JP2022537278A - 帯電表面を使用して誘導多能性幹細胞から複数の系統を産生するための方法 - Google Patents

帯電表面を使用して誘導多能性幹細胞から複数の系統を産生するための方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、誘導多能性幹細胞から前駆細胞を産生する方法であって、前駆細胞は、内皮細胞、周皮細胞、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ミクログリア又は神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含む、方法を提供する。

Description

本出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６１，６４０号明細書、２０１９年６月２４日に出願された同第６２／８６５，８０６号明細書及び２０２０年６月１２日に出願された同第６３／０３８，５６４号明細書の利益を主張し、これらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、分子生物学及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、誘導多能性幹細胞を分化させる方法に関する。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、再生医療及び医薬品開発に応用するための強力なリソースを提供する。過去１０年間において、インビトロモデルを改善し、異なる系統の発達の初期段階を調査するための潜在的に強力なツールを提供するために、複数の成長成分、細胞外マトリックス及び／又はフィーダー層を使用してｉＰＳＣから複数の系統を生成するための様々な方法が開発されている。
特定の細胞型への効率的なインビトロ分化は、疾患モデリング及び薬物スクリーニングのためのその潜在的な使用にとって鍵となるものである。系統特異的分化の主な成功要因には、定義された条件の使用、最終段階の細胞の優れた表現型及び機能の特性評価、分化のプロセス長の再現性並びにコストが含まれる。したがって、当技術分野では、ヒト多能性幹細胞の系統特異的分化のための効率的な方法が依然として必要とされている。
本開示の特定の実施形態は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を分化させるためのインビトロ方法であって、（ａ）細胞外マトリックスタンパク質の非存在下において帯電表面上でｉＰＳＣを培養すること；及び（ｂ）ｉＰＳＣを内皮細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させることを含むインビトロ方法のための方法及び組成物を提供する。
いくつかの態様において、帯電表面は、正に帯電している。特定の態様において、正に帯電した表面は、アミン表面又はポリＬリジン表面である。特定の態様において、正に帯電した表面は、窒素含有官能基を含む。他の態様において、帯電表面は、負に帯電している。特定の態様において、負に帯電した表面は、カルボキシル表面である。特定の態様において、負に帯電した表面は、酸素含有官能基を含む。いくつかの態様において、帯電表面は、ポリマー表面である。例えば、ポリマー表面は、ポリスチレン表面である。特定の態様において、帯電表面は、正に帯電した基及び負に帯電した基を含む。いくつかの態様において、正に帯電した基は、窒素含有基であり、及び負に帯電した基は、酸素含有基である。
特定の態様において、ｉＰＳＣは、無血清の限定培地で培養される。いくつかの態様において、分化させることは、ブレビスタチン又はＨ１１５２などのＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む。特定の態様において、この方法は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン又はコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を含まないか又は本質的に含まない。
さらなる態様において、方法は、ステップ（ａ）前に、ＴＲＥＭ２、ＭｅＣＰ２及び／又はＳＣＮＡの破壊された発現を有するようにｉＰＳＣを操作することをさらに含む。特定の態様において、操作することは、ＴＡＬヌクレアーゼを使用してＴＲＥＭ２のエクソン２にインデルを導入することを含む。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２の破壊された発現は、ＭｅＣＰ２タンパク質の短縮型変異体としてさらに定義される。特定の態様において、破壊された発現は、Ａ５３Ｔなどのミスセンス点変異によるものである。
いくつかの態様において、方法は、前駆細胞を内皮細胞に分化させることを含む。特定の態様において、ステップ（ａ）は、アミン表面上で培養して前駆細胞を生成することを含み、及びステップ（ｂ）は、内皮分化培地の存在下においてカルボキシル表面上で培養して内皮細胞を産生することを含む。特定の態様において、内皮細胞は、ＣＤ３１について陽性である。
さらなる態様において、方法は、内皮細胞を脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）に分化させることをさらに含む。
いくつかの態様において、方法は、内皮細胞をリンパ性内皮細胞に分化させることをさらに含む。
特定の態様において、方法は、前駆細胞をＭＳＣに分化させることを含む。特定の態様において、分化させることは、ＭＳＣ培地の存在下においてアミン表面上で前駆細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ１０５について陽性である。特定の態様において、分化された細胞の少なくとも９０％は、ＣＤ７３について陽性である。
さらなる態様において、方法は、ＭＳＣを周皮細胞に分化させることをさらに含む。特定の態様において、ＭＳＣは、細胞外タンパク質の非存在下において周皮細胞培地の存在下で培養される。いくつかの態様において、周皮細胞は、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲβ及びＣＤ１４６について陽性である。
いくつかの態様において、方法は、前駆細胞をＨＰＣに分化させることを含む。特定の態様において、方法は、ＨＰＣをミクログリアに分化させることをさらに含む。特定の態様において、分化させることは、ミクログリア分化培地の存在下において、中性に帯電した表面又は超低付着表面上でＨＰＣを培養することを含む。特定の態様において、ミクログリア分化培地は、ＩＬ３４、ＴＧＦ及びＭＣＳＦを含む。いくつかの態様において、分化させることは、正常酸素圧での培養を含む。いくつかの態様において、分化させることは、２０～２５日間にわたるものである。特定の態様において、ミクログリアは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ３３について陽性である。特定の態様において、分化された細胞の少なくとも５０％（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、５０～６０％、６０～７０％又は８０～９０％）は、ＣＤ１１ｂについて陽性である。いくつかの態様において、分化された細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）は、ＣＤ３３について陽性である。
特定の態様において、方法は、細胞の精製を含まない。いくつかの態様において、精製は、ＭＡＣＳを実施することとしてさらに定義される。
特定の態様において、方法は、適正製造基準（ＧＭＰ）に準拠している。いくつかの態様において、方法は、低酸素条件下で実施される。特定の態様において、ｉＰＳＣは、ヒトのものである。
別の実施形態において、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＩＢＡ－１及びＴＲＥＭ２について少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、９０～９３％、９３～９６％又は９６～１００％）陽性のミクログリア細胞集団を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、ミクログリア細胞集団は、実施形態の方法によって産生される。いくつかの態様において、ミクログリア細胞集団は、ＴＲＥＭ２、ＡＰＯＥ、ＣＤ３３、ＢＩＮ、ＡＢＣＡ７、ＳＮＰＳ又は神経変性に関連する遺伝子型を有する疾患関連ｉＰＳＣドナーから生成される。特定の態様において、ミクログリア細胞集団は、ＴＲＥＭ２、ＭｅＣＰ２及び／又はＳＣＮＡの破壊された発現を有する。いくつかの態様において、ＴＲＥＭ２の破壊された発現は、ＴＲＥＭ２発現のホモ接合ノックアウトとしてさらに定義される。特定の態様において、ＭｅＣＰ２の破壊された発現は、ＭｅＣＰ２タンパク質の短縮型変異体としてさらに定義される。いくつかの態様において、ＳＣＮＡの破壊された発現は、Ａ５３Ｔなどのミスセンス点変異によるものである。
さらなる実施形態は、試験化合物をスクリーニングするための方法であって、本実施形態のミクログリア細胞集団に試験化合物を導入することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、ミクログリア細胞集団は、アミロイドベータにさらに導入される。特定の態様において、ミクログリア細胞集団は、ＬＰＳにさらに導入される。
別の実施形態は、本実施形態の方法によって産生された周皮細胞集団を含む組成物を提供する。
さらに別の実施形態において、本明細書では、本実施形態によって産生されたミクログリア、周皮細胞及びＢＭＥＣを含む血液脳関門モデルが提供される。
さらなる実施形態は、ミクログリアを生成するための方法であって、（ａ）ｉＰＳＣをＨＰＣに分化させること；及び（ｂ）ＣＤ３４陽性細胞についてＨＰＣを選別すること；及び（ｃ）ミクログリア分化培地でＨＰＣを培養し、それによりミクログリアの集団を生成することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、ＨＰＣは、本実施形態に従って分化される。特定の態様において、選別することは、ＣＤ３４磁気ビーズを使用することを含む。特定の態様において、方法は、ＣＤ４３陽性細胞についてＨＰＣを選別することを含まない。特定の態様において、方法は、ＥＣＭタンパク質を含まない。
いくつかの態様において、ミクログリア分化培地は、ＩＬ－３４、ＴＧＦβ１又はＭ－ＣＳＦを含む。特定の態様において、ミクログリア分化培地は、２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４、１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１及び５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含む。いくつかの態様において、細胞は、４８時間ごとにミクログリア分化培地をフィードされる。
特定の態様において、ミクログリアの集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、９０～９３％、９３～９６％又は９６～１００％）は、ＴＲＥＭ陽性である。いくつかの態様において、ＨＰＣの少なくとも１０％（例えば、１５％、２０％、２５％、３０％、１０～１５％、１５～２０％又は２０～３０％）は、ミクログリアに分化される。
特定の態様において、ステップ（ｂ）の培養することは、９６ウェル形式で実施される。特定の態様において、ステップ（ｂ）の培養することは、帯電表面上で実施される。いくつかの態様において、帯電表面は、正に帯電している。例えば、正に帯電した表面は、アミン表面である。他の態様において、帯電表面は、負に帯電している。例えば、負に帯電した表面は、カルボキシル表面である。
さらなる態様において、方法は、ＣＤ２００及び／又はフラクタルカインを含む培地中でミクログリアの集団を成熟させることをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、ミクログリアを凍結保存することをさらに含む。
いくつかの態様において、ＨＰＣは、ＴＲＥＭ２の破壊された発現を有するように操作されたｉＰＳＣから分化される。特定の態様において、操作することは、ＴＡＬヌクレアーゼを使用することを含む。
特定の態様において、凍結保存されたミクログリアは、ｐＨｒｏｄｏ細菌粒子に対する食作用機能を保持する。特定の態様において、凍結保存されたミクログリアは、解凍後に成熟し、且つ刺激物質に応答し、且つ上清培地中においてインターロイキン、ケモカイン及び免疫調節リガンドを分泌することができる。
さらなる実施形態は、ｉＰＳＣから神経前駆細胞（ＮＰＣ）を産生するためのインビトロ方法であって、（ａ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む培地中でｉＰＳＣをプレコンディショニングすること；（ｂ）ｉＰＳＣをＮＰＣに分化させることを含み、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害を含まないインビトロ方法を提供する。
いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、ステップ（ａ）前に低酸素条件下で維持される。特定の態様において、ｉＰＳＣは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で播種され、且つその後、ステップ（ａ）前にＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養される。
特定の態様において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ又はＳＢ－２１６７６３である。特定の態様において、ＧＳＫ３阻害剤は、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ又は５μＭ、特に３μＭの濃度などのＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの態様において、プレコンディショニングすることは、１、２又は３日間などの２～４日間にわたるものである。
いくつかの態様において、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）のｉＰＳＣは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質でコーティングされた表面上で培養される。特定の態様において、ＥＣＭタンパク質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチンである。特定の態様において、ＥＣＭタンパク質は、ラミニン又はビトロネクチンである。
特定の態様において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、正常酸素条件下で実施される。いくつかの態様において、分化させることは、ＥＣＭタンパク質でコーティングされた表面上でｉＰＳＣを培養することを含む。特定の態様において、ＥＣＭタンパク質は、ラミニン又はビトロネクチンである。いくつかの態様において、分化させることは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において超低付着プレート又はスピナーフラスコでｉＰＳＣを培養することを含む。特定の態様において、ステップ（ｂ）は、５～１０日間、例えば６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間にわたって実施される。
さらなる態様において、方法は、ＮＰＣにおけるＴｒａ－１６２、ＣＤ５６、ＣＤ１５、Ｓｏｘ１、Ｎｅｓｔｉｎ、β３ミクログロブリン及び／又はＰａｘ－６の発現を検出することをさらに含む。いくつかの態様において、ＮＰＣの少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、７０～８０％、８０～９０％又は９０～１００％）は、ＣＤ５６について陽性である。
さらなる態様において、方法は、ＮＰＣを星状細胞又はニューロンにさらに分化させることを含む。
別の実施形態は、神経変性疾患をスクリーニングする方法であって、ミクログリア馴化培地中の可溶性ＴＲＥＭ２のレベルを検出することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、検出することは、ＥＬＩＳＡを実施することを含む。特定の態様において、ミクログリアは、疾患関連ＳＮＰ又は変異を発現する同質遺伝子操作されたｉＰＳＣ又はドナーに由来する。いくつかの態様において、ミクログリアは、本実施形態の方法又はその態様によって産生される。特定の態様において、対照と比較して増加したレベルの可溶性ＴＥＭは、アルツハイマー病又は多発性硬化症などの神経変性疾患を検出する。
さらなる実施形態は、治療剤を同定するためにハイスループットスクリーニングを実施するための方法であって、本実施形態又はその態様の方法によって産生されたミクログリアを複数の候補薬剤と接触させることと、サイトカイン及び／若しくはケモカインレベル並びに／又はアミロイドベータ食作用機能を測定することとを含む方法を提供する。
いくつかの態様において、ミクログリアは、凍結保存されている、同質遺伝子操作されたｉＰＳＣ系統に由来するミクログリア、疾患関連ＳＮＰを発現するドナーに由来するミクログリア又は神経変性に関連する変異を発現するドナーに由来するミクログリアである。いくつかの態様において、サイトカイン及び／又はケモカインは、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ３、ＴＮＦα、ＩＬ１３、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ及びＩＬ－８／ＣＸＣＬ８からなる群から選択される。
本明細書では、本実施形態のミクログリア及びその態様と、内皮細胞、周皮細胞、星状細胞及び／又は神経前駆細胞とを含む共培養物も提供される。別の実施形態は、ヒトの脳の発達を模倣するための、その共培養の使用を提供する。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び修正形態は、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
２Ｄ及び３Ｄ ＨＰＣ分化プロセスの概略図。
２Ｄ又は３ＤＨＰＣ分化プロセスに由来する６日目のＨＰＣからの内皮細胞の誘導の概略図。 ＣＤ３１+ＭＡＣＳを使用せずに連続継代精製を使用して生成された内皮細胞の特性評価。 （図４Ａ）再プレーティング３の終わりにおける細胞の形態。内皮細胞は、再プレーティング継代数２又は３の終わりに凍結保存することができる。（図４Ｂ）内皮細胞の誘導に使用される培地配合。 （図５Ａ）ＭＳＣ分化プロセスの概要。（図５Ｂ）ＭＳＣを生成するための培地配合。（図５Ｃ）ＭＳＣの脂肪細胞、骨細胞及び軟骨への三系統分化を示す概略図。（図５Ｄ）６日目のＭＳＣ前駆体の表現型の特徴付け。 アミン表面でのＭＳＣの純粋な集団の出現。凍結保存された６日目のＨＰＣ又は６日目の分化の終わりにおける生培養物は、アミン帯電プレート表面上において１ｕＭ Ｈ１１５２（又はブレビスタチン）の存在下でＭＳＣ培地の存在下に置かれる。培養物は、Ｐ４で正常酸素圧及び正常組織培養プレートに移行された。ＭＳＣの純度仕様は、Ｐ５で達成された。 表面ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｄ並びに内皮マーカーＣＤ３１及びＣＤ１４４の欠如について染色された細胞。凍結保存された６日目のＨＰＣ又は６日目の分化の終わりにおける生培養物は、アミン帯電プレート表面上において１ｕＭ Ｈ１１５２（又はブレビスタチン）の存在下でＭＳＣ培地の存在下に置かれる。培養物は、Ｐ５で正常酸素圧及び正常組織培養プレートに移行された。ＭＳＣの純度仕様は、Ｐ６で達成された。 （図８Ａ）三系統の可能性。ＭＳＣから脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞を生成するための様々なステップ。（図８Ｂ）ＭＳＣの三系統の可能性、骨細胞のアリザリンレッド、軟骨細胞のアルシアンブルー及び脂肪細胞のオイルレッドＯ染色を示す画像。（図８Ｃ）ＭＳＣを１，０００細胞／ｃｍ2でＭＳＣ分化培地にプレーティングし、隔日で１０～１４日間フィードする。クリスタルバイオレットを使用して染色されたプレート及びコロニーの総数を数えた。 ＭＳＣの周皮細胞への変換。（図９Ａ）ｉＣｅｌｌ ＭＳＣをｉＰＳＣ由来の周皮細胞に変換するプロセスの概略図。（図９Ｂ）ｉＰＳＣ由来周皮細胞を生成するための培地配合。（図９Ｃ）ｉＣｅｌｌ ＭＳＣ、ｉＰＳＣ由来周皮細胞及びＳｃｉｅｎＣｅｌｌ初代ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）における公知の周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２及びＣＤ１４６の比較フローサイトメトリー。解凍時にｉＣｅｌｌＭＳＣの周皮細胞マーカーが存在せず、周皮細胞培地でＰ１の終わりまでに周皮細胞マーカーが得られた。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、初代ＨＢＶＰよりも周皮細胞特異的マーカーの純度が高いことを示す。（図９Ｄ）明視野顕微鏡によるｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（Ｐ２）、ｉＰＳＣ由来周皮細胞の形態（Ｐ１）及びＳｃｉｅｎＣｅｌｌ初代ＨＢＶＰ形態。（図９Ｅ）表現型及びマーカー発現に基づくＰＣ１及びＰＣ２周皮細胞サブタイプの違いを説明する表。（図９Ｆ）ｉＰＳＣ由来周皮細胞は、周皮細胞サブタイプ特異的マーカーＣＤ２７４、ＶＣＡＭ１、デスミン、ＤＬＫ１及びαＳＭＡ並びに一般的な周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２、ＣＤ１３及びＣＤ１４６について、解凍直後及び解凍の５日後にフローサイトメトリーによって染色された。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、収縮性周皮細胞、サブタイプＰＣ２の特性を明らかにする。（図９Ｇ）食作用アッセイにおけるｉＰＳＣ由来周皮細胞のＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージングシステム画像。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、対照レベルを超える黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生体粒子の観察可能な食作用活性を示す。（Ａ）ｉＰＳＣ由来の周皮細胞のみの対照。（Ｂ）ｉＰＳＣ由来の周皮細胞＋ＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄ ４８８（ＮＧ）試薬対照。（Ｃ）ｉＰＳＣ由来の周皮細胞＋黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（ＢＰ）。（Ｄ）ｉＰＳＣ由来の周皮細胞＋ＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄ ４８８試薬（ＮＧ）＋黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（ＢＰ）。細胞播種から３６日１６時間後の時点から取得された全ての画像。（図９Ｈ）ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアによって分析された総赤色オブジェクト統合強度を介した食作用活性の定量化。 脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の生成。（図１０Ａ）脳微小血管内皮細胞の生成の概略図。（図１０Ｂ）ＥＣＲＡ培地の組成。（図１０Ｃ）Ｇｌｕｔ１／ＣＤ３１の共発現によるＢＭＥＣのフローサイトメトリー分析。（図１０Ｄ）１３日目のＰ糖タンパク質（緑）発現を伴うＢＭＥＣの免疫組織化学的染色。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３４２で染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）によって２００×の倍率で画像を取得した。（図１０Ｅ）プレーティング後の数日間にわたってＴＥＥＲ値を測定することによるＢＭＥＣの機能的特性評価。（図１０Ｆ）プレコンディショニングステップ及びＥＣＭを使用せずに帯電表面にプレーティングすることを含む代替の方法を使用した脳微小血管内皮細胞の生成の概略図。帯電表面でＢＭＥＣの生成を誘導するための改変培地の説明。（図１０Ｇ）異なる帯電表面上の７日目の分化中の脳微小血管内皮細胞を回収し、ＣＤ３１、ｐ糖タンパク質／及びＧｌｕｔ－１発現の存在及び多能性マーカー（ＴＲＡ－１８１）発現の不存在について染色することにより、純度を定量化した。 ３Ｄ分化プロセスを使用したＨＰＣのスケールアップ及びそれに続くＣＤ３４＋磁気ビーズを使用した精製。ＣＤ３４磁気ビーズを使用したＨＰＣのスケールアップ及び選別の概略図。手動及びＣｌｉｎｉＭＡＣを介した分離による選別プロセスの効率が示される。実行ごとのＨＰＣの実際の純度（選別された画分中のＣＤ３４陽性細胞のパーセンテージで測定）及びプロセスの効率が概説される。 ミクログリア分化のための培地配合。 （図１３Ａ）ＣＤ３４＋で選別されたＨＰＣからのミクログリアの誘導の概略図。ＨＰＣは、ミクログリア分化培地ＭＤＭ上に置いた。培養物には、４８時間ごとにＭＤＭ又は２×ＭＤＭをフィードした。培養は、分化の１２日目に分割され、２Ｄ分化は、２３日目まで継続された。２３日目に細胞を回収し、ミクログリア培養物の純度マーカーの存在について染色した。残りの培養物は、凍結保存された。ミクログリア培養物の純度は、凍結保存の前後に定量化された。（図１３Ｂ）ミクログリア分化培地及びミクログリア分化培地が示される。 凍結保存前後のＭＤＭ培地の存在下でのミクログリア純度評価。２３日目分化のミクログリア培養物を回収し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。残りの細胞は、コントロールレートフリーザーを使用して凍結保存された。凍結保存された細胞を解凍し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。両方のセットについての、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２及びＣＤ１１ｂの細胞表面発現（図１４Ａ）並びにフローサイトメトリーによるＣＸ３ＣＲ１ ＰＵ．１、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＲＥＭ２及びＴＭＥＭ１１９の細胞内発現。 手動対コントロールレートフリーザーを使用した凍結保存後のミクログリアの回収率。ＨＰＣを培地中に置き、ＭＤＭの存在下でミクログリアの分化を開始した。細胞は、手動凍結プロトコル又はコントロールレートフリーザー（ＣＲＦ）を使用して、分化の２０日目（図１５Ｂ）、２３日目（図１５Ｂ）及び２６日目（図１５Ｃ）に凍結保存された。凍結保存された細胞を１週間液体窒素に移した。凍結保存されたミクログリアを解凍し、ミクログリア成熟培地（ＭＭＭ）中に置いた。培養物には、４８時間ごとに新鮮な成熟培地をフィードした。解凍後３、５、７、１０、１２及び１４日目に細胞を回収し、最初のプレーティング数に関して生細胞の回収率を定量化した。 ＨＰＣをミクログリアに変換する効率。凍結保存されたＨＰＣは、ＭＤＭの存在下でミクログリアに分化した（Ｎ＝４）。インプットＨＰＣ及びアウトプットミクログリアの総生存数を定量化した。プロセス効率は、ミクログリア分化の２３日目に存在するＴＲＥＭ２陽性細胞の純度及び絶対数をインプット生ＨＰＣの絶対数で割ったものに基づいて計算された。 解凍時、解凍後３日及び解凍後１０日の、２０日目（図１７Ａ）、２３日目（図１７Ｂ）及び２６日目（図１７Ｃ）に手動又はコントロールレートフリーザーの存在下で凍結保存されたミクログリアの純度分析。２０、２３及び２６日目に凍結保存されたミクログリアを解凍し、ミクログリア成熟培地で３、５、７、１０及び１２日間プレーティングした。フローサイトメトリーにより、細胞をＰｕ１、ＩＢＡ、ＣＸ３ＣＲ及びＰ２ＲＹ１２発現の存在について染色した。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生体粒子による食作用アッセイを設定するための、解凍後、０日目（図１８Ａ）及び３日目（図１８Ｂ）に手動又はコントロールレートフリーザーの存在下で凍結保存されたミクログリアの手動血球計算盤による生細胞カウント。 手動又はコントロールレートフリーザーを使用して、分化の２０日目、２３日目及び２６日目に凍結保存されたミクログリアの機能的特性評価。凍結保存されたミクログリアを解凍し、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地の存在下において、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後５日までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。コントロールレートフリーザー法で凍結保存された細胞は、より強力な食作用を示す（細胞の生存率がより高いため）。