JP2024516992A - Ｉｐｓｃ由来ミクログリアのための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、防御ＣＤ３３アレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリアを提供する。防御ＣＤ３３アレルに関連する分析物及び遺伝子をスクリーニングするためのアッセイが、本明細書においてさらに提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１８４，７１１号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

１．分野
本発明は概して分子生物学及び医学の分野に関する。より詳しくは、本発明は防御ＣＤ３３アレルを含むミクログリア細胞に関する。

２．関連技術の説明
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的な神経変性疾患であり、高齢者の間で認知症の主な原因である。神経変性及び認知低下の発症及び進行の根底にある機序は、完全には理解されていない。ＡＤの理解における主要なブレークスルーは、まれな家族性ＡＤ（ＦＡＤ）症例に関連する遺伝子変異の特定であった。アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質（ＡＰＰ）並びにプレセニリン１及び２（ＰＳＥＮ１／２）遺伝子における常染色体優性変異は、早期発症型認知症につながる認知低下の速度を大きく加速する。

ほとんどのＡＤ症例は、明らかなメンデル遺伝パターンを欠く遅発型（ＬＯＡＤ）である。ＬＯＡＤは強力な遺伝成分を有し、各々が穏やかで部分的に浸透性の効果を有する複数のリスクアレル、及び環境因子の組み合わせによって引き起こされる可能性が高い（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

アポリポタンパク質Ｅε４（ＡＰＯＥε４）は、長い間、ＬＯＡＤの唯一の確認された遺伝的リスク因子であって、ＬＯＡＤリスクのわずか１０～２０％を占めており、これは、さらなるリスク因子の存在を示唆している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。最近、拡大コホート（数千人の個人）で確認されたゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、以下のようなＡＤのさらなる遺伝的リスク因子が確認された：ＣＤ３３（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｈｏｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｎａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＣＬＵ、ＢＩＮ１、ＰＩＣＡＬＭ、ＣＲ１、ＣＤ２ＡＰ、ＥＰＨＡ１、ＡＢＣＡ７、ＭＳ４Ａ４Ａ／ＭＳ４Ａ６Ｅ（Ｈａｒｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｈｏｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｎａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及びＴＲＥＭ２（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの遺伝的リスク因子の神経変性との関連をより深く理解し、新規な治療法を開発するために、これらの遺伝的リスク因子を研究するモデルシステムが求められているが、未だこの要求は満たされていない。

本開示の特定の実施形態は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む、単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株を提供する。

いくつかの態様では、細胞株はＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する。他の態様では、細胞株はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株のｉＰＳＣは、健康なドナーからエピソームとしてリプログラミングされたｉＰＳＣである。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリアのｉＰＳＣは、アルツハイマー病のドナーからエピソームとしてリプログラミングされたものである。いくつかの態様では、細胞株は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＲＥＭ２を発現する。特定の態様では、細胞株は、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９を発現する。特定の態様では、細胞株はアイソジェニックである。

さらなる態様は、本態様の細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）を含むキットを提供する。

特定の態様では、キットは、第１の容器中のＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株と、第２の容器中のＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株とを含む。いくつかの態様では、細胞株はＡＰＯＥ３／３遺伝子型又はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。

さらなる態様では、キットは、それぞれチューブなどの好適な容器に収容されたＩＦＮγ、ＬＰＳ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦをさらに含む。いくつかの態様では、キットは、それぞれチューブなどの好適な容器に収容されたＩＬ－４、ＩＬ－１３、及び／又はジブチルｃＡＭＰをさらに含む。さらなる態様では、キットは、それぞれ好適な容器に収容された、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試薬などの、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを検出するための試薬をさらに含む。キットは、１つ以上のＥＬＩＳＡプレートをさらに含み得る。

別の実施形態は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株を試料と接触させることを含む、神経変性疾患をスクリーニングするための方法を提供する。

いくつかの態様では、細胞株はＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する。他の態様では、細胞株はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。いくつかの態様では、本方法は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株を前記試料と接触させることをさらに含む。特定の態様では、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株及び／又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株は、本実施形態及びその態様の細胞株である。いくつかの態様では、細胞株はＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する。他の態様では、細胞株はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株のｉＰＳＣは、健康なドナーからエピソームとしてリプログラミングされたｉＰＳＣである。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリアのｉＰＳＣは、アルツハイマー病のドナーからエピソームとしてリプログラミングされたものである。いくつかの態様では、細胞株は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＲＥＭ２を発現する。特定の態様では、細胞株は、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９を発現する。特定の態様では、細胞株はアイソジェニックである。いくつかの態様では、試料は、血液試料などの患者の試料である。いくつかの態様では、試料は、合成された小分子などの分子のライブラリーを含む。

さらなる態様において、本方法は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを検出することをさらに含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルの低下は、神経変性疾患の存在を示す。例えば、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症である。

さらなる実施形態は、試験化合物をスクリーニングするための方法であって、試験化合物を本実施形態のミクログリア細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）に導入すること、及び分析物のレベルを測定することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、方法は、アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む。特定の態様では、ミクログリア細胞集団は、少なくとも１つの炎症促進（Ｍ１）剤又は抗炎症（Ｍ２）剤にさらに導入される。例えば、炎症促進（Ｍ１）剤は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦである。いくつかの態様では、抗炎症（Ｍ２）剤は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、及び／又はジブチルｃＡＭＰである。特定の態様では、分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１からなる群から選択される。いくつかの態様では、分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１である。特定の態様では、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを増加させる薬剤は、抗ベータアミロイド剤である。さらなる態様では、本方法は、アミロイドの蓄積を予防又は減少させるのに有効な量で抗ベータアミロイド剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、対象はＡＰＯＥ４／４陽性である。

さらに別の実施形態では、表１Ａからの少なくとも１０種の遺伝子及び表１Ｂからの少なくとも１０種の遺伝子の血液試料中の発現レベルを決定することを含む、神経変性のリスクがある対象を特定する方法であって、対照と比較して表１Ａにおける遺伝子の発現が減少し、表１Ｂにおける遺伝子の発現が増加している対象は神経変性のリスクがある、方法が提供される。

特定の態様では、表１Ａ中の少なくとも１０種の遺伝子は、ＴＥＮＭ４、ＭＴＮＤ１Ｐ２３、ＧＲＥＭ１、ＧＰＡＴ２、ＡＣ２４３７７２．３、ＣＤ３００Ｅ、ＦＮ１、ＳＬＣ１Ａ１、ＴＮＣ、及びＮＰＰＣである。特定の態様では、表１Ｂ中の少なくとも１０個の遺伝子は、ＭＭＰ２、ＭＡＧ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＣＹＴＬ１、ＰＤＣＤ１、ＺＮＦ９０、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＳＴ７、ＮＴ５ＤＣ４、及びＡＱＰ１である。いくつかの態様では、神経変性は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症に関連している。特定の態様では、発現レベルの決定は、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイ、ピコドロップレット標的化及び逆転写、又はＲＮＡ配列決定を行うことを含む。さらなる態様では、本方法は、神経変性のリスクがあると特定された前記対象に有効量の治療薬を投与することをさらに含む。特定の態様では、治療薬は、コリンエステラーゼ阻害剤又は抗炎症剤である。

さらなる実施形態は、本実施形態の細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）を複数の候補薬剤と接触させること、及び分析物のレベルを測定することを含む、治療薬を特定するためのハイスループットスクリーニングを実施するための方法を提供する。

いくつかの態様では、分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１である。特定の態様では、方法は、アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む。

別の実施形態は、本実施形態のミクログリア細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）、並びに内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、及び／又は神経前駆細胞を含む共培養物を提供する。

本発明の実施形態のミクログリア細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）、並びに内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、及び／又は神経前駆細胞の共培養物の、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症などの神経変性疾患のモデルとしての使用が、本明細書においてさらに提供される。いくつかの態様では、モデルは、生体機能チップとしてさらに定義される。

さらなる実施形態は、ＴＲＥＭ２、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９に対して少なくとも９０％陽性であるミクログリア細胞集団を含む組成物であって、ミクログリア細胞集団はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化したものである組成物を提供する。

いくつかの態様では、ミクログリア細胞集団は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣから分化したものである。特定の態様では、ミクログリア細胞集団は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化したものである。 いくつかの態様では、細胞株はＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する。他の態様では、細胞株はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株のｉＰＳＣは、健康なドナーからエピソームとしてリプログラミングされたｉＰＳＣである。特定の態様では、ｉＰＳＣ由来ミクログリアのｉＰＳＣは、アルツハイマー病のドナーからエピソームとしてリプログラミングされたものである。いくつかの態様では、細胞株は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＲＥＭ２を発現する。特定の態様では、細胞株は、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９を発現する。特定の態様では、細胞株はアイソジェニックである。

さらなる実施形態は、ＴＲＥＭ２、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９に対して少なくとも９０％陽性のミクログリア細胞集団を含む組成物（ここで、ミクログリア細胞集団はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化したものである）の使用であって、試験化合物を本実施形態のミクログリア細胞株（例えば、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株）に導入すること、及び分析物の濃度を測定することを含む、試験化合物をスクリーニングするための使用を提供する。

いくつかの態様では、使用は、アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む。特定の態様では、ミクログリア細胞集団は、少なくとも１つの炎症促進性（Ｍ１）剤又は抗炎症性（Ｍ２）剤にさらに導入される。例えば、炎症促進（Ｍ１）剤は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦである。いくつかの態様では、抗炎症（Ｍ２）剤は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０及び／又はジブチルｃＡＭＰである。特定の態様では、分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１からなる群から選択される。いくつかの態様では、分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１である。特定の態様では、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを増加させる薬剤は、抗ベータアミロイド剤である。さらなる態様では、本使用は、アミロイドの蓄積を予防又は減少させるのに有効な量で抗ベータアミロイド剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、対象はＡＰＯＥ４／４陽性である。

さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９に対して少なくとも９０％陽性のミクログリア細胞集団を含む組成物（ここで、ミクログリア細胞集団はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化したものである）の使用であって、表１Ａからの少なくとも１０種の遺伝子及び表１Ｂからの少なくとも１０種の遺伝子の血液試料中の発現レベルを決定することを含み、対照と比較して表１Ａ中の遺伝子の発現が減少し、表１Ｂ中の遺伝子の発現が増加した対象が神経変性のリスクがある、神経変性のリスクがある対象を特定するための使用が提供される。

特定の態様では、表１Ａ中の少なくとも１０種の遺伝子は、ＴＥＮＭ４、ＭＴＮＤ１Ｐ２３、ＧＲＥＭ１、ＧＰＡＴ２、ＡＣ２４３７７２．３、ＣＤ３００Ｅ、ＦＮ１、ＳＬＣ１Ａ１、ＴＮＣ、及びＮＰＰＣである。特定の態様では、表１Ｂ中の少なくとも１０個の遺伝子は、ＭＭＰ２、ＭＡＧ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＣＹＴＬ１、ＰＤＣＤ１、ＺＮＦ９０、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＳＴ７、ＮＴ５ＤＣ４、及びＡＱＰ１である。いくつかの態様では、神経変性は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症に関連している。特定の態様では、発現レベルの決定は、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイ、ピコドロップレット標的化及び逆転写、又はＲＮＡ配列決定を行うことを含む。さらなる態様では、本使用は、神経変性のリスクがあると特定された前記対象に有効量の治療薬を投与することをさらに含む。特定の態様では、治療薬は、コリンエステラーゼ阻害剤又は抗炎症剤である。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明によって明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内の様々な変更や修正は、当業者であればこの詳細な説明によって明らかになるので、単に例示を目的として提供されているものであることは理解されるべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の１つ以上を、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて参照することにより、より良好に理解されるであろう。

