면이 음으로 하전되는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 음으로 하전된 표면이 카복실 표면인, 방법.
  84. 제79항에 있어서, 상기 하전된 표면이 양으로 하전된 기 및 음으로 하전된 기를 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 양으로 하전된 기가 질소 함유 기이고, 상기 음으로 하전된 기가 산소 함유 기인, 방법.
  86. 제67항에 있어서, CD200 및/또는 프랙탈카인을 포함하는 배지에서 상기 미세 아교 세포 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 미세 아교 세포를 냉동 보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제67항에 있어서, 상기 HPC가 TREM2의 파괴된 발현을 갖도록 조작된 iPSC로부터 분화되는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 조작이 TAL 뉴클레아제를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  90. 제87항에 있어서, 상기 냉동 보존된 미세 아교 세포가 pHrodo 세균 입자에 대한 식세포 기능을 보유하는, 방법.
  91. 제87항에 있어서, 상기 냉동 보존된 미세 아교 세포가 해동 후 성숙되고 자극제에 반응하고 상청액 배지에서 인터루킨, 케모카인 및 면역 조절 리간드를 분비할 수 있는, 방법.
  92. iPSC로부터 신경 전구 세포 (neural precursor cell: NPC)를 생산하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 배지에서 iPSC를 사전 조건화하는 단계;
    (b) 상기 iPSC를 NPC로 분화시키는 단계
    를 포함하고, 상기 방법이 SMAD 신호 전달의 억제를 포함하지 않는, 시험관내 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 iPSC가 단계 (a) 전에 저산소 조건하에 유지되는, 시험관내 방법.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 iPSC가 ROCK 억제제의 존재하에 씨딩된 (seeded) 다음, 단계 (a) 전에 ROCK 억제제의 부재하에 배양되는, 시험관내 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021, BIO 또는 SB-216763인, 시험관내 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, 시험관내 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 CHIR99021이 3 μM의 농도로 상기 배지에 첨가되는, 시험관내 방법.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전 조건화가 2~4일 동안인, 시험관내 방법.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전 조건화가 3일 동안인, 시험관내 방법.
  100. 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및/또는 단계 (b)의 iPSC가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 코팅된 표면 상에서 배양되는, 시험관내 방법.
  101. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴인, 시험관내 방법.
  102. 제92항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 라미닌 또는 비트로넥틴인, 시험관내 방법.
  103. 제92항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b)가 정상 산소 조건하에 수행되는, 시험관내 방법.
  104. 제92항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 분화가 상기 iPSC를 ECM 단백질 코팅된 표면 상에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 ECM 단백질이 라미닌 또는 비트로넥틴인, 시험관내 방법.
  106. 제92항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 분화가 상기 iPSC를 ROCK 억제제의 존재하에 초저 부착 플레이트 또는 스피너 플라스크 (spinner flask) 상에서 배양하는 것을 포함하는, 시험관내 방법.
  107. 제92항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 5 내지 10일 동안 수행되는, 시험관내 방법.
  108. 제92항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 7일 동안 수행되는, 시험관내 방법.
  109. 제92항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPC에서 Tra-162, CD56, CD15, Sox1, 네스틴, β3 마이크로글로불린 및/또는 Pax-6의 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 방법.
  110. 제92항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPC 중 적어도 70%가 CD56에 대해 양성인, 시험관내 방법.
  111. 제92항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPC를 성상 교세포 또는 뉴런으로 추가로 분화시키는, 시험관내 방법.
  112. 미세 아교 세포 조건화 배지에서 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환을 스크리닝하는 방법.
  113. 제112항에 있어서, 검출이 ELISA를 수행하는 것을 포함하는, 방법.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 미세 아교 세포가 동종 동계로 조작된 iPSC, 또는 질병 관련 SNP 또는 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래되는, 방법.
  115. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세 아교 세포가 제1항 내지 제51항 또는 제67항 내지 제91항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는, 방법.
  116. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군과 비교하여 가용성 TREM2의 증가된 수준이 신경 퇴행성 질환을 검출하는, 방법.
  117. 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환이 알츠하이머병 또는 다발성 경화증인, 방법.
  118. 제1항 내지 제51항 또는 제67항 내지 제91항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 미세 아교 세포를 복수의 후보 제제와 접촉시키는 단계, 및 사이토카인 및/또는 케모카인 수준 및/또는 아밀로이드 베타 식세포 기능을 측정하는 단계를 포함하는, 고처리량 스크리닝을 수행하여 치료제를 식별하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 미세 아교 세포가 동종 동계로 조작된 iPSC 계통으로부터 유래된 냉동 보존된 미세 아교 세포, 질병 관련 SNP를 발현하는 공여자로부터 유래된 미세 아교 세포, 또는 신경 퇴행과 관련된 돌연변이를 발현하는 공여자로부터 유래된 미세 아교 세포인, 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 사이토카인 및/또는 케모카인이 IL6, IL10, IL3, TNFα, IL13, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CX3CL1/프랙탈카인, CXCL1/GROα, CXCL10/IP-10, CXCL2/GROβ 및 IL-8/CXCL8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  121. 제1항 내지 제51항 또는 제67항 내지 제91항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 미세 아교 세포와 내피 세포, 혈관 주위 세포, 성상 교세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 공동 배양물.
  122. 사람 뇌 발달을 모방하기 위한, 제121항의 공동 배양물의 용도.
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