手動凍結保存法では、全ての条件で食作用の速度が低下／右シフトしていることが明らかになった（細胞生存率が低いため）。 ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムでのライブイメージングを介して評価された、１４日目のミクログリア並びに手動又はコントロールレートフリーザーを使用した分化の２０日目、２３日目及び２６日目に凍結保存されたミクログリアの機能的特性評価。凍結保存されたミクログリアを解凍し、ＭＭＭで３日間プレーティングした。図１８Ｂに記載されているように、３日間の終わりに生細胞数を測定した。１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地（ＭＭＭ）の存在下で１５，０００個の生細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞には、４８時間ごとにＭＭＭの新鮮な５０μｌの培地がフィードされた。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後５、７及び１４日までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。手動凍結保存法では、全ての条件で食作用の速度が低下／右シフトしていることが明らかになった（細胞生存率が低いため）。 食作用効率比は、解凍後のサンプルからの食作用性赤血球数を総細胞数で割ることによって決定された。 ｐＨｒｏｄｏアミロイドベータを使用した凍結保存ミクログリアの機能的特性評価。凍結保存された２３日目のミクログリアを解凍し、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地の存在下において、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞／ウェルでプレーティングした。細胞をｐＨｒｏｄｏアミロイドベータで処理した。対照セットには、ｐＨｒｏｄｏアミロイドベータを含まない培地を含む細胞が含まれていた。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後２４時間までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。 ＥＣＭの非存在下における、スクリーニング適用に適した９６ウェル形式でのＨＰＣのミクログリアへの分化の小型化。ＨＰＣのミクログリアへの分化（図２３Ａ）及び実験で使用された異なる帯電表面の概略図。超低付着（ＵＬＡ）、組織培養（ＴＣ）及び非組織培養（非ＴＣ）血管（図２３Ｂ）。 様々な帯電表面の存在下での２３日目のミクログリアの最終段階の純度分析。凍結保存されたＨＰＣは、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア分化培地の存在下において、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレート又は超低付着組織培養（ＴＣ）若しくは非組織培養プレート（非ＴＣ）上に２０，０００～３５，０００生細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングされた。次の２３日間の分化のために、細胞に１ウェルあたり５０μｌのＭＤＭを４８時間ごとにフィードした。２３日目に冷ＰＢＳで細胞を回収し、自動セルカウンターを使用して総生細胞数を定量した。細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２の表面発現及びＴＲＥＭ２、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９の細胞内発現について染色された。 凍結保存されたミクログリアによって放出されるサイトカイン及びケモカイン。２３日目の凍結保存ミクログリアをＭＤＭ培地中に解凍し、５０，０００細胞／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ９６ウェルプレートにプレーティングした。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び５０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマによる刺激を開始する前に細胞を３日間プレーティングした。刺激は、２４時間にわたって３回行った。上清をスピンダウンして細胞及び破片を除去し、直ちに－２０℃に置いた。上清を多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。複数のＷＴバッチ（図２５Ａ）及びＷＴ、ホモ接合及びヘテロ接合ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）、ＭＥＣＰ２ ＨＭ及びＡ５３Ｔ－ＳＮＣＡ操作系統（図２５Ｂ）の平均が示される。 ホモ接合及びヘテロ接合ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）、ＭＥＣＰ２及びＡ５３Ｔ－ＳＮＣＡ操作系統の複数のバッチに由来する凍結保存ミクログリアをＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＴＲＥＭ２及び細胞内マーカーＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２及びＴＭＥＭ１１９の表面発現の存在について染色した。操作されたｉＰＳＣ株は、フローサイトメトリーによるＴＲＥＭ２の同等の発現を明らかにした。 （図２７Ａ）野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合体（ＨＴ）及びホモ接合体（ＨＯ）のＴＲＥＭ２ ＫＯで操作されたｉＰＳＣに由来する凍結保存されたミクログリアにおける可溶性ＴＲＥＭ２の放出。可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）のレベルは、ＷＴ及びＴＲＥＭ２ヘテロ接合及びホモ接合ＫＯ変異体の馴化培地からＳｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用して定量化された。ＷＴ及びＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを解凍し、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。（図２７Ｂ）野生型（ＷＴ）、ＭＥＣＰ２ ＨＭ及びＡ５３Ｔ－ＳＮＣＡで操作されたｉＰＳＣに由来する凍結保存されたミクログリアにおける可溶性ＴＲＥＭ２の放出。可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）のレベルは、ＷＴ、ＭＥＣＰ２ ＨＭ及びＡ５３Ｔ－ＳＮＣＡ操作株の馴化培地からＳｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用して定量化された。ミクログリアを解凍し、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。 ＷＴ、ＨＴ及びＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯで操作されたミクログリアＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯの生存動態を研究するための培地配合のリスト。ミクログリアは、サイトカイン製剤の３２の異なるバリエーションを含む２５０μｌのミクログリア基本培地中、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１５，０００生細胞の密度で配置された。細胞生存の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムで取得された。２滴／ｍＬに希釈したＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄを、様々な培地組成で細胞を含む全てのウェルに添加して、経時的な死細胞の数を取得した。画像は、８時間ごとに取得され、実験は、断続的なフィードなしで７２時間継続された。 ＷＴ（図２９Ａ）、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図２９Ｂ）、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図２９Ｃ）ミクログリア細胞の生存動態。 ２つのサイトカインを伴う、ＷＴ（図３０Ａ）、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３０Ｂ）、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３０Ｃ）ミクログリア細胞の生存動態。 ３つのサイトカインを伴う、ＷＴ（図３１Ａ）、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３１Ｂ）、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３１Ｃ）ミクログリア細胞の生存動態。 ４つのサイトカインを伴う、ＷＴ（図３２Ａ）、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３２Ｂ）、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯ（図３２Ｃ）ミクログリア細胞の生存動態。 ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを、２５０μｌのミクログリア基本培地（図３３Ａ）、又はＭＭＭ（図３３Ｂ）若しくはＩＬ－３４を補充したミクログリア基本培地（図３２Ｃ）、又はＩＬ－３４を補充したミクログリア基本培地（図３３Ｄ）、又はＭＣＳＦを補充したミクログリア基本培地（図３３Ｄ）、又はＩＬ－３４のみを補充した基本培地（図３３Ｃ）、又はＭＳＣＦ又はＩＬ－３４とＭＣＳＦの組み合わせ（図３３Ｅ）中、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞の密度でプレーティングした。細胞生存の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムで取得された。２滴／ｍＬに希釈したＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄを、様々な培地組成で細胞を含む全てのウェルに添加して、経時的な死細胞の数を取得した。画像は、８時間ごとに取得され、実験は、断続的なフィードなしで７日間継続された。ＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄの強度は、培養物中の死細胞を定量化する。 ２３日目にｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識細菌ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ及びｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄアミロイドベータで凍結保存したＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアの機能的特性評価。ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを、解凍後３日間、２５０μｌのＭＭＭ（図３４Ａ～Ｂ）若しくはＭＳＣＦのみを補充したＭＤＭベース（別名ミクログリア基本培地）（図３４Ｃ～Ｄ）又はＩＬ－３４（図３４Ｅ～Ｆ）或いはＩＬ－３４とＭＣＳＦの組み合わせ（図３４Ｇ～Ｈ）中、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）（図３４Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はｐＨｒｏｄｏアミロイドベータ（図３４Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、３０時間までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。ＷＴ及び操作されたミクログリアは、解凍後の食作用機能を明らかにした。食作用の動態及び効率は、ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリア間で異なっていた。 簡易成熟培地におけるミクログリア培養物の純度。成熟培地中の２つの重要な（ＩＬ－３４、ＭＳＣＦ）サイトカインの組み合わせを補充したＭＭＭ又はミクログリア基本培地の存在下での２３日目の凍結保存された野生型（ＷＴ）ミクログリアの解凍後の純度。純度は、細胞を回収することによって解凍後３、７及び１４日目に定量化され、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＩＢＡの純度は、分化プロセスの最後に細胞を回収し、細胞表面について細胞を染色し、マーカーを細胞内染色することにより、フローサイトメトリーで決定された。凍結保存されたミクログリアは、ＭＳＣＦ及びＩＬ－３４を補充した成熟培地で生存率、純度を保持する。この単純化された培地は、脳オルガノイドであるＴＲＥＭを開発するために、凍結保存されたミクログリアとニューロン及び星状細胞との共培養適用に役立つ。 （図３６Ａ）凍結保存されたミクログリアを用いたスクリーニング実験を示す概略図。（図３６Ｂ）スクリーンで試験された化合物の表。 ＧＷ５０１５１６（図３７Ａ）、ロイセチンＬ４１（図３７Ｂ）、ピセアタンノール（図３７Ｃ）及びアゼリラゴン（図３７Ｄ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 Ｊ１４７（図３８Ａ）、ジブチリル－ｃＡＭＰ（図３８Ｂ）、イスラジピン（図３８Ｃ）及びベキサロテン（図３８Ｄ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 ＳＢ－４３１５４２（図３９Ａ）、ＳＰ６００１２５（図３９Ｂ）、ＧＷ２５８０（図３９Ｃ）、ＰＰ２（図３９Ｄ）及びＳＢ２３９０６３（図３９Ｅ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 ＬＰＳ刺激を伴う、ＧＷ５０１５１６（図４０Ａ）、ロイセチンＬ４１（図４０Ｂ）、ピセアタンノール（図４０Ｃ）及びアゼリラゴン（図４０Ｄ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 ＬＰＳ刺激を伴うＪ１４７（図４１Ａ）、ジブチリル－ｃＡＭＰ（図４１Ｂ）、イスラジピン（図４１Ｃ）、ベキサロテン（図４１Ｄ）及びＳＢ－４３１５２（図４１Ｅ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 ＬＰＳ刺激を伴うＳＰ６００１２５（図４１Ａ）、ＧＷ２５８０（図４２Ｂ）、ＰＰ２（図４２Ｃ）及びＳＢ２３９０６３（図４２Ｄ）を用いたミクログリアスクリーニング実験の結果。 ミクログリアスクリーニング実験結果の概要。 （図４４Ａ）ＡＴＰ／ＢｚＡＴＰ全トレースを有するミクログリア － 比率。（図４４Ｂ）ＡＴＰ／ＢｚＡＴＰサンプルトレースを有するミクログリア － 比率。（図４４Ｃ）ミクログリアにおけるＢｚＡＴＰへの応答。（図４４Ｄ）ミクログリアにおけるＡＤＰへの異なる応答。（図４４Ｅ）Ｐ2Ｘ7アンタゴニストＡＺ１１６４５３７３の存在下での１００μＭのＢｚＡＴＰによる応答。（図４４Ｆ）Ｐ2Ｘ7アンタゴニストＡ４３８０７９の存在下での１００μＭのＢｚＡＴＰによる応答。（図４４Ｇ）ＡＺＤ１２８３（Ｐ２Ｙ12受容体の強力なアンタゴニスト）の存在下でのミクログリアの機能的なＡＤＰ依存性応答を示すための用量依存性応答。
ＡＮＨ及び疾患関連ミクログリアに由来する凍結保存ミクログリアにおける可溶性ＴＲＥＭ２の放出を、解凍後３日目（図４５Ａ）又は７日目（図４５Ｂ）に収集された馴化培地から、Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用して定量化した。ＡＮＨ及びＤＡＭに関連するミクログリアを解凍し、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。
ＡＮＨに由来する凍結保存されたミクログリア及びｉＰＳＣドナーのパネルからの疾患関連ミクログリアによって放出されたサイトカイン及びケモカイン。２３日目に凍結保存ミクログリアをＭＤＭ培地中に解凍し、５０，０００細胞／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ９６ウェルプレートにプレーティングした。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ又はＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰによる刺激を開始する前に細胞を３日間プレーティングした。刺激は、２４時間にわたって３回行った。上清をスピンダウンして細胞及び破片を除去し、直ちに－２０℃に置いた。上清を多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。ＬＰＳで刺激した際のＭ１分析物（図４６Ａ）、Ｍ２分析物（図４６Ｂ）、インターロイキン（図４６Ｃ）、ケモカイン（図４６Ｄ）及び他の分析物（図４６Ｅ）の放出。ＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰで刺激した際のＭ１分析物（図４６Ｆ）、Ｍ２分析物（図４６Ｇ）、インターロイキン（図４６Ｈ）、ケモカイン（図４６Ｉ）及び他の分析物（図４６Ｊ）の放出。
ｐＨｒｏｄｏ標識黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）生体粒子及びアミロイドベータを使用したＡＨＮ及び疾患関連ミクログリアの食作用機能の実証：凍結保存されたＡＨＮ及び疾患関連ミクログリアを３８４ウェルのポリ－Ｄ－リジンプレートの１ウェルあたり５，０００細胞でプレーティングした。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生体粒子を０．５μｇ／ｍＬで各ウェルに添加し、アミロイドベータを１Ｍ／ウェルで添加した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生体粒子及びアミロイドベータの食作用の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析システムを使用した総赤色オブジェクト統合強度を使用して定量化された。（図４７Ａ）（ＡＮＨ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、（図４７Ｂ）（ＡＮＨ、アミロイドベータ）、（図４７Ｃ）（Ｒ４７Ｈ対ＡＮＨ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、（図４７Ｄ）（Ｒ４７Ｈ対ＡＮＨ、アミロイドベータ）、（図４７Ｅ）（ＣＤ３３対ＡＮＨ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、（図４７Ｆ）（ＣＤ３３対ＡＮＨ、アミロイドベータ）、（図４７Ｇ）（ＡＢＣＡ７対ＡＮＨ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、（図４７Ｈ）（ＡＢＣＡ７対ＡＮＨ、アミロイドベータ）、（図４７Ｉ）（ＡＰＯＥアイソフォーム対ＡＮＨ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、（図４７Ｊ）（ＡＰＯＥアイソフォーム対ＡＮＨ、アミロイドベータ）。
（図４８Ａ）二重ＳＭＡＤ阻害を用いずにｉＰＳＣから神経前駆細胞（ＮＰＣ）を生成する方法の概略的な説明。関係する様々なステップ及び使用される培地の組成について説明する。（図４８Ｂ）３つのｉＰＳＣ株にわたるＮＰＣの出現の動態の概要。多能性マーカーの減少及び分化プロセスの異なる日におけるＮＰＣ固有のマーカーの出現。細胞表面染色及び細胞内染色によってフローサイトメトリーで実施される純度の定量化。（図４８Ｃ）培養物の複数の継代にわたるＮＰＣに由来する星状細胞の染色。細胞表面染色及び細胞内染色によってフローサイトメトリーで定量化された星状細胞の純度。（図４８Ｄ）ＮＰＣのニューロンへの分化及び細胞内フローサイトメトリーによる末期ニューロンの純度の定量化。
ｉＰＳＣ由来細胞系統の誘導に適合する表面の概要。
特定の実施形態において、本開示は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から内皮細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの複数の系統の細胞を産生するための方法を提供する。一般に、方法は、帯電表面を使用することにより、ｉＰＳＣを様々な系統の細胞に分化させることを含む。具体的には、分化方法は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の非存在下であり得、ＭＳＣ及び内皮細胞の産生などのための継代による自己精製を可能にする。
さらなる実施形態において、内皮細胞の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）又はリンパ管内皮細胞への分化、ＭＳＣの周皮細胞への分化及びＨＰＣのミクログリアへの分化のための方法が提供される。このプロセスにより、ＭＡＣＳ精製などの精製又はＥＣＭタンパク質の使用なしに内皮細胞及びＭＳＣを効率的に生成することができる。プロセスは、適正製造基準（ＧＭＰ）への準拠に適合させることができる。
内皮細胞は、血管、リンパ管を覆い、毛細血管を形成する、人体の相互接続された細胞のネットワークを構成する。内皮細胞は、栄養物質の流れを調節し、多様な生物学的に活性な分子を作製及びそれに応答し、血管毒性、血管透過性並びに組織虚血の処置及び移植片のバイオエンジニアリングを含む治療用途について化合物及び薬物をスクリーニングするためのツール空間での潜在的な用途を提供する。内皮細胞を誘導するために使用される多くのプロトコルがある。ほぼ全てのプロセスにおいて、内皮細胞の純粋培養物を生成するために、ＣＤ３１マイクロビーズを使用した磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣ）分離が必要である。
特定の実施形態において、本開示は、２段階プロセスにより、エピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣなどのｉＰＳＣから内皮細胞の純粋な集団を生成するための方法を提供する。ｉＰＳＣ細胞は、正に帯電したアミン表面で造血前駆細胞（ＨＰＣ）に変換され、その後、負に帯電したカルボキシル表面の存在下で内皮細胞がさらに増殖及び続いて精製される。内皮細胞は、ＭＡＣ精製ステップなしで造血性内皮細胞に由来し得る。細胞は、ＣＤ３１／ＣＤ１４４／ＣＤ１０５を高純度で発現し、増殖させて純度を維持し、初期及び後期継代で凍結保存することができる。
成人ヒト組織から分離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、インビトロで増殖し、その多能性を維持することができるため、再生医療にとって魅力的な細胞源になる。ただし、現在の調製方法では、自己複製の可用性及び機能が制限されている。ｉＰＳＣは、現在、ＭＳＣと同様の代替細胞源を提供する。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＧＭＰ適合条件を使用して、正に帯電したアミン表面で中胚葉分化を開始することにより、エピソーム的に再プログラムされたｉＰＳＣなどのｉＰＳＣからＭＳＣを分化させるための方法を提供する。このプロセスによって得られたＭＳＣは、ＭＳＣ系統の全ての純度マーカーを発現し、自己複製及び多能性を示す。これらの細胞は、臨床応用のためにスケールアップすることができる。
さらなる実施形態において、本開示は、ＭＳＣを周皮細胞（ＰＣ）に分化させるための方法を提供する。周皮細胞は、壁細胞としても知られ、血液微小血管（すなわち毛細血管、細動脈及び細静脈）を覆い、血管新生において組織的又は構造的な役割を果たしていると一般に理解されている。位置、形態、遺伝子又はタンパク質の発現パターン、血管周囲の密度を含む複数の基準を使用して、未成熟及び成熟周皮細胞を識別する。一般に、本明細書で提供される方法に従って得られた周皮細胞は、限定されないが、ＰＤＧＦＲβ、デスミン（ＤＥＳ）、ＣＤ１３（ＡＮＰＥＰ；アラニル（膜）アミノペプチダーゼ）、α－ＳＭＡ、ＲＧＳ５（Ｇタンパク質シグナル伝達５の調節因子）、ＮＧ２（ＣＳＰＧ４としても知られる；コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４）、ＣＤ２４８（エンドシアリン）、ＡＮＧ－１、ＣＤ１４６、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１３などの公知の周皮細胞分子マーカーの発現に基づいて同定することができる。
ミクログリアは、脳の発達、恒常性、免疫調節において重要な役割を果たす、中枢神経系の自然免疫細胞である。それらは、ヒトの胎児及び一次組織から取得することが困難である。したがって、本開示のさらなる実施形態は、定義された条件下において、エピソーム的に再プログラムされたｉＣｅｌｌ ＨＰＣなどのＨＰＣからのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア（ｉＭＧＬ）の生成、特徴付け及び凍結保存のための方法を提供する。凍結保存されたｉＭＧＬは、純度を維持し、免疫調節性サイトカインを分泌し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識された細菌性ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ及びアミロイドベータ凝集体を貪食する。本質的に無制限の量のｉＭＧＬを産生する能力は、正常状態及び疾患状態でのミクログリアの役割への人間の神経科学の探索を加速することについて大きい期待を有する。
ＴＲＥＭ２、ＭｅＣＰ２及び／又はＳＣＮＡの破壊を伴うミクログリアが本明細書でさらに提供される。患者由来のｉＰＳＣに由来するこれらのミクログリアは、２Ｄ又は３Ｄオルガノイドシステムにおけるヒトミクログリア、ニューロン、星状細胞間の複雑な相互作用を理解し、神経変性疾患を模倣するためのより正確なモデルを作成するためのインビトロツールを提供する。
また、本明細書では、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害することなく、ｉＰＳＣを神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化させる方法が提供される。これらのＮＰＣは、ｉＰＳＣ由来のミクログリアと共培養して、ヒトの脳の発達並びに正常及び／又は疾患特異的ｉＰＳＣ細胞由来の培養皿内の神経系統、ミクログリア、内皮細胞、周皮細胞、星状細胞間の複雑な細胞間相互作用を模倣する長期共培養アッセイを生成することができる。ｉＰＳＣは、ＮＰＣを生成する分化の開始前に低酸素条件下で維持され得る。神経前駆体の分化を開始するために、ＥＣＭでコーティングされた表面にＲＯＣＫ阻害剤又はブレビスタチンの存在下でｉＰＳＣを播種し得る。細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で次の４８時間培地中に置くことができる。次に、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を補充したＤＭＥＭＦ１２培地中で７２時間プレコンディショニングし、正常酸素条件下で培地を毎日交換する。プレコンディショニングステップの最後に細胞を回収し、ＥＣＭコーティングプレートに２Ｄ形式で再プレーティングするか、又はＲＯＣＫ阻害剤若しくはブレビスタチンの存在下で超低付着プレート若しくはスピナーフラスコを使用して３Ｄ凝集体として再プレーティングすることができる。培養物には、ＮＰＣを産生する正常酸素条件下において、次の８日間、Ｎ２を補充したＥ６培地を隔日でフィードし得る。ＮＰＣの生成に含まれる異なるステップは、図４５Ａに概説される。
本発明の方法によって産生された細胞は、疾患のモデリング、創薬及び再生医療に使用され得る。脳オルガノイド又は血液脳関門（ＢＢＢ）モデルの作製のために本細胞（例えば、ＭＳＣ、内皮細胞、神経前駆細胞及び周皮細胞）を使用する方法も本明細書で提供される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ以上を意味し得る。
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り又は代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義をサポートする。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のもの又はそれを超えるものを意味し得る。
「本質的に」という用語は、方法又は組成物が特定のステップ又は材料のみを含み、それらの方法及び組成物の基本的な及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさないものを含むことを理解されたい。