（図１Ａ）防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下及び非存在下でのＡＰＯＥ３／３バックグラウンドにおける末期ミクログリアの純度プロファイル。凍結保存したミクログリアを解凍し、細胞表面及び細胞内フローサイトメトリーにより純度を評価した。ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＴＲＥＭ２、及び細胞内マーカー（ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２及びＴＭＥＭ１１９）の細胞表面発現の発現を定量した。（図１Ｂ）防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下及び非存在下でのＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおける末期ミクログリアの純度プロファイル。ＣＤ３３の存在下及び非存在下でのＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおける末期ミクログリアの純度プロファイル。凍結保存したミクログリアを解凍し、細胞表面及び細胞内フローサイトメトリーにより純度を評価した。ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＴＲＥＭ２、及び細胞内マーカー（ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２及びＴＭＥＭ１１９）の細胞表面発現の発現を定量した。

（図２Ａ）防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下及び非存在下でのＡＰＯＥ３／３バックグラウンドにおける解凍後のミクログリアにおけるｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドβの食作用。（図２Ｂ）防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下及び非存在下でのＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおける解凍後のミクログリアにおけるｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドβの食作用。

凍結保存したｉＣｅｌｌミクログリアをミクログリア維持培地に播種し、３日間回復させた後、２４時間刺激した。上清を、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘシステムを用いて、技術的複製でアッセイした。非刺激対照に対する倍率変化を各細胞株について計算し、次いで、防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有する株を、各ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４コホート内の非防御株と、（図３Ａ）ＬＰＳ、（図３Ｂ）ＩＦＮγ、（図３Ｃ）ＬＰＳ＋ＩＦＮγ（図３Ｄ）ＩＬ－４（図３Ｅ）ＩＬ－１３、（図３Ｆ）ＩＬ－１０、（図３Ｇ）ＴＧＦβ、（図３Ｈ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３、（図３Ｉ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＩＬ－１０、（図３Ｊ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＴＧＦβ、及び（図３Ｋ）ＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰによる刺激について比較した。エラーバー＝±１ＳＥＭ。

凍結保存したｉＣｅｌｌミクログリアをミクログリア維持培地に播種し、３日間回復させた後、２４時間刺激した。上清を、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘシステムを用いて、技術的複製でアッセイした。非刺激対照に対する倍率変化を各細胞株について計算し、次いで、防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有する株を、各ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４コホート内の非防御株と、（図４Ａ）ＬＰＳ、（図４Ｂ）ＩＦＮγ、（図４Ｃ）ＬＰＳ＋ＩＦＮγ（図４Ｄ）ＩＬ－４（図４Ｅ）ＩＬ－１３、（図４Ｆ）ＩＬ－１０、（図４Ｇ）ＴＧＦβ、（図４Ｈ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３、（図４Ｉ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＩＬ－１０、（図４Ｊ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＴＧＦβ、及び（図４Ｋ）ＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰによる刺激について比較した。エラーバー＝±１ＳＥＭ。

凍結保存したｉＣｅｌｌミクログリアをミクログリア維持培地に播種し、３日間回復させた後、２４時間刺激した。上清を、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘシステムを用いて、技術的複製でアッセイした。非刺激対照に対する倍率変化を各細胞株について計算し、次いで、防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有する株を、各ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４コホート内の非防御株と、（図５Ａ）ＬＰＳ、（図５Ｂ）ＩＦＮγ、（図５Ｃ）ＬＰＳ＋ＩＦＮγ（図５Ｄ）ＩＬ－４（図５Ｅ）ＩＬ－１３、（図５Ｆ）ＩＬ－１０、（図５Ｇ）ＴＧＦβ、（図５Ｈ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３、（図５Ｉ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＩＬ－１０、（図５Ｊ）ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＴＧＦβ、及び（図５Ｋ）ＩＬ－４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰによる刺激について比較した。エラーバー＝±１ＳＥＭ。

ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４バックグラウンドを有する防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下及び非存在下で保有するミクログリアにおける解凍後３日目及び７日目の可溶性ＴＲＥＭの定量化。ｉＣｅｌｌミクログリアを解凍し、９６ウェルのＰｒｉｍａｒｉａプレート中の成熟培地に同じ密度でプレーティングした。ｓＴＲＥＭ２の絶対レベルを、別々のウェルからのＤＩＶの３日目及び７日目に上清を回収することによって定量した（技術的３連）。エラーバー＝±１ＳＥＭ。

（図７Ａ）ＡＰＯＥ３／３バックグラウンドにおいて倍率変化が≧２である非防御ＣＤ３３を保有するミクログリアにおいて上方制御される遺伝子の概要。（図７Ｂ）ＡＰＯＥ３／３バックグラウンドにおいて倍率変化が≧２である非防御ＣＤ３３を保有するｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいて下方制御される遺伝子の概要。（図７Ｃ）ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおいて倍率変化が≧２である非防御ＣＤ３３バリアントを保有するｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいて上方制御される遺伝子の概要。（図７Ｄ）ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおいて倍率変化が≧２である非防御ＣＤ３３バリアントを保有するｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいて下方制御される遺伝子の概要。（図７Ｅ）ＡＰＯＥ３／３バックグラウンドにおける防御ＣＤ３３バリアントの存在下及び非存在下でミクログリアにおいて上方又は下方制御される上位１０種の遺伝子の概要。（図７Ｆ）ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおける防御ＣＤ３３バリアントの存在下及び非存在下でミクログリアにおいて上方又は下方制御される上位１０種の遺伝子の概要。（図７Ｇ）防御及び非防御ＣＤ３３バリアントを保有するＡＰＯＥ３／３ミクログリアにおいて上方及び下方制御される経路の概要。（図７Ｈ）防御及び非防御ＣＤ３３バリアントを保有するＡＰＯＥ４／４ミクログリアにおいて上方及び下方制御される経路の概要。（図７Ｉ）非防御ＣＤ３３変異体を発現するミクログリアにおいて上方及び下方制御される経路の概要。（図７Ｊ）防御ＣＤ３３バリアントを発現するミクログリアにおいて上方及び下方制御される経路の概要。

ｐＨｒｏｄｏ ＳＥで標識されたアミロイドベータの食作用。ミクログリアを解凍し、３日間成熟させた後、食作用アッセイのためにプレーティングした。ミクログリアを３８４ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで播種した。ｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドベータ（１μＭ／ウェル）及びＮｕｃＳｐｏｔ ４８８核染色試薬（１：１０，０００）をプレートに加え、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャーを用いて４時間ごとにウェルを赤色及び緑色蛍光についてモニターした。ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウエア（ｖ２０１９Ｂ）を使用して、総赤色オブジェクト積分強度（ＲＣＵ×μｍ２／ｉｍａｇｅ）を１ウェル当たりの総緑色カウントに対して正規化した。（図８Ａ）非防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）を含むＡＰＯＥ４／４ミクログリアは、防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）と比較して、ｐＨｒｏｄｏアミロイドβに曝露された場合、食作用動態の減少を示した。（図８Ｂ）防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）を含むＡＰＯＥ３／３ミクログリアは、ｐＨｒｏｄｏアミロイドベータに曝露された場合、最高及び最低の食作用動態を示した。非防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）を含むＡＰＯＥ３／３ミクログリアは、Ｃ１２２２防御と比較したとき、同様のレベルの食作用を示した。

ＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４ミクログリアの予備呼吸能。ミクログリアを解凍し、３日間静置した後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイのために播種した。ミクログリアを、ＰＤＬをコーティングした９６ウェルプレートに１ウェル当たり２０，０００個の細胞で播種し、一晩静置した。アッセイ当日、培地を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ ＤＭＥＭ、グルコース（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、及びＬ－グルタミン酸（２ｍＭ）を含むアッセイ培地と交換した。次いで、プレートを、周囲ＣＯ_２を含む３７℃インキュベーター中で１時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｅｌｌ ミトストレステストキットからのオリゴマイシンＡ（１０μＭ）、ＦＣＣＰ（３０μＭ）、及びロテノン／アンチマイシンＡ（５μＭ）からなる原料化合物を調製し、製造業者の使用説明書に従ってＸＦ９６センサーカートリッジの適切なポートにロードした。試料は、ウエーブコントローラソフトウエアパッケージを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅアナライザーを用いて分析した。アッセイ後、Ｈｏｅｃｈｓｔ核色素（１：１０００）を用いて細胞数を決定し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｅｒを用いて捕捉した。データを、細胞１個当たりの酸素消費速度（ＯＣＲ）に対して正規化した。統計的有意性を、ｐ＜０．０５の両側ｔ検定により決定した。防御（ＰＲ）ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含む（図９Ａ）ＡＰＯＥ３／３及び（図９Ｂ）ＡＰＯＥ４／４ミクログリアは、非防御（ＮＰ）ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含むミクログリアよりも統計的に有意なＯＣＲを示した。

免疫機能、特に組織常在マクロファージは、疾患の発症に不可欠な役割を果たしている。例えば、神経免疫軸及びミクログリア、脳常在マクロファージは、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の病理に必須の役割を果たしており、これは、ゲノムワイド関連研究及びオミックス研究の両方によって支持されている。さらに、組織常在マクロファージは、ＮＡＳＨ（クッパー細胞）、ＡＭＤ（網膜下ミクログリア）、喘息及びＣＯＰＤ（肺胞マクロファージ）、並びにＨＩＶの発症に重要な役割を果たしている。多くの研究により、網膜ミクログリアドルーゼン形成、アテローム性動脈硬化プラーク形成（末梢マクロファージ）、肺泡沫細胞、及び脳ＡＤ神経病理に寄与する脂質調節機能障害も同定されている。組織常在マクロファージの脂質機能不全が恒常性機能にどのように影響するかを理解することは、炎症病因を有する多くの慢性疾患の治療手段として役立つであろう。

最近のゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）は、遅発性アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）リスクを調節するミクログリアにおいて発現される遺伝子内のいくつかの一塩基多型（ＳＮＰ）を同定した。アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ４）のＡＰＯＥアレルの遺伝、又は骨髄細胞２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）におけるＲ４７Ｈ変異の存在は、アルツハイマー病（ＡＤ）のリスクを増加させ、一方、ＣＤ３３におけるｒｓ１２４５９４１９Ｔバリアント、シグレックファミリー膜貫通糖タンパク質の存在は防御である。アミロイドβ（Ａβ）含有プラークの沈着は、ＦＡＤ及びＬＯＡＤの両方の病理学的特徴である。ＡｐｏＥ４は、Ａβの産生、クリアランス及び凝集に影響を及ぼす。ＣＤ３３アイソフォームの分析により、エクソン２を欠く一般的なアイソフォーム（Ｄ２－ＣＤ３３）が同定された。Ｄ２－ＣＤ３３として発現されるＣＤ３３の割合は、ｒｓ３８６５４４４遺伝子型と強く相関した。ｒｓ３８６５４４４はＣＤ３３プロモーター領域にあり、プロモーターからエクソン４までのＣＤ３３をさらに配列決定することにより、ｒｓ３８６５４４４と共遺伝する単一の多型、すなわちエクソン２のｒｓ１２４５９４１９が同定された。したがって、ＣＤ３３はミクログリアｍＲＮＡであり、ｒｓ３８６５４４４は、ＣＤ３３エクソン２スプライシングを調節するｒｓ１２４５９４１９のプロキシＳＮＰである。エクソン２は、シグレックファミリーメンバーにおけるシアル酸結合を典型的に媒介するＣＤ３３ ＩｇＶドメインをコードする。ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４の存在下でのＣＤ３３における防御ｒｓ１２４５９４１９Ｔバリアントの分子活性及び細胞活性、並びにそれらの機能的相互作用を理解することは、ＡＤの理解を大いに進めるはずである。