本明細書で使用される場合、特定の物質又は材料を「実質的に含まない」組成物又は培地は、３０％以下、２０％以下、１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下又は最も好ましくは１％以下の物質又は材料を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「およそ」という用語は、関連する基本機能に変化をもたらすことなく、許容される程度に変化し得る定量的比較、値、測定又は他の表現を変更するために適用され得る。
「約」という用語は、一般に、記載された値を測定するための標準的な分析技術を使用して決定された、記載された値の標準偏差内を意味する。この用語は、記載値のプラス又はマイナス５％を指すことによっても使用され得る。
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書において、特定の成分のいずれも意図的に組成物に配合されておらず、且つ／又は汚染物質として若しくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出できない組成物である。
「フィーダーフリー」又は「フィーダー非依存性」は、フィーダー細胞層の代わりとして、サイトカイン及び成長因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）が補充された培養物を指すために本明細書で使用される。したがって、「フィーダーフリー」又はフィーダー非依存性の培養システム及び培地を使用して、多能性細胞を未分化及び増殖状態に培養及び維持し得る。いくつかの場合、フィーダーフリー培養は、動物ベースのマトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、又はフィブロネクチン、コラーゲン若しくはビトロネクチンなどの基質上で培養される。これらのアプローチにより、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずにヒト幹細胞を本質的に未分化の状態に保つことができる。
「フィーダー層」は、本明細書において、培養皿の底などの細胞のコーティング層として定義される。フィーダー細胞は、栄養素を培地に放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着できる表面を提供することができる。
「限定」又は「完全限定」という用語は、培地、細胞外マトリックス又は培養条件に関連して使用される場合、ほぼ全ての成分の化学組成及び量が既知である培地、細胞外マトリックス又は培養条件を指す。例えば、限定培地には、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンなどの未定義の因子が含まれていない。一般に、限定培地は、組換えアルブミン、組成が既知である脂質及び組換えインスリンが補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液、抗酸化剤及びエネルギー源を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。完全限定培地の例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。
ヒト細胞で使用される培地、細胞外マトリックス又は培養システムについて、「ゼノフリー（ＸＦ）」という用語は、使用される材料が非ヒト動物由来ではない状態を指す。
「処置」又は「処置すること」には、（１）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患を阻害すること（例えば、病状及び／又は総体症状のさらなる発展を抑止すること）、（２）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患を改善すること（例えば、病状及び／又は総体症状を逆転させること）、及び／又は（３）疾患の病状又は総体症状を経験又は示している対象又は患者の疾患に測定可能な減少をもたらすことが含まれる。
「予防的処置」には、（１）疾患のリスクがあり、且つ／又は疾患の素因がある可能性があるが、疾患の病状又は総体症状のいずれか又は全てを依然として経験又は示していない対象又は患者において疾患を発症するリスクを低減又は軽減すること、及び／又は（２）疾患のリスク及び／又は素因がある可能性があるが、疾患の病状又は総体症状のいずれか又は全てを依然として経験又は示していない対象又は患者における疾患の病状又は総体症状の発症を遅らせることが含まれる。
本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット又はそれらのトランスジェニック種などの生きた哺乳動物を指す。特定の実施形態において、患者又は対象は、霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若年、乳児及び胎児である。
「効果的」という用語は、その用語が本明細書及び／又は特許請求の範囲で使用される場合、所望の、期待される又は意図された結果を達成するのに適切であることを意味する。化合物で患者又は対象を処置することに関連して使用される場合の「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与されたとき、そのような疾患の処置又は予防に影響を与えるのに十分な量である化合物の量を意味する。
一般に本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は合理的な利益／リスク比に見合った他の問題又は合併症がなく、ヒト及び動物の組織、器官及び／又は体液との接触での使用に適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」とは、因子の組み合わせ（本明細書では再プログラミング因子と呼ぶ）の発現又は発現の誘導によって体細胞を再プログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年又は成人の体細胞を使用して生成することができる。特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子には、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８が含まれる。いくつかの実施形態において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子又は４つの再プログラミング因子を発現することによって再プログラミングされる。
「細胞外マトリックスタンパク質」という用語は、周囲の細胞に構造的及び生化学的サポートを提供する分子を指す。細胞外マトリックスタンパク質は、組換え型であり得、またその断片又はペプチドも指す。例には、コラーゲン及びヘパリン硫酸が含まれる。
「三次元（３Ｄ）培養」は、生体細胞が３次元全てで成長又は周囲と相互作用することができる、人工的に作成された環境を指す。３Ｄ培養物は、バイオリアクター、細胞がスフェロイドに成長することができる小さいカプセル又は非接着培養プレートなどの様々な細胞培養容器で成長することができる。特定の態様において、３Ｄ培養は、足場なしである。対照的に、「二次元（２－Ｄ）」培養は、接着表面上の単層などの細胞培養を指す。
本明細書で使用される場合、遺伝子の「破壊」は、破壊がない場合の遺伝子産物の発現レベルと比較した、細胞内の対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現の排除又は減少を指す。例示的な遺伝子産物には、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が含まれる。破壊は、一時的又は可逆的である場合もあれば、永続的である場合もある。切断型又は非機能性の産物が産生され得るという事実にもかかわらず、いくつかの場合、破壊は、機能性又は完全長のタンパク質又はｍＲＮＡの破壊である。本明細書のいくつかの実施形態において、発現とは対照的に、遺伝子の活性又は機能が破壊される。遺伝子破壊は、一般に、人工的な方法、すなわち化合物、分子、複合体又は組成物の添加又は導入により、且つ／又はＤＮＡレベルなどにおいて、遺伝子の核酸又は遺伝子に関連する核酸の破壊によって誘導される。遺伝子破壊の例示的な方法には、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト及び／又は遺伝子編集などの遺伝子破壊技術が含まれる。例には、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び／又はリボザイムなどのアンチセンス技術が含まれ、これらは、一般に、発現の一過性の低下並びに例えば切断及び／又は相同組換えの誘導による、標的遺伝子の不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術をもたらす。例には、挿入、変異及び欠失が含まれる。破壊は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常又は「野生型」産物の発現の抑制及び／又は完全な欠如をもたらす。そのような遺伝子破壊の例は、遺伝子全体の欠失を含む、遺伝子又は遺伝子の一部の挿入、フレームシフト及びミスセンス変異、欠失、ノックイン及びノックアウトである。そのような破壊は、コーディング領域、例えば１つ以上のエクソンで発生し得、その結果、完全長の産物、機能性産物又は終止コドンの挿入などによる任意の産物を産生することができなくなる。そのような破壊は、遺伝子の転写を防ぐために、転写の活性化に影響を与えるプロモーター若しくはエンハンサー又は他の領域の破壊によっても起こり得る。遺伝子破壊には、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化を含む遺伝子標的化が含まれる。
ＩＩ．ｉＰＳＣ分化方法
Ａ．ＨＰＣ
ｉＰＳＣは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３７２，６４２号明細書に記載されているような当技術分野で公知の方法によってＨＰＣに分化することができる。１つの方法において、造血分化を促進するために、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦの組み合わせを使用し得る。特定の実施形態において、分化のためのｉＰＳＣを調製する第１の培地、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２の培地への細胞培養物の連続曝露、続いてＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３及びＩＬ－６を含む第３の培地での培養により、多能性細胞をＨＰＣ及び造血細胞に分化させることができる。第２の限定培地は、ヘパリンを含むこともできる。さらに、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含有する培地にＦＧＦ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を含めると、多能性細胞からの造血前駆細胞の生成効率を高めることができる。さらに、第１の限定培地にグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＳＢ－２１６７６３）を含めると、ＨＰＣの産生をさらに強化することができる。
一般に、多能性細胞の造血前駆細胞への分化は、定義された又は定義されていない条件を使用して実施され得る。得られた細胞がヒト対象に投与されることが意図される実施形態において、定義された条件が一般に好ましいことが理解されるであろう。造血幹細胞は、定義された条件下で（例えば、ＴｅＳＲ培地を使用して）多能性幹細胞に由来し得、造血細胞は、多能性細胞に由来する胚様体から生成され得る。他の実施形態において、多能性細胞は、ＯＰ９細胞又はマウス胚性線維芽細胞上で共培養され、続いて分化され得る。
多能性細胞は、分化プロセスの一部として胚様体又は凝集体を形成することができ得る。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）又は成長中の細胞のクラスターの形成は、一般に、ヒト多能性幹細胞のＥＢへのインビトロ凝集を含み、内胚葉、外胚葉及び中胚葉の起源を表す複数の組織タイプへのヒト多能性幹細胞の自発的且つランダムな分化を可能にする。したがって、三次元ＥＢを使用して、造血細胞及び内皮細胞の一部を産生することができる。
凝集体の形成を促進するために、細胞を低付着プレートに移して、７５％ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５％Ｎ２及び１％Ｂ－２７を補充し、ＲＡを補充してない２５％Ｈａｍ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２００ｍＭ １－グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ ２－Ｐ）（ＷＡＫＯ）及び４．５×１０-4ＭＴＧからなる無血清分化（ＳＦＤ）培地で一晩インキュベートし得る。翌日、細胞を各ウェルから収集し、遠心分離し得る。次に、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ４）、約５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び５０ｎｇ／ｍｌのｚｂ ＦＧＦを補充したＳＦＤ基礎培地からなる「ＥＢ分化培地」に分化の最初の４日間にわたって再懸濁することができる。細胞は、４８時間ごとに半分フィードされる。分化の５日目に、培地は、５０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－６（ＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－３（ＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌトロンボポエチン（ＴＰＯ）を補充したＳＦＤ培地で構成される第２の培地に置換される。細胞は、４８時間ごとに新鮮な分化培地が半分フィードされる。培地交換は、分化培養物を３００ｇで５分間スピンダウンし、分化培養物から半分の量を吸引し、新鮮な培地を補充することによって実施される。特定の実施形態において、ＥＢ分化培地は、約ＢＭＰ４（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）及び任意選択によりＦＧＦ－２（例えば、約２５～７５ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌ）を含み得る。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換し得る。代わりに、細胞に新鮮な培地を２日ごとに半分ずつフィードし得る。細胞は、分化プロセス中の様々な時点で回収することができる。
ＨＰＣは、限定培地を使用して多能性幹細胞から培養され得る。限定培地を使用した多能性細胞の造血ＣＤ３４+幹細胞への分化のための方法は、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第１２／７１５，１３６号明細書に記載されている。これらの方法は、本開示で使用され得ると予想される。
例えば、限定培地を使用して、造血性ＣＤ３４+分化を誘導し得る。限定培地は、成長因子ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及び／又はＧＭＣＳＦを含み得る。多能性細胞は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及び任意選択によりＦＧＦ－２を含む第１の限定培地で培養され、続いて（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及びＧＭＣＳＦ）又は（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、ＩＬ－６及びＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地で培養され得る。第１及び第２の培地は、ＳＣＦ、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ－２及び／又はＴＰＯの１つ以上も含み得る。実質的に低酸素の状態（例えば、２０％未満のＯ２）は、造血又は内皮の分化をさらに促進し得る。
細胞は、機械的又は酵素的手段を介して（例えば、トリプシン又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して）、実質的に個別化され得る。ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ１１５２又はＹ－２７６３２）も培地に含まれ得る。これらのアプローチは、例えば、ロボットによる自動化を使用して自動化することができると予想される。
特定の実施形態において、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するために、実質的に低酸素の状態を使用し得る。当業者によって認識されるであろうように、約２０．８％未満の大気中酸素含有量は、低酸素と見なされるであろう。培養物中のヒト細胞は、周囲空気と比較して酸素含有量が少ない大気条件で増殖することができる。この相対的な低酸素症は、培地にさらされる大気中の酸素を減らすことによって達成され得る。胚性細胞は、典型的には、酸素が減少した条件下、一般に約１％～約６％の大気中の酸素、周囲レベルの二酸化炭素下においてインビボで発生する。理論に拘束されることを望むものではないが、低酸素状態は、特定の胚発生状態の態様を模倣し得ると予想される。以下の例に示すように、特定の実施形態において、低酸素状態を使用して、誘導多能性細胞の、ＨＰＣなどのより分化された細胞型へのさらなる分化を促進することができる。
多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するために、以下の低酸素状態を使用し得る。特定の実施形態において、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％の大気中の酸素含有量を使用して、造血前駆細胞への分化を促進し得る。特定の実施形態において、低酸素雰囲気は、約５％の酸素ガスを含む。
所与の造血前駆細胞の増殖に使用される特定の培地にかかわらず、使用される培地は、好ましくは、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、より通常には１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で少なくとも１つのサイトカインが補充される。適切なサイトカインには、ｃ－ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（造血幹細胞因子（ＳｔＩ）、マスト細胞成長因子（ＭＧＦ）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれる）、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１１ ＭＩＰ－１α、ＬＩＦ、ｃ－ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が含まれるが、これらに限定されない。特に、培養物には、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯの少なくとも１つが含まれる。より具体的には、培養物には、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯが含まれる。
一実施形態において、サイトカインは、培地に含まれ、培地灌流によって補充される。代わりに、バイオリアクターシステムを使用する場合、サイトカインは、培地灌流なしで、別個の入口ポートを介して濃縮溶液として別個に添加され得る。サイトカインを灌流せずに添加する場合、典型的には、バイオリアクターの容量の１０分の１～１／１００に等しい量で１０倍～１００倍の溶液として添加し、およそ２日～４日ごとに新鮮なサイトカインを添加する。さらに、灌流培地中のサイトカインに加えて、新鮮な濃縮サイトカインを別々に加えることもできる。
例示的なＨＰＣ分化方法
２Ｄ ＨＰＣの分化：Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応し得る。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチンを補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングする。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加する。翌日、ブレビスタチンを除去するために新鮮な培地を交換する。分化プロセスの５日目に、細胞を、５Ｕ／ｍｌのヘパリンとともに、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地中に置く。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされる。プロセス全体は、低酸素条件下において、帯電したアミンプレート上で実施される。ＨＰＣは、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞及びＣＦＵの存在によって定量化される。
３Ｄ ＨＰＣの分化：細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５μＭのブレビスタチン又は１μＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、１ｍｌあたり２５～５０万細胞の密度でスピナーフラスコにプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を交換した。分化プロセスの５日目に、細胞を、５～１０Ｕ／ｍｌのヘパリンとともに、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地中に置いた。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされた。プロセス全体は、低酸素条件下で実施された。ＨＰＣは、ＣＤ４３／ＣＤ３４の存在によって定量化された。ＨＰＣは、ＣＤ３４ビーズを使用して選別されたＭＡＣＳである。
Ｂ．遺伝子破壊
特定の態様において、ＴＲＥＭ２、ＭｅＣＰ２及び／又はＳＣＮＡ遺伝子の発現、活性又は機能は、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣ）などの細胞において破壊される。いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ノックアウト、挿入、ミスセンス又は二対立遺伝子フレームシフト変異などのフレームシフト変異、遺伝子の全部又は一部、例えば１つ以上のエクソン又はその部分の欠失及び／又はノックインなどの遺伝子の破壊をもたらすことによって実行される。例えば、破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ及び遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む配列特異的又は標的ヌクレアーゼによって行うことができる。
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊は、遺伝子を破壊することによって実行される。いくつかの態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子破壊の非存在下又は破壊をもたらすために導入された成分の非存在下での発現と比較して少なくとも又は約２０、３０又は４０％、一般に少なくとも又は約５０、６０、７０、８０、９０又は９５％減少するように破壊される。
いくつかの実施形態において、破壊は、一過性又は可逆的であり、その結果、遺伝子の発現は、後に回復する。他の実施形態において、破壊は、可逆的又は一過性ではなく、例えば永続的である。
いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、典型的には、標的化された方法において、遺伝子における１つ以上の二本鎖切断及び／又は１つ以上の一本鎖切断の誘導によって実行される。いくつかの実施形態において、二本鎖又は一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えばエクソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、誘導は、コード領域のＮ末端部分の近く、例えば第１のエクソン、第２のエクソン又は後続のエクソンで発生する。
いくつかの態様において、二本鎖又は一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）などによる細胞修復プロセスを介して修復を受ける。いくつかの態様において、修復プロセスは、エラーが発生しやすく、フレームシフト突然変異、例えば二対立遺伝子フレームシフト変異などの遺伝子の破壊をもたらし、これは、遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、変異及び／又は挿入を誘発することを含む。いくつかの実施形態において、破壊は、早期停止コドンの存在をもたらす。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異及び／又は未成熟終止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊をもたらす。
いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）及び／又はリボザイムなどによるアンチセンス技術を使用して達成されて、遺伝子の発現を選択的に抑制又は阻止する。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列と、ヌクレオチド配列に相補的な配列とを有する二本鎖ＲＮＡ分子を用いたＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、又は異なる領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロン構築物に含まれる。特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡからの野生型及び変異体タンパク質の翻訳の両方を抑制する。
いくつかの実施形態において、破壊は、遺伝子に特異的に結合又はハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質若しくはＤＮＡ結合核酸などのＤＮＡ標的化分子又はそれを含む複合体、化合物若しくは組成物を使用して達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）又はＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン又はメガヌクレアーゼからのＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガー又はＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）を介して所定のヌクレオチド配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー又はＴＡＬＥ）は、非天然型のタンパク質である。設計の合理的な基準には、既存のＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥ設計の情報及び結合データを格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルール及びコンピューター化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット及び国際公開第０３／０１６４９６号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書も参照されたい。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子、複合体又は組み合わせは、ＤＮＡ結合分子と、遺伝子の抑制又は破壊を促進するためのエフェクタードメインなどの１つ以上のさらなるドメインとを含む。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ＤＮＡ結合タンパク質及び異種調節ドメイン又はその機能的断片を含む融合タンパク質によって実行される。いくつかの態様において、ドメインには、例えば、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、癌遺伝子などの転写因子ドメイン、ＤＮＡ修復酵素並びにそれに関連する因子及び修飾因子、ＤＮＡ再配列酵素並びにそれに関連する因子及び修飾因子、クロマチン関連タンパク質並びにその修飾因子、例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ及びＤＮＡ修飾酵素、例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ並びにそれらに関連する因子及び修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；同第２００６／０１８８９８７号明細書及び同第２００７／０２１８５２８号明細書を参照されたい。いくつかの態様において、追加のドメインはヌクレアーゼドメインである。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ヌクレアーゼなどの非特異的ＤＮＡ切断分子と融合又は複合体化された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成される、ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ含有複合体又は融合タンパク質などの操作されたタンパク質を使用する遺伝子又はゲノム編集によって促進される。
いくつかの態様において、これらの標的化キメラヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ含有複合体は、標的化された二本鎖切断又は一本鎖切断を誘導し、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）を含む細胞のＤＮＡ修復メカニズムを刺激することにより、正確な遺伝子改変を実行する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのエンドヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質などのＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、ドナー核酸、例えばドナープラスミド又は遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸が提供され、ＤＳＢの導入に続く遺伝子編集の部位でＨＤＲによって挿入される。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子の破壊及び抗原受容体、例えばＣＡＲの導入は、同時に実行され、それにより、遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸のノックイン又は挿入によって部分的に破壊される。
いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、提供されない。いくつかの態様において、ＤＳＢの導入後のＮＨＥＪ媒介修復は、例えば、ミスセンス変異又はフレームシフトを作製することにより、遺伝子破壊を引き起こし得る挿入又は欠失変異をもたらす。
１．ＺＦＰ及びＺＦＮ
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む。例には、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮが含まれる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又はそのドメインを含む。ＺＦＰ又はそのドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するより大きいタンパク質内のタンパク質又はドメインであり、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、その構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、よくジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略される。ＺＦＰの中には、個々のフィンガー組み立てによって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。
ＺＦＰには、単一フィンガードメインがおよそ３０アミノ酸長であり、亜鉛を介して単一のベータターンの２つのシステインと配位した２つの不変ヒスチジン残基を含み、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのフィンガーを有するアルファヘリックスを含むものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックスの４つのヘリックス位置（－１、２、３、及び６）でアミノ酸置換を行うことによって変更され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ又はＺＦＰ含有分子は、非天然型、例えば選択された標的部位に結合するように操作される。
いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２の破壊は、遺伝子の第１の標的部位を第１のＺＦＰと接触させることによって実行され、それにより遺伝子を破壊する。いくつかの実施形態において、遺伝子の標的部位は、６つのフィンガー及び調節ドメインを含む融合ＺＦＰと接触し、それにより遺伝子の発現を阻害する。
いくつかの実施形態において、接触させるステップは、遺伝子内の第２の標的部位を第２のＺＦＰと接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、第１及び第２の標的部位は、隣接している。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＺＦＰは、共有結合している。いくつかの態様において、第１のＺＦＰは、調節ドメイン又は少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、第１及び第２のＺＦＰは、それぞれ調節ドメインを含むか、又はそれぞれ少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、調節ドメインは、転写抑制因子、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又はヒストンデアセチラーゼである。
いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸によってコードされる。いくつかの態様において、方法は、脂質：核酸複合体において又はネイキッド核酸として、核酸を最初に細胞に投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる。いくつかの態様において、ＺＦＰは、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するためにＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプｌｉＳ制限酵素からの切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含み、これらは、操作されていても又はされていなくてもよい。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、タイプｌｉＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド及び他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。
いくつかの実施形態において、ＺＦＮは、操作された細胞に存在する遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ＺＦＮは、例えば、遺伝子のコード領域の所定の部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生成する。標的とされる典型的な領域には、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン及びプロモーター又はエンハンサー領域が含まれる。いくつかの実施形態において、ＺＦＮの一過性発現は、操作された細胞における標的遺伝子の高度に効率的且つ永続的な破壊を促進する。特に、いくつかの実施形態において、ＺＦＮの送達は、５０％を超える効率で遺伝子の永久的な破壊をもたらす。
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共同でジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者がジンクフィンガーの構築及び検証を全体でバイパスできるようにし、数千のタンパク質に特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態において、市販のジンクフィンガーが使用されるか又はカスタム設計される。
２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質など、天然型の又は操作された（非天然型の）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。
ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン又はＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥの同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「リピートユニット」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピートユニットは、典型的には、リピートの１２及び／又は１３位において、リピート可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つ又は２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識の天然の（標準的な）コードは、１２位及び１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）に結合し、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧ又はＡに結合し、ＮＯがＴに結合するように決定されており、非標準（非典型）ＲＶＤも知られている。米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって任意の遺伝子を標的とし得る。標的配列は、一般的にチミジンで始まる。
いくつかの実施形態において、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメインと、核酸標的配列を切断するためのヌクレアーゼ触媒ドメインとを含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、遺伝子中の標的配列を認識し、切断する。いくつかの態様において、ＤＮＡの切断は、二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様において、切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは、切断部位でのＤＮＡ配列の変化につながることの多い不完全な修復プロセスである。いくつかの態様において、修復メカニズムは、直接の再ライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９８）又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介して２つのＤＮＡ末端の残りを再結合することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪを介した修復は、小さい挿入又は欠失をもたらし、それを使用して遺伝子を破壊し、それにより遺伝子を抑制することができる。いくつかの実施形態において、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失又は付加であり得る。いくつかの態様において、切断誘導性変異誘発イベント、すなわちＮＨＥＪイベントに続く変異誘発イベントが発生した細胞は、当技術分野で周知の方法によって同定及び／又は選択することができる。
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的とするように組み立てられる。１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築された。カスタム設計のＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入される。いくつかの態様において、プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞の同定及び／又は選択を提供する選択マーカーを含み得る。
３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）
いくつかの実施形態において、破壊は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した破壊など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を使用して実行される。例えば、破壊は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行することができる。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的なダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも呼ばれる）及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を指示する転写物及び他のエレメントを総称して指す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムには、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ及びヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を備えたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含めることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、タイプＩ、タイプＩＩ又はタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来し得る。
いくつかの態様において、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡ及び固定化ｔｒａｃｒＲＮＡの融合物を含む）が細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位により、相補的な塩基対を使用してＣａｓヌクレアーゼが標的部位、例えば遺伝子を標的とする。標的部位は、典型的には、ＮＧＧ又はＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の直接５’の位置に基づいて選択することができる。この点において、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１又は１０ヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列に対応するように修飾することにより、所望の配列を標的とする。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は、必ずしも必要ではない。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発し、その後、本明細書で説明するような破壊を引き起こし得る。他の実施形態において、「ニッカーゼ」と見なされるＣａｓ９バリアントを使用して、標的部位で一本鎖にニックを入れる。対のニッカーゼは、例えば、特異性を改善するために使用することができ、ニックを同時に導入すると５’オーバーハングが導入されるように、配列を標的とする異なるｇＲＮＡの対によってそれぞれ指向される。他の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、転写リプレッサー又はアクチベーターなどの異種エフェクタードメインに融合されて、遺伝子発現に影響を与える。
標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の小器官内など、細胞の核又は細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列又はテンプレートは、「編集テンプレート」、又は「編集ポリヌクレオチド」、又は「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれ得る。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成は、標的配列内又はその近く（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０又はそれを超える数の塩基対内）の一方又は両方の鎖の切断をもたらす。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部又は一部を含むか又はそれからなり得るｔｒａｃｒ配列（例えば、約２０以上、約２６以上、約３２以上、約４５以上、約４８以上、約５４以上、約６３以上、約６７以上、約８５以上又はそれを超えるヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒ配列）は、ガイド配列に動作可能に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全部又は一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対する相補性（最適にアラインされた場合のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列相補性など）を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように細胞に導入することができる。成分は、タンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達することもできる。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。代わりに、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを単一のベクターに組み合わせ、１つ以上のさらなるベクターが第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の成分を提供し得る。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１つ以上の挿入部位を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化し得る。
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体又はそれらの改変バージョンが含まれる。これらの酵素は、公知であり、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２に見出され得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内及び／又は標的配列の補体内などの標的配列の位置で一方又は両方の鎖の切断を指示することができる。ベクターは、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができる。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えばＤＮＡ標的のセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない、哺乳動物などの特定の生物のもの又はそれに由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドンを、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することにより、目的の宿主細胞における発現を強化するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で選択されたｔＲＮＡが支配的であるのは、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するために、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上又はそれを超える。
最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列及び任意選択により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例には、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが含まれる。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むが、これらに限定されない他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合させ得る。
Ｃ．帯電した細胞表面
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞培養物の帯電表面に関する。帯電表面は、アミン表面又は窒素含有官能基などの正に帯電したものであり得るか、又はカルボキシル表面又は酸素含有官能基などの負に帯電したものであり得る。細胞表面を処理して培養容器の表面電荷を変え得る。
いくつかの態様において、負に帯電した官能基及び正に帯電した官能基の両方を含む表面など、表面は、中性に帯電している。例えば、ＣＯＲＮＩＮＧ ＰＲＩＭＡＲＩＡ（登録商標）表面は、ポリスチレン表面における酸素含有（負に帯電）及び窒素含有（正に帯電）官能基の独自の混合物を特徴としている。表面は、従来のＴＣ表面で培養した場合、付着が不十分であるか、又は分化の可能性が制限されている可能性のある細胞の増殖をサポートする。いくつかの態様において、表面は、ＵＬＡ表面コーティングを含む。例えば、コーニング超低付着表面は、親水性で中性に帯電している共有結合したヒドロゲル層である。タンパク質及び他の生体分子は、疎水性又はイオン性の相互作用を介してポリスチレン表面に受動的に吸着するため、このヒドロゲルは、これらの力による非特異的固定化を自然に阻害し、その後の細胞接着を阻害する。この表面は、非常に安定しており、細胞毒性がなく、生物学的に不活性で分解性がない。ＨＰＣからのミクログリアの生成をサポートすることができる他の例は、以下を含む。Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ培養（米国特許第６，６１７，１５２号明細書）は、より高エネルギーのマイクロ波プラズマを使用して、ポリスチレン表面により多くの酸素を取り込み、従来のプラズマ又はコロナ放電処理された表面と比較して表面の安定性を高めながら、より親水性（湿潤性）にする。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｍａｘセルフコーティング基板は、ＲＧＤモチーフ及び隣接配列を含む、ユニークで動物を含まない合成ビトロネクチンベースのペプチドである。合成ペプチドは、不動態被膜、配向及び最適な細胞結合及びシグナル伝達のためのペプチドの提示のためにポリマー骨格に共有結合する。
細胞培養表面は、プラズマ重合フィルムでコーティングされ得る。プラズマ重合のソースは、１つ以上のモノマーである。有用な重合性モノマーには、オレフィンアミン、ハロゲン化オレフィン、オレフィンカルボン酸及びカルボキシレート、オレフィンニトリル化合物、酸素化オレフィン及びオレフィン炭化水素などの不飽和有機化合物が含まれ得る。いくつかの実施形態において、オレフィンは、ビニル型及びアリル型を含み得る。他の実施形態において、シクロヘキサン、シクロペンタン及びシクロプロパンなどの環状化合物を使用し得る。
当業者によって認識されるように、様々なプラズマ重合技術を利用して、１つ以上のモノマーを細胞培養表面に沈着させ得る。好ましくは、正に帯電した重合フィルムが表面に堆積される。当業者によって理解されるように、プラズマ重合表面は、それとともに使用されるタンパク質に応じて負の電荷を有し得る。アミンは、好ましくは、ポリマーのモノマー源として使用される。いくつかの実施形態において、プラズマ重合モノマーは、プラズマ源を使用して、ガス状モノマーの重合を開始するためのエネルギーを提供し、薄いポリマーフィルムを培養容器上に堆積させる、ガス放電を生成するように作製される。グロー放電法によるガスプラズマを含み得る環状化合物を利用し得る。例えば、１，２－ジアミノシクロヘキサンなどのこれらの環状化合物の誘導体も一般にガスプラズマ中で重合可能である。
重合性モノマーの混合物を使用し得る。さらに、重合性モノマーは、それ自体重合性であると一般に考えられていない他のガス、例えばアルゴン、窒素及び水素とブレンドされ得る。
接着培養に有用な任意の培養容器を使用し得ることが企図される。本開示によって企図される好ましい細胞培養容器構成には、マルチウェルプレート（６ウェル、１２ウェル及び２４ウェルプレートなど）、皿（ペトリ皿など）、試験管、培養フラスコ、ローラーボトル、チューブ又はシェーカーフラスコなどが含まれる。
細胞培養表面の材料には、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリカーボネート）；ガラス；微孔質フィルター（例えば、セルロース、ナイロン、グラスファイバー、ポリエステル及びポリカーボネート）；中空線維管又はマイクロキャリアビーズが含まれ得る、バッチ又は連続細胞培養又は遺伝子操作で使用されるバイオリアクターのための材料（例えば、バイオリアクター）；ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、セラミック及び関連する高分子材料が含まれ得る。
特定の態様において、細胞培養物は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンデュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン及びカリニンなどの任意の細胞外マトリックスタンパク質を含まないか又は本質的に含まない。
Ｄ．ＨＰＣのミクログリアへの分化
ミクログリアは、脳の発達、恒常性及び免疫調節において重要な役割を果たす、中枢神経系の自然免疫細胞である。それらは、ヒトの胎児及び一次組織から取得することが困難である。特定の実施形態において、本発明の方法は、定義された条件下における、エピソーム的に再プログラムＨＰＣからのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア（ｉＭＧＬ）の生成、特徴付け及び凍結保存を説明する。凍結保存されたｉＭＧＬは、純度を維持し、免疫調節性サイトカインを分泌し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識された細菌性ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ及びアミロイドベータ凝集体を貪食する。本質的に無制限の量のｉＭＧＬを産生する能力は、正常状態及び疾患状態でのミクログリアの役割への人間の神経科学の研究を加速することについて大きい期待を有する。
例示的な方法において、新鮮な又は凍結保存されたＨＰＣを解凍し、ＦＬＴ－３リガンド及びＩＬ－３を含むミクログリア分化培地にプレーティングする。細胞は、２０～３５Ｋ／ｃｍ２などの１０～５０Ｋ／ｃｍ２の密度でプレーティングされ得る。ミクログリア分化培地は、ＩＬ－３４、ＴＧＦβ１又はＭ－ＣＳＦ（ＭＤＭ）を含み得る。培養は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングプレート、又はＰｒｉｍａｒｉａプレートなどの帯電表面、又は超低付着プレート、又は組織培養プレート（ＴＣ）、又は非組織培養プレート（Ｎｏｎ－ＴＣ）で行われ得、９６ウェルプレート（例えば、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア分化培地）などのハイスループットであり得る。分化の次の２３日間、１ウェルあたり５０μｌの培地の２×ミクログリア分化培地（ＭＤＭ）を細胞に４８時間ごとに半分フィードし得る。特定の態様において、分化は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などのＥＣＭタンパク質の非存在下で行われる。２３日目に冷ＰＢＳで細胞を回収し、自動セルカウンターを使用して総生細胞数を定量する。細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ－２の表面発現及びＴＲＥＭ－２、ＩＢＡ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９の細胞内発現について染色される。
Ｅ．内皮細胞
Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応し得る。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングし得る。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加し得る。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされ得る。プロセス全体は、低酸素条件下で実施され得る。分化の終わりに回収された細胞は、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ内皮培地又はＳＦＤ内皮培地の存在下で内皮分化を開始するために、凍結保存又は２５ｋ／ｃｍ２の密度でカルボキシル表面に再プレーティングすることができる。
例示的な方法において、凍結保存された６日目のＨＰＣ又は生培養物を、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ内皮培地又はＳＦＤ内皮培地及び低酸素条件の存在下において、カルボキシル表面上に２５ｋ／ｃｍ2でプレーティングする。細胞は、プレーティングの２４時間後に内皮培地の新鮮なフィードを与えられ、培養物は、それらがコンフルエントに達するまで４８時間ごとにフィードされる。細胞がコンフルエントに達するまで５～６日間かかり得る。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して細胞を回収し、表面内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１０５及びＣＤ１４４で染色し、内皮培地を使用して２５ｋ／ｃｍ2でカルボキシル表面に再プレーティングし、低酸素インキュベーター条件に置く。細胞は、分割後２、４、６日目に内皮培地を全量フィードされる。７日目に細胞を回収し、染色し、同じ方法でさらに３回再プレーティングする。
いくつかの実施形態において、内皮細胞は、脳微小血管内皮細胞に変換される。例示的な方法において、生ＨＰＣ又は凍結保存されたＨＰＣ（例えば、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２が補充されたＳＦＤの存在下においてアミン表面で得られる７日目のＨＰＣ）は、ＥＣＲＡ培地（ヒト内皮ＳＦＭ［Ｇｉｂｃｏ］、１％低血小板血漿由来ウシ血清［Ｆｉｓｈｅｒ］、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ［Ｐｒｏｍｅｇａ］、１０ｕＭレチノイン酸）を有する、フィブロネクチン（例えば、５０～２００μｇ／ｍＬ、特に１００μｇ／ｍＬ）及びコラーゲンＩ（例えば、１００～５００μｇ／ｍＬ、特に４００μｇ／ｍＬ）を含有するＥＣＭ上にプレーティングされる。細胞を５０～１００ｋ／ｃｍ2、特に７５ｋ／ｃｍ2の密度でプレーティングし得る。培養は、低酸素インキュベーター条件下で維持することができる。コンフルエントになるまで培養物にＥＣＲＡ培地を隔日でフィードし得る。次に、ＴｒｙｐＬＥの使用などにより、コンフルエントな培養物を回収する。ＰＥＣＡＭ－１（ＣＤ３１）及びＧＬＵＴ－１を検出するために、回収した細胞に対して染色を実施し得る。回収した細胞は、ＥＣＲＡ培地を用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートなどに再プレーティングし、低酸素インキュベーター条件に置かれ得る。コンフルエントになるまで培養物にＥＣＲＡ培地を隔日でフィードし得る。コンフルエントな培養物は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）について試験され得る。
Ｆ．間葉系細胞
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＭＳＣに分化される。例えば、図５Ｃは、ＭＳＣを生成するための２Ｄ ＨＰＣ分化プロセスの概略図を示す。Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応する。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１０ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングする。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加する。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされる。プロセス全体は、低酸素条件下で実施される。分化の６又は７日目の終わりに細胞をＧＭＰ－ＭＳＣ培地中に置く。細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、各継代の終わりに回収し、次に５ｕＭブレビスタチン又は１０ｕＭ Ｈ１１５２を補充したＧＭＰ－ＭＳＣ培地においてアミン表面に５０Ｋ／ｃｍ2の密度で再プレーティングして、ＭＳＣの成長及び増殖を選択的に可能にする。
いくつかの態様において、凍結保存された６日目のＨＰＣ又は６日目の分化の終わりにおける生培養物は、アミン帯電プレート表面上において１０ｕＭ Ｈ１１５２の存在下でＭＳＣ培地の存在下に置かれる。細胞は、プレーティングの２４時間後にＭＳＣ培地の新鮮なフィードを与えられ、培養物は、それらがコンフルエントに達するまで４８時間ごとにフィードされた。細胞がコンフルエントに達するまで５～６日間かかった。細胞は、ＴｒｙｐＬＥを使用して回収され、表面ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｄ並びに内皮マーカーＣＤ３１及びＣＤ１４４の欠如について染色される。新たな培養物は、低酸素条件下及びアミン表面で上記のプロセスを使用して３回継代される。培養物は、Ｐ４で正常酸素圧及び正常組織培養プレートに移行される。
いくつかの態様において、ＭＳＣは、周皮細胞にさらに分化され得る。例示的な方法において、ＭＳＣは、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（カタログ：１２０１）に播種（例えば、１～２０ｋ／ｃｍ2の細胞密度、特に組織培養プラスチック（ＴＣＰ）６ウェルプレート上に１０ｋ／ｃｍ2で）され、正常酸素状態のインキュベーター条件に置かれる。コンフルエントになるまで培養物にＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地を隔日でフィードし得る。次に、ＴｒｙｐＬＥの使用などにより、コンフルエントな培養物が回収され得る。神経グリア抗原２／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＮＧ２）及びＰＤＧＦＲ－ベータ（ＣＤ１４０ｂ）を検出するために、回収した細胞に対して染色を実施し得る。回収した細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地に再プレーティングされ得る（例えば、細胞密度が１～２０ｋ／ｃｍ2、特にＴＣＰ ６ウェルプレートでは１０ｋ／ｃｍ2）。培養物は、コンフルエントになるまで隔日でＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地をフィードし、前述と同じ方法で回収及び染色し得る。次に、培養物の純度が拡大及び保持されるまで細胞を再プレーティングする。さらに、ＣＤ１４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ１６６、ＣＤ５４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ５６、ＣＤ４９ｄ及び／又はＣＤ４４の存在について細胞が陽性に染色される場合がある。
Ｇ．分化培地
細胞は、細胞の特定の各集団の成長をサポートするために必要な栄養素で培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源及びｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地で培養される。培地には、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、ｐＨ指示薬及び無機塩を含めることもできる。例示的な増殖培地は、幹細胞の成長を強化するために、非必須アミノ酸及びビタミンなどの様々な栄養素が補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含む。最小必須培地の例には、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地及びＦ１２培地が含まれるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地にウマ、仔ウシ又はウシ胎児血清などの添加剤を補充し得る。代わりに、培地は、無血清であり得る。他の場合、増殖培地は、培養において幹細胞などの未分化細胞を増殖及び維持するように最適化された無血清製剤として本明細書で呼ばれる「ノックアウト血清置換」を含み得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書に開示されている。好ましくは、ＰＳＣは、フィーダーフリーの完全限定培地で培養される。
いくつかの実施形態において、培地は、血清の任意の代替物を含んでも又は含まなくてもよい。血清の代替物には、アルブミン（脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール又はその均等物を適切に含有する材料を含めることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。代わりに、より便宜的には、市販の材料を使用することもできる。市販の材料には、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＳＲ）、組成が既知である脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
他の培養条件は、適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃、例えば少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、特にそれらに限定されない。一実施形態において、細胞は、３７℃で培養される。ＣＯ2濃度は、約１～１０％、例えば約２～５％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとも最大又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％又はその中で導出可能な任意の範囲であり得る。
Ｈ．凍結保存
本明細書に開示される方法によって産生された細胞は、ステージＩ、ステージＩＩ又はステージＩＩＩなどのプロセスの任意の段階で凍結保存することができ、例えば参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。細胞は、基質を伴って又は伴わずに凍結保存することができる。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲及びそれらの重複範囲である。いくつかの実施形態において、より低い温度は、凍結保存された細胞の貯蔵（例えば、維持）のために使用される。いくつかの実施形態において、液体窒素（又は他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態において、細胞は、約６時間を超えて保存される。さらなる実施形態において、細胞は、約７２時間保存される。いくつかの実施形態において、細胞は、４８時間～約１週間保存される。さらに他の実施形態において、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７又は８週間保存される。さらなる実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別個に又は本明細書に開示される基質のいずれかなどの基質上に凍結保存することができる。
いくつかの実施形態において、追加の凍結防止剤を使用することができる。例えば、細胞は、ＤＭ８０などの１つ以上の凍結保護剤、ヒト又はウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンを含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。特定の実施形態において、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態において、溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％又は約８％～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はアルブミンを含む。特定の実施形態において、溶液は、２．５％のＤＭＳＯを含む。別の特定の実施形態において、溶液は、１０％のＤＭＳＯを含む。
細胞は、例えば、凍結保存中に約１℃／分で冷却され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存温度は、約－８０℃～約－１８０℃又は約－１２５℃～約－１４０℃である。いくつかの実施形態において、細胞は、約１℃／分で冷却する前に４℃に冷却される。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施形態において、例えば細胞が約－８０℃に達すると、それらは、液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存は、コントロールレートフリーザーを使用して行うこともできる。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃～約４０℃の温度、典型的には約３７℃の温度で解凍され得る。
ＩＩＩ．使用方法
本開示は、複数の系統の多数の細胞を産生することができる方法を提供する。これらの細胞集団は、多くの重要な研究、開発及び商業目的に使用することができる。これらには、ごく数例を挙げると、インビボでの細胞の移植又は埋入；抗ウイルス剤、細胞毒性化合物、発癌性物質、変異原性物質、成長／調節因子、医薬品化合物などのインビトロでのスクリーニング；肝疾患及び感染症のメカニズムの解明；薬物及び／又は成長因子が作用するメカニズムの研究；患者の癌の診断及びモニタリング；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な産物の産生が含まれるが、これらに限定されない。
Ａ．医薬組成物
本明細書では、本細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤も提供される。
したがって、本発明による対象に投与するための細胞組成物は、化合物を、薬学的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、任意の従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択した投与経路によって異なる。
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する有効成分（細胞など）を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で１つ以上の任意選択による薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２nd ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
Ｂ．商業、治療及び研究目的での配布
いくつかの実施形態において、製造、流通又は使用中の任意の時間に存在する細胞を含む試薬システムが提供される。キットは、多くの場合に同じゲノムを共有する、未分化の多能性幹細胞又は他の分化された細胞型と組み合わせて、本開示に記載される細胞の任意の組み合わせを含み得る。各細胞型は、事業関係を共有する同じ主体又は異なる主体の制御下において、一緒に、又は同じ施設内の別々の容器に、又は異なる場所で同じ又は異なる時間にパッケージ化され得る。医薬組成物は、任意選択により、機構的毒性などの所望の目的のための書面による説明とともに適切な容器中にパッケージすることができる。
いくつかの実施形態において、例えば、細胞を産生するための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。試薬システムは、必要に応じて、水性媒体中又は凍結乾燥形態のいずれかにパッケージ化することができる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含み、その中に成分を入れ、好ましくは適切に分割し得る。キットに複数の成分が含まれる場合、キットには、一般に、追加の成分が別個に配置され得る第２、第３又は他の追加の容器も含まれる。ただし、成分の様々な組み合わせをバイアルに含め得る。キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒は、別の容器手段でも提供され得ることが想定される。本開示のキットは、典型的には、市販のためにキットの成分を密に閉じ込めて収容するための手段も含む。そのような容器は、所望のバイアルがその中に保持される、射出又はブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。キットには、印刷形式又はデジタル形式などの電子形式などの使用説明書を含めることもできる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることを当業者は理解すべきである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に対する多くの変更形態がなされ得、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
実施例１ － 内皮細胞の生成
Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応した。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加する。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされる。プロセス全体は、低酸素条件下で実施される。細胞は、分化の終わりに回収され、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ内皮培地又はＳＦＤ内皮培地の存在下で内皮分化を開始するために、凍結保存又は２５ｋ／ｃｍ2の密度でカルボキシル表面に再プレーティングすることができる（図２）。
凍結保存された６日目のＨＰＣ又は生培養物を、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ内皮培地の存在下において、１μＭのＨ１１５２及び低酸素条件の存在下でカルボキシル表面上に２５ｋ／ｃｍ2でプレーティングする。細胞は、プレーティングの２４時間後にＶａｓｃｕＬｉｆｅの新鮮なフィードを与えられ、培養物は、それらがコンフルエントに達するまで４８時間ごとにフィードされた。細胞がコンフルエントに達するまで５～６日間かかった。最小限の撹拌又はピペッティングによりＡｃｃｕｍａｘを使用して細胞を回収し、表面内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１０５及びＣＤ１４４で染色し、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ＋Ｈ１１５２を使用して２５ｋ／ｃｍ2でカルボキシル表面に再プレーティングし、低酸素インキュベーター条件に置いた。分割後２、４、６日目に細胞にＶａｓｃｕＬｉｆｅを全量フィードした。７日目に細胞を回収し、染色し、同じ方法でさらに３回再プレーティングした。ヒストグラムは、各再プレーティング段階での内皮細胞の純度の増加を示す。純粋な内皮細胞は、ＣＤ３１＋ＭＡＣＳを使用せずに連続継代精製を使用して生成された。内皮細胞は、再プレーティング継代数３の終わりに凍結保存することができる（図３）。
実施例２ － 間葉系幹細胞の生成
図５Ｃは、ＭＳＣを生成するための２Ｄ ＨＰＣ分化プロセスの概略図を示す。Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応した。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加した。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされた。プロセス全体は、低酸素条件下で実施された。分化の６／７日目の終わりに細胞をＧＭＰ－ＭＳＣ培地中に置いた。前駆体集団の表現型は、回収後に分析された（図５Ｃ）。細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、各継代の終わりに回収し、次に５ｕＭブレビスタチン又は１ｕＭ Ｈ１１５２を補充したＧＭＰ－ＭＳＣ培地においてアミン表面に５０Ｋ／ｃｍ2の密度で再プレーティングして、ＭＳＣの成長及び増殖を選択的に可能にした。
３Ｄ／２Ｄ ＨＰＣ分化からの凍結保存された６日目のＨＰＣ又は２Ｄ ＨＰＣ分化から生じる６日目の分化の終わりにおける生培養物は、アミン帯電プレート表面上において１ｕＭ Ｈ１１５２の存在下でＭＳＣ培地の存在下に置かれた。細胞は、プレーティングの２４時間後にＭＳＣ培地の新鮮なフィードを与えられ、培養物は、それらがコンフルエントに達するまで４８時間ごとにフィードされた。細胞がコンフルエントに達するまで５～６日間かかった。細胞は、ＴｒｙｐＬＥを使用して回収され、表面ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｄ並びに内皮マーカーＣＤ３１及びＣＤ１４４の欠如について染色された。新たな培養物は、低酸素条件下及びアミン表面で上記のプロセスを使用して３回継代された。培養物は、Ｐ４で正常酸素圧及び正常組織培養プレートに移行された。ＭＳＣの純度仕様は、Ｐ６で達成された（図６、７）。Ｐ３で凍結保存されたＭＳＣを解凍し、図８Ａに記載されるように系統特異的分化マトリックスに配置して、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞を生成するための三系統の可能性を示した（図８Ｂ）。凍結保存されたＭＳＣのクローン増殖能は、１０ｃｍの組織培養プレートに１０００細胞／ｃｍ2の密度でＭＳＣをプレーティングすることによって実証された。細胞にＭＳＣ培地を２週間フィードし、培地を隔日で交換した。出現したコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、スコアを付けた（図８Ｃ）。
実施例３ － ＭＳＣからの周皮細胞の生成
ｉＣｅｌｌ ＭＳＣ及びｉＰＳＣ由来の周皮細胞を５０％の培養密度でサンプリングし、フローサイトメトリーで公知の周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２及びＣＤ１４６を分析した。凍結保存されたＭＳＣを解凍し、ＭＳＣ維持培地に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含まない６ウェルプレートに３５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした（図９Ａ）。細胞は、コンフルエント達することができ、細胞は、ＳＦＤ周皮細胞培地（ＳＰＭ）中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含まない６ウェルプレートに１５，０００細胞／ｃｍ２で再プレーティングされた（図９Ａ；図９Ｂ）。
初代ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ＃１２００）を解凍し、ポリ－Ｌ－オルニチンでコーティングした６ウェルプレートに周皮細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ＃１２０１）中、５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした。これらの細胞は、分化プロセスの陽性対照として使用された。ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＨＢＶＰ、ｉＣｅｌｌ ＭＳＣ及びｉＰＳＣ由来周皮細胞を公知の周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２及びＣＤ１４６についてフローサイトメトリーによって分析した（図９Ｃ）。解凍時にｉＣｅｌｌ ＭＳＣの周皮細胞マーカーが存在しなかった。ＨＢＶＰ及びｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、公知の周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２及びＣＤ１４６の発現を示し、ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＨＢＶＰよりも高い純度を有する（図９Ｃ）。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＨＢＶＰと同様の形態を示す（図９Ｄ）。
それらの機能に基づいて、周皮細胞は、表現型でＰＣ１（炎症誘発性）又はＰＣ２（収縮性）に分類することができる（Ｒｕｓｔｅｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。両方のサブタイプの特性が図９Ｅに記載される。解凍後、ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、ＰＣ１及びＰＣ２マーカーＣＤ２７４、ＶＣＡＭ１、カルポニン、デスミン、ＤＬＫ１及びαＳＭＡについてフローサイトメトリーによってサブタイプ化された（図９Ｆ）。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、収縮性周皮細胞、サブタイプＰＣ２の特性を明らかにする。
慢性及び急性のＢＢＢモデルで見られる非特異的な食作用の取り込みに加えて、周皮細胞は、生理学的及び病的状態の両方で特定の高分子のクリアランスを処理することにより、ニューロンの微小環境を特異的に調節する（Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞を、ＳＰＭ中、ＰＤＬコーティング（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５９４６）を有する９６ウェルプレートに１５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞をプレーティング後３日間静置し、その後、デッドインジケーターＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｒ３７１０９）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１００１０）を細胞に添加した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅライブイメージングシステムに１ヶ月以上置き、毎週フィード（同濃度の生／死及び生体粒子試薬を含む）した。ｉＰＳＣ由来の周皮細胞は、対照を超える黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生体粒子の観察可能な食作用活性を示す。
実施例４ － 脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の生成
Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、脳微小血管内皮細胞を生成するために、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応した。生ＨＰＣ又は凍結保存されたＨＰＣ（例えば、ＢＭＰ４及びＦＧＦ２など、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及び／又はＦＧＦ２が補充されたＳＦＤの存在下においてアミン表面で得られる６日目のＨＰＣ）は、ＥＣＲＡ培地（ヒト内皮ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１％低血小板血漿由来ウシ血清（Ｆｉｓｈｅｒ）、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｕＭレチノイン酸）を有する、フィブロネクチン（例えば、５０～２００μｇ／ｍＬ、特に１００μｇ／ｍＬ）及びコラーゲンＩＶ（例えば、１００～５００μｇ／ｍＬ、特に４００μｇ／ｍＬ）を含有するＥＣＭ上にプレーティングされた。細胞を５０～１００ｋ／ｃｍ2、特に７５ｋ／ｃｍ2の密度でプレーティングした。培養物は、毎日フィードされ、低酸素インキュベーター条件下で維持された。コンフルエントになるまで培養物にＥＣＲＡ培地を隔日でフィードする。次に、ＴｒｙｐＬＥの使用などにより、コンフルエントな培養物を回収する。回収された細胞に対して染色を行い、ＰＥＣＡＭ－１（ＣＤ３１）及びＧＬＵＴ－１を検出してＢＭＥＣの同一性を確認した（図１０Ｂ）。回収した細胞は、ＥＣＲＡ Ｍｅｄｉｕｍを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートなどに再プレーティングし、低酸素培養条件に置く（図１０Ａ）。コンフルエントになるまで培養物にＥＣＲＡ培地を隔日でフィードし得る。コンフルエントな培養物は、フローサイトメトリー（図１０Ｃ）及び免疫細胞化学（図１０Ｄ）並びに経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）によってＰ－ｇｐ、ＣＤ１０５、Ｇｌｕ－１及びＣＤ３１発現の存在について試験され、ブランク培地と比較され得る（図１０Ｅ）。免疫組織化学では、細胞を２００μｌのＤＰＢＳで３回洗浄した後、ウサギ抗Ｐ－ｇｐ抗体（ブロッキングバッファー（ＤＰＢＳ中１０％ＦＢＳ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ）で１：５０）と４℃で一晩インキュベートした。２００μｌのＤＰＢＳで３回洗浄した後、Ｐ－ｇｐを二次抗体（１：１０００、ロバ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）によって２００×の倍率で画像を取得した。