ＬＯＡＤにおけるＡＰＯＥ４とＣＤ３３との間の遺伝的関連、及びＡＤリスクの用量依存的減少を伴う防御ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルのコピー数間の強い相関を考慮して、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリアを作製し、ＡＤの発症におけるこれらのバリアントの相乗的寄与を理解した。（ｉ）ＡＰＯＥ３／３遺伝子型を発現する健康なドナー、及び（ｉｉ）ＣＤ３３防御ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又は非防御ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを有するＡＰＯＥ４／４遺伝子型を発現するＡＤドナーからエピソームとしてリプロミングされたｉＰＳＣを拡大し、ミクログリアに首尾よく分化させた。全てのドナー試料からの凍結保存ミクログリアは、ミクログリア特異的細胞マーカー（ＣＤ４５、ＴＲＥＭ２、ＣＤ３３、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭＥ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＢＡ－１）を発現した。末期凍結保存ミクログリアの機能評価は、防御ｒｓ１２４５９４１９Ｔ又はｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを保有するドナー間で、食作用の変化した動態及び可溶性ＴＲＥＭ２レベルの差異を示した。ミクログリアを炎症促進性（Ｍ１）又は抗炎症性（Ｍ２）刺激で処理して、神経炎症及び神経修復の異なる段階に関与する経路を解明した。防御ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを保有するドナーに由来するミクログリアは、ＡＰＯＥ３／３対ＡＰＯＥ４／４を保有するドナーにおいて非防御ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを保有するミクログリアと比較して、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３及びＣＣＬ６を含むより高いレベルの免疫調節Ｍ２分析物を放出した。これらの知見は、ＡＰＯＥ遺伝子型との関連において、防御ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルによって誘発される細胞応答の機構を明らかにする。このｉＰＳＣ由来ミクログリアのパネルを使用して、ＡＤリスクに関与する遺伝子バリアントの相互作用を理解し、ＡＤ処置のための治療標的を特定することができる。本方法によって生成される細胞は、疾患モデリング、創薬、及び再生医療に使用することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば患者由来のｉＰＳＣ（例えば、健康な対象又は神経変性疾患を有する対象）から、ミクログリアを生成するための方法を提供する。一般に、本方法は、ｉＰＳＣをミクログリアに分化させることを含む。いくつかの態様では、細胞は、帯電した表面で培養される。具体的には、分化方法は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の非存在下であってもよい。患者由来ｉＰＳＣに由来するこれらのミクログリアは、２Ｄ又は３Ｄオルガノイドシステムにおけるヒトミクログリア、ニューロン、星状膠細胞と、疑似神経変性疾患との間の複雑な相互作用をより正確に理解するモデルを作成するためのインビトロツールを提供する。

さらに、特定の実施形態では、本開示は、防御ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又は非防御ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む細胞株を提供する。さらに、神経変性の研究、並びにＡＤなどの神経変性疾患の診断及び処置のための、これらの細胞株を使用するためのキット、モデル、及びアッセイが、本明細書において提供される。本方法及び本組成物は、ＡＰ０Ｅ４／４陽性ドナーにおけるＡＤの発症を予防するために、ＣＤ３３の防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔ及び他の知られた防御アレルの機構の理解を高めるために使用することができる。実際、本研究により、ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおいて増強された場合に、対象におけるβアミロイド蓄積の減少、阻害、又は低減をもたらし得る蛋白質（例えば、可溶性ＴＲＥＭ２）、サイトカイン、及びケモカインがさらに同定された。特に、本研究により、ｒｓ１２４５９４１９Ｔの存在下でのＩＬ－２７の抗炎症作用が示された。

加えて、本研究により、非防御ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルと比較して、防御ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを有するｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいて、上方制御又は下方制御される特定の遺伝子が見出された。表１に、発現が少なくとも２倍異なる遺伝子を示す。表２に、上位１０個の上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子を示す。これらの遺伝子は、対象が良好な予後を有するかどうかを検出するために使用し得る。本開示は、疾患関連ミクログリアによって特異的に放出される上方制御又は下方制御される遺伝子とタンパク質ベースのバイオマーカーの組み合わせに対する洞察を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、これらの分析物を使用して、神経変性疾患の早期発症の検出、又は患者の疾患状態の特定を行うことができる。正常なミクログリア及び疾患関連ミクログリアの現在のパネルは、分子機構を明らかにし、神経変性疾患の発症を予防するために、ミクログリアを再生促進／非炎症性機能にプライミングするための治療標的を特定する可能性がある。

表１．非防御ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルと比較した、防御ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを有するｉＰＳＣ由来ミクログリアにおける遺伝子発現。

表２．上位１０の上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子。

Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲における使用において、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替のみを指すことが明示的に示されていない限り、又は代替が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持している。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。

「本質的に（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、方法又は組成物が、特定された工程又は材料、並びにそれらの方法及び組成物の基本的且つ新規な特徴に大きく影響しないものみを含むと理解されたい。

本明細書で使用される場合、特定の物質又は材料を「実質的に含まない」組成物又は媒体は、≦３０％、≦２０％、≦１５％、より好ましくは≦１０％、より一層好ましくは≦５％、又は最も好ましくは≦１％の物質又は材料を含有する。

本明細書で使用される「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」又は「およそ」という用語は、それが関連する基本機能の変化をもたらすことなく許容可能に変化し得る任意の定量的比較、値、測定、又は他の表現を改変するために適用され得る。

用語「約」は一般に、記載された値を測定するための標準的な分析手法を用いて決定される記載された値の標準偏差内を意味する。これらの用語はまた、記載された値の±５％を参照することによって使用することができる。

本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、特定の成分のいずれも意図的に組成物に配合されておらず、且つ／又は汚染物質としてのみか若しくは微量で存在することを意味するために本明細書では使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、０．０５％を大きく下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、特定の成分の量が標準的な分析方法で検出することができない組成物である。

「フィーダーフリー」又は「フィーダー非依存性」は、本明細書では、フィーダー細胞層の代わりとして、サイトカイン及び増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）が補充された培養物を指すために使用される。したがって、「フィーダーフリー」又はフィーダー非依存性培養系及び培地を使用して、多能性細胞を未分化且つ増殖状態で培養し維持することができる。場合によって、フィーダーフリー培養物は、動物ベースのマトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、又はフィブロネクチン、コラーゲン若しくはビトロネクチンなどの基質で増殖される。これらのアプローチは、ヒト幹細胞が、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに、本質的に未分化の状態なままでいることを可能にする。

「フィーダー層」は、本明細書では、培養皿の底部などの細胞のコーティング層として定義される。フィーダー細胞は培養培地中に栄養素を放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が接着することができる表面を提供することができる。

「規定（の）」又は「完全規定（の）」という用語は、培地、細胞外マトリックス、又は培養条件に関して使用される場合、化学組成及び略全ての成分の量が知られている培地、細胞外マトリックス、又は培養条件を指す。例えば、規定培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンなどの規定されていない因子を含有しない。一般に、規定培地は、組換えアルブミン、化学的に定義された脂質、及び組換えインシュリンを補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤、抗酸化剤、及びエネルギー源を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。完全規定培地の例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。

ヒト細胞と共に使用される培地、細胞外マトリックス、又は培養系では、用語「ゼノフリー（ＸＦ）」は、使用される材料が非ヒト動物起源ではない状態を指す。

「処置」或いは「処置すること」には、（１）疾患の病理又は症候を経験又は示す対象又は患者における疾患を阻害すること（例えば、病理及び／又は症候のさらなる発達を停止させること）、（２）疾患の病理又は症候を経験又は示す対象又は患者における疾患を改善すること（例えば、病理及び／又は症候を反転させること）、並びに／或いは（３）疾患の病理又は症候を経験又は示す対象又は患者における疾患の任意の測定可能な低下をもたらすことが含まれる。

「予防的処置」には、（１）リスクがあり且つ／又は疾患の素因があり得るが、疾患の病状又は症候のいくつか又は全てをまだ経験していないか又は示していない対象又は患者の疾患を発症するリスクを低減又は軽減すること、並びに／或いは（２）リスクがあり且つ／又は疾患の素因があるが、疾患の病状又は症候のいくつか又は全てをまだ経験していないか又は示していない対象又は患者の疾患の病状又は症候の発症を遅らせることが含まれる。

本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又はそれらのトランスジェニック種などの生きている哺乳動物生物を指す。特定の実施形態では、患者又は対象は霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若年者、乳児及び胎児である。

用語「効果的」は、この用語が本明細書及び／又は特許請求の範囲で使用される場合、所望する、予想される又は意図される結果を達成するのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、患者又は対象を化合物で処置する文脈において使用される場合、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与される場合に、そのような疾患の処置又は予防に影響を及ぼすのに十分な量である化合物の量を意味する。

「薬学的に許容される」は、本明細書で一般に使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は合理的な利益／リスク比に相応する他の問題若しくは合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織、器官及び／又は体液と接触して使用するのに好適な化合物、物質、組成物及び／又は剤形を指す。

「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書ではリプログラミング因子と呼ばれる）の組み合わせの発現又は発現の誘導によって体細胞をリプログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、幼若体、又は成体の体細胞を用いて作製することができる。特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用することができる因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞が少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、又は４つのリプログラミング因子を発現させて、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングすることによってリプログラミングされる。

「細胞外マトリックスタンパク質」という用語は、周囲の細胞に構造的及び生化学的なサポートを提供する分子を指す。細胞外マトリックスタンパク質は、組換え体であってもよく、その断片又はペプチドも指す。例としては、コラーゲン及びヘパリン硫酸が挙げられる。