実施例５ － ミクログリアの生成
Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上に維持されたｉＰＳＣは、少なくとも５～１０継代にわたって低酸素に適応した。２Ｄ ＨＰＣの分化：細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５～５０万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加した。翌日、完全な培地交換が実施された。
分化プロセスの５日目に、細胞を、５Ｕ／ｍｌのヘパリンとともに、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地中に置いた。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされた。プロセス全体は、低酸素条件下で実施された。ＨＰＣは、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞の存在によって定量化された。
３Ｄ ＨＰＣの分化：細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５ｕＭのブレビスタチン又は１ｕＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、１ｍｌあたり２５～５０万細胞の密度でスピナーフラスコにプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を交換した。分化プロセスの５日目に、細胞を、５Ｕ／ｍｌのヘパリンとともに、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地中に置いた。細胞は、分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされた。プロセス全体は、低酸素条件下で実施された。ＨＰＣは、ＣＤ４３／ＣＤ３４の存在によって定量化された。プロセスの概要及び効率を（図１１）に示し、培地の組成を（図１２）に示す。
ＨＰＣは、ミクログリア分化培地ＭＤＭ又は２×ＭＤＭ上に置いた（図１１）。培養物は、４８時間ごとにフィードされた。分化の２３日目のミクログリア培養物の純度マーカーを凍結保存の前後に定量化した（図１３Ａ、図１３Ｂ）。
２３日目に生ミクログリア培養物及び凍結保存されたミクログリア培養物の純度を評価した。２３日目分化のミクログリア培養物を回収し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。残りの細胞は、コントロールレートフリーザーを使用して凍結保存された。凍結保存された細胞を解凍し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。両方のセットについての、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２及びＣＤ１１ｂの細胞表面発現（図１４Ａ）並びにフローサイトメトリーによるＰＵ．１、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＲＥＭ２及びＴＭＥＭ１１９の細胞内発現である（図１４Ｂ）。結果は、凍結保存されたミクログリアが凍結保存後の純度を保持していることを明らかにした。
ＨＰＣを培地中に置き、ＭＤＭの存在下でミクログリアの分化を開始し、２×ＭＤＭを用いて断続的なフィードを実施した。細胞は、手動凍結プロトコル又はコントロールレートフリーザー（ＣＲＦ）を使用して、分化の２０日目、２３日目及び２６日目に凍結保存された。凍結保存された細胞を１週間液体窒素に移した。凍結保存されたミクログリアを解凍し、ミクログリア成熟培地（ＭＭＭ）中に置いた。培養物には、４８時間ごとに新鮮なミクログリア成熟培地をフィードした。解凍後３、５、７、１０、１２及び１４日目に細胞を回収し、最初のプレーティング数に関して生細胞の回収率を定量化した（図１５Ａ～１５Ｃ）。
凍結保存されたＨＰＣは、ＭＤＭの存在下でミクログリアに分化した。インプットＨＰＣ及びアウトプットミクログリアの総生存数を定量化した。プロセス効率は、ミクログリア分化の２３日目に存在するＴＲＥＭ２陽性細胞の純度及び絶対数をインプット生ＨＰＣの絶対数で割ったものに基づいて計算された（図１６）。
分化の２０日目（図１７Ａ）、２３日目（図１７Ｂ）又は２６日目（図１７Ｃ）の凍結保存ミクログリアをミクログリア成熟培地（ＭＭＭ）で解凍し、４８時間ごとに新鮮な培地をフィードした。総生存率及び絶対細胞数は、解凍後３、７及び１０日目に定量化された。データは、２６日目のミクログリアよりも２３日目のミクログリアの方が解凍後の回収率が高いことを明らかにした（図１７Ａ～１７Ｃ）。
次に、分化プロセスの２０日目、２３日目及び２６日目に凍結保存されたミクログリアの機能評価を実施した。細胞を解凍し、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地の存在下において、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後５日までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。コントロールレートフリーザー法で凍結保存された細胞は、より強力な食作用を示す（細胞の生存率がより高いため（図１９））。
機能評価は、解凍後の後の時点に延ばされた。食細胞の可能性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムのライブイメージングを介して評価された手動又はコントロールレートフリーザーを使用して、分化の２０、２３及び２６日目の凍結保存ミクログリアについて、解凍後５日目及び７日目及び１４日目に評価された。凍結保存されたミクログリアを解凍し、ＭＭＭで３日間プレーティングした。図１８Ｂに記載されているように、３日間の終わりに生細胞数を測定した。１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地（ＭＭＭ）の存在下において、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓを用いて、１５，０００個の生細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後５、７及び１４日までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。手動凍結保存法では、全ての条件で食作用の速度が低下／右シフトしていることが明らかになった（細胞生存率が低いため）。
食作用指数は、細菌及び食細胞の懸濁液の限られた期間のインキュベーション中に食細胞ごとに摂取された細菌の数を数えることによって決定される食作用活性の尺度である。凍結保存されたミクログリアが、標識された細菌粒子を貪食する能力は、食作用赤色オブジェクトの数／総生細胞の比率によって定量化された。この比率は、食作用指数として決定された（図２１）。
凍結保存されたミクログリアを解凍し、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア成熟培地の存在下において、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、解凍後５日までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。コントロールレートフリーザー法で凍結保存された細胞は、より強力な食作用を示す（細胞の生存率がより高いため（図２２）。
次に、ＨＰＣのミクログリアへの分化は、ＥＣＭの非存在下における、スクリーニング適用に適した９６ウェル形式でさらに発展した。分化は、超低付着（ＵＬＡ）、組織培養（ＴＣ）及び非組織培養（非ＴＣ）血管で実施された（図２３Ａ）。凍結保存されたＨＰＣは、１ウェルあたり２００ｕｌのミクログリア分化培地の存在下において、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレート又は超低付着組織培養（ＴＣ）若しくは非組織培養プレート（非ＴＣ）上に２０，０００～３５，０００生細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングされた（図２３Ｂ）。次の２３日間の分化のために、細胞に１ウェルあたり５０μｌのＭＤＭ培地を４８時間ごとにフィードした。２３日目に冷ＰＢＳで細胞を回収し、自動セルカウンターを使用して総生細胞数を定量した。細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２の表面発現及びＴＲＥＭ２、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９の細胞内発現について染色された（図２４Ａ～２４Ｂ）。
Figure 2022537278000001
凍結保存されたミクログリアによって放出されるサイトカイン及びケモカイン。２３日目の凍結保存ミクログリアをＭＤＭ培地中に解凍し、５０，０００細胞／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ９６ウェルプレートにプレーティングした。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び５０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマによる刺激を開始する前に細胞を３日間プレーティングした。刺激は、２４時間にわたって３回行った。上清をスピンダウンして細胞及び破片を除去し、直ちに－２０℃に置いた。上清を多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。
実施例６ － 神経変性疾患を模倣するバリアントを生成するためのｉＰＳＣの操作
ＴＲＥＭ２の機能は、エクソン２にインデルを導入することによって破壊され、フレームシフト及び早期翻訳停止につながった。ＴＡＬ－ヌクレアーゼ（以下のペアＴＲＥＭ２）は、エクソン２内のアミノ酸５８を中心とするＤＮＡ配列に結合するように設計された。操作に使用された細胞株は、ＦＣＤＩ ｉＰＳＣ株０１２７９．１０７であった。ＴＡＬヌクレアーゼｍＲＮＡと、ＳＶ４０プロモーターの制御下でブラスチシジン耐性を発現する共選択プラスミドとを、１２５Ｖ／９５０ｕＦの設定でＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌシステムを使用して細胞にエレクトロポレーションした。細胞をプレーティングし、エレクトロポレーション後１及び２日目に短いブラストサイジン選択を適用した。生存細胞を増殖させ、エレクトロポレーション後７日目に９６ウェルプレートに単一細胞を選別した。約２週間後、８１のクローンが選択され、ＰＣＲ及び配列決定によって遺伝子型が決定された。
配列決定された８１のクローンのうちの７つが配列改変を示した。３つのクローンは、１つの塩基対が挿入された１つの対立遺伝子を含み、３つのクローンは、１つの塩基対が欠失した１つの対立遺伝子を含み、１つのクローンは、１つの塩基対の挿入を含む１つの対立遺伝子と、４つの塩基対の欠失を含む１つの対立遺伝子とを有する複合ヘテロ接合体であった。第７のクローンには、フレームシフトを導入すると予想されなかった２４塩基対の欠失が含まれていた。クローンは、拡大され、凍結保存され、配列確認及び核型分析を受けた。ミクログリアに分化した後、２つの主要なクローンがヘテロ接合又はホモ接合の破壊の例として選択された。ヘテロ接合クローン０１２７９．１１８５には、１ｂｐの挿入を有する対立遺伝子が含まれ、ＴＲＥＭ２の６０位でフレームシフトが生じ、その後、４５アミノ酸の後に終結した。ホモ接合クローン０１２７９．１１８７には、５９位に１ｂｐのフレームシフト挿入があり、１６アミノ酸後に終了する対立遺伝子と、５９位にフレームシフトを生じる４ｂｐの欠失があり、４６アミノ酸後に終了する第２の対立遺伝子とが含まれていた。
Figure 2022537278000002
Figure 2022537278000003
実施例７ － 神経変性を模倣する追加の同質遺伝子操作された系統の生成：
パーキンソン病モデルは、ヌクレアーゼを介した相同組換え及びドナーオリゴＳＪＤ１４－１３３によってエピソームで再プログラムされたｉＰＳＣ０１２７９を遺伝子操作することによって産生された。得られたｉＰＳＣには、アミノ酸５３がアラニンからスレオニンに変化したＳＮＰ ｒｓ１０４８９３８７７が含まれ、アルファシヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）のＡ５３Ｔバリアントと、ＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ ｉＰＳＣ株をもたらす２つのサイレント変異とが生じた。
レット症候群を研究するための同質遺伝子操作されたモデルは、ヌクレアーゼを介した相同組換え及びドナープラスミドｐ１５５３を使用して生成された。ドナープラスミドｐ１５５３は、メチルＣｐＧ結合ドメインの前に一連の停止コドンを挿入し、続いてＬｏｘＰ部位に隣接するＰＧＫｐ－ピューロマイシンＲ－ＳＶ４０ｐＡ選択カセットを挿入した。親系統０１２７９に由来するＭＥＣＰ２ ＨＭ系統は、レット症候群の疾患モデルを提供した。
同質遺伝子操作されたｉＰＳＣからのＨＰＣ及びミクログリアの生成：０１２７９ｉＰＳＣに由来するホモ接合及びヘテロ接合のＴＲＥＭ２ ＫＯ ｉＰＳＣと、０１２７９に由来するＳＮＣＡ Ａ５３Ｔ及びＭＥＣＰ２ ＨＭ操作株は、Ｅ８及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）の存在下で１０継代にわたり継代することにより低酸素状態に順応させて維持した。細胞の核型を決定し、ｉＰＳＣバンクを作製して、３Ｄ ＨＰＣ分化プロトコルを介してＨＰＣ分化を開始した。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５μＭのブレビスタチン又は１μＭのＨ１１５２を補充した無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下において、１ｍｌあたり２５～５０万細胞の密度でスピナーフラスコにプレーティングした。プレーティングの２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を交換する。分化プロセスの５日目に、細胞を、５～１０Ｕ／ｍｌのヘパリンとともに、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地中に置く。細胞は、１３日間の分化プロセス全体を通して４８時間ごとにフィードされる。プロセス全体は、低酸素条件下で実施される。ＨＰＣは、ＣＤ４３／ＣＤ３４の存在によって定量化された。ＨＰＣは、ＣＤ３４ビーズを使用して選別するＭＡＣ後に凍結保存される。ミクログリアは、凍結保存されたＨＰＣを解凍し、実施例５に記載されているように細胞を２３日間の分化プロセスに置くことによって生成された。
２３日目の野生型及びＴＲＥＭ操作クローンからの凍結保存ミクログリアを解凍し、ＣＤ４５とともにＴＲＥＭ－２発現の存在をフローサイトメトリーによって定量化した（図２６）。
同質遺伝子操作された系統に由来する凍結保存された２３日目のミクログリアを解凍し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２及びＣＤ１１ｂの細胞表面発現並びにフローサイトメトリーによるＰＵ．１、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＲＥＭ２及びＴＭＥＭ１１９タンパク質の細胞内発現を定量化するために染色された。図２６は、同質遺伝子操作された４つのｉＰＳＣ全てで得られた純度の概要である。結果は、分化プロトコルに変更を加えることなく、同質遺伝子操作されたｉＰＳＣから高純度のミクログリアを生成することを示す。
解凍後にミクログリアによって分泌された可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）タンパク質のレベルは、ＷＴ及びＴＲＥＭ２ヘテロ接合及びホモ接合ＫＯ変異体から回収した馴化培地からＳｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用して定量化された（図２７Ａ）。ＷＴ及びＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを解凍し、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。データは、ＷＴ、ヘテロ接合ＴＲＥＭ２ ＫＯ及びホモ接合ＫＯミクログリア間の可溶性ＴＲＥＭ２のレベルの差異を明らかにした。このアッセイは、ＷＴ及びＴＲＥＭ２の操作されたｉＰＳＣを区別するための機能アッセイとして使用することができる。
解凍後にミクログリアによって分泌された可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）タンパク質のレベルは、ＷＴ及びＴＲＥＭ２ヘテロ接合及びホモ接合ＫＯ変異体、ＭＥＣＰ２ＨＭ及びＳＮＣＡ－Ａ５３Ｔから回収した馴化培地からＳｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用して定量化された（図２７Ａ）。ＷＴ及びＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを解凍し、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。データは、ＷＴ、ヘテロ接合ＴＲＥＭ２ ＫＯ及びホモ接合ＫＯミクログリア間の可溶性ＴＲＥＭ２のレベルの差異を明らかにした。このアッセイは、ＷＴ及びＴＲＥＭ２の操作されたｉＰＳＣを区別するための機能アッセイとして使用することができる。可溶性ＴＲＥＭ２の放出は、Ａ５３Ｔ－ＳＮＣＡミクログリアで損なわれたが、ＭＥＣＰ２ＨＭミクログリアは培地で放出されたｓＴＲＥＭのレベルの任意の変化を明らかにした（図２７Ｂ）。
同質遺伝子操作された凍結保存ミクログリアによって放出されるサイトカイン及びケモカイン。ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯ Ａ５３Ｔ－ＳＮＣＡ及びＭｅＣＰ２ＨＭミクログリアに由来する２３日目の凍結保存ミクログリアをＭＤＭ培地中に解凍し、Ｐｒｉｍａｒｉａ９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。Ｍ１を介した応答を確認するために、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳによる刺激を開始する前に細胞を３日間プレーティングした。刺激は、２４時間にわたって３回行った。上清をスピンダウンして細胞及び破片を除去し、直ちに－２０℃に置いた。上清を多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。この多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの結果は、図２７Ｃにヒートマップとして取得される。操作された株は、ＡＮＨ対照と比較してより高いレベルのＩＬ－６を分泌した。ＴＲＥＭ２ ＨＺ及びＴＲＥＭ２ ＨＯ及びＭｅＣＰ２ＨＭミクログリアは、より少ないＴＮＦアルファを放出したが、ＡＮＨと比較してＩＬ６のレベルを増加させた。Ａ５３Ｔ－ＳＮＣＡミクログリアは、ＡＨＮ対照ミクログリアと比較して同様のレベルのＩＬ－６及びＴＮＦアルファを放出した。
全ての操作された株は、Ｍ１刺激（ＬＰＳ）で処理されると、Ｍ２サイトカインＩＬ－１０を放出した。ＭＥＣＰ２ＨＭミクログリアは、ＡＨＮ対照ミクログリアと比較してより少ないＩＬ－１０を放出した（図２７Ｅ）。ＡＨＮ及び操作されたミクログリアは、ＬＰＳ刺激に応答して、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３アルファ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１ベータ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯベータ、ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８を放出することができた。サイトカイン放出のレベルには、いくつかの固有の違いがあった。ＴＲＥＭ２ＨＯは、アルツハイマー病（ＡＤ）の発症中に放出される主要な分析物であるＣＣＬ４の最高レベルを明らかにした。ＭＥＣＰ２ＨＭ、ＴＲＥＭ２ＨＺ及びＴＲＥＭ２ＨＯミクログリアは、高レベルのＣＸＣＬ１／ＧＲＯを放出した。これは、微生物の死滅を促進し、食作用中に炎症反応を引き起こす補助細胞型顆粒球を動員する試みを意味し、ＭＥＣＰＨＭミクログリアは、ＩＬ－８／ＣＸＣ１８の自発的分泌を明らかにした。この分析物は、脳損傷で上昇し、炎症誘発性プロテアーゼ及びＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の発現を誘導する。ＭＥＣＰＨＭミクログリアは、高レベルのＩＬ－６を分泌した。これらの結果は、ＭＥＣＰＨＭが炎症誘発性反応について刺激されていることを示唆している。操作されたミクログリア及びＡＨＮミクログリアは、ＬＰＳに応答して、培地で同様のレベルのＰＤＬ－１、ＣＤ４０、ＦＬＴ－３及びＰＤＧＦＡＡを放出した。
凍結保存されたミクログリアを成熟培地中で解凍し、スクリーニング実験を実施する前に４８時間回復させた（図３６）。ＴＲＥＭ２ ＷＴ及びＴＲＥＭ２ ＨＯＫＯからの５，０００ミクログリアを、３８４ウェルプレートのウェルごとに４０ｕＬ培地中、２４時間プレーティングした。第１のセット（プレート１）では、細胞を１μＭの最終濃度の化合物で前処理した。細胞を化合物で処理してから２４時間後、ｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドベータを最終濃度１μＭでプレート１に添加し、食作用をＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３で９６時間取得した（図３７～３９）。第２のセット（プレート２）では、細胞を２４時間プレーティングした後、最終濃度１μｇ／ｍＬにおいて１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで処理した（図４０～４２）。ＬＰＳへの曝露の２４時間後及び最初のプレーティングの４８時間後、ｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドベータを最終濃度１μＭでプレート２に添加した。細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して１時間に１回、最大９６時間画像化された。食細胞データは、総赤色オブジェクト統合強度×μＭ２／画像として取得された。全ての処理について最終的な体積は、一定のままであった。スクリーニングの結果は、図４３に要約される。
成熟培地での解凍後のミクログリアの生存に必要なサイトカインを理解するために、３２の異なる培地配合を用いて概略図のマトリックスを計画した（図２８）。ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを、２５０μｌのミクログリア基本培地若しくはＭＭＭ又は成熟培地に単一サイトカイン（図２９）、２つのサイトカイン（図３０）、３つのサイトカイン（図３１）又は４つのサイトカイン（図３２）を補充したミクログリアベース培地中、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞の密度で置いた。細胞生存の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムで取得された。２滴／ｍＬに希釈したＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄを、様々な培地組成で細胞を含む全てのウェルに添加して、経時的な死細胞の数を取得した。画像は、８時間ごとに取得され、実験は、断続的なフィードなしで７２時間継続された。ＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄの強度は、培養物中の死細胞を定量化する。
ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを、２５０μｌのミクログリア基本培地（図３３Ａ）、ＭＭＭ（図３３Ｂ）、ＩＬ－３４を補充したミクログリア基本培地（２６Ｃ）、ＩＬ－３４を補充したミクログリア基本培地（図３３Ｄ）、ＭＣＳＦを補充したミクログリア基本培地（図３３Ｄ）若しくはＩＬ－３４のみを補充した基本培地（図３３Ｃ）又はＭＳＣＦ又はＩＬ－３４とＭＣＳＦの組み合わせ（図３３Ｅ）中、９６ウェルプレートに１５，０００生細胞の密度で置いた。細胞生存の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムで取得された。２滴／ｍＬに希釈したＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄを、様々な培地組成で細胞を含む全てのウェルに添加して、経時的な死細胞の数を取得した。画像は、８時間ごとに取得され、実験は、断続的なフィードなしで７日間継続された。ＮｕｃＧｒｅｅｎ Ｄｅａｄの強度は、培養物中の死細胞を定量化する。
２３日目にｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識細菌ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ及びｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄアミロイドベータで凍結保存したＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアの機能的特性が評価された。ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリアを、解凍後３日間、２５０μｌのＭＭＭ（図３３Ａ～Ｂ）若しくはＭＳＣＦのみを補充したＭＤＭベース（別名ミクログリア基本培地）（図３３Ｃ～Ｄ）又はＩＬ－３４（図３３Ｅ～Ｆ）或いはＩＬ－３４とＭＣＳＦとの組み合わせ（図３３Ｇ～Ｈ）中、９６ウェルプレートに１５，０００～３０，０００生細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングした。細胞を、希釈した１μｇ／ウェルのオプソニン化又は非オプソニン化ｐＨｒｏｄｏ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１００１０、１バイアルあたり２ｍｇ、－２０℃で保存）（図３３Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はｐＨｒｏｄｏアミロイドベータ（図３３Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）で処理した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ上に置き、３０時間までの様々な時点で食作用の画像を撮影した。ＷＴ及び操作されたミクログリアは、解凍後の食作用機能を明らかにした。食作用の動態及び効率は、ＷＴ、１１８５ ＨＴ ＴＲＥＭ２ ＫＯ、１１８７ ＨＯ ＴＲＥＭ２ ＫＯミクログリア間で異なっていた。
成熟培地中の２つの重要な（ＩＬ－３４、ＭＳＣＦ）サイトカインの組み合わせを補充したＭＭＭ又はミクログリア基本培地の存在下での２３日目の凍結保存された野生型（ＷＴ）ミクログリアの解凍後の純度が決定された（図３５）。純度は、細胞を回収することによって解凍後３、７及び１４日目に定量化され、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＩＢＡの純度は、分化プロセスの最後に細胞を回収し、細胞表面について細胞染色し、マーカーを細胞内染色することにより、フローサイトメトリーで決定された。凍結保存されたミクログリアは、ＭＳＣＦ及びＩＬ－３４を補充した成熟培地で生存率及び純度を保持する。この単純化された培地は、神経変性に関連する多くのＳＮＰ及び変異の寄与を研究するための脳オルガノイドモデルを開発するために、凍結保存されたミクログリアとニューロン及び星状細胞との共培養適用に役立つ。
実施例８ － 患者由来のｉＰＳＣからの疾患関連ミクログリアの生成
最近の遺伝学的研究では、いくつかのミクログリアに富む遺伝子の多型は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及びいくつかの神経変性疾患を発症するリスクの変化に関連していることが示されている。ＧＷＡＳ研究からのリスク関連ＳＮＰのリストを要約すると、最終段階のミクログリアのパネルは、ＡＰＯＥアイソフォームとともにＴＲＥＭ２、ＣＤ３３及びＡＢＣＡ７の変異を示すドナーから生成された。ｉＰＳＣに由来する患者からの凍結保存したミクログリアは、２Ｄ又は３Ｄオルガノイドシステムにおけるヒトミクログリア、ニューロン、星状細胞間の複雑な相互作用を理解し、神経変性疾患を模倣するためのより正確なモデルを作成するためのインビトロツールを提供する（ＭｃＱｕａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
エピソームで再プログラムされたＡＨＮ及び疾患特異的ｉＰＳＣからのＨＰＣの生成：正常及び疾患特異的ドナーから生成されたエピソームで再プログラムされたｉＰＳＣは、造血細胞への分化及びその後のミクログリアへの分化のためのソース材料をバンクする前に、Ｅ８／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を使用して少なくとも５～１０継代にわたり低酸素に順応させた。ｉＰＳＣのパネルの遺伝子型を表４に示す。全てのドナーに由来するｉＰＳＣを核型分析し、３Ｄ ＨＰＣ分化プロトコルを介してＨＰＣ分化を開始するようにｉＰＳＣバンクを作成し、実施例５で説明したように実施した。ミクログリアは、凍結保存されたＨＰＣを解凍し、実施例５に記載されているように細胞を２３日間の分化プロセスに置くことによって生成された。様々なドナーに由来する凍結保存された２３日目のミクログリアを解凍し、ミクログリア特異的マーカーの存在について染色した。細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２及びＣＤ１１ｂの細胞表面発現並びにフローサイトメトリーによるＰＵ．１、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＲＥＭ２及びＴＭＥＭ１１９タンパク質の細胞内発現について染色された。表５は、全てのＡＨＮ及び疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）にわたって得られた純度の概要である。結果は、分化プロトコルへの変更なしで、健康で疾患特異的なドナーのパネルから高純度のミクログリアが生成されることを示す。
Figure 2022537278000004
Figure 2022537278000005
解凍後にミクログリアによって分泌される可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）タンパク質のレベルは、Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（ＡｂＣａｍ）を使用してｉＰＳＣドナーのパネルから生成されたミクログリアから収集された馴化培地から定量化された（図４５）。明らかに健康な正常ドナー及び疾患特異的ドナーから生成されたミクログリアを解凍し、９６ウェルのＰｒｉｍａｒｉａプレートの成熟培地に同じ密度でプレーティングした。使用済み培地は、解凍後３日目及び解凍後７日目に収集された。解凍後３日目及び５日目に培養物に新鮮な成熟培地を半分フィードした。
データは、Ｒ４７Ｈ遺伝子型を示すドナーに由来するミクログリアの様々なサンプル間の可溶性ＴＲＥＭ２のレベルの違いを明らかにし、解凍後３日目で最高レベルの可溶性ＴＲＥＭレベルに達し、解凍後７日でもそのレベルが高いままであったことを明らかにした。このドナーは、無症候性であり、したがってＡＨＮとして分類されたが、ｉＰＳＣ由来のミクログリアは、高レベルのｓＴＲＥＭを分泌した。このデータは、アルツハイマー病患者の脳脊髄液で観察され、この変異状態に関連する高レベルのｓＴＲＥＭ２と一致している（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。このデータは、神経変性疾患の発症をスクリーニングする予測キットを設計する際にｉＰＳＣ由来のミクログリアを使用するための強力な例である。ＡＤの発症を示すＡＰＯＥ４／４／遺伝子型を有する若いドナーは、同じ遺伝子型を有するより高齢のドナーと比較して高レベルの可溶性ＴＲＥＭを示した。ＣＤ３３又はＡＢＣＡ７遺伝子におけるＳＮＰの存在は、上清培地における可溶性ＴＲＥＭの放出を増強するように見えなかった。ＡＨＮドナー１２０６８は、解凍後３日及び７日で高レベルの可溶性ＴＲＥＭを示した。
神経炎症は、多くの神経変性疾患の進行及び病因に寄与する。脳内に存在するミクログリア及び星状細胞は、サイトカインを放出し、刺激及び微小環境に応じて、脳内で炎症誘発性及び抗炎症性の両方の役割を果たすことができる。炎症誘発性プロファイルと抗炎症性プロファイルとの間のこの変動は、ＡＤ及び他の神経変性疾患の発症と関連付けられている。疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）によって放出されるサイトカイン及びケモカインのレベルを定量化するために、凍結保存されたＡＨＮ及びＤＡＭミクログリアをＭＤＭ培地中に解凍し、５０，０００細胞／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を３日間プレーティングした後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激を開始してＭ１を介した応答を確認するか、又は１０ｕＭのｄＢｕ－ｃＡＭＰとともに１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４で刺激を開始してＭ２特異的応答をトリガーした。刺激は、２４時間にわたって３回行った。上清をスピンダウンして細胞及び破片を除去し、直ちに－２０℃に置いた。上清を多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。この多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの結果は、図２７Ｃにヒートマップとして取得される。
ケモカインＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４は、化学誘引物質として機能し、骨髄細胞、顆粒球、リンパ系細胞又は神経前駆細胞の炎症領域への動員を媒介し、食作用反応を強化し、一般的にアルツハイマー病（ＡＤ）又は多発性硬化症でアップレギュレートされる。ＬＰＳ又はｄＢｕ－ｃＡＭＰに応答して、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）由来のミクログリアは、ＡＨＮ系統と比較して高レベルのこれら全ての分析物を放出した。増加倍数は、様々なミクログリア遺伝子型間で０．１倍～７倍で変動した。疾患関連ミクログリアからのこのデータは、ＡＤ脳サンプルにおけるＣＣＬ２及びＣＣＬ５発現の増加を示す以前の発見を裏付ける。脳及び脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＣＣＬ２の発現は、Ｗｅｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．によってＡＤ重症度の信頼できる予測因子として報告されている。
ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）由来のミクログリアは、Ｍ２分極に関連する炎症及び炎症性疾患のマーカーである可溶性ＣＤ１６３のレベルがわずかに上昇した。ｓＣＤ１６３の放出は、単球の過剰活性化を防ぎ、炎症誘発性サイトカインＴＮＦアルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６及びＩＬ－８の分泌を減少させる。同様の傾向は、神経炎症中の組織リモデリングに役割を果たすキチナーゼ－３でも観察された（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，２０１２）；Ｍｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
ＰＤ－Ｌ１及びその受容体であるＰＤ－１は、Ｔ細胞の活性化、耐性及び免疫媒介性組織損傷間のバランスを調節する阻害性シグナルを誘発する。ＬＰＳに応答して、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４由来のミクログリアは、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較して増加しなかった。ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＰＯＥ Ｅ２／Ｅ４及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）由来のミクログリアは、ＡＨＮ系統と比較して増加を示した。ＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰに応答して、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａは、ＡＨＮ系統よりもわずかな増加を示したが、ＡＰＯＥ Ｅ２／Ｅ４由来のミクログリアは、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較して７倍の増加を示した。
ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを含む）由来のミクログリアは、わずかに上昇したレベルの可溶性フラクタルカイン、走化性、生存を促進し、神経炎症中にＴＮＦ－α及び酸化窒素のレベルを低下させることによって神経保護を強化する可溶性ケモカインを放出した。
ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４及びＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ由来のミクログリアは、ＬＰＳ及びｄＢｕ－ｃＡＭＰの両方に応答して、高レベルのＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファを放出したが、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ及びＣＤ３３由来のミクログリアは、放出されるこのサイトカインのレベルの増加がわずかであることを示し、これは、この分析物とＡＰＯＥ及びＡＢＣＡ７遺伝子型との相関関係を意味する。最近の研究では、ＣＸＣＬ１がＡＤの発症における炎症反応に寄与する可能性があるが、この疾患の病因におけるＡＤの素因を与える潜在的な遺伝的要因としてではないことが示された。生理学的条件下において、ＣＸ３ＣＲ１は、それらの活性化を制限することによってミクログリアの恒常性を維持する。刺激後に放出されるこのサイトカインのレベルが高いことは、ＡＰＯＥ又はＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ遺伝子型に関連する疾患関連ミクログリアの恒常性機能を維持するためのＣＸ３ＣＲ１による救済メカニズムの発生を示している。代わりに、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４及びＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ活性化ミクログリアによって分泌される高レベルのＣＸ３ＣＲ１は、ニューロンの変性を促進するシグナルである可能性がある（Ａｔａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４及びＡＰ０ＥＥ２／Ｅ４由来のミクログリアは、ＬＰＳ及びＩＬ４／ｄＢｕ－ｃＡＭＰの両方に応答して高レベルのＩＬ－６を放出した一方、他の全ての遺伝子型は、ＡＨＮと同様のレベルのＩＬ－６を分泌した。ＩＬ－６分泌は、顆粒球を誘引し、細胞媒介体液性Ｔｈ２応答を促進し、炎症を引き起こす。このメカニズムは、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４遺伝子型に関連するより大きい神経炎症も裏付ける。
ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ由来のミクログリアは、ＬＰＳに応答して高レベルのＩＬ－１ベータ及びＩＬ－１アルファを放出した一方、他の遺伝子型は、ＡＨＮミクログリアと同等のレベルを分泌した。
ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４及びＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ由来のミクログリアも、ｄＢｕ－ｃＡＭＰよりもＬＰＳに応答して高レベルのＩＬ－８／ＣＸＣＬ８を放出した。ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ由来のミクログリアは、高レベルのＩＬ－８を放出し、これは、脳損傷に寄与する炎症誘発性応答の発生を示唆する。
ミクログリアは、Ａβ沈着を排除し、ＡＤプロセスを制限し得るタンパク質分解酵素及びマトリックスメタロプロテイナーゼも分泌し、ＡＤにおいて神経保護の役割を果たす。ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）由来のミクログリアは、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較してＭＭＰ－９及びＭＭＰ－１２のレベルがわずかに上昇した。
Ｒ４７Ｈ ＴＲＥＭ２由来のミクログリアは、ＬＰＳ又はＭ１刺激によって刺激された場合、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較して７倍を超えるＩＬ－１２ ｐ７０を放出した。一方、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４は、ＩＬ４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰ又はＭ２刺激に応答して、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較して７倍を超えるＩＬ－１２ ｐ７０を放出した。他の遺伝子型は、ＩＬ－１２分泌レベルのわずかな増加を明らかにした。初代ミクログリアは、脳内でＩＬ－１２を産生し、感染中又はＣＮＳのＴｈ１細胞媒介性自己免疫疾患における免疫応答を制御する。Ｒ４７Ｈ ＴＲＥＭ２由来のミクログリアによるＩＬ－１２のレベルの上昇は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞毒性活性の強力な活性化を意味する。
最後に、ＡＰＯＥ Ｅ４／Ｅ４、ＡＰ０Ｅ Ｅ２／Ｅ４、ＡＢＣＡ７ Ｇ１５２７Ａ由来のミクログリアは、同様の又はわずかに高レベルのＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３及びアルファシヌクレインレベルを放出し、これは、これらの分析物と上記の遺伝子型との相関関係が欠如していることを意味する。
神経炎症は、アルツハイマー病（ＡＤ）の病因及び進行の重要な原因である。いくつかの炎症性メディエーターの組み合わせにより、特定のＳＮＰ変異に関連する独自の特性が作られる。疾患特異的ドナーに由来するｉＰＳＣ由来のミクログリアを使用して、様々なミクログリアＳＮＰ及び変異関連遺伝子型に関連する主要なシグネチャーサイトカインを決定することができる。
ミクログリアの食作用機能は、神経保護効果を維持するために重要である。ミクログリアを介した食作用は、疾患特異的なＳＮＰ又は変異によって損なわれる可能性があり、これは、脳内の重要な恒常性メカニズムに影響を与え得る。ミクログリアの食作用機能に対する疾患関連ＳＮＰの役割を比較するために、ｐＨｒｏｄｏで標識された細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓ ａｕｒｅｕｓ）及びアミロイドベータの存在下で疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）の食作用機能を評価した。この機能は、ハイスループットスクリーニングアプリケーションに使用することができる。
これらのミクログリア発現疾患関連遺伝子の中でも、骨髄細胞２（ＴＲＥＭ２）及びＡＰＯ Ｅアイソフォームで発現するトリガー受容体をコードする遺伝子の配列バリアントは、ＡＤのリスクの異常な増加と関連している。ＡＰＯＥは、脳内の主要なコレステロール担体であり、脂質輸送、コレステロール恒常性及びシナプス安定性において重要な役割を果たす。抗ＡｐｏＥ免疫療法は、アミロイドの蓄積及び沈着を阻害し、Ａβの凝集及びクリアランスにおけるＡｐｏＥの役割をさらにサポートする。ＡｐｏＥの発現は、疾患関連ミクログリアで有意にアップレギュレーションされることが示されている。ＡｐｏＥ４／Ｅ４アイソフォームは、インビトロで運動性及び食作用をアップレギュレートすることにより、ミクログリアの生理機能に本質的に影響を与えることが示されている。ＡｐｏＥ４／Ｅ４の過剰発現は、他のアイソフォームとは対照的に、アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）の取り込みを減少させることが示されている。神経変性における３番目に一般的な主要ＡｐｏＥアイソフォームであるＡｐｏＥ２の役割は、家族性ＡＤの発症を遅らせることが示されている。ｉＰＳＣ由来のミクログリア機能に対するＡｐｏＥアイソタイプ特異的効果は、これまで十分に調査されていない。
ＴＲＥＭ２は、脂質を感知し、ミエリンの食作用を媒介する。ＴＲＥＭ２の機能喪失（ＬＯＦ）バリアントは、アミロイド斑の播種の増加、アミロイドクラスターの減少及びＡｐｏＥトリガーシグナル伝達カスケードとの相互作用の追加に関連しており、機能障害を伴うアミロイド斑におけるミクログリアクラスター及びＡｐｏＥ蓄積の減少につながる。
ミクログリアの食作用機能に対する疾患関連ＳＮＰの役割を比較するために、細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓ ａｕｒｅｕｓ）及びアミロイドベータの存在下で疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）の食作用機能を評価した。
同じ系統上において、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ７（ＡＢＣＡ７）は、ゲノムワイド関連解析において遅発性アルツハイマー病の感受性因子として同定されている。ＡＢＣＡ７は、食作用を媒介し、膜輸送に影響を与えることが示されている。ＡＢＣＡ７は、ＡＤと強く関連している。アミロイドベータの食細胞クリアランスは、Ａｂｃａ７－／－マウスでは損なわれている。ＡＢＣＡ７のＧ１５２７Ａ置換に関連するミスセンスバリアントを有する患者に由来するｉＰＳＣは、食細胞機能の変化に対する脳のアミロイドベータ恒常性の調節に役割を果たすＢＣＡ７を提供する。
ＣＤ３３は、ミクログリアの食作用の調節を介してアルツハイマー病（ＡＤ）感受性に関連する免疫調節受容体である。ＴＲＥＭ２は、ミクログリアの生理機能及び代謝を調節する際にＣＤ３３の下流で相互作用するため、ＷＴ及びＣＤ３３ ｒｓ３８６５４４４ ＳＮＰを発現するｉＰＳＣ由来のミクログリアを使用して、食作用機能の障害に関連するＣＤ３３の役割を検証することができる（Ｃａｌｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
凍結保存されたＡＨＮ及びＤＡＭミクログリアを解凍し、成熟培地中で３日間培養し、ｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドベータ及びｐＨｒｏｄｏ黄色ブドウ球菌（Ｓ ａｕｒｅｕｓ）に曝露した。食作用の動態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析システムを使用して測定された。総赤色オブジェクト統合強度は、機能的応答を定量化するために使用された。
ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈミクログリア及びＡＢＣＡ７－Ｇ１５２７Ａミクログリアは、ＡＨＮミクログリアと比較して細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）に対して強い食作用能力を明らかにした。ＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）ミクログリアは、ＡＨＮミクログリアと比較して細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）と同等の食作用能力を明らかにした。ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈミクログリア、ＡＢＣＡ７－Ｇ１５２７Ａミクログリア及びＣＤ３３（ｒｓ４２９３５８ ＳＮＰを保有）ミクログリアは、ＡＨＮミクログリアと比較してアミロイドベータの存在下で食作用の強度が低下していることを明らかにした。
ＣＷ１３０３０ＥＥ１ ＡＰＯＥ ４／４は、ＡＨＮミクログリアと比較して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びアミロイドベータによる食作用の強度がより高いことを示した。ＣＷ１３０９８ＡＡ１ ＡＰＯＥ ４／４は、ＡＨＮミクログリアと比較して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びアミロイドベータの両方による食作用の強度がより低いことを示した。ＣＷ１３００５ＡＡ１ ＡＰＯＥ ２／４ミクログリアは、ＡＨＮ由来のミクログリアと比較してアミロイドベータに対する強い食作用能力及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する食作用の低下を明らかにした。ＣＷ１３０７４ＡＡ１ ＡＰＯＥ ４／４ミクログリアは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対してＡＨＮミクログリアと同様の食作用の傾向を示し、アミロイドベータからＡＨＮミクログリア細胞株に対してわずかに増強された食作用を示した。
恒常性、炎症誘発性及び抗炎症性ミクログリアサブタイプを標的とする遺伝子変化の包括的な理解は、新規な生物学的洞察を提供し、神経変性疾患の免疫調節治療アプローチの標的優先順位付けを容易にすることができる。
実施例９ － ミクログリアのさらなる特性評価
ＡＴＰ及びＡＤＰなどの細胞外ヌクレオチドは、「プリン作動性シグナル伝達」経路と呼ばれる受容体を介した経路を誘発することが知られている。組織の恒常性、創傷治癒、神経変性、免疫、炎症、癌などの生理学的プロセスは、プリン作動性シグナル伝達によって調節される。細胞外ＡＴＰ及びＰ２受容体は、ミクログリアの活性化メカニズムにとって重要である。Ｐ２Ｘ受容体は、ＡＴＰ又はその誘導体に結合するイオノトロピック受容体である。Ｐ２Ｙ受容体の１つは、ＡＤＰに応答するＧタンパク質共役型受容体である。病理学的条件下では、ＡＴＰなどのヌクレオチドが損傷した細胞から放出又は漏出され、「ｆｉｎｄ ｍｅ」又は「ｅａｔ ｍｅ」シグナルとして機能して、ミクログリアによるプロセスの延長、走化性及び食作用を引き起こす。Ｐ２受容体の活性化は、インターロイキン１ｂ（ＩＬ－１ｂ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を含むミクログリアからのサイトカイン産生も誘導する。このような炎症誘発性メディエーターは、星状細胞におけるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の発現及び機能を動的に変化させることが示されている。
ミクログリアのプリン受容体応答が特徴付けられた。ミクログリアは、ミクログリア分化培地で解凍され、２００，０００細胞／ウェルの細胞懸濁液に再構成された。ミクログリアの細胞懸濁液１５μｌを３８４ウェルプレートのウェルごとに添加した。細胞を異なる用量（０～１０００ｎＭ）のＢｚＡＴＰ及びＡＤＰで処理した。ＢｚＡＴＰ及びＡＤＰに対する応答は、ＡＺ１１６４５３７３（Ｐ2Ｘ7アンタゴニスト）及びＡＺＤ１２８３（Ｐ２Ｙ12受容体の強力なアンタゴニスト）の存在下でも測定された。全ての処理について、１０ｕｌの化合物の４Ｘストック又は阻害剤を細胞に添加した。細胞は、アッセイ前に阻害剤の存在下又は非存在下で３０分間にわたって化合物に曝露された。ＦＬＰＲカルシウム６のボトル１本をアッセイバッファーＢで１１ｍｌに再構成し、化合物の存在下で細胞懸濁液に１５μｌの色素溶液を添加した。細胞を３７℃で１．５時間インキュベートし、ＦＤＳＳ μＣＥＬＬシステムでイメージングを実施した。
図４４Ａは、ＡＴＰ／ＢｚＡＴＰ全トレースを有するミクログリアを示し、図４４Ｂは、ＡＴＰ／ＢｚＡＴＰサンプルトレースを有するミクログリアを示す。図４４Ｃ～Ｆは、Ｐ2Ｘ7アンタゴニストＡＺ１１６４５３７３の存在下でのＢｚＡＴＰ、ＡＤＰ、ＢｚＡＴＰ及びＰ2Ｘ7アンタゴニストＡ４３８０７９の存在下でのＢｚＡＴＰに対するミクログリアの応答を示す。図４４Ｇは、ＡＺＤ１２８３の存在下でのミクログリアの機能的なＡＤＰ依存性応答を示すために、用量依存性応答を示す。
実施例１０ － ｉＰＳＣからの神経前駆細胞の生成
インビトロ疾患モデルの開発の成功は、患者由来のｉＰＳＣに由来する大量の末期系統の利用可能性に依存する。神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、ニューロン及びグリアを生成する能力を備えた自己複製前駆細胞である（Ｂｒｅｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。初代神経細胞及びｉＰＳＣからＮＰＣを生成するための様々な効率を有する多くの確立されたプロトコルが存在する（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。最近のプロトコルの大半は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の阻害に依存する。本出願は、二重ＳＭＡＤ阻害経路を使用せずに、外胚葉へのｉＰＳＣの自発的ドリフトを利用して、異なるｉＰＳＣ系統にわたってＮＰＣを生成するための単純なプロトコルを説明する。この細胞型を生成する理論的根拠は、ｉＰＳＣ由来のミクログリアと組み合わせて、ヒトの脳の発達並びに正常及び疾患特異的ｉＰＳＣ細胞由来の培養皿内の神経系統、ミクログリア、内皮細胞、周皮細胞、星状細胞間の複雑な細胞間相互作用を模倣する長期共培養アッセイを生成することである。
この研究では、複数のエピソームで再プログラムされたｉＰＳＣ株は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチンでコーティングされたプレート及びＥ８培地で維持された。ｉＰＳＣは、分化の開始前に低酸素条件下で維持されて、神経前駆細胞を産生した。神経前駆体の分化を開始するために、ｉＰＳＣを回収し、ｒｏｃｋ阻害剤の存在下でＥ８培地を使用して、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチンプレートに１５Ｋ／ｃｍ2で播種した。細胞をｒｏｃｋ阻害剤の非存在下で次の４８時間新鮮なＥ８培地に置いた。次のステップは、ｉＰＳＣ培養物を３ｕＭ ＣＨＩＲを補充したＤＭＥＭＦ１２培地に７２時間入れ、正常酸素条件下で培地を毎日交換することを含むプレコンディショニングステップを含んでいた。プレコンディショニングステップの最後に細胞を回収し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチンプレートに２Ｄ形式で３０Ｋ／ｃｍ２で再プレーティングするか、又はｒｏｃｋ阻害剤の存在下において、１ｍｌあたり３０万細胞の密度で超低付着プレート若しくはスピナーフラスコを使用して３Ｄ凝集体を生成した。培養物には、正常酸素条件下で次の８日間、Ｎ２を補充したＥ６培地を隔日でフィードした。分化の１４日目に培養物を回収し、ＴｒｙｐＬＥを使用して個別化した。フローサイトメトリーのための細胞表面染色によりＴｒａ－１６２、ＣＤ５６、ＣＤ１５の存在について、フローサイトメトリーのための細胞内染色によりＳｏｘ１、Ｎｅｓｔｉｎ、β３ミクログロブリン及びＰａｘ－６発現の存在について細胞を染色した。ＮＰＣの生成に含まれる異なるステップは、図４５Ａに概説される。３つのｉＰＳＣ株にわたる分化の異なる日におけるＮＰＣマーカーの出現は、図４５Ｂに要約されている。ＣＤ５６は、この方法で得られたＮＰＣのマーカーとして使用された。細胞は、ＣＳ１０を使用して凍結保存され、解凍後も純度及び増殖可能性を保持していた。ＮＰＣは、星状細胞及びＰａｎニューロンを生成するために下流の分化プロトコルに配置された。