「三次元（３Ｄ）培養」は、生物学的細胞が三次元全てにおいて、増殖又はそれらの環境と相互作用することが可能である人工的に作製された環境を指す。３Ｄ培養は、バイオリアクター、細胞がスフェロイドに成長することができる小型カプセル、又は非接着性培養プレートなどの様々な細胞培養容器中で成長させることができる。特定の態様では、３Ｄ培養はスキャフォールドフリーである。対照的に、「二次元（２Ｄ）」培養は、接着表面上の単層などの細胞培養を指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子の「破壊」は、破壊の非存在下での遺伝子産物の発現レベルと比較した、細胞における対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現の消失又は低減を指す。例示的な遺伝子産物としては、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が挙げられる。場合によって、破壊は、一過性又は可逆性であり、他の場合には永続的である。切断型又は非機能性産物が産生され得るという事実にもかかわらず、場合によって、破壊は、機能的又は完全長のタンパク質又はｍＲＮＡの破壊である。本明細書のいくつかの実施形態では、発現とは対照的に、遺伝子活性又は機能が破壊される。遺伝子破壊は一般に、人工的な方法、例えば、化合物、分子、複合体若しくは構成物の付加若しくは導入によって、及び／又はＤＮＡレベルなどの、遺伝子の核酸若しくは遺伝子に関連する核酸の破壊によって誘導される。遺伝子破壊の例示的な方法としては、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、及び／又は遺伝子編集などの遺伝子破壊技術が挙げられる。例としては、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び／又はリボザイムなどの、一般に一過性の発現の減少をもたらすアンチセンス技術、並びに、例えば、切断及び／又は相同組換えの誘発によって、標的遺伝子の不活化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術が挙げられる。例えば、挿入、変異及び欠失が挙げられる。破壊は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常な又は「野生型」の産物の発現の抑制及び／又は完全な欠如をもたらす。そのような遺伝子破壊の例は、遺伝子全体の欠失を含む、遺伝子又は遺伝子の一部の挿入、フレームシフト及びミスセンス変異、欠失、ノックイン及びノックアウトである。そのような破壊は、コード領域、例えば１つ又は複数のエクソンにおいて起こり得、終止コドンの挿入などによって、完全長産物、機能的産物、又は任意の産物を産生することができなくなる。そのような破壊はまた、遺伝子の転写を妨げるように、転写の活性化に影響を及ぼすプロモーター又はエンハンサー又は他の領域における破壊によっても起こり得る。遺伝子破壊には、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化を含む遺伝子標的化が含まれる。

ＩＩ．ｉＰＳＣの分化方法
Ａ．ＨＰＣ
ｉＰＳＣは、米国特許第８，３７２，６４２号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような当該技術分野で知られた方法によってＨＰＣに分化させることができる。１つの方法では、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦの組み合わせを使用して、造血細胞の分化を促進することができる。特定の実施形態では、分化用のｉＰＳＣを調製するための第１の培地、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２の培地へ細胞培養物を連続曝露し、続いてＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３及びＩＬ－６を含む第３の培地中で培養することによって、多能性細胞をＨＰＣ及び造血細胞に分化させることができる。第２の規定培地はまた、ヘパリンを含むことができる。さらに、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含有する培地中にＦＧＦ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を含めることにより、多能性細胞からの造血前駆細胞の生成効率を高めることができる。

一般に、多能性細胞の造血前駆細胞への分化は、規定の条件又は規定されていない条件を用いて実施され得る。得られた細胞をヒト対象に投与することが意図された実施形態では、規定の条件一般に好ましいことは理解されるであろう。造血幹細胞は、規定の条件下（例えば、ＴｅＳＲ培地を使用して）で多能性幹細胞から生成され得、造血細胞は多能性細胞から生じる胚様体から生成され得る。他の実施形態では、多能性細胞は、ＯＰ９細胞又はマウス胚線維芽細胞で共培養され、その後、分化され得る。

多能性細胞は、分化プロセスの一部として胚様体又は凝集体を形成することができる。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）又は増殖細胞のクラスターの形成は、一般に、ヒト多能性幹細胞のＥＢへのインビトロ凝集を伴い、ヒト多能性幹細胞の内胚葉、外胚葉、及び中胚葉起源を表す複数の組織型への自発的及びランダムな分化を可能にする。したがって、三次元ＥＢは、造血細胞及び内皮細胞の一部を産生するために使用され得る。

凝集体形成を促進するために、７５％のＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５％のＮ２及び１％のＢ－２７が添加され、ＲＡサプリメント、２００ｍＭの１－グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ ２－Ｐ）（ＷＡＫＯ）及び４．５×１０^－４ＭＴＧを含まない、２５％のハム改変Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）からなる無血清分化（ＳＦＤ）培地中で一晩インキュベートするために、細胞を低接着プレートに移すことができる。翌日、細胞を各ウェルから収集し、遠心分離することができる。次いで、細胞を、分化の最初の４日間、約５０ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ４）、約５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び５０ｎｇ／ｍｌのｚｂ ＦＧＦを補充したＳＦＤ基礎培地からなる「ＥＢ分化培地」に再懸濁することができる。細胞に４８時間毎に半分を与える。分化の５日目に、培地を、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６（ＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３（ＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）を補充したＳＦＤ培地からなる第２の培地と交換する。細胞に、新鮮な分化培地を４８時間毎に半分与える。培地交換は、分化培養物を３００ｇで５分間遠心沈殿させ、分化培養物から体積の半分を吸引し、それに新鮮な培地を補充することによって実施する。特定の実施形態では、ＥＢ分化培地は、約ＢＭＰ４（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、及び任意選択でＦＧＦ－２（例えば、約２５～７５ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌ）を含み得る。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換することができる。或いは、細胞に新鮮な培地を２日毎に半分供給してもよい。分化プロセスの間の異なる時点で、細胞を採取し得る。

ＨＰＣは、規定培地を用いて多能性幹細胞から培養され得る。規定培地を用いて多能性細胞を造血ＣＤ３４^＋幹細胞に分化させる方法は、例えば、米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書に記載されており、この文献はその全体が参照により援用される。これらの方法は、本開示と共に使用され得ると思われる。

例えば、規定培地を使用して、造血ＣＤ３４^＋分化を誘導することができる。規定培地は、増殖因子ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及び／又はＧＭＣＳＦを含み得る。多能性細胞を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及び任意選択でＦＧＦ－２を含む第１の規定培地中で培養し、続いて（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３及びＧＭＣＳＦ）又は（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、ＩＬ－６及びＴＰＯ）を含む第２の培地中で培養し得る。第１及び第２の培地はまた、ＳＣＦ、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ－２及び／又はＴＰＯの１種以上を含み得る。実質的に低酸素状態（例えば、２０％未満のＯ２）とすることにより、造血細胞又は内皮細胞の分化をさらに促進し得る。

細胞は、機械的又は酵素的手段（例えば、トリプシン又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用する）により、実質的に個別化し得る。ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ１１５２又はＹ－２７６３２）も培地に含まれ得る。これらの手法は、例えばロボット自動化を使用して自動化し得ると思われる。

特定の実施形態では、実質的な低酸素状態を使用して、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。当業者によって認識されるように、大気酸素含有量が約２０．８％未満であると、低酸素と考えられる。培養物中のヒト細胞は、周囲空気と比較して酸素含有量が低い大気条件下で増殖することができる。この相対的低酸素は、培養培地に曝露される大気酸素を減少させることによって達成され得る。胚細胞は、典型的には、低酸素条件下（一般に約１％～約６％の大気酸素下）、二酸化炭素が周囲レベルである、インビボで発達する。理論に拘束されることを望むものではないが、低酸素状態は特定の胚発生状態の態様を模倣し得ると考えられる。以下の実施例に示されるように、特定の実施形態では、低酸素を使用して、誘導された多能性細胞がＨＰＣなどのより分化した細胞型へさらに分化するのを促進することができる。

多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するために、以下の低酸素状態が使用され得る。特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するために、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％の大気酸素含有量が使用され得る。特定の実施形態では、低酸素雰囲気は、約５％の酸素ガスを含む。

任意の所与の造血前駆細胞増殖において特定の培地が使用されるにもかかわらず、使用培地には、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、より一般的には１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度の少なくとも１種のサイトカインを補充することが好ましい。好適なサイトカインとしては、ｃ－ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（スチール因子（ＳｔＩ）、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれる）、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１１ ＭＩＰ－１α、ＬＩＦ、ｃ－ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ、及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯの少なくとも１種を含む。より特には、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯを含む。

一実施形態では、サイトカインは培地中に含有され、培地潅流によって補充される。或いは、バイオリアクターシステムを使用する場合、サイトカインは、培地潅流をせず、入口ポートを通して濃縮溶液として、別個に添加され得る。サイトカインが潅流によらず添加される場合、典型的にはバイオリアクター中の体積の１０分の１～１／１００に等しい量の１０×～１００×溶液として添加され、新鮮なサイトカインはおよそ２～４日毎に添加される。さらに、潅流培地中のサイトカインに、新鮮な濃縮サイトカインを別々にさらに添加することもできる。

例示的なＨＰＣ分化方法
２Ｄ ＨＰＣ分化：ｉＰＳＣを、Ｅ８の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチン上で維持され、少なくとも５～１０継代の間、低酸素に適応させ得る。細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５μＭブレビスタチンを補充した無血清規定（ＳＦＤ）培地の存在下で、２５万細胞／ウェルの密度でアミン培養皿上に播種する。播種から２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を培養物に添加する。翌日、新鮮な培地に交換して、ブレビスタチンを除去する。分化プロセスの５日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地に、細胞を、５Ｕ／ｍｌのヘパリンと共に入れる。分化プロセスを通して、４８時間毎に細胞に供給する。プロセス全体を、低酸素条件下、帯電したアミンプレート上で実施する。ＨＰＣを、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞及びＣＦＵの存在によって定量する。

３Ｄ ＨＰＣ分化：細胞をサブコンフルエントなｉＰＳＣから分割し、５μＭのブレビスタチン又は１μＭのＨ１１５２を補充した無血清規定（ＳＦＤ）培地の存在下で、１ｍｌ当たり２５～５０万細胞の密度でスピナーフラスコに播種した。播種から２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地を交換した。分化プロセスの５日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰ０、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地に、細胞を、５～１０Ｕ／ｍｌのヘパリンと共に入れた。分化プロセスを通して、４８時間毎に細胞に供給した。プロセス全体を低酸素条件下で行った。ＣＤ４３／ＣＤ３４の存在によって定量化されたＨＰＣ。ＨＰＣを、ＣＤ３４ビーズを用いてＭＡＣＳ法により選別する。

Ｂ．遺伝子破壊
特定の態様では、ＴＲＥＭ２、ＭｅＣＰ２、及び／又はＳＣＮＡ遺伝子の発現、活性又は機能を、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣ）などの細胞において破壊する。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子の破壊、例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス又はフレームシフト変異、例えば両アレル性フレームシフト変異、遺伝子の全部又は一部、例えばしたがって１つ又は複数のエクソン若しくは部分の欠失、及び／又はノックインをもたらすことによって行われる。例えば、破壊は、ＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、並びにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）を含む、配列特異的又は標的化ヌクレアーゼ、特に遺伝子又はその一部の配列を標的化するように設計されたヌクレアーゼによってなされる。

いくつかの実施形態では、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊は、遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの態様では、遺伝子は、その発現が、遺伝子破壊が行われないか又は破壊をもたらす成分が導入されていない場合の発現と比較して、少なくとも又は約２０、３０又は４０％、一般に少なくとも又は約５０、６０、７０、８０、９０又は９５％減少するように破壊される。

いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子の発現が後に回復されるような一過性又は可逆性である。他の実施形態では、破壊は、可逆的でも一過性でもなく、例えば永続的である。

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、典型的には標的化された方法で、遺伝子における１つ以上の二本鎖切断及び／又は１つ以上の一本鎖切断の誘導によって行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖切断又は一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによってなされる。いくつかの態様では、切断は、遺伝子のコード領域、例えばエクソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態では、誘導は、コード領域、例えば第１のエクソン、第２のエクソン、又はその後のエクソンのＮ末端部付近で起こる。

いくつかの態様では、二本鎖又は一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）などの細胞修復プロセスによって修復される。いくつかの態様では、修復プロセスは、エラーを起こしやすく、フレームシフト変異、例えば両アレルフレームシフト変異などの遺伝子の破壊を生じ、これは遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る。例えば、いくつかの態様では、破壊は、欠失、変異及び／又は挿入の誘導を含む。いくつかの実施形態では、破壊は早期終止コドンの存在をもたらす。いくつかの態様では、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異、及び／又は未成熟終止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊をもたらす。

いくつかの実施形態では、遺伝子の破壊は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）などのアンチセンス技術を使用して達成され、リボザイムを使用して、遺伝子の発現が選択的に抑制又は抑止される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列と、ヌクレオチド配列と相補的な配列とを有する二本鎖ＲＮＡ分子を用いるＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、又は異なる領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡはポリシストロン性構築物に含まれる。特定の態様では、ｓｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡからの野生型及び変異タンパク質翻訳の両方を抑制する。

いくつかの実施形態では、破壊は、ＤＮＡ結合タンパク質若しくはＤＮＡ結合核酸などのＤＮＡ標的化分子、又は遺伝子に特異的に結合するか若しくはハイブリダイズする、それを含有する複合体、化合物若しくは組成物を使用して達成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）若しくはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン、又はメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガー又はＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ又は複数のアミノ酸の改変）によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガー又はＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、既存のＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥ設計及びバインディングデータの情報を記憶するデータベースにおいて情報を処理するための置換規則及びコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書、同第６，４５３，２４２号明細書、及び同第６，５３４，２６１明細書を参照されたい；また国際公開第９８／５３０５８号パンフレット、同第９８／５３０５９号パンフレット、同第９８／５３０６０号パンフレット、同第０２／０１６５３６号パンフレット及び同第０３／０１６４９６号パンフレット、並びに米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書も参照されたい。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子、複合体、又は組み合わせは、ＤＮＡ結合分子と、遺伝子の抑制又は破壊を促進するためのエフェクタードメインなどの１つ以上の追加のドメインとを含有する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、ＤＮＡ結合タンパク質及び異種調節ドメイン又はその機能的断片を含む融合タンパク質によって行われる。いくつかの態様では、ドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン、例えばアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、癌遺伝子、ＤＮＡ修復酵素並びにそれらの関連因子及び修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素並びにそれらの関連因子及び修飾因子；クロマチン関連タンパク質及びそれらの修飾因子、例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ；ＤＮＡ修飾酵素、例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、並びにそれらの関連因子及び修飾因子が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ切断ドメインの融合については、例えば、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書、同第２００６／０１８８９８７号明細書及び同第２００７／０２１８５２８を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、追加のドメインは、ヌクレアーゼドメインである。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ含有複合体などの操作されたタンパク質、又はヌクレアーゼなどの非特異的ＤＮＡ切断分子に融合又は複合体化した配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成される融合タンパク質を使用して、遺伝子又はゲノム編集によって促進される。

いくつかの態様では、これらの標的化キメラヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ含有複合体は、標的化二本鎖切断又は一本鎖切断を誘導し、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む細胞ＤＮＡ修復機構を刺激することによって、正確な遺伝子改変を行う。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、又はメガヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、ドナー核酸、例えばドナープラスミド、又は遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸が提供され、ＤＳＢの導入後に遺伝子編集部位にＨＤＲによって挿入される。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子の破壊及び抗原受容体、例えばＣＡＲの導入は同時に行われ、それによって遺伝子はＣＡＲをコードする核酸のノックイン又は挿入によって部分的に破壊される。

いくつかの実施形態では、ドナー核酸は提供されない。いくつかの態様では、ＤＳＢの導入後のＮＨＥＪ媒介修復が、例えばミスセンス変異又はフレームシフトを生成することによって、遺伝子破壊を引き起こし得る挿入又は欠失変異をもたらす。

１．ＺＦＰ及びＺＦＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１つ又は複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的な方法でＤＮＡに結合する１つ又は複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又はそのドメインを含む。ＺＦＰ又はそのドメインは、１つ又は複数のジンクフィンガーを介して配列特異的な方法でＤＮＡに結合する、大きなタンパク質内のタンパク質又はドメインであり、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域は、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略記される。ＺＦＰの中には、個々のフィンガーの集合によって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。

ＺＦＰには、単一のフィンガードメインが約３０アミノ酸長であり、単一のベータターンの２つのシステインと亜鉛を介して配位した２つの不変ヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスを含み、２、３、４、５、又は６本のフィンガーを有するものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３及び６）でアミノ酸置換を行うことによって改変され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰ又はＺＦＰ含有分子は、天然に存在せず、例えば、選択した標的部位に結合するように操作されている。

いくつかの態様では、ＭｅＣＰ２の破壊は、遺伝子中の第１の標的部位を第１のＺＦＰと接触させ、それによって遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子中の標的部位を、６本のフィンガー及び調節ドメインを含む融合ＺＦＰと接触させ、それによって遺伝子の発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、接触工程は、遺伝子の第２の標的部位を第２のＺＦＰと接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、第１及び第２の標的部位は隣接している。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＺＦＰは共有結合している。いくつかの態様では、第１のＺＦＰは、調節ドメイン又は少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のＺＦＰは、それぞれが調節ドメインを含むか、又はそれぞれが少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、転写抑制因子、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼである。

いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸によってコードされる。いくつかの態様では、本方法は、脂質：核酸複合体又は裸の核酸として細胞に核酸を最初に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、誘導プロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、弱いプロモーターに作動可能に連結されたＺＦＰ核酸によってコードされる。

いくつかの実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様では、標的部位が遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様では、標的部位は遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ切断ドメインに融合されてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのｌｉＳ型制限酵素からの切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）と、操作されていてもいなくてもよい１つ又は複数のジンクフィンガー結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、切断ドメインは、ｌｉＳ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉ由来である。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。

いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、操作された細胞中に存在する遺伝子を標的とする。いくつかの態様では、ＺＦＮは、例えば、遺伝子のコード領域の所定の部位において、二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生成する。標的とされる典型的な領域としては、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン、及びプロモーター又はエンハンサー領域が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＺＦＮの一過性発現は、操作された細胞における標的遺伝子の高効率で且つ永続的な破壊を促進する。特に、いくつかの実施形態では、ＺＦＮの送達は、５０％を超える効率で遺伝子の永続的破壊をもたらす。

多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、米国）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）と提携して、ジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発して、研究者がジンクフィンガーの構築及び検証を完全に回避することを可能にし、何千ものタンパク質のための特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供している（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、又はカスタム設計される。

２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などの、天然に存在する又は操作された（天然に存在しない）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン又はＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくつかの配列相同性を示す。各ＴＡＬＥ反復単位は、典型的には、リピートの１２位及び／又は１３位に、反復可変性二残基（ＲＶＤ）を構成する１個又は２個のＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識の天然（カノニカル）コードは、１２位及び１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合を引き起こし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧ又はＡに結合し、ＮＯがＴに結合するように決定されており、非カノニカル（非定型）ＲＶＤも知られている。米国特出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥが標的ＤＮＡ配列に対して特異性を有するＴＡＬアレイを設計することによって、任意の遺伝子を標的とすることができる。標的配列は一般にチミジンで始まる。

いくつかの実施形態では、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメインと、核酸標的配列を切断するヌクレアーゼ触媒ドメインとを含む融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子中の標的配列を認識し切断する。いくつかの態様では、ＤＮＡの切断が二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様では、切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは不完全な修復プロセスであり、切断部位でＤＮＡ配列に変化をもたらすことが多い。いくつかの態様では、修復機構は、直接リライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９８）によって、又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合によって、２つのＤＮＡ末端の残部の再結合が含まれる。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪによる修復は小さな挿入又は欠失をもたらし、これを使用して遺伝子を破壊し、それによって遺伝子を抑制することができる。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失又は付加であり得る。いくつかの態様では、切断によって誘発される変異誘発事象、例えばＮＨＥＪ事象に連続する変異誘発事象が起こった細胞は、当該技術分野でよく知られた方法によって同定し且つ／又は選択することができる。

いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的とするように組み立てられる。１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築されている。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、仏国）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、米国）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）によって市販されている。

いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１つ又は複数のプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入される。いくつかの態様では、プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞の同定及び／又は選択を提供する選択マーカーを含有することができる。

３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）
いくつかの実施形態では、破壊は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）による破壊など、１つ又は複数のＤＮＡ結合核酸を使用して行われる。例えば、破壊は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行うことができる。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与する、又はＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子を誘導する転写産物及び他の要素、例えば、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性化部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイトピオ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈における「直接リピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡでプロセシングされた部分直接リピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「スペーサー」とも称される）、並びに／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写産物を総称して指す。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、配列特異的にＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ又は複数の要素は、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来し得る。

いくつかの態様では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと固定されたｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体を含む）を細胞に導入する。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位は、相補的塩基対形成を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に向ける。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えば典型的にはＮＧＧ又はＮＡＧのすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１又は１０のヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列に対応するように改変することによって、所望の配列を標的とする。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。典型的には、「標的配列」とは一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があることを条件とする。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、続いて本明細書に記載するような破壊を誘導することができる。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントを用いて、標的部位で一本鎖にニックを入れる。ペアニッカーゼを用いて、例えば、特異性を改善することができ、それぞれが、ニックを同時に導入すると５’オーバーハングが導入されるように、配列を標的とする１対の異なるｇＲＮＡによって誘導される。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、遺伝子発現に影響を及ぼすために、転写抑制因子又は転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。

標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の小器官内など、細胞の核又は細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えのために使用され得る配列又は鋳型は、「編集鋳型」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称され得る。いくつかの態様では、組換えは相同組換えである。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む）の形成は、標的配列内又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、又はそれ以上の塩基対内）の一方又は両方の鎖の切断をもたらす。ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部又は一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５若しくはそれ以上であるか、又はそれらを超えるヌクレオチド）を含むか、又はそれから構成されていてもよく、また、ガイド配列と作動可能に連結しているｔｒａｃｒメイト配列の全部又は一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成していてもよい。ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列に対し、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列相補性など、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成にハイブリダイズし関与するのに十分な相補性を有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ又は複数の要素の発現を駆動する１つ又は複数のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が１つ又は複数の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように、細胞に導入することができる。成分はまた、タンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別々のベクター上の別々の調節エレメントに作動可能に連結され得る。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一のベクター内に組み合わせてもよく、１つ以上のさらなるベクターは第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の成分を提供する。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１つ又は複数の挿入部位を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の挿入部位は、１つ又は複数のベクターの１つ又は複数の配列要素の上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物が、ＣＲＩＳＰＲ活性を細胞内の複数の異なる対応する標的配列に標的化するために使用され得る。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節要素を含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はそれらの改変体が挙げられる。これらの酵素は知られており、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見出すことができる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はＳ．ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内などの標的配列の位置で、一方又は両方の鎖の切断を誘導することができる。ベクターは、対応する野生型酵素に関して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができ、その結果、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼをガイド配列、例えば２つのガイド配列と組み合わせて使用することができ、これらはそれぞれ、ＤＮＡ標的のセンス鎖及びアンチセンス鎖を標的とする。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを入れることができ、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用することが可能になる。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドンが最適化される。真核細胞は、哺乳動物などの特定の生物の細胞又はそれに由来し得、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、コドン最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率とよく相関し、これはとりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への直接的な配列特異的結合を誘導するのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％若しくはそれ以上であるか、又はそれらを超える。

最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び、任意選択的に、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合し得、例えば、以下に限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体が挙げられる。

Ｃ．帯電した細胞表面
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養のための帯電表面に関する。帯電表面は、アミン表面若しくは窒素含有官能基などの正に帯電していてもよく、又はカルボキシル表面若しくは酸素含有官能基などの負に帯電していてもよい。細胞表面は、培養容器の表面電荷を変化させるために処理され得る。