星状細胞は、Ｊｕｌｉａ ｅｔ ａｌ．によって概説されたプロトコルに従ってＮＰＣから分化された。１４日目にＮＰＣ細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした６ウェルプレートに、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ星状細胞培地中、１５ｋ／ｃｍ２でプレーティングした。プレートは、２日ごとに完全な培地交換が行われた。６日ごと又は培養物が約９０％コンフルエントになったとき、Ａｃｃｕｍａｘを使用してプレートを回収し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした６ウェルプレートに１５ｋ／ｃｍ2で再プレーティングした。培養物は、４継代にわたって上記のようにフィードされ、再プレーティングされた。４継代の終わりに、培養物を表面マーカー、ＣＤ４４及びグルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）及び細胞内マーカー、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アクアポリン４（ＡＱＰ４）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ（Ｓ１００β）について染色した（図４５Ｃ）。
皮質グルタミン酸作動性ニューロンは、Ｓｌｏｓａｒｅｋ ｅｔ ａｌによって開発されたプロトコルを使用してＮＰＣから生成された。１４日目のＮＰＣを、１μＭのサイクリックＡＭＰ、１０ｎｇ／ｍｌの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び１０ｎｇ／ｍｌのグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を補充したＥ６培地に３０日間プレーティングした。その後、さらに３０日間にわたり、培地を皮質神経分化培地（Ｅ６培地、１μＭサイクリックＡＭＰ、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、１００ｎｇ／ｍｌインスリン様成長因子－Ｉ及び２％Ｂ２７補充）に変更した（Ｂｒｅｎｎａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。皮質グルタミン酸作動性ニューロンは、異なるｉＰＳＣ株で１４～３６日目に観察された。神経培養物の純度は、β３チューブリン、ＭＡＰ２発現の存在について染色することによって確認された。
本明細書で開示及び特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又は一連のステップに変更を適用し得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代わりに使用し得、そこで同じ又は同様の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替形態及び改変形態の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内にあると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット
国際公開第０３／０１６４９６号パンフレット
国際公開第９８／３０６７９号パンフレット
国際公開第９８／５３０５８号パンフレット
国際公開第９８／５３０５９号パンフレット
国際公開第９８／５３０６０号パンフレット
Ｊｕｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ．９（２）：６００－６１４，２０１７．
ＭｃＱｕａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４３１（９）：１８０５－１７，２０１９．
Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ．６０（１０）：１５０６－１７，２０１２．
Ｍｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．１３（１）：１３５，２０１６．
ＰＣＴ公開国際公開第２０１２／１４９４８４号パンフレット
Ｒｕｓｔｅｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３８（３），２９１－３０４，２０１７．
Ｓｌｏｓａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２４（９）：２２４８－２２６０，２０１８．
米国特許出願公開第１２／７１５，１３６号明細書
米国特許第６，１４０，０８１号明細書
米国特許第６，４５３，２４２号明細書
米国特許第６，５３４，２６１号明細書
米国特許第６，６１７，１５２号明細書
米国特許第８，３７２，６４２号明細書
米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書
米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書
米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書
米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号明細書
米国特許出願公開第２００７／０２１８５２８号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
Ｗｅｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．７：ｅ３０５２５，２０１２．
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Claims (122)

  1. 誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を分化させるためのインビトロ方法であって、
    （ａ）細胞外マトリックスタンパク質の非存在下において帯電表面上で前記ｉＰＳＣを培養すること；及び
    （ｂ）前記ｉＰＳＣを内皮細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させること
    を含むインビトロ方法。
  2. 前記帯電表面は、正に帯電した表面である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記正に帯電した表面は、アミン表面又はポリＬリジン表面である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記正に帯電した表面は、窒素含有官能基を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記帯電表面は、負に帯電した表面である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記負に帯電した表面は、カルボキシル表面である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記負に帯電した表面は、酸素含有官能基を含む、請求項５に記載の方法。
  8. 前記帯電表面は、正に帯電した基及び負に帯電した基を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記正に帯電した基は、窒素含有基であり、及び前記負に帯電した基は、酸素含有基である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記帯電表面は、ポリマー表面である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ポリマー表面は、ポリスチレン表面である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ｉＰＳＣは、無血清の限定培地で培養される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 分化させることは、ブレビスタチン又はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｈ１１５２である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記培養することは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン及び／又はコラーゲンの非存在下で実行される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ステップ（ａ）前に、ＴＲＥＭ２の破壊された発現を有するように前記ｉＰＳＣを操作することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 操作することは、ＴＡＬヌクレアーゼを使用してＴＲＥＭ２のエクソン２にインデルを導入することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の破壊された発現を有するように前記ｉＰＳＣを操作することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＭｅＣＰ２の破壊された発現は、ＭｅＣＰ２タンパク質の短縮型変異体としてさらに定義される、請求項１８に記載の方法。
  20. アルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）の破壊された発現を有するように前記ｉＰＳＣを操作することをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＳＣＮＡの破壊された発現は、ミスセンス点変異によるものである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ミスセンス点変異は、Ａ５３Ｔである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前駆細胞を内皮細胞に分化させることを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ステップ（ａ）は、アミン表面上で培養して前駆細胞を生成することを含み、及びステップ（ｂ）は、内皮分化培地の存在下においてカルボキシル表面上で培養して内皮細胞を産生することを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記内皮細胞は、ＣＤ３１について陽性である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記内皮細胞を脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）に分化させることをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記内皮細胞をリンパ性内皮細胞に分化させることをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記前駆細胞をＭＳＣに分化させることを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 分化させることは、ＭＳＣ培地の存在下においてアミン表面上で前記前駆細胞を培養することを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ１０５について陽性である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記分化された細胞の少なくとも９０％は、ＣＤ７３について陽性である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＭＳＣを周皮細胞に分化させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  33. 前記ＭＳＣは、細胞外タンパク質の非存在下において周皮細胞培地の存在下で培養される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記周皮細胞は、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲβ及びＣＤ１４６について陽性である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記前駆細胞をＨＰＣに分化させることを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＨＰＣをミクログリアに分化させることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 分化させることは、ミクログリア分化培地の存在下において、中性に帯電した表面又は超低付着表面上で前記ＨＰＣを培養することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ミクログリア分化培地は、ＩＬ３４、ＴＧＦ及びＭＣＳＦを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 分化させることは、正常酸素圧での培養を含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 分化させることは、２０～２５日間にわたるものである、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記ミクログリアは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ３３について陽性である、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記分化された細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂについて陽性である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記分化された細胞の少なくとも９０％は、ＣＤ３３について陽性である、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記方法のステップ（ｂ）は、前記細胞の精製を含まない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 精製は、ＭＡＣＳを実施することとしてさらに定義される、請求項４４に記載の方法。
  46. 適正製造基準（ＧＭＰ）に準拠している、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 低酸素条件下で実施される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ｉＰＳＣは、ヒトのものである、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. ステップ（ａ）～（ｄ）の１つ以上は、ゼノフリー条件、フィーダーフリー条件及び／又は馴化培地なしの条件下で実施される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ステップ（ａ）～（ｄ）のそれぞれは、ゼノフリー条件、フィーダーフリー条件及び／又は馴化培地なしの条件下で実施される、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. ステップ（ａ）～（ｄ）のそれぞれは、定義された条件下で実施される、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. ＴＲＥＭ２、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＩＢＡ－１及び／又はＣＸ３ＣＲ１について少なくとも９０％陽性のミクログリア細胞集団を含む組成物であって、前記ミクログリア細胞集団は、ｉＰＳＣから分化される、組成物。
  53. 前記ミクログリア細胞集団は、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記ミクログリア細胞集団は、ＴＲＥＭ２、ＡＰＯＥ、ＣＤ３３、ＢＩＮ、ＡＢＣＡ７、ＳＮＰＳ又は神経変性に関連する遺伝子型を有する疾患関連ｉＰＳＣドナーから生成される、請求項５２に記載の組成物。
  55. 前記ミクログリア細胞集団は、ＴＲＥＭ２の破壊された発現を有する、請求項５２に記載の組成物。
  56. 前記ＴＲＥＭ２の破壊された発現は、ＴＲＥＭ２発現のホモ接合ノックアウトとしてさらに定義される、請求項５３に記載の組成物。
  57. 前記ミクログリア細胞集団は、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の破壊された発現を有する、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記ＭｅＣＰ２の破壊された発現は、ＭｅＣＰ２タンパク質の短縮型変異体としてさらに定義される、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記ミクログリア細胞集団は、アルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）の破壊された発現を有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記ＳＣＮＡの破壊された発現は、ミスセンス点変異によるものである、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ミスセンス点変異は、Ａ５３Ｔである、請求項６０に記載の組成物。
  62. 試験化合物をスクリーニングするための方法であって、請求項５２～５６のいずれか一項に記載のミクログリア細胞集団に前記試験化合物を導入することを含む方法。
  63. 前記ミクログリア細胞集団は、アミロイドベータにさらに導入される、請求項５６に記載の方法。
  64. 前記ミクログリア細胞集団は、ＬＰＳにさらに導入される、請求項５６に記載の方法。
  65. 請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法によって産生された周皮細胞集団を含む組成物。
  66. 請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法によって産生されたミクログリア、周皮細胞及びＢＭＥＣを含む血液脳関門モデル。
  67. ミクログリアを生成するための方法であって、
    （ａ）ｉＰＳＣをＨＰＣに分化させること；及び
    （ｂ）前記ＨＰＣからＣＤ３４陽性細胞を選択すること；及び
    （ｃ）ミクログリア分化培地で前記ＨＰＣを培養し、それによりミクログリアの集団を生成すること
    を含む方法。
  68. 前記ＨＰＣは、請求項１に従って分化される、請求項６７に記載の方法。
  69. 選択することは、ＣＤ３４陽性細胞について選別することを含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 選別することは、ＣＤ３４磁気ビーズを使用することを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. ＣＤ４３陽性細胞についてＨＰＣを選別することを含まない、請求項６７に記載の方法。
  72. 前記ミクログリア分化培地は、ＩＬ－３４、ＴＧＦβ１又はＭ－ＣＳＦを含む、請求項６７に記載の方法。
  73. 前記ミクログリア分化培地は、２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４、１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１及び５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記細胞は、４８時間ごとにミクログリア分化培地をフィードされる、請求項６７に記載の方法。
  75. ＥＣＭタンパク質を含まない、請求項６７に記載の方法。
  76. 前記ミクログリアの集団中の前記細胞の少なくとも９０％は、ＴＲＥＭ陽性である、請求項６７に記載の方法。
  77. 前記ＨＰＣの少なくとも１０％は、ミクログリアに分化される、請求項６７に記載の方法。
  78. ステップ（ｂ）の前記培養することは、９６ウェル形式で実施される、請求項６７に記載の方法。
  79. ステップ（ｂ）の前記培養することは、帯電表面上で実施される、請求項６７に記載の方法。
  80. 前記帯電表面は、正に帯電している、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記正に帯電した表面は、アミン表面である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記帯電表面は、負に帯電している、請求項７９に記載の方法。
  83. 前記負に帯電した表面は、カルボキシル表面である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記帯電表面は、正に帯電した基及び負に帯電した基を含む、請求項７９に記載の方法。
  85. 前記正に帯電した基は、窒素含有基であり、及び前記負に帯電した基は、酸素含有基である、請求項８４に記載の方法。
  86. ＣＤ２００及び／又はフラクタルカインを含む培地中で前記ミクログリアの集団を成熟させることをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  87. 前記ミクログリアを凍結保存することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ＨＰＣは、ＴＲＥＭ２の破壊された発現を有するように操作されたｉＰＳＣから分化される、請求項６７に記載の方法。
  89. 操作することは、ＴＡＬヌクレアーゼを使用することを含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記凍結保存されたミクログリアは、ｐＨｒｏｄｏ細菌粒子に対する食作用機能を保持する、請求項８７に記載の方法。
  91. 前記凍結保存されたミクログリアは、解凍後に成熟し、且つ刺激物質に応答し、且つ上清培地中においてインターロイキン、ケモカイン及び免疫調節リガンドを分泌することができる、請求項８７に記載の方法。
  92. ｉＰＳＣから神経前駆細胞（ＮＰＣ）を産生するためのインビトロ方法であって、
    （ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む培地中でｉＰＳＣをプレコンディショニングすること；
    （ｂ）前記ｉＰＳＣをＮＰＣに分化させること
    を含み、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害を含まないインビトロ方法。
  93. 前記ｉＰＳＣは、ステップ（ａ）前に低酸素条件下で維持される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記ｉＰＳＣは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で播種され、且つその後、ステップ（ａ）前にＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養される、請求項９２又は９３に記載の方法。
  95. 前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ又はＳＢ－２１６７６３である、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＣＨＩＲ９９０２１は、３μＭの濃度で前記培地に添加される、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記プレコンディショニングすることは、２～４日間にわたるものである、請求項９２～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記プレコンディショニングすることは、３日間にわたるものである、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）の前記ｉＰＳＣは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質でコーティングされた表面上で培養される、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. ＥＣＭタンパク質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ラミニン又はビトロネクチンである、請求項９２～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記ＥＣＭタンパク質は、ラミニン又はビトロネクチンである、請求項９２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. ステップ（ａ）及び（ｂ）は、正常酸素条件下で実施される、請求項９２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 分化させることは、ＥＣＭタンパク質でコーティングされた表面上で前記ｉＰＳＣを培養することを含む、請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. ＥＣＭタンパク質は、ラミニン又はビトロネクチンである、請求項１０４に記載の方法。
  106. 分化させることは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において超低付着プレート又はスピナーフラスコで前記ｉＰＳＣを培養することを含む、請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  107. ステップ（ｂ）は、５～１０日間にわたって実施される、請求項９２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. ステップ（ｂ）は、７日間にわたって実施される、請求項９２～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記ＮＰＣにおけるＴｒａ－１６２、ＣＤ５６、ＣＤ１５、Ｓｏｘ１、Ｎｅｓｔｉｎ、β３ミクログロブリン及び／又はＰａｘ－６の発現を検出することをさらに含む、請求項９２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記ＮＰＣの少なくとも７０％は、ＣＤ５６について陽性である、請求項９２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記ＮＰＣを星状細胞又はニューロンにさらに分化させる、請求項９２～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 神経変性疾患をスクリーニングする方法であって、ミクログリア馴化培地中の可溶性ＴＲＥＭ２のレベルを検出することを含む方法。
  113. 検出することは、ＥＬＩＳＡを実施することを含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. ミクログリアは、同質遺伝子操作されたｉＰＳＣ、又は疾患関連ＳＮＰ又は変異を発現するドナーに由来する、請求項１１２又は１１３に記載の方法。
  115. 前記ミクログリアは、請求項１～５１又は６７～９１のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 対照と比較して増加したレベルの可溶性ＴＲＥＭ２は、神経変性疾患を検出する、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病又は多発性硬化症である、請求項１１２～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 治療剤を同定するためにハイスループットスクリーニングを実施するための方法であって、請求項１～５１又は６７～９１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたミクログリアを複数の候補薬剤と接触させることと、サイトカイン及び／若しくはケモカインレベル並びに／又はアミロイドベータ食作用機能を測定することとを含む方法。
  119. 前記ミクログリアは、凍結保存されている、同質遺伝子操作されたｉＰＳＣ系統に由来するミクログリア、疾患関連ＳＮＰを発現するドナーに由来するミクログリア、又は神経変性に関連する変異を発現するドナーに由来するミクログリアである、請求項１１８に記載の方法。
  120. サイトカイン及び／又はケモカインは、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ３、ＴＮＦα、ＩＬ１３、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ及びＩＬ－８／ＣＸＣＬ８からなる群から選択される、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
  121. 請求項１～５１又は６７～９１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたミクログリアと、内皮細胞、周皮細胞、星状細胞及び／又は神経前駆細胞とを含む共培養物。
  122. ヒトの脳の発達を模倣するための、請求項１２１に記載の共培養の使用。
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