いくつかの態様では、表面は、負の電荷を有する官能基と正の電荷を有する官能基の両方を含む表面など、中性に帯電している。例えば、ＣＯＲＮＩＮＧ ＰＲＩＭＡＲＩＡ（登録商標）表面は、ポリスチレン表面の酸素含有（負の電荷を有する）官能基と窒素含有（正の電荷を有する）官能基との特有の混合物を特徴とする。この表面は、従来のＴＣ表面で培養された場合に、接着が弱いか又は限定された分化能を示し得る細胞の増殖をサポートする。いくつかの態様では、表面は、ＵＬＡ表面コーティングを含む。例えば、ｃｏｒｎｉｎｇ超低接着表面は、親水性であって中性に帯電している共有結合したヒドロゲル層である。タンパク質及び他の生体分子は、疎水性又はイオン性相互作用によってポリスチレン表面に受動的に吸着するので、このヒドロゲルはこれらの力によって非特異的固定化を自然に阻害し、したがって、その後の細胞の接着を阻害する。この表面は、非常に安定しており、細胞毒性がなく、生物学的に不活性であり、非分解性である。ＨＰＣからのミクログリアの生成をサポートすることができる他の例としては、以下が挙げられる：Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ培養（米国特許第６，６１７，１５２号明細書）は、より高いエネルギーのマイクロ波プラズマを使用して、より多くの酸素をポリスチレン表面に導入し、従来のプラズマ又はコロナ放電処理表面と比較して表面の安定性を増加させながら、より親水性（湿潤性）にしている。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ自己コーティング基質は、ＲＧＤモチーフ及びフランキング配列を含有する、特有の動物を含まない合成ビトロネクチンベースのペプチドである。合成ペプチドは、受動的コーティング、配向、及び最適な細胞結合及びシグナル伝達のためのペプチドの提示のために、ポリマー骨格に共有結合される。

細胞培養表面は、プラズマ重合フィルムでコーティングされてもよい。プラズマ重合の供給源は、１つ以上のモノマーである。有用な重合性モノマーとしては、不飽和有機化合物、例えばオレフィンアミン、ハロゲン化オレフィン、オレフィンカルボン酸及びカルボン酸塩、オレフィンニトリル化合物、酸素化オレフィン及びオレフィン系炭化水素が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、オレフィンは、ビニル系及びアリル系を含み得る。他の実施形態では、シクロヘキサン、シクロペンタン及びシクロプロパンなどの環状化合物が使用され得る。

当業者によって認識されるように、様々なプラズマ重合技術を利用して、１つ以上のモノマーを細胞培養表面に堆積させることができる。好ましくは、正に帯電した重合膜が表面に堆積させる。当業者には理解されるように、プラズマ重合表面は、それと共に使用されるタンパク質に応じて負の電荷を有し得る。好ましくは、アミンがポリマーのモノマー源として使用される。いくつかの実施形態では、プラズマ重合モノマーは、ガス状モノマーの重合を開始するためのエネルギーを提供し、薄いポリマーフィルムを培養容器上に堆積させるガス放電を生成するために、プラズマ源を使用して作製される。グロー放電法によるガスプラズマを含むことができる環状化合物を利用することができる。例えば、１，２－ジアミノシクロヘキサンなどのこれらの環状化合物の誘導体も、ガスプラズマ中で一般に重合可能である。

重合性モノマーの混合物を使用することができる。さらに、重合性モノマーは、それ自体では重合可能であると一般に考えられない他のガス、例えばアルゴン、窒素及び水素とブレンドされてもよい。

接着培養に有用な任意の培養容器が使用され得ることが企図される。本開示によって企図される好ましい細胞培養容器構成には、マルチウェルプレート（６ウェル、１２ウェル及び２４ウェルプレートなど）、皿（ペトリ皿など）、試験管、培養フラスコ、ローラーボトル、チューブ又はシェーカーフラスコなどが含まれる。

細胞培養表面のための材料としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリカーボネート）、ガラス、微孔性濾材（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステル、及びポリカーボネート）；バッチ培養又は連続細胞培養又は遺伝子工学において使用されるバイオリアクター（例えば、バイオリアクター）のための材料（これには、中空繊維管又はマイクロキャリアビーズが含まれ得る）；ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、セラミック、及び関連するポリマー材料を挙げることができる。

特定の態様では、細胞培養物は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンズリン、エピリグリン及びカリニンなどの任意の細胞外マトリックスタンパク質を含まないか、又は本質的に含まない。

Ｄ．ＨＰＣのミクログリアへの分化
ミクログリアは、脳の発達、ホメオスタシス、及び免疫調節において重要な役割を果たす中枢神経系の自然免疫細胞である。それらは、ヒト胎児及び初代組織から獲得することが困難である。特定の実施形態では、本方法は、規定条件下でエピソームとしてリプログラミングされたＨＰＣからのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア（ｉＭＧＬ）の生成、特徴付け、及び凍結保存を記載する。凍結保存されたｉＭＧＬは、純度を保持し、免疫調節性サイトカインを分泌し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識した細菌のＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ及びアミロイドベータ凝集体を貪食する。本質的に無限の量のｉＭＧＬを産生する能力は、正常状態及び疾患状態におけるミクログリアの役割に関するヒト神経科学研究を加速するための大いに有望である。

例示的な方法では、新鮮な又は凍結保存されたＨＰＣを解凍し、ＦＬＴ－３リガンド及びＩＬ－３を含むミクログリア分化培地に播種する。細胞は、１０～５０Ｋ／ｃｍ２、例えば２０～３５Ｋ／ｃｍ２の密度で播種され得る。ミクログリア分化培地は、ＩＬ－３４、ＴＧＦβ１又はＭ－ＣＳＦ（ＭＤＭ）を含み得る。培養は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆プレート、又はＰｒｉｍａｒｉａプレート若しくは超低接着プレート若しくは組織培養プレート（ＴＣ）若しくは非組織培養プレート（非ＴＣ）などの帯電した表面で実施することができ、９６ウェルプレート（例えば、１ウェルあたり２００μｌのミクログリア分化培地）などのハイスループットであってもよい。細胞に、次の２３日間の分化において、１ウェル当たり５０μｌの２×ミクログリア分化培地（ＭＤＭ）を４８時間毎に半分供給し得る。特定の態様では、分化は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などのＥＣＭタンパク質の非存在下で行われる。２３日目に、細胞を冷ＰＢＳで回収し、自動化細胞カウンターを用いて、全生存細胞数を定量する。細胞を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ－２の表面発現、及びＴＲＥＭ－２、ＩＢＡ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２及びＴＭＥＭ１１９の細胞内発現のために染色する。

特定の態様では、本ミクログリアは、ＡＰＯＥ３／３（健康）又はＡＰＯｅ４／４（アルツハイマー）バックグラウンドの存在下でＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを保有する対象、並びにＡＰＯＥ３／３（健康）又はＡＰＯｅ４／４（アルツハイマー）バックグラウンドの存在下でＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有する対象からエピソームとしてリプログラミングされたｉＰＳＣに由来した。他の態様では、ＣＤ３３アレルバリアントミクログリアは、防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又は非防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むように遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化され得る。本ミクログリアは、神経変性疾患における目的の他の防御又は非防御アレルを含み得る。ミクログリアは、同質遺伝子的に操作された凍結保存ミクログリアであってもよい。

Ｅ．分化培地
細胞は、細胞のそれぞれの特定の集団の増殖をサポートするために必要な栄養素と共に培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源、及びｐＨを維持する緩衝液を含む増殖培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、ｐＨ指示薬、及び無機塩を含むことができる。例示的な増殖培地は、幹細胞増殖を増強するために、非必須アミノ酸及びビタミンなどの様々な栄養素を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含む。最小必須培地の例としては、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地、及びＦ１２培地が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地には、ウマ、ウシ又はウシ胎児血清などの添加物が補充されてもよい。或いは、培地は無血清であってもよい。他の場合には、増殖培地は、培養物中で幹細胞などの未分化細胞を増殖し維持するように最適化された、本明細書において無血清製剤と称される「ノックアウト血清置換」を含有し得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）血清置換は、例えば、米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、ＰＳＣは、完全に規定されたフィーダーフリーの培地中で培養される。

いくつかの実施形態では、培地は、血清に代わるものを含有しても含有しなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミン（脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物など）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール、又はそれらの等価物を適切に含有する材料を挙げることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。或いは、より便利には、任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換（ＫＳＲ）、化学的に定義された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。

他の培養条件は、適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃、例えば、少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃とし得るが、特にこれらに限定されない。一実施形態では、細胞は３７℃で培養される。ＣＯ_２濃度は、約１～１０％、例えば約２～５％、又はそれから導き出される任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとも、最大で、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％、又はそれから導き出される任意の範囲であり得る。

Ｆ．凍結保存
本明細書に開示される方法によって作製される細胞は、プロセスの任意の段階、例えば段階Ｉ、段階ＩＩ又は段階ＩＩＩで凍結保存することができ、例えば、国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。細胞は、基質と共に又は基質なしで凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃、及びこれらの重複する範囲である。いくつかの実施形態では、凍結保存された細胞の貯蔵（例えば、維持）のために低温が使用される。いくつかの実施形態では、液体窒素（又は他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を貯蔵する。さらなる実施形態では、細胞は、約６時間を超えて貯蔵される。さらなる実施形態では、細胞は、約７２時間貯蔵される。いくつかの実施形態では、細胞は、４８時間～約１週間貯蔵される。さらに他の実施形態では、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７又は８週間貯蔵される。さらなる実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２か月間貯蔵される。細胞はまた、より長い時間貯蔵することができる。細胞は、個別に又は基質上で、例えば本明細書に開示されるいずれかの基質上で凍結保存することができる。

いくつかの実施形態では、追加の抗凍結剤を使用することができる。例えば、細胞は、ＤＭ８０などの１種以上の抗凍結剤、ヒト又はウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンを含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。特定の実施形態では、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態では、溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％、又は約８％～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はアルブミンを含む。特定の実施形態では、溶液は２．５％のＤＭＳＯを含む。別の特定の実施形態では、溶液は１０％のＤＭＳＯを含む。

細胞は、例えば、凍結保存中、約１℃／分で冷却し得る。いくつかの実施形態では、凍結保存温度は、約－８０℃～約－１８０℃、又は約－１２５℃～約－１４０℃である。いくつかの実施形態では、細胞は、約１℃／分で冷却する前に４℃に冷却される。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、細胞が約－８０℃に達したなら、それらを液体窒素貯蔵場所に移す。凍結保存はまた、速度制御フリーザーを用いて行うことができる。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃～約４０℃の温度、典型的には約３７℃の温度で解凍され得る。

ＩＩＩ．使用方法
本発明は、ミクログリア（例えば、防御ＣＤ３３アレルの有無にかかわらず）を提供し、これは、いくつかの重大な研究、開発及び商業的用途に使用することができる。これらには、数例を挙げれば、インビボでの細胞の移植又は注入；インビトロでの、抗ウイルス薬、細胞傷害性化合物、発癌物質、変異原、清澄／調節因子、医薬化合物などのスクリーニング；神経変性疾患の機構の解明；薬物及び／又は成長因子が作用する機構の研究；患者の神経変性疾患の診断及びモニタリング；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な産物の生成が含まれるが、これらに限定されない。

Ａ．医薬組成物
本明細書においてはまた、本発明の細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤が提供される。

したがって、本発明による対象への投与のための細胞組成物は、医薬として使用することができる製剤への化合物の加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を使用して、任意の従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。

本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する活性成分（細胞など）を、１種以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、調製することができる。薬学的に許容される担体は一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントに毒性のないものであり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；保存剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－蛋白質錯体）；並びに／或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の例示的な薬学的に許容される担体としてはさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などの侵入型薬物分散剤が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと結合される。

Ａ．商業、治療、研究目的のための流通
いくつかの実施形態では、製造、流通、又は使用中の任意の時点に存在する細胞を含む試薬システムが提供される。キットは、多くの場合、同じゲノムを共有する、未分化多能性幹細胞又は他の分化細胞型と組み合わせた、本開示に記載される細胞の任意の組み合わせを含み得る。各細胞型は、ビジネス関係を共有する同じ実体又は異なる実体の制御下で、一緒に、又は同じ施設内の別々の容器に、又は異なる場所で、同じ又は異なる時間に、パッケージ化され得る。医薬組成物は、任意選択により、機構毒性学などの所望の目的のために、説明書を含む好適な容器にパッケージ化されてもよい。

いくつかの実施形態では、例えば、細胞の作製のための１つ以上の培地及び成分を含み得るキットが提供される。試薬系は、必要に応じて、水性媒体又は凍結乾燥形態でパッケージ化することができる。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、又は他の容器手段を含み、その中に成分を入れることができ、好ましくは、好適にアリコートすることができる。キット中に２つ以上の成分が存在する場合、キットはまた一般に、追加の成分を別々に入れることができる第２の、第３の、又は他の追加の容器を含有する。しかし、成分を様々に組み合わせて１つのバイアル中に含めてもよい。キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を好適な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段で提供され得ることが想定されている。本発明のキットはまた、典型的には、市販のために、キットの構成要素を密閉状態に収容するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルがその中に保持される射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。キットはまた、印刷又は電子形式、例えばデジタル形式などでの使用説明書を含むことができる。

ＩＶ．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例において開示される手法は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を示しており、したがって本発明の実施に好ましいモードを構成すると考え得ることは、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮して、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、それでもなお同様の結果を得ることができることは理解できるであろう。

実施例１－末期ミクログリアの生成及び特徴付け
ＣＤ３３は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）と呼ばれるスーパーファミリーのメンバーをコードする。ミクログリアでは、ＣＤ３３は、他の細胞又は病原体上の細胞外シアリル化グリカンに結合する。その細胞質ドメインは、比較すると、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によってシグナル伝達し、ミクログリア食作用を抑制する。

防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔは、得られるタンパク質がＣＤ３３のシアル酸結合ドメインを欠き、したがって細胞がＡβを取り込み、除去する能力を保存するように、ＣＤ３３ ｍＲＮＡのスプライシングを変化させることが報告された。したがって、本研究は、ＡＰＯＥ３／３（健康）又はＡＰＯｅ４／４（アルツハイマー）バックグラウンドの存在下で、ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを保有するミクログリアにおける食作用機能を比較する。

ミクログリアは、防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの有無にかかわらず、ＡＰＯＥ３／３対ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドを有する健康な対象とアルツハイマー病を有するドナーに由来するｉＰＳＣから生成された。細胞は、ＡＰＯＥ４／４陽性ドナーにおけるＡＤの発症を予防するために使用され得る防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔの機構を理解するために開発された。全てのドナー試料からの凍結保存ミクログリアは、ミクログリア特異的細胞マーカー（ＣＤ４５、ＴＲＥＭ２、ＣＤ３３、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭＥ１１９、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＢＡ－１）を発現した（図１）。

表３．見かけ上健康で正常（ＡＮＨ）ＡＰＯＥ３／３バックグラウンド、防御ｒｓ１２４５９４１９を有するものと有さないもの。

表４．ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドを有するアルツハイマー病患者由来のｉＰＳＣであって、保護ｒｓ１２４５９４１９を有するものと有さないもの。

健康な対象及びアルツハイマー病を有するドナー（防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有するものと有さないもの）からの末期ミクログリアの生成及び特徴付け：全てのｉＰＳＣを、Ｅ８及びマトリゲルを用いて維持し、１０継代の間低酸素に順化した。ｉＰＳＣをスケールアップし、最初に精製造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させた。Ｅｂｕｄ ｅｔ ａｌ．によって記載されたプロトコルに従って、ＨＰＣを末期ミクログリアにさらに分化させ、凍結保存した。ミクログリアの純度を、フローサイトメトリーによって解凍後に定量した。ミクログリアのインビトロでの分化は、ＡＰＯＥ又はＣＤ３３状態によって影響されなかった。

さらに、防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを有するミクログリアは、総赤色オブジェクト積分強度によって定量されたように、アミロイドベータの食作用動態が減少したことが見出された（図２）。細胞数に対して正規化すると、防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９を有するミクログリアは、食作用動態の変化を示すことが見出された（図８）。細胞数に対し正規化することにより、ＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４ミクログリアの表現型応答の検出が可能になる。ミクログリアを解凍し、３日間成熟させた後、食作用アッセイのためにプレーティングした。ミクログリアを３８４ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで播種した。ｐＨｒｏｄｏ標識アミロイドベータ（１μＭ／ウェル）をプレートに加え、ウェルをＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャーで２時間ごとに赤色蛍光総赤色オブジェクト積分強度（ＲＣＵ×μｍ２／画像）についてモニターした。ＲＣＵは、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウエア（ｖ２０１９Ｂ）を用いて測定し分析した。ＲＣＵはまた、緑色蛍光によってモニターし、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウエア（ｖ２０１９Ｂ）を用いて分析されるように、総細胞数に対して正規化した。防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９Ｔ）を含有するＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４の両方のミクログリアは、全細胞数に対して正規化した場合、防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９Ｃ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏアミロイドベータに曝露された場合、食作用動態の増加を示した。したがって、防御ＣＤ３３アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔは、アミロイドベータに対する移動性及び食作用の定常状態を維持することによって、アルツハイマー病を防御し得る。

ミクログリアは、環境シグナルに応答してＭ１又はＭ２マクロファージに分極する。Ｍ１分極ミクログリアは、サイトカイン、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、ＬＰＳ又はＧＭ－ＣＳＦによって活性化され、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びインターロイキン（ＩＬ）－１、－６、－１２、－２３を含む炎症誘発性分子を産生する（図３－５）。ＩＬ－４、ＩＬ－１３、又はｄＢｕ－ｃＡＭＰによって刺激されるＭ２分極は、免疫調節、神経保護、組織リモデリングに関連し、病原体又は腫瘍に対する保護を付与する。それらは、一酸化窒素（ＮＯ）又は反応性酸素中間体（ＲＯＩ）などの殺微生物性及び殺腫瘍性試薬を産生する。

凍結保存したｉＣｅｌｌミクログリアをミクログリア維持培地に播種し、３日間回復させた後、ＬＰＳで刺激してミクログリアをＭ１表現型に向けて分極させるか、又はＩＬ＋４＋ｄＢｕ－ｃＡＭＰで分極させてミクログリアをＭ２表現型に向けて２４時間分極させた。上清を、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘシステムを用いて、技術的複製でアッセイした。分析物の各セットについて、刺激されていない対照に対する倍率変化を各細胞株について計算し、その後、ＡＰＯＥ３／３又はＡＰＯＥ４／４コホートの中で、防御アレルを有する株を非防御株と比較した。各グラフは、平均±１ＳＥＭを示す。防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔを発現するミクログリアは、ＡＰＯＥ４／４バックグラウンドを有するＡＤ ｉＰＳＣにおけるインターロイキンＩＬ－２７及びＩＬ－１０、ケモカインＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０及びＣＣＬ２２の分泌、並びにＰＤ－１リガンド発現の倍増を示した。

実施例２－ＣＤ３３の防御効果に寄与する経路及び機構
凍結保存したｉＣｅｌｌミクログリアをミクログリア維持培地に播種し、３日間回復させ、ＲＮＡ Ｓｅｑ分析に供した。非防御アレルよりもＣＤ３３防御アレルを有するｉＰＳＣ由来ミクログリアのトランスクリプトームプロファイルを、ＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４バックグラウンドの両方の下で比較した。図７Ａ～７Ｄの火山プロットは、補正Ｐ≦０．０５及び青色の丸で強調表示されている｜倍率変化｜≧２で統計的に有意な差次的に発現された遺伝子を示す（表１）。図７Ｅ及び７Ｆは、ＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４バックグラウンドにおける非防御アレルよりも上方制御及び下方制御された上位１０個の遺伝子の倍率変化を示す。

図７Ｇ、７Ｈ、７Ｉ及び７Ｊに概説した遺伝子概念ネットワークプロット（ＣＮＥＴプロット）及びドットプロットは、経路濃縮分析の結果を示す。ＧＯ（生物学的プロセス）用語濃縮分析は、統計的に有意な（補正ｐ値≦０．０５及び｜Ｌｏｇ２ＦＣ｜≧２）遺伝子。ドットサイズは、ｋ／ｎ比（「遺伝子比」）を示し、ここで、ｋは（選択された遺伝子リスト内の）現在のＧＯ生物学的プロセスに関与する遺伝子の数であり、ｎは、任意のＧＯ用語の参加者として注釈付けされた遺伝子の総数である。ドット色は、濃縮試験ｐ値（フィッシャーの直接確率検定）を示す。データは、ＣＤ３３の防御バリアントによって駆動される多くの新規な機構に対する洞察を示す。

ＡＰＯＥ３／３及びＡＰＯＥ４／４ミクログリアの予備呼吸能力。ミクログリアを解凍し、３日間静置した後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイのために播種した。ミクログリアを、ＰＤＬをコーティングした９６ウェルプレートに１ウェル当たり２０，０００個の細胞で播種し、一晩静置した。アッセイ当日、培地を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ ＤＭＥＭ、グルコース（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、及びＬ－グルタミン酸（２ｍＭ）を含むアッセイ培地と交換した。次いで、プレートを、周囲ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中で１時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｅｌｌ ミトストレステストキットからのオリゴマイシンＡ（１０μＭ）、ＦＣＣＰ（３０μＭ）、及びロテノン／アンチマイシンＡ（５μＭ）からなる原料化合物を調製し、製造業者の使用説明書に従ってＸＦ９６センサーカートリッジの適切なポートにロードした。試料を、ウエーブコントローラソフトウエアパッケージを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅアナライザーを用いて分析した。アッセイ後、Ｈｏｅｃｈｓｔ核色素（１：１０００）を用いて細胞数を決定し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｅｒを用いて捕捉した。データを、細胞１個当たりの酸素消費速度（ＯＣＲ）に対して正規化した。統計的有意性を、ｐ＜０．０５の両側ｔ検定により決定した。防御（ＰＲ）ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含む（図９Ａ）ＡＰＯＥ３／３及び（図９Ｂ）ＡＰＯＥ４／４ミクログリアは、非防御（ＮＰ）ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含むミクログリアよりも統計的に有意なＯＣＲを示した。

ＡＤ患者におけるミトコンドリア代謝の障害は、疾患表現型の発症及びさらなる進行の細胞機構として示唆されている（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。加えて、他の細胞型と比較して、ミクログリアはミトコンドリアのターンオーバーが低く、ミトコンドリア機能の障害を引き起こして、細胞の質及び活性に深刻な影響を及ぼす（Ｆａｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。代謝欠損によって開始されるミクログリア応答性の欠如は、アルツハイマー病進行の初期段階における可溶性及びオリゴマーＡベータの蓄積を可能にし、神経毒性環境を作り出す（Ｓｈｉｐｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。防御アレルｒｓ１２４５９４１９Ｔ及びＣＤ３３の他の知られた防御アレルは、ＡＰＯＥ４／４陽性ドナーにおけるＡＤの発症を予防することができることが示されている。これを裏付けるように、防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含むミクログリアは、非防御ＣＤ３３（ｒｓ１２４５９４１９）ＳＮＰを含むミクログリアよりも、高い酸素消費速度を示した。

本明細書に開示され、特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく実施され実行され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法に、及び方法の工程において、又は方法の工程の順序において、変形が適用され得ることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じ又は類似の結果が達成され得ることは理解されるであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様の置換及び修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に記載したものを補足する例示的な手順上又はその他の詳細を提供する範囲で、参照によりして明確に本明細書に組み込まれる。
Ａｔａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２９０（４３）：２６０４３－５０，２０１５．
Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｅｒｓ Ｍｅｄ．１０（２）：３２，２０２０．
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Ｃａｌｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：２７７，２０１７．
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Ｅｂｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，９４（２）：２７８－２９３，２０１７．
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国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット
国際公開第０３／０１６４９６号パンフレット
国際公開第９８／３０６７９号パンフレット
国際公開第９８／５３０５８号パンフレット
国際公開第９８／５３０５９号パンフレット
国際公開第９８／５３０６０号パンフレット
Ｊｕｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ．９（２）： ６００－６１４，２０１７．
ＭｃＱｕａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４３１（９）：１８０５－１７，２０１９．
Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ．６０（１０）：１５０６－１７，２０１２．
Ｍｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．１３（１）：１３５，２０１６．
国際公開第２０１２／１４９４８４号パンフレット
Ｒｕｓｔｅｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３８（３），２９１－３０４，２０１７．
Ｓｈｉｐｐｙ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５６３４４６，２０２０．
Ｓｌｏｓａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２４（９）：２２４８－２２６０，２０１８．
米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書
米国特許第６，１４０，０８１号明細書
米国特許第６，４５３，２４２号明細書
米国特許第６，５３４，２６１号明細書
米国特許第６，６１７，１５２号明細書
米国特許第８，３７２，６４２号明細書
米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書
米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書
米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書
米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号明細書
米国特許出願公開第２００７／０２１８５２８号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
Ｗｅｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．７：ｅ３０５２５，２０１２．
Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ （Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），２４（４），３７１－３８６，２０１４．
Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０（１），２０１８．

Claims (72)

1. ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含む、単離された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞株。
2. 細胞株がＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する、請求項１に記載の細胞株。
3. 細胞株がＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、請求項１に記載の細胞株。
4. ｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株のｉＰＳＣは、健康なドナーからエピソームとしてリプログラミングされたｉＰＳＣである、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞株。
5. ｉＰＳＣ由来ミクログリアのｉＰＳＣは、アルツハイマー病のドナーからエピソームとしてリプログラミングされている、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞株。
6. 細胞株がＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＲＥＭ２を発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞株。
7. 細胞株がＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９を発現する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞株。
8. 細胞株がアイソジェニックである、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞株。
9. 好適な容器中に請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞株を含むキット。
10. 第１の容器中のＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株と、第２の容器中のＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株とを含む、請求項９に記載のキット。
11. 細胞株は、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する、請求項１０に記載のキット。
12. 細胞株は、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、請求項１０に記載のキット。
13. それぞれ好適な容器中のＩＦＮγ、ＬＰＳ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦをさらに含む、請求項９又は１０に記載のキット。
14. それぞれ好適な容器中のＩＬ－４、ＩＬ－１３、及び／又はジブチルｃＡＭＰをさらに含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット。
15. それぞれ好適な容器中の、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを検出するための試薬をさらに含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載のキット。
16. 試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試薬としてさらに定義される、請求項１５に記載のキット。
17. ＥＬＩＳＡプレートをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
18. ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株を試料と接触させることを含む、神経変性疾患をスクリーニングするための方法。
19. 細胞株は、ＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する、請求項１８に記載の方法。
20. 細胞株は、ＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、請求項１８に記載の方法。
21. ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株を前記試料と接触させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
22. ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株及び／又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞株が、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞株である、請求項１８又は２１に記載の方法。
23. 試料は、患者の試料である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 試料は、血液試料である、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを検出することをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルは、神経変性疾患の存在又は非存在を示す、請求項２５に記載の方法。
27. 神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症である、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 試験化合物をスクリーニングするための方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載のミクログリア細胞株に試験化合物を導入すること、及び分析物のレベルを測定することを含む方法。
29. アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. ミクログリア細胞集団は、炎症促進（Ｍ１）剤又は抗炎症（Ｍ２）剤にさらに導入される、請求項２８又は２９に記載の方法。
31. 炎症促進（Ｍ１）剤は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦである、請求項２６に記載の方法。
32. 抗炎症（Ｍ２）剤は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、及び／又はジブチルｃＡＭＰである、請求項３０に記載の方法。
33. 分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１からなる群から選択される、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１である、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
35. ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを増加させる薬剤が、抗ベータアミロイド剤である、請求項３３に記載の方法。
36. アミロイドの蓄積を予防又は減少させるのに有効な量で抗ベータアミロイド剤を対象に投与することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
37. 対象が、ＡＰＯＥ４／４陽性である、請求項３６に記載の方法。
38. 表１Ａからの少なくとも１０種の遺伝子及び表１Ｂからの少なくとも１０種の遺伝子の血液試料中の発現レベルを決定することを含む、神経変性のリスクがある対象を特定する方法であって、対照と比較して表１Ａにおける遺伝子の発現が減少し、表１Ｂにおける遺伝子の発現が増加している対象は神経変性のリスクがある方法。
39. 前記表１Ａ中の少なくとも１０種の遺伝子が、ＴＥＮＭ４、ＭＴＮＤ１Ｐ２３、ＧＲＥＭ１、ＧＰＡＴ２、ＡＣ２４３７７２．３、ＣＤ３００Ｅ、ＦＮ１、ＳＬＣ１Ａ１、ＴＮＣ、及び／又はＮＰＰＣである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記表１Ｂ中の少なくとも１０個の遺伝子が、ＭＭＰ２、ＭＡＧ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＣＹＴＬ１、ＰＤＣＤ１、ＺＮＦ９０、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＳＴ７、ＮＴ５ＤＣ４、及び／又はＡＱＰ１である、請求項３８に記載の方法。
41. 前記神経変性は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症に関連している、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記発現レベルの決定が、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイ、ピコドロップレット標的化及び逆転写、又はＲＮＡ配列決定を行うことを含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 神経変性のリスクがあると特定された前記対象に有効量の治療薬を投与することをさらに含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 治療薬が、コリンエステラーゼ阻害剤又は抗炎症剤である、請求項４３に記載の方法。
45. 請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞株を複数の候補薬剤と接触させること、及び分析物のレベルを測定することを含む、治療薬を特定するためのハイスループットスクリーニングを実施するための方法。
46. 前記分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１である、請求項４５に記載の方法。
47. アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
48. 請求項１～８のいずれか一項に記載のミクログリア細胞株、並びに内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、及び／又は神経前駆細胞を含む共培養物。
49. 神経変性疾患のモデルとしての、請求項４８に記載の共培養物の使用。
50. ＴＲＥＭ２、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＰＵ．１、ＩＢＡ－１、ＴＲＥＭ２、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、及び／又はＴＭＥＭ１１９に対して少なくとも９０％陽性であるミクログリア細胞集団を含む組成物であって、前記ミクログリア細胞集団はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレル又はＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化されている、組成物。
51. ミクログリア細胞集団は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｔアレルを含むｉＰＳＣから分化されている、請求項５０に記載の組成物。
52. ミクログリア細胞集団は、ＣＤ３３ ｒｓ１２４５９４１９Ｃアレルを含むｉＰＳＣから分化されている、請求項５０に記載の組成物。
53. ミクログリア細胞集団はＡＰＯＥ３／３遺伝子型を有する、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の組成物。
54. ミクログリア細胞集団はＡＰＯＥ４／４遺伝子型を有する、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の組成物。
55. 神経変性のリスクがある対象を特定するための、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
56. リスクがある対象の特定が、表１Ａからの少なくとも１０種の遺伝子及び表１Ｂからの少なくとも１０種の遺伝子の血液試料中の発現レベルを決定することを含む、請求項５５に記載の使用であって、対照と比較して表１Ａにおける遺伝子の発現が減少し、表１Ｂにおける遺伝子の発現が増加している対象は神経変性のリスクがある、使用。
57. 前記表１Ａ中の少なくとも１０種の遺伝子は、ＴＥＮＭ４、ＭＴＮＤ１Ｐ２３、ＧＲＥＭ１、ＧＰＡＴ２、ＡＣ２４３７７２．３、ＣＤ３００Ｅ、ＦＮ１、ＳＬＣ１Ａ１、ＴＮＣ、及び／又はＮＰＰＣである、請求項５６に記載の使用。
58. 前記表１Ｂ中の少なくとも１０個の遺伝子は、ＭＭＰ２、ＭＡＧ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＣＹＴＬ１、ＰＤＣＤ１、ＺＮＦ９０、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＳＴ７、ＮＴ５ＤＣ４、及び／又はＡＱＰ１である、請求項５６に記載の使用。
59. 神経変性が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は多発性硬化症に関連している、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の使用。
60. 発現レベルの決定は、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイ、ピコドロップレット標的化及び逆転写、又はＲＮＡ配列決定を行うことを含む、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の使用。
61. 神経変性のリスクがあると特定された前記対象に有効量の治療薬を投与することをさらに含む、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の使用。
62. 治療薬が、コリンエステラーゼ阻害剤又は抗炎症剤である、請求項６１に記載の使用。
63. 試験化合物をスクリーニングするための請求項５０～５４のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、組成物に試験化合物を導入すること、及び分析物のレベルを測定することを含む使用。
64. アミロイドベータ食細胞機能を測定することをさらに含む、請求項６３に記載の使用。
65. ミクログリア細胞集団は、炎症促進（Ｍ１）剤又は抗炎症（Ｍ２）剤にさらに導入される、請求項６３又は６４に記載の使用。
66. 炎症促進（Ｍ１）剤は、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、及び／又はＧＭ－ＣＳＦである、請求項６３に記載の使用。
67. 抗炎症（Ｍ２）剤は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、及び／又はジブチルｃＡＭＰである、請求項６５に記載の使用。
68. 分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及びＰＤ－１からなる群から選択される、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の使用。
69. 分析物は、ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１である、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の使用。
70. ＩＬ－２７、ＩＬ－１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、及び／又はＰＤ－１のレベルを増加させる薬剤は、抗ベータアミロイド剤である、請求項６８に記載の使用。
71. アミロイド蓄積を予防又は減少させるのに有効な量で抗ベータアミロイド剤を対象に投与することをさらに含む、請求項７０に記載の使用。
72. 対象はＡＰＯＥ４／４陽性である、請求項７１に記載の使用。